Biocapteurs électrochimiques pour le dosage du glucose

Biocapteurs électrochimiques pour le dosage du glucose SIMON DELVARRE, NICOLAS WITCZAK IC2M4

SOMMAIRE Introduction... 3 1. Les biocapteurs... 4 1.1. Définition... 4 1.2. Biocapteurs ampérométriques... 5 1.2.1. Principe de l ampérométrie... 5 1.2.2. Biocapteur ampérométrique sans médiateur... 7 1.2.3. Biocapteur ampérométrique avec médiateur... 7 1.2.4. Biocapteur ampérométrique à transfert électronique direct... 8 1.3. Capteurs intégrés... 10 1.3.1. Capteur de type ISFET... 10 1.3.2. Capteur de type ENFET... 10 2. Choix des matériaux et méthodes... 12 2.1. METHODES D IMMOBILISATION DE L ENZYME... 12 2.1.1. L adsorption... 12 2.1.2. La réticulation... 13 2.1.3. Le greffage covalent... 13 2.1.4. L inclusion... 14 2.2. Choix du ligand... 15 2.2.1. Définition d une enzyme... 15 2.2.2. La Glucose-oxydase (EC 1.1.3.4)... 15 2.2.3. Les glucose-déshydrogénases... 17 2.2.4. La quinoprotéine glucose déshydrogénase (EC 1.1.5.2)... 18 2.2.5. Récapitulatif... 19 2.3. Choix de la membrane... 19 2.3.1. Les polymères... 19 2.3.2. Les nanoparticules... 21 Conclusion... 23 Bibliographie... 24 Résumé... 27 2

INTRODUCTION Le glucose est sans doute l un des composés les plus dosés dans le domaine médical. Le traitement du diabète nécessite, par exemple, une détermination régulière de la glycémie des patients. Le dosage du glucose a des applications dans bien d autres domaines, comme l agroalimentaire. De nombreuses techniques de dosage du glucose ont donc été mises au point. On utilise par exemple la polarimétrie, la spectroscopie infrarouge, la spectroscopie Raman ou la fluorescence (1). Les techniques optiques sont très performantes, mais elles nécessitent des instruments complexes et couteux. Les méthodes de dosages électrochimiques permettent, généralement, la conception de capteurs bon marché, et sont donc très répandues. Nous avons donc décidé d étudier les capteurs électrochimiques plus en détail. Notre intérêt s est porté plus particulièrement sur les biocapteurs à glucose. Depuis leur mise au point en 1962 par Clark et Lyons, ils se sont considérablement démocratisés. Actuellement, les biocapteurs à glucose représentent à eux seuls 85% du marché mondial des biocapteurs. Dans cette étude bibliographique, nous exposerons d abord le fonctionnement d un biocapteur. Nous verrons plus en détail les méthodes de transduction utilisées pour doser le glucose, notamment l ampérométrie. Cette partie sera l occasion d aborder les problématiques liées aux interférences qui peuvent perturber la réponse du capteur. Nous avons prêté une certaine importance à ce sujet, car la limite de détection du capteur dépend directement de la maitrise des interférences. La deuxième partie sera l occasion d aborder plus en détails la composition des capteurs. Nous présenterons les différents types d enzymes employées pour doser le glucose, ainsi que leur impact sur la sélectivité et la rapidité du capteur. Nous avons fait le choix d insister plus particulièrement sur la glucose-oxydase, car il s agit de l enzyme la plus couramment utilisé au sein des biocapteurs à glucose. Nous verrons, pour finir les membranes et les différentes techniques d immobilisation des enzymes. Nous détaillerons, pour chaque méthode, les avantages, les inconvénients et les précautions particulières à prendre. Le but de cette démarche est d aider le lecteur à choisir la méthode la plus appropriée en fonction de ses besoins en termes de sélectivité, de sensibilité, de rapidité et de gamme analytique. 3

1. LES BIOCAPTEURS 1.1. DEFINITION Un biocapteur peut être défini comme un dispositif permettant de détecter quantitativement la présence d une espèce chimique, appelée analyte, à l aide d un processus de reconnaissance biologique (2). Le biocapteur est composé de deux parties : le ligand et le transducteur (figure 1). Le ligand joue le rôle de biorécepteur : il signale la présence de l analyte en produisant un signal physicochimique. Le transducteur détecte et convertit le signal produit par le biorécepteur en un signal électrique amplifié et quantifiable (3). Il existe deux grandes familles de ligands : les systèmes enzymatiques et les immunoespèces (4). Ces biorécepteurs ont une spécificité de substrats particulièrement prononcée, ce qui confère aux biocapteurs une bonne sélectivité. FIGURE 1, REPRESENTATION SCHEMATIQUE DU FONCTIONNEMENT D'UN BIOCAPTEUR Les biocapteurs électrochimiques se distinguent au niveau de la transduction : celle-ci peut être soit ampérométrique, soit potentiométrique soit conductimétrique (5). De ce fait, ils reposent sur l utilisation de systèmes enzymatiques. En effet, dans le cas des immunoespèces, la transduction s effectue plutôt par l intermédiaire de phénomènes piézoélectriques ou optiques (3). En ce qui concerne les systèmes enzymatiques, la reconnaissance de l analyte a pour effet soit une modification de la concentration d une espèce, soit d une modification du potentiel, ou encore une modification de la conductivité de l échantillon (4). Ces systèmes conviennent donc pour l utilisation de méthodes de transductions électrochimiques. L enzyme est alors directement immobilisée sur la surface de l électrode. Dans le cas du dosage du glucose, les enzymes utilisées catalysent l oxydation de cette molécule. Nous détaillerons les différentes enzymes employées pour le dosage du glucose lors de la seconde partie de cette étude bibliographique. Les performances du capteur dépendent à la fois de l enzyme utilisée et des matériaux d électrode utilisés. L ampérométrie est la méthode de transduction la plus répandue, ce qui s explique par le fait que les biocapteurs ampérométriques sont plus rapides, plus sensibles et plus précis que les capteurs potentiométriques. Cependant, ils sont particulièrement sujets aux problèmes d interférences. Enfin, ces dernières années ont été marquées par le développement de nouveaux types de capteurs intégrés à l image de l ENFET dont le fonctionnement se rapproche de la potentiométrie (4). Ils sont destinés plus particulièrement à une utilisation dans l agroalimentaire. 4

