Rôle de la PTOX dans la tolérance au stress lumineux chez les plantes alpines Etude d écotypes alpins chez Arabidopsis thaliana

Rapport de stage 1 ère année de Master Environnement Spécialité Ecologie, Biodiversité, Evolution (EBE) Valérie GUITTET Soutenance : 7-8 juin 2010 Rôle de la PTOX dans la tolérance au stress lumineux chez les plantes alpines Etude d écotypes alpins chez Arabidopsis thaliana Laboratoire Ecologie Systématique Evolution (Université Paris-XI) Ecophysiologie Végétale Durée du stage : 15 février - 28 mars 2010 Responsable de stage : Peter Streb Année universitaire : 2009-2010

Sommaire Remerciements p3 Introduction p4 I. Matériels et méthodes p6 1.1. Mesure de fluorescence chlorophyllienne p6 1.1. a. Description de la technique de mesure de la fluorescence et des paramètres associés 1.1. b. Description du matériel utilisé 1.1. c. Description du protocole expérimental 1.2. Calcul de l ETR (electron transport rate) p13 1.3. Extraction de la protéine PTOX par Western Blot p13 II. Résultats p15 2.1. Mesure de fluorescence chlorophyllienne : calculs des qp et NPQ p15 2.1. a. Quenching photochimique qp 2.1. b. Quenching non-photochimique NPQ 2.2. Calcul de l ETR (electron transport rate) p19 2.3. Extraction de la protéine PTOX par Western Blot p21 III. Discussion p22 Conclusion p29 Bibliographie p30 Annexes p32 Abstract / Résumé p36 2

Remerciements Je remercie tout d abord mon responsable de stage Mr Peter Streb, pour m avoir intégré à son équipe, pour toute l aide et le temps qu il m a consacré au cours du stage. Je remercie également Constance Laureau, thésarde à l ESE, pour toutes les réponses qu elle m a apportée et sans qui je n aurai pu réaliser les Western Blots. Enfin je remercie toutes les personnes qui ont pu contribuer de près ou de loin au bon déroulement de ce stage. 3

Introduction Que se soit en conditions naturelles ou en culture, les plantes sont fréquemment exposées à des conditions environnementales défavorables à l origine d un stress. Le stress est communément défini comme un facteur environnemental ne permettant pas le développement optimal de la plante, comme par exemple une forte lumière (stress abiotique). Les conditions environnementales stressantes jouent un rôle majeur en déterminant comment le sol et le climat limitent la distribution des espèces. Les plantes alpines poussent à de hautes altitudes, elles sont ainsi exposées à des conditions environnementales extrêmes, notamment de fortes intensités lumineuses et des températures variables (faibles ou fortes). De plus, la saison de croissance des plantes herbacées alpines est très courte (deux ou trois mois), elles ont donc besoin d un système d assimilation du carbone très efficace (Streb et al, 1997 ; Streb et al, 2005). De nombreuses études ont montré que la photosynthèse des plantes alpines était bien adaptée à ces conditions climatiques de haute altitude : large optimum de température permettant l assimilation efficace du carbone et maintien de la photosynthèse sous de fortes radiations lumineuses. Les plantes sont acclimatées à utiliser l énergie absorbée si le flux quantique reçu est similaire à celui de leur condition de croissance. A la lumière, selon le flux quantique absorbé, la protéine D1 du photosystème II (PSII) est dégradée en permanence et resynthétisée à la même vitesse. Si la lumière reçue est trop forte, c est-à-dire si le flux quantique reçu excède la capacité photosynthétique de la plante, l inactivation peut excéder la réparation et la plante risque la photoinhibition du PSII (diminution du rendement quantique induit par la lumière). L exposition à de fortes radiations lumineuses, associée à d autres conditions de stress (une faible température par exemple), induit la formation d oxygène réactif (ROS : reactive oxygen species) à l origine du stress oxydant. L oxygène réactif est formé en permanence dans les membranes, mais en grande quantité, il peut être dangereux pour la plante. Les ROS sont généralement formés en conditions réductrices (accumulation des électrons dans la chaine de transport), par réduction de O 2 (transfert d un électron) en ion superoxyde O - - 2, à l origine de destructions membranaires. De plus, O 2 peut réagir (réaction de Haber Weiss) pour former des ions hydroxyles HO - très dangereux pour la plante (destructions cellulaires). L oxygène singulet (réaction de la chlorophylle avec l oxygène) est également très réactif. La production de ROS peut affecter la synthèse de protéines, et notamment la protéine D1 du PSII. Une faible température associée au stress oxydant ralentit les réactions enzymatiques et par conséquent le renouvellement de la protéine D1. Ainsi, les conditions défavorables de haute altitude (forte lumière, faible température) peuvent induire la photoinhibition du PSII chez des plantes non-acclimatées (Streb et al, 1997). De plus, une forte température peut altérer la fluidité des membranes thylakoïdiennes et inhiber le transport d électrons lors de la 4

