Sanquin Reagents Plesmanlaan 5 0 CX Amsterdam The Netherlands Phone: +.0.5.599 Fax: +.0.5.570 Email: reagents@sanquin.nl Website: www.sanquinreagents.com M55/ November 007 ELISA PeliClass human IgG subclass kit REF M55 Kit ELISA pour la détermination quantitative des sousclasses d'igg humaine d le sérum (fr) Ab BLACK BUF CAL CONJ CONTROL fr Anticorps contre Noir Tampon Calibrateur Conjugué Contrôle DIL GREEN HRP HUM HO MOU fr Dilution Vert HRP Humain Peroxyde d'hydrogène Souris RED SEALS STOCK STOP SUB SUBS fr Rouge Scellés pour plaque Solution mère Arrêt Sousclasses Substrat WASH WELL YELLOW fr Lavage Puits Jaune Limite de confiance ELISA REF PeliClass ELISA kit M800 x8 WELL aigg, aigg RED BLACK M80 x8 WELL aigg, aigg YELLOW GREEN M80 0. ml CAL M80 0. ml CONTROL M80 0. ml HRP MOU Ab HUM IgG CONJ M805 50 ml BUF WASH STOCK :0 M80 0 ml BUF DIL STOCK :0 M808 5 ml BUF SUBS STOCK :0 M80.0 ml ABTS STOCK :50 M809 0.5 ml HO STOCK :00 M807 0 ml BUF STOP SEALS
fr I. INTRODUCTION Les IgG humaines comprennent quatre sousclasses : IgG, IgG, IgG et IgG. La littérature a largement décrit les caractéristiques biochimiques de ces sousclasses d'igg (5). Les différences se reflètent d plusieurs fonctions biologiquement importantes telles que la reconnaissance antigénique, l'activation du complément et la fixation sur les récepteurs présents à la surface des cellules. De nombreuses études ont révélé que des anomalies des taux sériques des sousclasses d'igg peuvent être associées à diverses situations de maladie. En particulier, l association d une carence sélective de sousclasse IgG à une susceptibilité accrue aux infections virales ou bactériennes (,5) a amplement été documentée. Des taux sériques faibles d'igg ou d'igg ont été constatés chez des patients souffrant d'infections récurrentes des tractus respiratoires inférieur et supérieur. Chez d'autres patients, une relation a été établie entre des concentrations sériques d'igg très faibles et des infections récurrentes sinopulmonaires (). Des anomalies des taux sériques de sousclasses d'igg ont également été observées au cours de maladies autoimmunes, de troubles neurologiques et d'infections par le VIH (). II. PRINCIPE DU PROCÉDÉ Le kit ELISA PeliClass de détermination des sousclasses d IgG humaine est un immunoessai enzymatique de type «sandwich». Le kit contient des barrettes de micropuits revêtue d anticorps monoclonaux de haute avidité; chaque barrette est dirigée spécifiquement contre l une des sousclasses d IgG humaine. Les échantillons d essai et les sérums de calibrateur et de contrôle sont incubés d les puits respectifs. La sousclasse d IgG à déterminer se fixe à la phase solide et l IgG nonfixée est éliminée par lavage. L antisérum anti IgG humaine conjugué à la peroxydase est ensuite ajouté à chaque puits et le conjugué non fixé est éliminé par lavage. Après incubation avec une solution de substrat (ABTS) et de peroxyde d hydrogène, la réaction est arrêtée à l aide d un tampon acide. La densité optique du produit de réaction de couleur verte est mesurée et la concentration de la sousclasse d IgG de l échantillon d essai est calculée par comparaison aux valeurs obtenues avec une courbe de calibrage. Le dosage du sérum de contrôle des sousclasses d IgG est effectué afin de déterminer la validité des courbes de calibrage et la précision des déterminations de sousclasses d'igg. Les taux de sousclasses