1.2. BIOCAPTEURS AMPEROMETRIQUES 1.2.1. PRINCIPE DE L AMPEROMETRIE Le principe des biocapteurs ampérométriques repose sur la mesure de courants limites de diffusion d espèces électroactives (6). Les capteurs ampérométriques prennent la forme d une cellule électrochimique à trois électrodes (5). Celle-ci est constituée d une électrode de référence dont le potentiel doit être fixe, et d une électrode de travail dont le potentiel varie en fonction des conditions expérimentales. Enfin la troisième, appelée électrode auxiliaire, a pour rôle de limiter le courant circulant dans l électrode de référence. En effet, lorsque l électrode de référence est parcourue par un courant, son potentiel varie et entraine une dérive des mesures. Pour réaliser les mesures, on privilégie un montage à une électrode indicatrice. A l aide d un potentiostat, on impose une différence de potentiel constante, entre l électrode de référence et l électrode indicatrice, ce qui provoque l électrolyse de l espèce dont on souhaite connaître la concentration. Il faut appliquer une surtension suffisamment importante pour atteindre le palier limite de diffusion de l espèce en question, car celui-ci est proportionnel à la concentration de l électrolyte (première loi de Fick dans l approximation de Nerst) (5). Un étalonnage préalable permet de déterminer la concentration de l électrolyte à partir de l intensité mesurée. D ailleurs, bien qu elle soit facile à mettre en œuvre, la méthode d ampérométrie à une électrode indicatrice requiert des étalonnages réguliers. En effet, les intensités mesurées dépendent fortement de paramètres expérimentaux, comme la température, l agitation ou la surface de l électrode (7). L ampérométrie étant basée sur la mesure de courants de diffusion, les courants de migrations doivent être négligeables. La présence d un électrolyte indifférent permet de réduire les courants de migration au profit des courants de diffusion. L inconvénient majeur des capteurs ampérométriques, c est qu ils peuvent manquer de sélectivité. Bien que la réaction enzymatique soit hautement sélective, il peut en effet y avoir des interférences dues à d autres espèces électroactives dont les tensions d oxydation ou de réduction sont proches de celles de l espèce suivie par ampérométrie. Celles-ci vont être à l origine de courants parasites, perturbant la mesure (5). Prenons l exemple du dosage du glucose dans le sang par suivi ampérométrique du peroxyde d hydrogène. L oxydation de cette espèce intervient à un potentiel de 600mV par rapport à l électrode Ag/AgCl. Le sang contient bien d autres substances s oxydant à ce potentiel. On peut citer par exemple l acide ascorbique, l acide urique (interférents endogènes) ou encore le paracétamol (interférent exogène) (8). Habituellement, chez l Homme, l acide ascorbique est considéré comme le principal responsable des courants parasites (9). La maitrise des courants parasites est primordiale, car ce sont eux qui fixent la limite de détection du capteur. Prenons en exemple le capteur à glucose intégré sur une lentille de contact (8). En l absence d interférents, la limite de détection est de 0,01mM. Lorsque l on ajoute un mélange composé d acide ascorbique, d acide urique et de lactate à 10mM, la limite de détection grimpe à 30mM. 5

Plusieurs solutions ont été envisagées pour résoudre ce problème. On recourt à une membrane sélective afin d éviter les interactions entre les électrodes et les interférents. On utilise par exemple une membrane en acétate de cellulose ou en Nafion (10). Une membrane en Nafion permet de réduire jusqu à 50% les interférences dues à l acide ascorbique, de 65% celles dues à l acide urique (11). A la vue de ces valeurs, on remarque qu une telle membrane présente une efficacité limitée, surtout si les espèces interférentes sont présentes à des concentrations similaires à celles de l espèce dosée (8). Pour cette raison, différentes générations de biocapteurs ampérométriques ont été mises au point. Il existe trois générations de biocapteurs à glucose : les biocapteurs sans médiateur, ceux avec médiateurs et ceux à transfert électronique direct (figure 2). Ces deux dernières permettent de réduire les interférences travaillant à un potentiel de mesure faible. Ces capteurs se distinguent sur le mode de transfert de l électron impliqué dans l oxydation du glucose vers l électrode (Figure 2). Dans le premier cas, le dioxygène assure la connexion entre l enzyme et l électrode. Avec la seconde génération de biocapteur à glucose, c est un couple redox médiateur qui joue ce rôle. Enfin, dans le cas des capteurs de troisième génération, l enzyme et l électrode s échangent les électrons directement. Glucose Gluconolactone Oxydation Enzyme (FAD, NAD(P), PQQ) Réduction H2O2 O2 H2O Transfert Direct e- Réduction Médiateur Oxydation Capteur de 1 ère génération Capteur de 3 ème génération Capteur de 2 ème génération FIGURE 2, REPRESENTATION SCHEMATIQUE DES CAPTEURS DE PREMIERE, DEUXIEME ET TROISIEME GENERATION 6

1.2.2. BIOCAPTEUR AMPEROMETRIQUE SANS MEDIATEUR La première génération de biocapteur ampérométrique a été imaginée par Leland Clark en 1956 (12). Dans ce type de système, on électrolyse directement une espèce impliquée dans la réaction catalysée par l enzyme, par exemple le dioxygène ou le peroxyde d hydrogène. Ces capteurs ont donc l avantage de ne pas nécessiter l ajout d un réactif supplémentaire pour fonctionner, mais en contrepartie, la mesure s effectue à un potentiel de travail élevé. Ces capteurs sont donc faciles à mettre en œuvre et ils sont donc beaucoup utilisés. Mais, ils sont très affectés par les problèmes d interférences évoqués précédemment. Ils ne conviennent donc que dans le cas des mesures où les quantités de substances interférentes sont négligeables. 1.2.3. BIOCAPTEUR AMPEROMETRIQUE AVEC MEDIATEUR Les biocapteurs de deuxième génération ont été mis au point en 1984 (13). Ils sont constitués d un transducteur qui utilise une espèce oxydante appelé médiateur pour suivre la catalyse de l analyte. Le plus souvent, le médiateur réagit directement avec la forme réduite de l enzyme, mais dans certaines réalisations, le médiateur réagit avec un produit de la catalyse (14). Le médiateur peut réagir soit directement avec l enzyme, soit avec un produit de la catalyse comme le peroxyde d hydrogène. Voici les équations des réactions mises en jeux au sein d un biocapteur de seconde génération : Substrat + E OX Produit + E RED E RED + MED OX E OX + MED RED Avec E OX et E RED les formes oxydée et réduite de l enzyme, et MED OX et MED RED les formes oxydée et réduite du médiateur. Par ampérométrie, on suit l oxydation du médiateur : MED RED MED OX + ne - Le médiateur est immobilisé conjointement avec l enzyme afin de permettre une réutilisation du capteur. Le suivi ampérométrique du médiateur permet de le renouveler (5). Parmi les différentes méthodes d immobilisation, citons par exemple l adsorption sur la surface de l électrode, l encapsulation dans un film polymère, ou encore l immobilisation covalente. Nous reviendrons plus en détail sur les différentes techniques d immobilisation dans la deuxième partie de cette étude bibliographique. L intérêt des médiateurs est qu ils permettent d abaisser le potentiel de travail, ce qui diminue l influence des espèces interférentes trouvées habituellement dans les milieux biologiques. Le médiateur doit présenter plusieurs caractéristiques. Il doit donner lieu à des transferts d électrons hétérogènes et homogènes rapides et bien définis. Son oxydation doit s effectuer à potentiel suffisamment faible par rapport aux potentiels des substances interférentes. Les formes oxydées et réduites doivent être stables en solution. 7

