LA CROISSANCE DES MICROORGANISMES Deux modèles de croissance : - Discontinue ou batch : système fermé sans apport de milieu frais. - Continue : système ouvert avec apport de milieu frais. I/Mesure de la croissance. Croissance : nombre de bactéries dans une colonie nombre de division cellulaire. 1) Le titre de la culture. Titre de culture : nombre de cellules par ml de solution. a) La titration (nombre de cellules viables) : Méthode très idéale entre 25 et 250 colonies par boite : - Très sensible. - Facile. - Technicité et équipements simples. - Compte que les bactéries vivantes. Le problème est le temps d incubation. Mode d action : Prélèvement dans le titre puis effectuation de dilutions stérilisées en série de 10 en 10 puis prélèvement de 100µL de chaque dilution et dépôts sur différentes boites de pétri. La solution la plus diluée présente un nombre faible de bactéries sur la boite qui est exploitable. Exemple : 25 bactéries obtenues dans 100µL dilués à 10-7. On cherche le nombre de bactéries par ml : 25 b/100µl 25.10 8 b/ml. b) La chambre de Petroff-Hausser (comptage direct) : Permet le comptage des bactéries au microscope par division en petites chambres identiques. Avantages : - Comptage direct rapide. - Facile à faire. Inconvénients : - Bactéries vivantes et mortes présentes (sauf utilisation de colorant). - Ne compte pas les petites bactéries. c) Compteur de Coulter : Comptage électronique qui dénombre les bactéries par rapport au flux, méthode très efficace mais très onéreuse. 1
2) Mesure de la masse cellulaire ou densité microbienne. a) La masse : A la base d une solution centrifugée on récupère le culot de bactérie puis on le pèse : - Poids frais direct. - Poids sec après chauffage du culot. Se fait surtout pour les mycètes et cultures de plus de 100mL. b) Le dosage turbidimétrie (densité optique) : La mesure de l intensité lumineuse non diffractée donne le nombre de cellules dans la solution. Fiable pour une DO entre 0.1 et 1 : - Facile d utilisation. - Rapide. - Demande un spectrophotomètre. La DO au cours du temps donne la croissance de la colonie. 3) Mesure de l allongement du mycélium (champignon et bactéries filamenteuses). 4) Mesure indirecte (dosage des métabolites). II/La croissance en culture discontinue ou batch. 1) Calcul de croissance bactérienne. La croissance par divisions binaires : - Duplication de l ADN. - Séparation de l ADN. - Formation paroi. N représente le nombre de génération. G (h) =temps de génération, représente le temps pour lequel dans les conditions optimales de poussée exponentielle de croissance une bactérie en donne deux. µ (h -1 ) =vitesse de croissance. G = t/n µ = n/t Xt = 2 µt X 0 X peut représenter le nombre de cellules par ml ou la biomasse en mg par L ou la DO. 2) Les différentes phases de croissance. 2
Phase de latence µ=0 : - Cellules âgées (métaboliquement inactives). - Synthèse de molécules. - Proviennent d un milieu différent. Phase d accélération µ. Phases d adaptation. Phase exponentielle de croissance µ=µmax : - Phase de calcul de µ et g. Phase de décélération µ : - La croissance continue. - La vitesse diminue fortement. Phase stationnaire µ=0 : - Croissance arrêtée. - Milieu fermé Nutriment limitant. Modification ionique (b lactique ph7 ph3). - Déchets toxiques de métabolisme bloquent la croissance. Phase de déclin : - Phase de lyse cellulaire. - Rarement observé sauf chez streptocoque qui implose à cause de la sécrétion d une enzyme. 3) La biomasse. Elle est atteinte en fonction de la concentration initiative en substrat limitant dans le milieu de culture. Elle représente toute la quantité de cellule présente. Expérience réalisée en milieu minimum : - Tous les constituants sont en excès. - Un seul constituant doit être limitant. - Assurance du maintien de l équilibre ionique. Permet de sélectionner un constituant dont dépend la biomasse. Nous donne le fait que plus la concentration du facteur limitant est grande et plus la croissance sera élevée. Donne une droite : biomasse = f(glucose) - Ordonnées : croissance totale en mg/l. - Abscisses : concentration en glucose en g/l. On obtient y = M / S (masse de microorganisme formé /masse de substrat consommé) avec 0<y<1. 3
Rend compte de la biomasse à partir : - D un nutriment limitant pour la croissance. - Comparaison de préférences des sucres par la bactérie. Phénomène de diauxie : utilisation séquentielle du sucre, le premier sucre est un répresseur catabolique du deuxième et donc le sucre préférentiel. III/La croissance en culture continue. Culture qui permet de maintenir la population dans une phase précise et donc permet l obtention d une grande quantité des produits de la bactérie. Deux types de systèmes : - Chemostat : un élément nutritif limitant. Vitesse de dillution : D=f/V (vitesse d écoulement / volume de la chambre). D grand grande concentration en nutriments. - Turbidostrat : pas de nutriment limitant. Réglage automatique de D pour maintenant une densité cellulaire prédéterminée. IV/L influence de l environnement sur la croissance. 1) La pression osmotique. Il existe des bactéries qui sont osmophiles et halophiles (2,8 M < [NaCl] <6,2 M), parfois stricte (sel nécessaire). Ce sont principalement des archées qui peuvent croitre dans de fortes concentrations de sel et subir des pressions osmotiques de grande force. Le choc hyperosmotique entraine la sortie d eau et la cellule entre en plasmolyse, comme réponse primaire, la bactérie fait entrer du K + qui a pour conséquences l entrée d eau ainsi que de composés moléculaires rétablissant ainsi la turgescence de la bactérie. 2) Le ph. Plusieurs catégories de µo dépendant du ph : - Acidophiles : 1 à 5,5 (mycètes et algues). - Neutrophiles: 5, 5 à 8 (bactéries). 4
- Basophiles: 8, 5 à 11, 5. - Alcalophiles extremes : ph > 10. 3) La température. Si la température est trop basse, les transports sont grandement ralentis, et à forte température, les protéines sont dénaturées Différentes appellations en fonctions de la température optimale : - Psychrophiles : 0 20 C Opt = 15 C. - Mésophiles : 20 45 C Opt = 30 C. - Thermophiles : 45 110 C Opt = 65 C. Extrême : 70 90 C. Hyperthermophile : 90 110 C. 4) L oxygène. Cinq types respiratoires : - Aérobie obligatoire : l oxygène est l accepteur final de la chaine d électrons. - Microaérophile : la [O 2 ] est entre 2 et 10%. - Anaérobie aérotolérant : croissance bactérienne sur toutes [O 2 ]. - Anaérobie stricte : l oxygène est létal. - Anaérobie facultative : préfère la présence d O 2 mais non obligatoire. Certaines formes de l'oxygène sont toxiques : O 2 (oxygène singulet) et O 2 (superoxyde). Les bactéries faisant ces composés doivent pouvoir s'auto-détoxifier : Superoxyde dismutase : 2O 2 - + 4H + H 2 O 2 + O 2 Le peroxyde d'hydrogène n'étant pas aussi toxique, il faut malgré tout (dans certains cas) : Catalase : 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 Contrôle de la bactérie par la peroxydase : H 2 O 2 + 2H + 2H 2 O. 5
5) La pression. On distingue : - Microorganismes Barotolérants : de 400 à 500atm. - Microorganismes Barophiles : jusqu à 600 à 1100atm. 6) Les radiations. 3 à 5 million de rad contre 100 maximums par l'homme. 6