photosynthèse (Yordanov et al, 1986 ; Schreiber & Berry, 1977). Les plantes ont développé de nombreux systèmes de protection leur permettant d éliminer cet oxygène réactif ou d empêcher sa production. L enzyme superoxyde dismutase (SOD), associée aux enzymes ascorbate peroxydase (APX) et glutathion peroxydase (GPX), est impliquée dans la détoxification des ions superoxydes - O 2 par production d H 2 O dans les chloroplastes (système antioxydant) (Foyer et al, 1994). La quantité d antioxydants dans les plantes alpines augmente avec l altitude (Wildi & Lütz, 1996). Le cycle des xanthophylles permet de dissiper l énergie en excès sous forme de chaleur (Demming- Adam & Adam, 1993). La photorespiration peut consommer jusqu à 30% des électrons résultant de la réaction primaire de la photosynthèse. Elle permet ainsi d éviter une sur-réduction de la chaine de transport photosynthétique à l origine de la production de ROS (Heber et al, 1996). La quantité de caroténoïdes dans les thylakoïdes augmente dans des plantes acclimatées, suggérant que les caroténoïdes sont impliqués dans les mécanismes de photo-protection des plantes (Tallon & Quiles, 2007). Enfin, la protéine PTOX (plastid terminal oxidase), aussi connu sous le nom d IMMUTANS, serait impliquée dans la protection des plantes contre le stress oxydant, en prévenant une surréduction du pool de plastoquinones dans les chloroplastes. Elle serait capable de transférer les électrons de la plastoquinone à l oxygène, immédiatement transformé en H 2 O dans le stroma, sans générer d espèces oxygènes réactives (Streb et al, 2005). Située du côté stroma de la membrane thylakoïdienne, elle jouerait ainsi le rôle d accepteur alternatif d électrons. Cette enzyme, associée à la NADH DH (NADH Déshydrogénase) est impliquée dans la chlororespiration (Quiles, 2006). Bennoun (1982) définit la chlororespiration comme une chaine de transport d électrons située dans la membrane du thylakoïde, en interaction avec la chaine de transport photosynthétique (circulation des électrons entre PSII et PSI) et impliquant l oxydation non-photochimique des plastoquinones. Cependant, la PTOX est une protéine mineure dans de nombreuses espèces de plantes déjà étudiées et sa capacité à consommer les électrons en excès parait être faible (Peltier & Cournac, 2002). Cette enzyme est pourtant très abondante chez Ranunculus glacialis, une plante alpine de haute altitude, dont la quantité excède celles de nombreuses autres plantes, notamment des feuilles de tomates transgéniques sur-exprimant la PTOX. De plus, la quantité de PTOX chez R. glacialis diminue fortement lors d une désacclimatation (22 C à faible lumière pendant trois semaines), suggérant qu elle tient un rôle important dans la protection contre la lumière forte. Enfin, l abondance de la PTOX chez Geum montanum, une autre plante alpine, est corrélée avec l altitude (Streb et al, 2005). La PTOX serait de ce fait une protéine importante dans l adaptation des plantes alpines aux conditions environnementales difficiles induisant un stress oxydant. Cependant, aucun test n est actuellement disponible pour quantifier le rôle de la PTOX comme accepteur alternatif d électrons. Le but du stage est de développer une méthode, basée sur la fluorescence chlorophyllienne, afin de mettre en évidence le rôle de la PTOX chez les plantes alpines. 5