Parmi les médiateurs employés au sein des biocapteurs à glucose, le ferrocène et ses dérivés (polyvinylferrocène, diméthylferrocène ), sont très largement utilisés (15). Ils permettent de travailler avec un potentiel aux alentours de +160mV par rapport à l électrode Ag/AgCl, valeur bien plus faible que les 600mV requis pour suivre le peroxyde d hydrogène. L inconvénient du ferrocène est sa toxicité. Dans le domaine médical pour les analyses, le ferricyanure de potassium est préféré car bien moins toxique. Evidemment, les médiateurs ne conviennent pas à une utilisation in vivo, du fait du risque de relargage dans l organisme. Dans le milieu médical, ils sont uniquement utilisés pour des tests in vitro (16). La table 1 indique les médiateurs utilisés par les fabricants de lecteurs de glycémie. Fabricants Lecteur Enzyme Médiateur Abbot-Medisense Precision Glucose-oxydase Ferrocène Abbot-Medisense Free style Glucose-déshydrogénase FAD Osmium Bayer Contour Glucose-déshydrogénase FAD Ferricyanure LifeScan Onetouch Glucose-oxydase Ferricyanure Roche-Diagnostics Accu-Check PQQ-Glucose-déshydrogénase Ferricyanure TABLE 1 : DIFFERENTS LECTEURS DE GLYCEMIE (TEST IN VITRO) Bien d autres médiateurs existent, on citera par exemple le tétrathiafulvalène, l anthraquinone, l osmium, le dichlorophenolindophénol, ou encore le tétracyanoquinodiméthane (9). Le diméthylferrocène et le tétracyanoquinodiméthane permettent notamment de concevoir des capteurs dont la réponse est rapide. On trouvera les différents potentiels de ces médiateurs dans la table 2. Médiateurs Potentiel du pallier de diffusion par rapport à Ag/AgCl Diméthylferrocène +160 mv Anthraquinone +400 mv Tétrathiafulvalène +175 mv Dichlorophenolindophénol +450 mv Tétracyanoquinodiméthane +200 mv TABLE 2 : PRINCIPAUX MEDIATEURS ETUDIES DANS LA CHERCHE SUR LES BIOCAPTEURS A GLUCOSE. Dans le sang humain, la concentration de l acide ascorbique est typiquement de 0,2mM et celle du glucose de 4mM. Dans ces conditions, à un potentiel de +200mV, la réponse de l acide ascorbique représente 70% de celle du glucose (9). Il est donc nécessaire d utiliser une membrane sélective en supplément si l on veut avoir une mesure fiable. 1.2.4. BIOCAPTEUR AMPEROMETRIQUE A TRANSFERT ELECTRONIQUE DIRECT Dans les biocapteurs de troisième génération, le transfert d électrons s effectue directement entre l enzyme et l électrode (17). La détection ampérométrique s effectue au potentiel de l enzyme. Dans le cas de la glucose-oxydase, le potentiel de travail est de -0,5V par rapport à Ag/Ag/Cl (18). Ces capteurs sont les candidats idéaux pour une utilisation in vivo, car ils permettent de réduire considérablement les interférences lors de la détection ampérométrique et ils ne font pas appel à des substances toxiques (19). Les premières réalisations de biocapteur à glucose de troisième génération, étaient peu performantes, car le greffage de la glucose-oxydase directement sur la surface de l électrode provoquait une modification de la conformation de l enzyme. De ce fait, la sélectivité de ces capteurs était mauvaise (20). 8

Récemment, les chercheurs ont obtenu des résultats très prometteurs en utilisant des nanoparticules métalliques qui servent de relais électroniques entre l enzyme et l électrode (figure 3). La surface de l électrode est fonctionnalisée à l aide de nanoparticule sur lesquelles on greffe l enzyme (21). Des études spectroscopiques menées sur la glucose-oxydase ont montré que cette technique permet de conserver intact l enzyme (19). FIGURE 3, ELECTRODE MODIFIEE AVEC DES NANOPARTICULES D'OR POUR LA DETECTION DU GLUCOSE Des capteurs utilisant des nanoparticules de platine (PtNPs-CS) permettent d atteindre une limite de détection de 0,4µM par ampérométrie (19), et cela même en présence d interférents en solution. Afin de se rendre compte de la spécificité de ces capteurs, nous avons reporté sur la table 3 les constantes de Michaelis apparentes de différents biocapteurs à nanoparticules. Dans le cas des constantes de Michaelis apparentes, plus la constante est faible et plus l électrode est spécifique visà-vis d un substrat. Au-dessous de 10, la sélectivité est très bonne (confère partie 2.2) Nanoparticules Domaine de linéarité (mmol L 1) Constante de Michaelis Fe3O4/GOx/CS 0.006 2.2 0.61 SBA-15/GOx/HRP 0.003 34 0.27 SWCNTs/Au/Pd/GOx 0.01 50 1.3 ZnO/PVP/GOx 0.25 19 2.19 Pt-CNTs/GOx 0.16 11.5 2.6 f-tio2-pt/cs/gox 0.00125 3 0.25 Pt-CNTs-ACS/GOx 0.001 26 6.18 TABLE 3 : CARACTERISTIQUES DE DIFFERENTS CAPTEURS UTILISANT DES NANOPARTICULES 9