d'igg du (des) sérum(s) calibrateur ont été déterminés au moyen d'un calibrateur dérivé de la préparation de référence 7/97 de l OMS. Les valeurs cibles recommandées ont été utilisées, c estàdire 5,0 g/l pour l'igg,, g/l pour l'igg, 0, g/l pour l'igg et 0,5 g/l pour l'igg (7). III. CONSERVATION ET STABILITÉ Le kit ELISA PeliClass de détermination des sousclasses d IgG humaine doit être conservé debout, à 8 C. Il peut être utilisée jusqu à la date de péremption indiquée sur l étiquette. La stabilité après ouverture est d une semaine pour tous les composants, lorsqu ils sont conservés à 8 C. Les conditions de trport peuvent diverger des conditions de conservation. IV. CONTENU DU KIT Voir le tableau au début de cette notice. Le kit ELISA PeliClass de détermination des sousclasses d'igg humaine contient suffisamment de réactifs pour effectuer 8 dosages de chaque sousclasse, y compris sérums calibrateur, contrôles positifs et blanc. Les anticorps monoclonaux ont été purifiés, à partir de milieu de culture tissulaire, par chromatographie sur colonnes (chromatographie par échange d ions et chromatographie d affinité). Les sérums de calibrateur et de contrôle sont des sérums humains liquides. V. MATÉRIEL SUPPLÉMENTAIRE REQUIS Eau distillée pour la dilution des tampons de lavage, de dilution et de substrat. Dispositif pour pipetter fournissant des volumes précis. Incubateur (7 ± C). Laveur ELISA ou pissette en plastique de 500 ml pour le lavage automatique ou manuel des barrettes de micropuits. Lecteur ELISA standard pour la mesure de la densité optique à ou à 05 nm. Papier semilog. VI. TRAITEMENT DES ÉCHANTILLONS DU TEST Ce test est uniquement destiné à l analyse d échantillons sériques. Les échantillons doivent être aussi frais que possible ou avoir été conservés congelés. Les échantillons doivent être dilués manuellement avant d'être utilisés (voir VII MÉTHODE D ANALYSE). VII. MÉTHODE D ANALYSE Laisser tous les réactifs atteindre la température ambiante (85 ºC) et bien les homogénéiser. Éviter la formation de bulles ou de mousse. Il est recommandé d effectuer le dosage de tous les échantillons et des sérums de calibrateur et de contrôle en double.. MICROPLAQUE Le kit ELISA PeliClass de détermination des sousclasses d IgG offre la flexibilité de pouvoir utiliser des parties de plaque à des moments différents. Avant d ouvrir la pochette en plastique, déterminer le nombre de barrettes nécessaires pour effectuer le dosage du nombre désiré d échantillons et y ajouter puits pour les calibrateurs et les contrôles positifs et blanc en double. Retirer les barrettes qui ne seront pas utilisées du châssis de la microplaque et les réemballer d la pochette en plastique contenant le dessiccant et conserver à 8 C.. PRÉPARATION DES TAMPONS Tampon de lavage: Préparer le tampon de lavage en ajoutant le contenu entier de la bouteille de concentré de tampon de lavage à 950 ml d eau distillée. Le tampon de lavage dilué doit être conservé à 8 C et reste stable pendant semaine. Remarque: Le tampon concentré peut contenir des cristaux de sel. Avant de préparer le tampon de travail, chauffer la solution concentrée BRIÈVEMENT à 7 C afin de dissoudre les cristaux. Tampon de dilution : Calculer la quantité de tampon de dilution nécessaire (environ ml de tampon non dilué par barrette de puits) et préparer la solution de travail en diluant 0 fois le tampon d de l eau distillée.