I. Matériels et méthodes 1.1. Mesure de fluorescence chlorophyllienne 1.1. a. Description de la technique de mesure de la fluorescence et des paramètres associés L énergie lumineuse absorbée par la chlorophylle d une feuille peut être utilisée de trois façons différentes. Elle peut être utilisée pour réaliser la photosynthèse (photochimie), l énergie en excès peut être dissipée sous forme de chaleur ou réémise sous forme de lumière (fluorescence chlorophyllienne). Cependant, la quantité de lumière absorbée ré-émise sous forme de fluorescence est très faible : seulement 1 à 3% de la lumière totale absorbée. Cela représente donc un rendement de fluorescence (énergie émise par fluorescence / énergie absorbée par le PSII) très faible. Ces trois processus sont en compétition, du fait que si l efficacité de l un d eux augmente, celle des deux autres diminue. Ainsi, en mesurant le rendement de la fluorescence chlorophyllienne, on peut obtenir des informations concernant la photochimie et la libération de chaleur (Maxwell & Johnson, 2000). Figure 1 : Les trois voies d utilisation de l énergie La lumière bleue excite la chlorophylle vers un niveau énergétique S2, et la lumière rouge vers un niveau S1. Lorsqu un électron retombe du niveau S1, cela entraine une libération d énergie qui peut être utilisée par trois processus : photosynthèse, fluorescence et émission de chaleur. Technique de mesure de l émission de fluorescence de la chlorophylle d une feuille : (Cornic, 2007) Figure 2 : schéma du dispositif 6

Trois sources lumineuses sont produites : - une lumière modulée ou lumière analytique (lambda < 680nm) émise par une LED. Il lui correspond une fluorescence modulée qui est amplifiée. Cette lumière analytique de flux quantique constant et très faible permet de mesurer la fluorescence Fo. - une lumière actinique (lumière solaire ou toute autre source lumineuse susceptible d activer la photosynthèse) produisant une émission de fluorescence par la feuille, non amplifiée. La lumière actinique modifie l état redox de Q A (et donc l état d ouverture des centres PSII), qui résulte d une part de l afflux d électrons par les antennes (réactions amonts) et d autre part de l utilisation de ces électrons pour l assimilation du CO 2 et de l O 2, etc. (réactions avales). - une source de lumière sursaturante (flash lumineux) : environ 8000 10.000 µmol photons/m 2 /s, qui provoque la fermeture des centres PSII. Quand tous les centres sont fermés, la fluorescence est maximale (Fm). Variation de la fluorescence en fonction du temps sur une feuille intacte (Cornic, 2007) : La variabilité de la fluorescence est due principalement au PSII. En effet, au niveau du PSI, le quenching photochimique (qp) est toujours maximal. La fluorescence est donc faible et ne varie pas. La raison de cette faible fluorescence est que le PSI trouve toujours un accepteur d électrons : même si NADP + n est pas libre ou que le transport cyclique est bloqué, le PSI peut transférer les électrons à l oxygène. Au niveau du PSII, la fluorescence dépend de l état redox du pool de plastoquinones et en particulier de Q A. Elle dépend également du gradient de protons. La feuille est maintenue à l obscurité 30 minutes environ avant d être éclairée par une lumière modulée (LM) de très faible intensité. La fluorescence atteint un niveau minimal Fo (les Q A sont oxydées au maximum et tous les centres PSII sont ouverts). La feuille reçoit ensuite un flash de lumière sursaturante (LSS), qui provoque la fermeture des centres PSII (Q A réduites brutalement au maximum) qui ne peuvent plus faire de photochimie. La fluorescence atteint un niveau maximal Fm. Puis Q A donne ses électrons à Q B et l émission de fluorescence diminue (oxydation de Q A ). La lumière actinique (LA < LSS) provoque la fermeture de quelques centres PSII (réduction partielle des Q A ) ainsi qu une augmentation de l émission de fluorescence jusqu à un niveau Fp puis Fs (valeur stationnaire correspondant à la réoxydation des Q A ). En effet, la photosynthèse est induite à la lumière et donc les électrons sont consommés. Lorsqu un flash de lumière sursaturante est donnée, on atteint le niveau de fluorescence Fm (fluorescence maximale à la lumière). L augmentation de la fluorescence lors du flash est proportionnelle au nombre de Q A oxydées 7