1.3. CAPTEURS INTEGRES 1.3.1. CAPTEUR DE TYPE ISFET Le capteur ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor) est issu du MOSFET (Metal Oxide Semiconductor Field Effect Transistor) qui est l élément le plus important des circuits intégrés. Ils mesurent le ph d une solution (6). C est Bergveld qui, en 1970, a montré la sensibilité aux ions H + d un MOSFET sans grille métallique, lorsque l isolant silice est directement en contact avec la solution. L électrode de grille est remplacée par une combinaison d une membrane sélective d ions (ISE) dans une solution analytique et d une électrode de référence. Voici un Schéma montrant le principe d'un capteur ISFET : FIGURE 4, SCHEMA D'UN ISFET La tension de seuil VT est une fonction des caractéristiques chimiques de la solution et on a : VT=VT0+ψ0 VT0 ne dépend que des caractéristiques du composant ISFET et ψ0 est la différence de potentiel entre la membrane sensible et la solution électrolytique. Etant donné l équilibre qui existe entre l ion à doser en solution et sa forme chimique dans la membrane sensible, ψ0 est fonction de l activité de l ion à doser. Dans la méthode de mesure la plus utilisée, le courant de drain I ds est maintenu constant et la tension VG est asservie; la variation de la tension VG est directement égale à celle du potentiel ψ0 (22). Les avantages de ces capteurs sont : la robustesse, le faible coût (ils peuvent être jetables, ce qui a un intérêt pour le domaine biomédical) et le faible volume d analyse (de l ordre du millilitre). 1.3.2. CAPTEUR DE TYPE ENFET Le terme ENFET (Enzyme Field Effect Transistor) a été proposé par Janata et Moss en 1976. L'ENFET est semblable à l'isfet à la différence près que sur la membrane sensible aux ions, on immobilise des enzymes (6). Ce sont généralement des ISFET sensibles aux ions H+ qui sont utilisés, associés avec des enzymes comme par exemple la glucose-oxydase. 10

Son principe est analogue à celui des électrodes spécifiques enzymatiques: la réaction enzymatique décompose le substrat à doser en une espèce facilement détectable par le transducteur (ISFET) tel que le proton. La membrane contenant l'enzyme est déposée à la surface de la couche sensible de I'ISFET ph. Quand l'enzyme est en contact du substrat à doser, la réaction enzymatique provoque une consommation ou une production de protons qui génère un changement de ph dans la membrane enzymatique. Cette variation de ph est détectée par la couche sensible. Plusieurs espèces peuvent être détectées par ce type de capteur comme le glucose, l'urée, les pesticides, mais aucun n'est commercialisé. Ces capteurs miniatures permettent de détecter des concentrations variant de 10 à 100 μmol.l-1. Voici un schéma montrant le fonctionnement d'un ENFET : FIGURE 5, SCHEMA D'UN ENFET 11

2. CHOIX DES MATERIAUX ET METHODES 2.1. METHODES D IMMOBILISATION DE L ENZYME L immobilisation des enzymes, au contact du transducteur ou placées dans une position optimale vis-à-vis du transducteur est nécessaire à une bonne détection du signal biochimique issu du bio récepteur. Les enzymes peuvent être immobilisées par des méthodes chimiques et/ou physiques. Les qualités demandées à la membrane enzymatique sont nombreuses : stabilité: la capacité à conserver l activité de l enzyme pendant un temps nécessaire pendant les mesures. sélectivité: l aptitude de l enzyme à reconnaître un seul analyte défini. reproductibilité: l aptitude de l enzyme à retrouver l activité initiale après des mesures. sensibilité: la capacité à détecter une concentration faible de l analyte accessibilité de l espère de reconnaissance, la capacité de l analyte de passer facilement à travers la couche sensible vers l enzyme. Nous allons voir quelles sont les principales méthodes utilisées pour immobiliser l'enzyme. 2.1.1. L ADSORPTION L adsorption repose sur la capacité de certains corps minéraux ou organiques à fixer une molécule donnée à leur surface (Figure 6). Elle est due à des interactions de type ionique, hydrophobe ou encore des liaisons hydrogène entre l enzyme et la surface du transducteur, par l intermédiaire d un matériau actif. Les matériaux actifs peuvent être des résines échangeuses d ions anionique ou cationique, du charbon de bois actif, des gels de silice, de l argile, de l oxyde de l aluminium, du verre poreux ou des céramiques. Cette technique permet une immobilisation simple et non dénaturante de l enzyme. Elle présente plusieurs avantages. C est une méthode très simple à mettre en œuvre nécessitant seulement de mettre en contact l enzyme et le support dans des conditions de ph, température et de force ionique données. De plus elle est facilement réversible, économique et ne requiert aucun réactif chimique pouvant dénaturer l enzyme. Cependant, elle présente un inconvénient majeur puisque, du fait des interactions faibles liant l enzyme au support, ces systèmes sont peu stables, l enzyme se désorbant au cours du temps. La stabilité et la durée de vie des biocapteurs sont donc diminuées (17). FIGURE 6, ADSORPTION D'ENZYMES SUR UN SUPPORT 12

2.1.2. LA RETICULATION La réticulation repose sur l utilisation d agents dit réticulants qui vont permettre de lier les enzymes entre elles par des liaisons chimiques. Il existe deux méthodes de réticulation, soit les enzymes sont reliées entre elles par des agents réticulant de façon directe, soit en plus de l agent réticulant une protéine inerte peut être utilisée afin de faciliter ou améliorer la réticulation, on parle alors de co-réticulation (Figure 7) (4). L utilisation de cette protéine permet, par une meilleure répartition des masses des différentes protéines, une meilleure maîtrise de l activité enzymatique sans altérer les propriétés mécaniques des membranes obtenues. Cependant, à cause de la réaction chimique, une perte d activité enzymatique de la membrane co-réticulée peut être observée pendant les mesures. Cette méthode d immobilisation présente l avantage d être assez simple à mettre en œuvre et de plus de par les liaisons chimiques, elle offre une bonne stabilité au système. Néanmoins les propriétés physiques du système sont modifiées, leur donnant des propriétés mécaniques médiocres. FIGURE 7, RETICULATION ET CO-RETICULATION DES ENZYMES 2.1.3. LE GREFFAGE COVALENT Le principe de cette méthode d immobilisation est de faire réagir un groupement fonctionnel libre de l enzyme avec un groupement fonctionnel du réactif (Figure 8). En général, les groupements fonctionnels du réactif sont des fonctions carboxyliques (COOH), hydroxyles (OH) ou encore amines (NH2). Ces groupements sont très peu réactifs et doivent être activés afin de pouvoir réagir avec les groupements de l enzyme, n intervenant pas dans la catalyse enzymatique, dans des conditions dites douces afin de ne pas dénaturer la biomolécule. Cette méthode d immobilisation présente principalement comme avantage de fixer l enzyme de façon permanente et augmente sa stabilité, lui conférant une durée de vie plus importante (4). Cependant, les réactifs indispensables au greffage risquent de dénaturer l enzyme et donc de provoquer une perte d activité. FIGURE 8, GREFFAGE COVALENT D'UN ENZYME 13