. PRÉPARATION DES SERUMS DE CALIBRATEUR ET DE CONTRÔLE Pour les concentrations, voir les tableaux et de la notice incluse d le kit. Calibrateur: (Voir le tableau de la notice incluse d le kit) Étiqueter un tube de 0 ml avec «:500» et huit tubes de ml avec respectivement «Cal» à «Cal8». À l aide d une pipette, trférer,99 ml de tampon de dilution d le tube de 0 ml et y ajouter 0 µl de calibrateur (dilution initiale :500). À l aide d une pipette, trférer,9 ml de tampon de dilution d le tube étiqueté «Cal» et,0 ml d les tubes étiquetés «Cal» à «Cal8». À l aide d une pipette, trférer 00 µl de calibrateur dilué :500 d le tube «Cal» et effectuer à partir de ce tube sept dilutions en série de facteur en ajoutant,0 ml de la dilution précédente d le tube «Cal» suivant. Sélectionner pour chaque sousclasse d IgG la série appropriée de dilutions du calibrateur: IgG :80 000 : 80 000 ; IgG, IgG et IgG :0 000 :0 000. Contrôle : Étiqueter un tube avec «:500» et deux tubes de ml avec respectivement «:0 000» (pour IgG,, ) et «:0 000» (pour IgG). À l aide d une pipette, trférer d le tube étiqueté :500 :,99 ml de tampon de dilution et 0 µl de sérum d étalonnage. À l aide d une pipette, trférer d le tube étiqueté :0 000 : 885 µl de tampon de dilution et 5 µl de dilution :500. À l aide d une pipette, trférer d le tube étiqueté :0 000 : 875 µl de tampon de dilution et 5 µl de dilution :0 000. Préparer un tube de ml avec ml de solution de dilution en tant que blanc.. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS Diluer les échantillons d essai avec le tampon de dilution, conformément à la méthode utilisée pour le sérum d étalonnage. Lorsque les résultats se situent en dehors de la plage des valeurs données (se reporter au Tableau de la notice incluse d le kit), le dosage doit être répété avec un échantillon dilué différemment. 5. PREMIER LAVAGE Avec le tampon de lavage, laver quatre fois les puits nécessaires placés d le châssis de la microplaque. Pour un lavage manuel, remplir entièrement les puits (> 00 µl) de tampon de lavage, puis les vider ; répéter trois fois cette procédure. Les puits doivent finalement être complètement vides. Le réactif suivant doit être ajouté immédiatement, ne pas laisser les puits à sec pendant une période de temps prolongée.. PREMIÈRE INCUBATION Trférer 00 µl des solutions diluées de calibrateur, de contrôles positifs, d échantillons et de blancs d les puits appropriés. Recouvrir la microplaque d un film adhésif, l agiter doucement en la tapotant pendant quelques secondes sur les rebords afin de mélanger le contenu de chaque puits. Laisser incuber pendant heure à 7 C. Juste avant le lavage, préparer le réactif pour l incubation suivante, conformément aux instructions du point 8. 7. DEUXIÈME LAVAGE Aspirer le surnageant hors des puits et laver la microplaque comme indiqué au point 5. 8. INCUBATION AVEC L ANTICORPS ANTIIGG HUMAINE CONJUGUÉ À LA PEROXYDASE DE RAIFORT Diluer le conjugué :500 en trférant avec une pipette 0 µll de conjugué d,97 ml de tampon de dilution. Diluer ensuite le conjugué comme suit: :000 par trfert de, ml de dilution :500 d,0 ml de tampon de dilution. :000 par trfert de,0 ml de dilution :500 d,0 ml de tampon de dilution. :000 par trfert de,5 ml de dilution :500 d,5 ml de tampon de dilution. Ajouter: 00 µl de dilution :500 aux barrettes antiigg; 00 µl de dilution :000 aux barrettes antiigg; 00 µl de dilution :000 aux barrettes antiigg; 00 µl de dilution :000 aux barrettes antiigg. Recouvrir la microplaque d un film adhésif, l agiter doucement en la tapotant pendant quelques secondes sur les rebords afin de mélanger le contenu de chaque puits. Laisser incuber pendant heure à 7 C. Juste avant le lavage, préparer le réactif pour l incubation suivante, conformément aux instructions du point 0. 