pouvant être réduites. La différence entre Fm et Fm (avec Fm > Fm ) est proportionnelle à l énergie émise sous la forme de chaleur, qui dépend du gradient de protons. Lorsque la lumière actinique est éteinte, on atteint un niveau Fo. Le niveau Fo est récupéré si la feuille est maintenue à l obscurité. Le schéma ci-dessous représente les variations de fluorescence d une feuille selon les traitements lumineux décrits précédemment. Figure 3 : Variation de la fluorescence en fonction du temps sur une feuille intacte La fluorescence sera supprimée par deux phénomènes : le quenching non-photochimique (émission d énergie sous forme de chaleur) et le quenching photochimique (lié au nombre de Q A oxydées pouvant être réduites en réalisant la photosynthèse). - le quenching photochimique qp : Il correspond à une estimation de la capacité du PSII à atténuer la fluorescence en réalisant la photochimie. Cette capacité est liée à la concentration de centres ouverts susceptibles d accepter les électrons, donc liée à l état redox de Q A. Si la photosynthèse est maximale, la fluorescence ainsi que l émission de chaleur sont minimales. On appelle cette suppression quenching photochimique. Le quenching photochimique se calcule selon la formule suivante : qp = Fq / Fv Fq correspond à la différence entre Fm (fluorescence maximale d une feuille adaptée à la lumière) et F (fluorescence émise par une feuille recevant une lumière actinique). Fv correspond à la différence entre Fm et Fo (fluorescence minimale d une feuille adaptée à la lumière). - le quenching non-photochimique qn ou NPQ : NPQ estime la capacité du PSII à supprimer la fluorescence en diminuant l énergie d excitation par perte de chaleur. Tous changements dans les mesures de NPQ indiquent un changement dans l efficacité de la dissipation thermique. En général, une augmentation de NPQ est le résultat de la mise en place de mécanismes de protection de la feuille contre des dommages pouvant être induits par une forte lumière par exemple. 8

NPQ peut être décomposé en trois paramètres : - qe (quenching énergétique) : est associé au transport de protons vers le lumen sous lumière forte et donc régule le niveau d excitation du PSII - qi (quenching par la photoinhibition) : résulte de la photoinhibition du PSII - qt (quenching associé aux états de transition) : résulte de la phosphorylation des complexes recevant la lumière associés au PSII Généralement, sur des plantes non-stressées exposées à une lumière modérée à saturante, qe est le paramètre principal. Afin de diminuer l énergie lumineuse absorbée en excès, la plante est capable de dissiper cette énergie sous forme de chaleur. Ce mécanisme met en jeu le cycle des xanthophylles, la protéine PsbS associée au PSII ainsi qu une enzyme présente dans le lumen du thylakoïde : la violaxanthine dé-époxidase (VDE) (cf Fig. 4). Une forte intensité lumineuse induit un flux électronique important entre PSII et PSI, ce qui provoque l acidification du lumen (accumulation de protons H + transportés depuis le stroma vers le lumen par le pool de PQ). Il en résulte l activation de la VDE qui se fixe à la membrane du thylakoïde et convertit la violaxanthine en zéaxanthine, induisant la protonation de PsbS (cf Fig. 4 et 5). Ceci provoque un changement conformationnel des antennes liées au PSII, la quantité de chaleur émise par le PsbS augmente, et qe augmente. Lorsque l intensité lumineuse diminue, la déprotonation de PsbS et la reconversion de la zéaxanthine en violaxanthine provoque une diminution de qe. C est ce que l on appelle le quenching non-photochimique (la photochimie n intervient pas dans cette extinction puisque la lumière sursaturante ferme tous les centres). La diminution de Fm à la lumière (Fm < Fm) est due à l augmentation de la dissipation de chaleur. Figure 4 : organisation du PSII et son rôle dans la dissipation de l énergie en excès par émission de chaleur 9

Figure 5 : cycle des xanthophylles Le quenching non-photochimique se calcule de la façon suivante : NPQ = (Fm-Fm ) / Fm. 1.1. b. Description du matériel utilisé - Arabidopsis thaliana : un écotype contrôle Col0 et deux écotypes alpins Jo et J3E - DBMIB (2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinone) et DCMU (3-(3,4- dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) : inhibiteurs du transport des électrons au niveau de la chaine photosynthétique (voir principe des inhibiteurs en page 12) - Mini-PAM (pulse amplitude modulated fluorometre) relié à une source lumineuse - Un enregistreur (LINSEIS) L70 25 11 Source lumineuse Enregistreur Mini-PAM Figure 6 : Matériel utilisé pour les mesures de fluorescence chlorophyllienne 10