2.1.4. L INCLUSION La méthode d inclusion consiste à incorporer l enzyme dans un gel insoluble (Figure 9). Ce gel peut être constitué d une matrice organique ou inorganique (argiles). Dans les deux cas, l enzyme est mélangée au matériau, puis déposée à la surface d un biocapteur sous certaines conditions. L enzyme se trouve piégée mécaniquement à l intérieur des matrices. La maille de la matrice assure de manière purement physique la rétention de l enzyme tout en permettant la diffusion du substrat jusqu au site actif de l enzyme grâce à une porosité du gel suffisante. Toutefois cette technique est parfois limitée par la taille des pores du gel qui favorise le relargage des enzymes de faible poids moléculaire. L activité de l enzyme est dépendante du micro-environnement local de l enzyme immobilisé (ph, force ionique, diffusion moléculaire, etc.). Les principaux avantages de cette méthode d immobilisation sont qu elle est économique, facile à mettre en œuvre et peut s appliquer à un nombre élevé d enzymes (17). Cependant, un problème est que l enzyme peut diffuser à travers la matrice au cours de l utilisation et de plus elle n est applicable que pour des substrats de petite taille. En outre, les groupements actifs de l enzyme peuvent réagir avec la matrice et donc peuvent entraîner une diminution de l activité catalytique de celle-ci. FIGURE 9, INCLUSION D'ENZYMES SUR UN SUPPORT 14

2.2. CHOIX DU LIGAND 2.2.1. DEFINITION D UNE ENZYME Les enzymes sont des protéines, c est-à-dire qu elles sont constituées d un enchainement d acides aminés reliés par des liaisons peptidiques. Elles sont naturellement synthétisées par les êtres vivants à partir de leurs génomes, par les mécanismes de transcription et de traduction. Le gène codant l enzyme, est d abord transcrit en un brin d ARN, qui sera ensuite traduit par un ribosome pour former la protéine correspondante. Les enzymes ont une structure tertiaire, voire quaternaire pour les plus grandes. Les enzymes sont des catalyseurs, c est-à-dire qu elles permettent d accélérer la vitesse d une réaction chimique sans intervenir dans le bilan globale de la réaction. L enzyme favorise la réaction entre elle et son substrat, et empêche les réactions secondaires de se produire. La réaction enzymatique peut être modélisée de la manière suivante : K 1 K 2 Enzyme + Substrat Complexe ES Enzyme + Produit K- 1 Les catalyseurs enzymatiques sont préférés aux catalyseurs métalliques car leur sélectivité est meilleure. C est la structure de l enzyme qui est à l origine de sa spécificité de substrat car elle permet la formation du site actif (22). Le substrat se lie avec l enzyme au niveau du site actif, qui est responsable de la catalyse. Certaines enzymes ne peuvent pas effectuer la catalyse seule. Elles ont besoin d une espèce supplémentaire appelée cofacteur. L activité catalytique d une enzyme dépend du ph et de la température. Il existe un ph et une température optimaux pour lesquels l activité est maximale. Les biocapteurs à glucose reposent sur l utilisation d une enzyme qui catalyse l oxydation du glucose ; il s agit donc exclusivement d oxydoréductases (4). Le choix de l enzyme conditionnera la sélectivité du capteur et sa rapidité. Deux caractéristiques permettent de juger l efficacité d une enzyme. La première est son affinité vis-à-vis d un substrat, qui est d autant plus grande que la constante de Michaelis K m de l enzyme est petite. La seconde est la constante catalytique de l enzyme K cat qui représente le nombre de catalyse effectué par l enzyme en une seconde. 2.2.2. LA GLUCOSE-OXYDASE (EC 1.1.3.4) Historiquement, le tout premier biocapteur à glucose, développé par Clark et Lyons en 1962, avait recours à la glucose-oxydase (GOD). Aujourd hui, cette enzyme reste encore la plus utilisée pour le dosage du glucose. Ce succès s explique par la supériorité de la glucose-oxydase en termes de sélectivité et de stabilité (23). Naturellement, l activité catalytique de l enzyme est maximale pour un ph compris entre 5,5 et 6,0, et une température comprise entre 20 et 35 C (24). Au-delà, l activité de l enzyme décroit. L immobilisation de la glucose-oxydase permet de travailler à des températures plus élevées, de l ordre de 55 C. 15