9. TROISIÈME LAVAGE Aspirer le surnageant hors des puits et laver la microplaque comme indiqué au point 5. 0. INCUBATION AVEC LE SUBSTRAT ABTS Calculer la quantité de solution de substrat nécessaire (environ 0,9 ml par barrette de puits). Ajouter l équivalent de 00 µl de solution stock de peroxyde d hydrogène et de 00 µl de solution stock d ABTS à 0 ml de tampon de substrat de travail ( ml de solution stock de substrat + 8 ml d eau distillée). Ajouter 00 µl de solution de substrat à tous les puits. L agiter doucement en la tapotant pendant quelques secondes sur les rebords afin de mélanger le contenu de chaque puits. Laisser incuber pendant 0 minutes à température ambiante (85 ºC).. ARRÊT DE LA RÉACTION ENZYMATIQUE Ajouter 50 µl de solution d arrêt à tous les puits.. LECTURE DE LA MICROPLAQUE Lire la microplaque d un délai de heure à nm (de préférence) ou à 05 nm à l aide d un lecteur ELISA. VIII. RÉSULTATS ET INTERPRÉTATION DES DONNÉES Enregistrer la densité optique à nm (de préférence) ou à 05 nm d chaque puits et calculer la moyenne des valeurs doubles. Pour chaque échantillon, les doubles ne devront pas diverger de plus de 5 % de la valeur moyenne. Si la divergence est supérieure, le dosage devra être répété. Sur papier semilog, représenter graphiquement les valeurs de densité optique obtenues pour les calibrateurs (axe des ordonnées) en fonction de la concentration en sousclasse correspondante en ng/ml (axe des abscisses) et tracer la droite de régression. Les taux de sousclasses d'igg d le sérum de contrôle doivent se situer d la (les) plage(s) de valeurs données d le tableau de la notice incluse d le kit. Sur la courbe de calibrage, interpoler les valeurs moyennes de densité optique obtenues pour chaque échantillon. Les échantillons qui présentent une densité optique moyenne se trouvant en dehors de la plage des dilutions de la courbe de calibrage doivent être dilués de façon appropriée. Pour évaluer les concentrations de sousclasses d'igg pouvant être présentes d un échantillon, comparer les taux déterminés avec les valeurs normales de sousclasses d IgG (voir X PLAGE DES VALEURS DE RÉFÉRENCE).
IX. PLAGE DES VALEURS POUR L'ANALYSE Consulter le tableau de la notice incluse pour obtenir les plages de valeurs spécifiques au kit. X. PLAGES DES VALEURS DE RÉFÉRENCE Plages des valeurs de références (g/l) des sousclasses d'igg d des échantillons sériques provenant d'individus sains de type caucasien (8). Des valeurs de référence différentes doivent être prises en compte pour les autres types de population. Âge IgG IgG IgG IgG 0 ½ 9 > ½ 9 8 8, 0,,8,7,8 7,0,0 7,7,5 8,,9 8,5, 9,0,5 9,,7 0,0,0 0,8,0,5,7,8,9, 0,87, 0,8, 0,, 0,, 0,8, 0,5, 0,5,8 0,,0 0,7, 0,85, 0,98,8,0,,50, 0, 0,55 0, 0,70 0,5 0,80 0,5 0,97 0,5,07 0,5, 0,,0 0,, 0,, 0,, 0,5,9 0,8, 0,0,0 0,0 0,5 <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0, <0,0 0,79 <0,0,0 <0,0,7 <0,0,58 <0,0,89 0,0,0 0,0,0 0,08,0 XI. a CARACTÉRISTIQUES SPÉCIFIQUES DES PERFORMANCES Reproductibilité Concentration en sousclasse d'igg IgG IgG IgG IgG Variation intraanalyse (%) Variation interanalyse (%) 7 7 b Comparaison du kit PeliClass de détermination des sousclasses d'igg humaine avec la technique de Mancini Les concentrations sériques d IgG, d IgG, d IgG