1.1. c. Description du protocole expérimental Après acclimatation à l obscurité pendant 30 minutes, une feuille d Arabidopsis thaliana est placée sur la trajectoire du faisceau lumineux, associée à une bande de papier filtre imbibée d eau distillée pour éviter son desséchement. Figure 7 : Détails du dispositif La feuille est soumise à différentes intensités lumineuses successives (10, 50, 100, 250 µmol/m 2 /s), chacune des séries lumineuses étant séparée par une minute d obscurité. Un flash de lumière sursaturante est également programmé pour émettre toutes les 5minutes. Le mini-pam enregistre les variations de fluorescence émises par la feuille, retransmises ensuite à l enregistreur qui fournit un enregistrement papier de ces variations. A partir de cet enregistrement papier seront relevées les différentes valeurs nécessaires aux calculs du qp et du NPQ. La feuille subit ensuite un traitement au DBMIB (immersion dans une solution de DBMIB 25 µm et passage sous vide). Les séries lumineuses sont répétées de la même façon que précédemment. La feuille subit pour finir un traitement au DCMU (immersion dans une solution de DCMU 50 µm et passage sous vide, puis incubation 10 min (écotype Col0) ou 20 min (écotypes alpins Jo et J3E)) et les mêmes séries lumineuses sont répétées. L objectif étant de montrer l activité de la protéine PTOX dans des feuilles d A. thaliana, les différentes intensités lumineuses ainsi que les concentrations en inhibiteurs ont été choisi de façon à ne pas entrainer la destruction du PSII (lumière trop forte, concentration trop élevée en inhibiteurs). En effet, si le PSII est détruit, les flux électroniques circulant dans la chaine de transport seront inexistants, et aucune observation concernant la protéine PTOX ne pourra être faite sur les différents écotypes. Le but est de moduler l activité photosynthétique sans entrainer la destruction du PSII. 11

Principe des inhibiteurs DBMIB et DCMU : Le DBMIB et le DCMU sont des inhibiteurs qui agissent au niveau de la chaine de transport photosynthétique des électrons. Ils sont utilisés dans le même objectif : bloquer le transport des électrons du PSII vers le PSI, et par conséquent induire la réduction des quinones du PSII. Leur site d action est cependant différent : le DBMIB se fixe sur le Cytochrome b6f à la place de la plastoquinone ; le DCMU (herbicide, nom commercial : diuron) se fixe par contre directement sur le PSII à la place de Q B, ce qui induit la réduction de toutes les Q A (accumulation des électrons qui ne sont plus utilisés dans la chaine de transport). La fluorescence est alors maximale. La photosynthèse en présence de DCMU est nulle, l énergie est donc entièrement émise sous forme de chaleur et de fluorescence. L utilisation de ces deux inhibiteurs permettra d apporter des réponses d une part concernant la fonctionnalité de la protéine PTOX et d autre part sur son rôle dans le maintien du flux électronique en PSII et PSI permettant la réalisation de la photosynthèse. DCMU DBMIB Figure 8 : Chaine de transport des électrons entre PSII et PSI Localisation de la PTOX et des cibles du DBMIB et du DCMU Les différents résultats obtenus par fluorescence chlorophyllienne (qp et NPQ pour les trois écotypes et pour chaque traitement : témoin, DBMIB, DCMU) seront analysés par des tests statistiques de comparaison de moyennes (critère de test t : Student). 12