La glucose-oxydase catalyse l oxydation du β-d-glucose par le dioxygène en δ-dgluconolactone selon la réaction (25): β-d-glucose + O 2 δ-d-gluconolactone + H 2O 2 En présence d eau, le δ-d-gluconolactone se transforme en acide gluconique. C est la coenzyme flavine adénine dinucléotide (FAD) liée à l enzyme qui est impliquée dans la réaction d oxydoréduction (5). La figure 10 permet de mieux se rendre compte de l action du cofacteur FAD de l enzyme. FIGURE 10, REPRESENTATION SCHEMATIQUE DE LA CATALYSE DU GLUCOSE Il existe différentes variétés de glucose-oxydase. Pour le dosage du glucose, la glucose-oxydase produite par le champignon Aspergillus niger est particulièrement appréciée, car celle-ci présente une spécificité de substrat très prononcée vis-à-vis du β-d-glucose (26). La constante de Michaelis vaut 7,1mM pour la glucose-oxydase extraite d Aspergillus niger, alors que cette constante est comprise entre 9,6 et 110 mm pour les autres champignons (24). C est donc le meilleur choix d enzyme si l on doit travailler sur des échantillons contenant de nombreux sucres. La table 4, qui regroupe les taux d oxydation relatifs des sucres avec lesquels la glucose-oxydase a le plus d affinité, met justement en évidence cette spécificité de substrat. Sucres Taux d oxydation relatif (%) Β-D-Glucose 100 2-Deoxy-D-Glucose 25 6-Deoxy-6-fluoro-D-Glucose 3 6-Méthyl-D-Glucose 1.85 4,6-Diméthyl-D-Glucose 1.22 D-Mannose 0.98 D-Xylose 0.98 Α-D-Glucose 0.64 Tétralose 0.28 Maltose 0.19 Galactose 0.14 Mélibiose 0.11 TABLE 4 : TAUX D OXYDATION RELATIF DE DIFFERENTS SUCRES PAR L ACTION DE LA GLUCOSE-OXYDASE EXTRAITE D ASPERGILLUS NIGER. LES TAUX SONT NORMALISES PAR RAPPORT AU TAUX D OXYDATION DU Β-D-GLUCOSE On remarquera que la glucose-oxydase catalyse principalement la transformation du β-d- Glucose. Or le glucose existe sous plusieurs formes en solution, les deux principales étant le α-d- Glucose et le β-d-glucose. A 20 C, la forme α représente 35% du glucose en solution, et 65% pour la forme β. Néanmoins, la consommation en β-d-glucose lors de la catalyse déplace l équilibre existant entre les différentes formes du glucose vers le β-d-glucose (23), ce qui permet in fine l étude de tout le glucose présent en solution. 16

La réaction s accompagne de la libération de peroxyde d hydrogène. Ce dernier étant un inhibiteur de la glucose-oxydase, il faudra veiller à l éliminer (27). On pourra par exemple utiliser la catalase afin de provoquer la dismutation du peroxyde d hydrogène. Plusieurs solutions peuvent être envisagées pour la transduction (28). L apparition d acide gluconique étant proportionnelle à la quantité de glucose, on peut mesurer les variations de ph avec un ENFET ou une électrode à ph pour déduire la concentration en glucose. Néanmoins, il faut souligner que les fluides biologiques sont des milieux tamponnés, et donc que les variations de ph en leur sein sont faibles. En conséquence, cette méthode n est viable que pour des usages en agroalimentaire. Une deuxième possibilité est de suivre la consommation en oxygène, en utilisant l électrode de Clark. Le biocapteur de Clark et Lyons recourrait à cette méthode. L électrode à oxygène a l avantage d être très spécifique, mais sa sensibilité est faible (3). Enfin, une autre possibilité est le suivi par ampérométrie du peroxyde d hydrogène. Cette méthode permet de mettre au point des capteurs très sensibles. Nous avons vu cependant, que les biocapteurs basés sur ce principe sont particulièrement sujets aux problèmes d interférences, l oxydation du peroxyde d hydrogène ayant lieu pour un potentiel de +600mV par rapport à Ag/AgCl. Dans ce cas, on utilisera un médiateur ou une membrane sélective. L utilisation de la glucose-oxydase présente deux inconvénients. Le premier vient du fait que, naturellement, la glucose-oxydase catalyse une réaction faisant intervenir l oxygène. Or, dans les milieux biologiques, la concentration en dioxygène dissoute est bien inférieure à la concentration en glucose. En plus de cette limitation stœchiométrique, le capteur est sensible aux fluctuations de la pression partielle de dioxygène (17). Il est toutefois possible de surmonter ce problème en utilisant un médiateur en excès, comme le diméthylferrocène, qui réagira avec la forme réduite de l enzyme. Dans ce cas, la transduction s effectue par l intermédiaire du suivi ampérométrique du médiateur. D autre part sa constante catalytique valant 640 s -1, la glucose-oxydase présente une faible activité catalytique (24). 2.2.3. LES GLUCOSE-DESHYDROGENASES Les glucose-déshydrogénases représentent une large variété d enzymes. Contrairement à la glucose-oxydase, elles nécessitent l ajout d un cofacteur en solution pour assurer la catalyse du glucose. On distingue d un côté, les déshydrogénases à Flavine adénine dinucléotide, et de l autre, celles à Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). Les réactions sont les suivantes : β-d-glucose + NAD + δ-d-gluconolactone + NADH + H + (EC 1.1.1.47) β-d-glucose + FAD δ-d-gluconolactone + FADH 2 (EC 1.1.99.10) Si l obligation de fournir un cofacteur à l enzyme est un inconvénient indéniable, notons que la réaction catalysée ne fait pas intervenir le dioxygène. Les capteurs basés sur les déshydrogénases sont donc plus stables que ceux utilisant la glucose-oxydase, car étant insensibles aux variations de pressions en dioxygène (26). Les déshydrogénases ont aussi une activité catalytique meilleure que la glucose-oxydase avec un K cat variant entre 1000 s -1 et 10000 s -1. Elles permettent la mise au point de capteurs dont la réponse est rapide. Les lecteurs de glycémie, où l on veut que le temps de mesure soit le plus court possible, recourent principalement aux glucose-déshydrogénases (table 1). 17