et d IgG ont été déterminées par ELISA et comparées aux valeurs correspondantes, déterminées par la technique de Mancini. Les corrélations suivantes ont été établies : Sousclasse d'igg régression linéaire corrélation IgG Y = 0,90X 0,9 0,97 IgG Y =,0X 0,7 0,9 IgG Y = 0,9X + 0,00 0,99 IgG Y = 0,9X 0,0 0,98 Remarque : Les valeurs mentionnées pour les caractéristiques spécifiques de performance du test, représentent des résultats typiques et ne doivent pas être considérées comme des spécifications propres à ce kit. XII. LIMITES. L'utilisateur doit être entraîné et familiarisé avec les dosages ELISA et les procédures de test.. Les échantillons extrêmement hémolytiques ou lipémiques ne doivent pas être utilisés. Les échantillons contenant le facteur rhumatoïde, de fortes concentrations de bilirubine ou d'autres complexes immuns circulants peuvent donner des résultats inattendus. Il convient d'analyser ces échantillons avec d'autres méthodes.. Les échantillons hors plage, par exemple en cas de présence de paraprotéines, doivent être réanalysés en utilisant d'autres dilutions.. La découverte d'un taux diminué de l'une des sousclasses d'igg ne peut en aucun cas amener à établir un diagnostic définitif, mais doit plutôt être considérée comme l indication d un trouble du système immunitaire, requérant un examen diagnostic supplémentaire. 5. Le sérum de contrôle doit toujours être utilisé afin de vérifier la validité des courbes de calibrage. Lorsque le contrôle est hors plage, les résultats du dosage ne sont pas fiables. Le dosage doit être répété.. Les réactifs provenant de différents lots ne sont pas interchangeables. 7. Les résidus de réactifs (par exemple un volume mort) ne doivent pas être mélangés avec le contenu de flacons récemment ouverts. 8. Les bouchons et les flacons ne sont pas interchangeables. Les bouchons doivent être replacés sur les flacons correspondants. 9. Bien que le calibrateur humain et que les sérums de contrôle aient été testés quant à la présence de marqueurs d'agents trmetteurs de maladies spécifiques, conformément aux directives en vigueur de l UE en matière de BPF, et reconnus non réactifs, tous les composants d'origine humaine doivent être considérés comme potentiellement infectieux. 0. Agents de conservation: Thiomersal 0,00 %.. Utiliser un nouveau film plastic pour chaque étape d incubation/fixation de l ELISA afin d éviter une contamination croisée. Ne pas utiliser de film aluminium.. Utiliser des embouts de pipettes à usage unique pour chaque trfert afin d éviter une contamination croisée.. À chaque fois que le kit est utilisé, préparer des dilutions fraîches de calibrateur, de conjugué et de tampons.. Ne pas utiliser d autres réactifs et d autres barrettes de microplaque que ceux fournis avec le kit. 5. L azide de sodium inactive la peroxydase de raifort (HRP); ne pas utiliser de solutions contenant de l azide de sodium et ne pas ajouter d azide de sodium aux tampons fournis.. L élimination des déchets doit être effectuée conformément aux réglementations en vigueur d votre laboratoire.
XIII. BIBLIOGRAPHIE. Shakib, F. (Editeur), Monograph in Allergy, Karger A.G., 9 (98).. Shakib, F. (Editeur), The human IgG subclass, Pergamon Press (990).. Vlug, A. et al., Eur. Clin. lab., 8: (989).. Jefferis, R. et al Clin.Exp.Immunol. 8:57 (990). 5. Hamilton, R.C., Clin. Chem., :707 (987).. Beck, C.S. and Heiner, D.C., Am. Rev. Respir. Dis., :9 (98). 7. Klein, F et al., Clin. Chem. Acta., 50 9 (985) 8. Vlug, A. et al., Ann. Biol. Clin. 5:57 (99). 5