1.2. Calcul de l ETR (electron transport rate) Comme nous l avons vu précédemment, les inhibiteurs utilisés ont pour objectif de bloquer le transport des électrons au sein de la chaine de transport. Nous allons donc quantifier ce transport électronique au sein de feuilles non traitées (témoins) et de feuilles traitées au DBMIB et au DCMU. L ETR se calcule de la manière suivante : ETR = ФPSII * PFD * a * (0,5) avec : - ФPSII : mesure la proportion de lumière absorbée par la chlorophylle associée au PSII et qui sera utilisée dans la photochimie, et plus particulièrement dans la réduction de Q A (= efficacité du PSII) ; - PFD * a : lumière absorbée (µmol photon/m 2 /s) sachant que PFD (Photon Flux Density) correspond à l intensité lumineuse reçue par la feuille (10, 50, 100 et 250 µmol/m 2 /s) et que a est calculé de la manière suivante : (100% - % T - % R)/100 (avec %T : % lumière reçue par la feuille et %R : % lumière réfléchie par la feuille) ; - 0,5 : facteur tenant compte de la répartition de l énergie entre le PSII et le PSI. Mesure de ФPSII : Les résultats obtenus par fluorescence chlorophyllienne (cf chapitre 1.1. Mesure de fluorescence chlorophyllienne) sont réutilisés ici puisque ФPSII correspond au ratio Fm / Fq (paramètres décrits précédemment). Mesure de a : Les paramètres T et R s obtiennent par le biais de la spectrophotométrie. Une feuille par écotype est soumise à un rayon lumineux. La quantité de lumière transmise et réfléchie par la feuille est calculée automatiquement pour chaque longueur d onde entre 400 et 700 nm (300 valeurs par prise). Il suffit par la suite de calculer la moyenne des %T et %R entre 400 et 700 nm pour chaque écotype, puis de faire le calcul (100% - %T - %R)/100 pour obtenir les trois valeurs de a. Les résultats obtenus seront également traités par des tests statistiques de comparaison de moyennes (critère de test t : Student). 1.3. Extraction de la protéine PTOX par Western Blot L objectif est de quantifier la protéine PTOX présente dans les trois écotypes d A. thaliana, et de déterminer si des conditions de stress (faible ou forte température, forte lumière) peuvent entrainer des modifications dans la quantité de cette protéine. 13

Des feuilles d Arabidopsis thaliana (écotype Col0 et écotypes alpins Jo et J3E) ont subi au préalable différents traitements de lumière ou de température : pour chaque écotype, quatre traitements différents sont réalisés : - aucun traitement : feuilles témoins (lumière reçue : 80 µmol/m 2 /s) - exposition à une plus forte lumière (120 µmol/m 2 /s) pour Col0 uniquement - traitement à faible température (4 C, lumière reçue : 100 µmol/m 2 /s) pendant 5 jours - traitement à forte température (33 C, lumière reçue : 100 µmol/m 2 /s) pendant 4 jours Les feuilles prélevées sont immédiatement congelées dans de l azote liquide. Méthode d extraction protéique par Western Blot : Les principales étapes sont les suivantes : 1. Préparation des échantillons : les feuilles préalablement congelées sont broyées dans l azote liquide, et le broyat est suspendu dans des solutions tampon. Les protéines membranaires sont séparées des protéines solubles par centrifugations successives. 2. Electrophorèse : Les protéines migrent successivement dans un gel de concentration à 3% de polyacrylamide (0,1% SDS), puis dans un gel de séparation à 13% (0,1% SDS). Dans le champ électrique, les protéines sont donc séparées en fonction de leur masse et non en fonction de leur charge électrique. 3. Transfert sur membrane de nitrocellulose : Les protéines sont électrotransférées sur une membrane de nitrocellulose dans un appareil de transfert Biorad. 4. Immunodétection : Incubation en présence d anticorps primaires anti-ptox, puis d anticorps secondaires anti-ig de lapin. 5. Révélation sur films photographiques : Dans une chambre noire, la membrane est mise à incuber dans une solution de révélation (kit de chimioluminescence). Un film photographique est ensuite placé au niveau de la membrane, mais le contact direct est évité à l aide d un film plastique inséré entre les deux. Après un court instant, on réalise le développement du film photographique. Le détail des cinq étapes est disponible en Annexe 1. 14

II. Résultats : 2.1. Mesure de fluorescence chlorophyllienne : calculs des qp et NPQ Pour chaque écotype d A. thaliana, 4 à 6 répétitions sont effectuées. Les résultats obtenus sont traités sous le logiciel Excel. La moyenne des valeurs de qp et NPQ obtenues pour chaque intensité lumineuse (10, 50, 100, 250 µmol/m 2 /s) est calculée. 2.1. a. Quenching photochimique qp Unités relatives 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Valeurs de qp selon la lumière reçue par une feuille d'a. thaliana (écotype Col0) 10 50 100 250 Intensités lumineuses (µmol/m2/s) Feuille témoin Avec DBMIB 25µM sans incubation Avec DCMU 50µM 10 min d'incubation Graphique n 1 : écotype Col0 (6 répétitions) Unités relatives 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Valeurs de qp selon la lumière reçue par une feuille d'a. thaliana (écotype alpin Jo) 10 50 100 250 Intensités lumineuses (µmol/m2/s) Feuille témoin Avec DBMIB 25µM sans incubation Avec DCMU 50µM 20min d'incubation Graphique n 2 : écotype alpin Jo (5 répétitions) 15