Les déshydrogénases à FAD catalysent spécifiquement l oxydation du glucose. En revanche, certaines déshydrogénases à NAD catalysent aussi l oxydation du xylose (29). L oxydation des cofacteurs s effectue à des potentiels très élevés (5). Il est donc nécessaire d utiliser un médiateur afin de régénérer le cofacteur et de s affranchir des problèmes d interférences (30). Les différents médiateurs ont déjà été exposés lors de la première partie de cette étude bibliographique. 2.2.4. LA QUINOPROTEINE GLUCOSE DESHYDROGENASE (EC 1.1.5.2) Il existe un dernier type d enzyme utilisé au sein des biocapteurs à glucose : les quinoprotéines glucose-déshydrogénases. Leur cofacteur est la pyrroloquinoléine quinone (PQQ). Contrairement aux déshydrogénases vues précédemment, le cofacteur est déjà lié à l enzyme, comme dans le cas des groupements FAD de la glucose-oxydase. La quinoprotéine permet donc de simplifier la fabrication des capteurs, puisque qu il n est pas nécessaire de fournir de cofacteur (31). Elle ne fait pas non plus appel au dioxygène pour oxyder le glucose. La réaction catalysée est : D-Glucose + Quinone D-Gluconolactone + Hydroquinone Tout comme les autres déshydrogénases, elle présente une activité catalytique élevée, sa constante catalytique valant 3450 s -1, et permet donc la mise au point de détecteur à réponse rapide. A la vue de ces caractéristiques, elle semble être le choix d enzyme idéal. Cependant, la quinoprotéine glucose déshydrogénase n est pas spécifique au glucose et catalyse l oxydation d autres sucres. Elle est particulièrement sensible au maltose, au xylose, au galactose et au lactose, avec qui l enzyme a plus d affinité qu avec le glucose. La constante de Michaelis est de 26,8 mm pour le glucose, 6,8mM pour le galactose et de 14,3 pour le xylose et la lactose, ce qui démontre bien le manque de sélectivité de l enzyme (32). La U.S. Food and Drugs Administration a averti en 2009 sur les risques liés à l utilisation de cette quinoprotéine au sein de détecteur de glycémie (33). La présence d autres sucres entrainant une surévaluation de la concentration en glucose, certains patients diabétiques s étaient administrés une dose d insuline trop forte. La FDA a d ailleurs enregistré 13 décès causés par l utilisation de la quinoprotéine glucose déshydrogénase. Par mutations des bactéries produisant l enzyme, des recherches ont permis d améliorer la spécificité de l enzyme (32). Mais la méconnaissance de la synthèse de la quinoprotéine glucose déshydrogénase limite les avancées dans ce domaine (26). En définitive, on utilisera cette enzyme dans le cas d échantillon où les sucres autres que le glucose sont présents en quantités négligeables. 18

2.2.5. RECAPITULATIF Enzyme Transduction Avantages inconvénients Suivi ampérométrique de Glucose oxydase (Aspergillus niger) Glucose déshydrogénase à FAD Glucose oxydase à NAD quinoprotéine glucose déshydrogénase H2O2 ou de O2 Variation de ph Suivi électrochimique du médiateur Suivi électrochimique du médiateur Suivi électrochimique du médiateur Spécifique au glucose Activité catalytique élevée Spécifique au glucose Activité catalytique élevée Activité catalytique élevée TABLE 5 : AVANTAGES ET INCONVENIENTS DES DIFFERENTES ENZYMES UTILISEES POUR DOSER LE GLUCOSE Sensible aux variations de concentration en dioxygène Faible activité catalytique Cofacteur à fournir Réaction avec d autres sucres Cofacteur à fournir Réaction avec d autres sucres 2.3. CHOIX DE LA MEMBRANE Le choix de la membrane est important, car c est de lui que dépendra la sensibilité du capteur. Plus la membrane assurera une bonne rétention de l enzyme et plus la sensibilité de l électrode sera élevée. 2.3.1. LES POLYMERES La plupart des biocapteurs commercialisés recourent le plus souvent à un polymère déposé sur une électrode de platine (34). Ce succès s explique par le fait qu il est facile de fabriquer une telle membrane. La technique utilisée pour déposer le film de polymère sur la surface de l électrode est l électro-polymérisation. Cette technique est rapide, et permet de contrôler avec précision l épaisseur de la membrane en jouant avec le potentiel et la durée de l électro-polymérisation (22). Elle permet aussi la fabrication de structures multicouches qui permettent d immobiliser conjointement l enzyme et son cofacteur avec un éventuel médiateur. Il existe un très grand nombre de polymères différents utilisés pour la conception d électrode à glucose. Les plus fréquemment utilisés sont présentés sur la figure 11. Ils peuvent être répartis en deux catégories : d un côté les polymères non conducteurs, et de l autre les polymères conducteurs (leur nom commence par «poly», confère figure 11). Pour assurer l immobilisation de l enzyme sur la surface de l électrode, les polymères conducteurs sont préférés aux polymères non-conducteurs. En effet, un polymère conducteur facilitant le transfert électronique, il permet la mise au point d électrodes plus rapides et plus sensibles (22).La sensibilité est de l ordre du microampère. 19

FIGURE 11, LES POLYMERES UTILISEES DANS L'ELABORATION D'ELECTRODES ENZYMATIQUES Les polymères non conducteurs sont principalement utilisés en tant que membranes sélectives, afin d empêcher d éventuelles substances interférentes d entrer en contact avec l électrode. Nous avons déjà abordé ce point lors de la partie dédiée aux interférences. Dans l exemple de la figure 12, la membrane de polycarbonate assure l immobilisation de l enzyme tandis que la membrane en acétate de cellulose isole l électrode de platine des interférents. FIGURE 12, SCHEMA D'UN BIOCAPTEUR COMMERCIALISE PAR YELLOW SPRINGS INSTRUMENTS Polymère Gamme analytique Limite de détection Poly-tyramine 0.1-0.15 mm 0.03 mm Polyvinyle 50 µm - 5 mm 30 µm Cyclo-dextrine 50 µm 13.5 mm 10 µm Poly-diaminobenzène 2 µm 2 mm 0.5 µm TABLE 6 : COMPARAISON DE DIFFERENTS POLYMERES 20

Les procédés sol-gel permettent l élaboration de membranes assurant un meilleur maintien de l enzyme (35). Ils permettent donc la mise au point de capteurs présentant une meilleure stabilité, une meilleur sensibilité et une réponse plus rapide. La sensibilité du biocapteur utilisant un sol-gel est typiquement de quelques dizaines de microampères (34), mais peut atteindre 260 µa.cm -2.mM -1 dans certain cas (36). 2.3.2. LES NANOPARTICULES L utilisation de nanoparticules pour la fabrication d électrodes à glucose a fait l objet d intenses recherches depuis dix ans (19). En effet, celle-ci ont rendu possible la mise au point de capteur à transfert électronique direct. Pour rappel, ces capteurs ont l avantage de ne pas être soumis aux problèmes d interférences liés à la présence d espèces électroactives en solution. Elles permettent donc de mettre au point des capteurs très sélectifs (confère partie 1.2.4.) Les nanoparticules sont de natures métalliques. Parmi les plus couramment utilisées, il y a les nanoparticules d or (AuNPs), les nanoparticules de platine (PtNPs), les nanoparticules de palladium (PdNPs), d oxyde de fer (Fe 3O 4). Les nanoparticules servent à fonctionnaliser la surface d une électrode, par exemple une électrode de platine, ou une électrode de carbone. Elles peuvent être implantées directement sur la surface de l électrode, ou bien être déposées sur un sol-gel pour améliorer leur greffage (37). Notons que les matériaux à base de carbone sont devenus les matériaux de prédilection pour la conception d électrodes à nanoparticules. Le carbone est un très bon conducteur électrique d une part, mais il permet aussi la miniaturisation des électrodes (19) : les nanotubes de carbone (MWCNT et SWCNT) ont une très grande surface et occupent peu d espace (figure 13). Les enzymes sont ensuite greffées sur les nanoparticules. FIGURE 13, VUE D'UN MWCNT Le greffage sur les nanoparticules permet d immobiliser durablement les enzymes. Cela permet de mettre au point des capteurs ayant une durée de vie de plusieurs mois (19). 21

Composition de l électrode Stabilité Graphene et nanoparticles d or(aunps) 2 semaines Nanoparticule d oxyde de fer 8 semaines Nanoparticules de palladium 35 jours Nanoparticule de platine 1 mois ZrO2 1 mois Oxyde de titane 7 jours TABLE 7 : DUREE DE VIE DE DIFFERENTS CAPTEURS A NANOPARTICULES L immobilisation ne dénature pas non plus l enzyme, ce qui permet aux électrodes d être très sensibles. La table 8 regroupe les valeurs de sensibilité de différents capteurs utilisant des électrodes modifiées avec des nanoparticules (18). Composition de l électrode Sensibilité Domaine de linéarité (µa mm -1 cm -2 ) AuNPs 47.2 0.001mM 5mM PtPd-MWCNTs 112 0.062mM 14mM Fe3O4 58.9 0.001mM 30mM TiO2 9.90 Jusqu à 1.5 mm ZnO 70.2 0.25 mm 19mM TABLE 8 : SENSIBILITE DE DIFFERENTS CAPTEURS A NANOPARTICULES 22

CONCLUSION Les recherches relatives aux biocapteurs à glucose ampérométriques sont nombreuses, ce qui indique une innovation constante dans ce domaine. Le nombre important d enzymes commercialement disponibles a contribué au développement des biocapteurs enzymatiques. La fabrication de biocapteurs enzymatiques présente un intérêt pour de futures applications, notamment médicales. En effet, outre la simplicité de fabrication et la grande sensibilité de la détection ampérométrique, les biocapteurs permettent de délivrer une information en temps réel. La capacité de détecter des changements rapides de concentration de glucose dans les fluides biologiques permet l'élaboration de systèmes miniaturisés qui sont soit fixés dans le corps du patient, soit comme dispositifs implantables pour le suivi en continu de la concentration in vivo. Chaque type de biocapteur comporte des points forts et des points faibles. Le choix du biocapteur se fera surtout en fonction du type d'application visée. Lors de la mise au point d un biocapteur, le choix de la membrane et celui du matériau de électrode sont primordiaux. En effet, la sensibilité, la limite de détection, la rapidité et la durée de vie du capteur dépendront du choix des matériaux. Cependant la principale problématique est le manque de stabilité durable. L'exploitation des films polymères comme support enzymatique pour la fabrication de biocapteurs ampérométriques a atteint un développement considérable. L'incorporation d'un film électro-polymérisé permet au biocapteur de surmonter des problèmes liés aux interférences et de réduire la taille des biocapteurs. Le choix de l enzyme conditionnera la sélectivité et la rapidité du capteur. 23

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RESUME L ampérométrie est la méthode électrochimique de transduction la plus répandue, ce qui s explique par le fait que les biocapteurs ampérométriques sont plus rapides, plus sensibles et plus précis que les capteurs potentiométriques. Cependant, ils sont particulièrement sujets aux problèmes d interférences. Les espèces interférentes sont présentes à des concentrations similaires à celles de l espèce dosée. Pour cette raison, différentes générations de biocapteurs ampérométriques ont été mises au point : les biocapteurs sans médiateur, ceux avec médiateurs et ceux à transfert électronique direct. Ces derniers assurent une grande sélectivité et sensibilité sur la glucose-oxydase. Les capteurs intégrés de type ENFET utilisent des électrodes sensibles à la variation du ph. Ils sont pratiques et faciles à mettre en place mais n'admettent pas une grande sensibilité. Ensuite, nous avons vu qu'il existait plusieurs méthodes d'immobilisation de l'enzyme qui ont pour but d'assurer la meilleure stabilité, sélectivité, reproductibilité, sensibilité. Chaque méthode admet ses avantages et ses inconvénients. Néanmoins c'est l'adsorption qui est le plus souvent utilisée pour sa facilité de mise en œuvre et pour le fait qu'elle ne dénature pas l'enzyme. La glucose-oxydase est l enzyme la plus fréquemment utilisée pour doser le glucose car elle ne nécessite pas de cofacteur et est très sélective au glucose. Les polymères conducteurs sont associés aux procédés gel-sol pour présenter une meilleure stabilité, une meilleure sensibilité et une réponse plus rapide. Cependant, la récente utilisation des nanoparticules a permis de mettre au point des capteurs encore plus sélectifs, sensibles et qui admettent une plus longue durée de vie. ABSTRACT The amperometric electrochemical method is the most widespread transduction, which is explained by the fact that the amperometric biosensors are faster, more sensitive and accurate than the potentiometric sensors. However, they are particularly prone to interference problems. Interfering species are present at concentrations similar to the blood glucose concentration. For this reason, different generations of amperometric biosensors have been developed: biosensors without a mediator, mediators and those with direct electronic transfer. The latter provides a high selectivity and sensitivity on the glucose oxidase. The ENFET type integrated sensors use sensitive electrodes to change in ph. They are practical and easy to implement but do not allow high sensitivity. In the second part of this study, we saw that there were several methods of immobilization of the enzyme which aim to ensure the best stability, selectivity, reproducibility, sensitivity. Each method takes advantages and disadvantages. Nevertheless it is the adsorption is most often used for its ease of implementation and the fact that it does not denature the enzyme. The use of glucose oxidase is most frequently used for the glucose assay because it does not necessitate any cofactor and is highly selective to glucose. Conductive polymers are associated with the sol-gel process to introduce more stability, better sensitivity and faster response. However, the recent use of nanoparticles led to the development of more selective sensors, sensitive and which admit a longer lifetime... Mots-clés : Biocapteur à glucose, ampérométrie, médiateur électronique, capteurs intégrés, enzyme, techniques d immobilisation, glucose-oxydase, polymère, Nanoparticule métallique. 27