Unités relatives 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Valeurs de qp selon la lumière reçue par une feuille d'a. thaliana (écotype alpin J3E) 10 50 100 250 Intensités lumineuses (µmol/m2/s) Graphique n 3 : écotype alpin J3E (4 répétitions) Feuille témoin Avec DBMIB 25µM sans incubation Avec DCMU 50µM 20min incubation On remarque que les valeurs de qp diminuent avec l intensité lumineuse reçue par la feuille, quels que soient l écotype et le traitement (témoin, DBMIB ou DCMU). On remarque également qu après traitement au DBMIB, l écotype Col0 comparé aux écotypes alpins Jo et J3E ne répond pas de la même façon. Les valeurs de qp chez Col0 paraissent beaucoup plus faibles par rapport aux valeurs du témoin, alors que chez les deux écotypes alpins, les valeurs de qp semblent être assez similaires au témoin. Concernant le DCMU, la réponse de la plante est semblable chez les trois écotypes. Le quenching photochimique est fortement inhibé dès l exposition de la feuille à une source lumineuse, et finit par être nul à la fin de l expérience. Des tests statistiques basés sur des comparaisons de moyennes sont réalisés afin d établir la significativité de telles différences entre les écotypes. Concernant l écotype Col0, les valeurs de qp après traitement au DBMIB et après traitement au DCMU sont significativement différentes au seuil de 5% des valeurs témoins, quelle que soit l intensité lumineuse à laquelle la feuille traitée est soumise (Pc < 0,05) (cf Tableaux 1 et 2 Annexe 2). Pour l écotype alpin Jo, des résultats similaires sont trouvés lors du traitement au DCMU : différence significative de valeurs moyennes de qp entre les feuilles traitées au DCMU et les feuilles témoin au seuil de 5%, quelle que soit l intensité lumineuse (Pc < 0,05) (cf Tableau 4 Annexe 2). Par contre, les valeurs moyennes de qp entre les feuilles témoin et les feuilles traitées au DBMIB pour chaque intensité lumineuse ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% (Pc > 0,05) (cf Tableau 3 Annexe 2). 16

Chez l écotype alpin J3E, malgré des résultats graphiques similaires à l écotype alpin Jo qui nous poussent à conclure de la même façon, seule les données obtenues sous faible lumière (10µmol/m 2 /s) permettent de conclure qu il n y a pas de différence significative entre la feuille témoin et la feuille traitée au DBMIB, au seuil de 5% (Pc = 0,759 > 0,05). Pour les trois autres valeurs correspondant aux intensités lumineuses suivantes, les tests statistiques réalisés indiquent une différence significative au seuil de 5% entre la feuille témoin et la feuille traitée au DBMIB (Pc < 0,05) (cf Tableau 5 Annexe 2). Concernant le traitement au DCMU, il existe une différence significative entre la feuille témoin et la feuille traitée au seuil de 5% (Pc < 0,05) (cf Tableau 6 Annexe 2). 2.1. b. Quenching non-photochimique NPQ 1,000 Valeurs du NPQ selon la lumière reçue par une feuille d'a. thaliana (écotype Col0) Unités relatives 0,800 0,600 0,400 0,200 Feuille témoin Avec DBMIB 25µM sans incubation Avec DCMU 50µM 10min d'incubation 0,000 10 50 100 250 Intensités lumineuses (µmol/m2/s) Graphique n 4 : écotype Col0 (6 répétitions) Unités relatives 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Valeurs du NPQ selon la lumière reçue par une feuille d'a. thaliana (écotype alpin Jo) 10 50 100 250 Intensités lumineuses (µmol/m2/s) Feuille témoin Avec DBMIB 25µM sans incubation Avec DCMU 50µM 20min d'incubation Graphique n 5 : écotype alpin Jo (5 répétitions) 17

Unités relatives 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Valeurs du NPQ selon la lumière reçue par une feuille d'a. thaliana (écotype alpin J3E) 10 50 100 250 Intensités lumineuses (µmol/m2/s) Graphique n 6 : écotype alpin J3E (4 répétitions) Feuille témoin Avec DBMIB 25µM sans incubation Avec DCMU 50µM 20min d'incubation Quel que soit l écotype ou le type de traitement considéré, on remarque que les valeurs de NPQ augmentent avec la quantité de lumière reçue par la feuille, avec une nette augmentation à 250 µmol/m 2 /s. Les valeurs de NPQ mesurées à 10, 50 et 100 µmol/m 2 /s sont très faibles et donc considérées comme étant négligeables. On ne s attachera donc qu aux résultats obtenus à 250 µmol/m 2 /s. Chez Col0, la différence observable entre la feuille témoin et la feuille traitée soit au DBMIB, soit au DCMU est significative au seuil de 5% (Pc = 0,038 < 0,05 et Pc = 0,002 < 0,05 respectivement). Le quenching non-photochimique est donc plus important dans une feuille non traitée aux inhibiteurs. Chez l écotype alpin Jo au contraire, il n existe aucune différence significative au seuil de 5% entre la feuille témoin et celle traitée au DBMIB (Pc = 0,97 > 0,05). Par contre, concernant le traitement au DCMU, la différence de NPQ par rapport au témoin est significative au seuil de 5% (Pc = 0,0097 < 0,05). Concernant le deuxième écotype alpin J3E, les résultats obtenus sont similaires à Jo. Aucune différence de NPQ n est observée entre la feuille témoin et la feuille traitée au DBMIB (Pc = 0,49 > 0,05). Enfin, entre la feuille témoin et la feuille traitée au DCMU, il existe une différence significative au seuil de 5% (Pc = 0,014 < 0,05). 18

2.2. Calcul de l ETR (electron transport rate) ETR (J) 35 30 25 20 15 10 5 0 Valeurs de l'etr (electron transport rate) selon la lumière reçue par une feuille d'a. thaliana (écotype Col0) 10 50 100 250 Intensités lumineuses (µmol/m2/s) Feuille témoin Avec DBMIB 25µM sans incubation Avec DCMU 50µM 10min d'incubation Graphique n 7 : écotype Col0 (6 répétitions) ETR (J) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Valeurs de l'etr (electron transport rate) selon la lumière reçue par une feuille d'a. thaliana (écotype alpin Jo) 10 50 100 250 Intensités lumineuses (µmol/m2/s) Feuille témoin Avec DBMIB 25µM sans incubation Avec DCMU 50µM 20min d'incubation Graphique n 8 : écotype alpin Jo (5 répétitions) 19

ETR (J) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Valeurs de l'etr (electron transport rate) selon la lumière reçue par une feuille d'a. thaliana (écotype alpin J3E) 10 50 100 250 Feuille témoin Avec DBMIB 25µM sans incubation Avec DCMU 50µM 20min d'incubation Intensités lumineuses (µmol/m2/s) Graphique n 9 : écotype alpin J3E (4 répétitions) Dans le cas des feuilles témoin (quel que soit l écotype), la quantité d électrons transportés augmente avec la quantité de lumière reçue par la feuille. Plus la lumière reçue est forte (et donc plus l énergie reçue est importante), plus la quantité d électrons qui transitent dans la chaine de transport entre PSII et PSI est élevée. On remarque une différence entre l écotype Col0 d une part, et les écotypes alpins Jo et J3E d autre part. La quantité d électrons transportée est similaire chez les deux écotypes alpins et elle est également plus importante par rapport à Col0. Le flux électronique est donc facilité chez les écotypes alpins en comparaison à Col0. Lors du traitement au DBMIB, la quantité d électrons transportés chez Col0 par rapport au témoin est significativement plus faible au seuil de 5% (Pc < 0,05). Au contraire, les flux électroniques entre PSII et PSI ne sont pas significativement différents du témoin chez Jo au seuil de 5% (Pc > 0,05). Concernant J3E, les résultats graphiques laissent croire à des résultats similaires à l écotype Jo. Pourtant, d après les tests statistiques réalisés, la quantité d électrons transportés entre PSII et PSI chez la feuille témoin et la feuille traitée est significativement différente au seuil de 5% (Pc < 0,05). Dans le cas du traitement au DCMU par contre, les valeurs d ETR sont très proches de 0 voire même totalement nulles chez les trois écotypes. Le transport des électrons est bloqué. Les tests statistiques réalisés montrent pour les trois écotypes une différence significative des valeurs d ETR entre la feuille témoin et la feuille traitée au seuil de 5% (Pc < 0,05). 20