Molecular diagnosis of HFE mutations in routine laboratories Results of a survey from reference laboratories in France

Ann Biol Clin 2012 ; 70 (3) : 305-13 Recommandations pour la (bonne) pratique du diagnostic moléculaire de l hémochromatose liée au gène HFE * Synthèse d une enquête réalisée auprès du réseau national des laboratoires pratiquant le diagnostic de maladies rares du métabolisme du fer Molecular diagnosis of HFE mutations in routine laboratories Results of a survey from reference laboratories in France doi:10.1684/abc.2012.0704 Anne-Marie Jouanolle 1 Victoria Gérolami 2 Cécile Ged 3 Bernard Grandchamp 4 Gérald Le Gac 5 Serge Pissard 6 Jacques Rochette 7 Patricia Aguilar-Martinez 8 1 Laboratoire de génétique moléculaire, Centre de référence des surcharges en fer rares d origine génétique, CHU Pontchaillou, Rennes <anne-marie.jouanolle@chu-rennes.fr> 2 Laboratoire de biologie moléculaire, CHU Conception, Marseille 3 Laboratoire de biochimie, CHU Bordeaux, Hôpital Pellegrin, Inserm U1035 Université V Segalen Bordeaux 2, Bordeaux 4 Service de génétique APHP, Université Denis Diderot, CHU Xavier Bichat, Paris 5 Laboratoire de génétique moléculaire et d histocompatibilité, CHRU de Brest - Hôpital Morvan, Université de Bretagne Occidentale, Inserm U613, Brest 6 Laboratoire de biochimie et de génétique, GH Henri Mondor-Chenevier, UPEC (Université Paris Est Créteil), Créteil 7 Laboratoire de génétique moléculaire, Inserm U 925, CHU d Amiens 8 Laboratoire d hématologie, Hôpital Saint Eloi, CHU de Montpellier Article reçu le 6 décembre 2011, accepté le 16 février 2012 Tirés à part : A.-M. Jouanolle Résumé. L hémochromatose liée au gène HFE (hémochromatose HFE) ou hémochromatose de type 1, est une maladie génétique à transmission autosomique récessive caractérisée par une surcharge en fer progressive de l organisme se manifestant habituellement chez l adulte. Le gène HFE, localisé sur le bras court du chromosome 6 (6p21.3), code une protéine qui joue un rôle essentiel dans le métabolisme du fer en modulant la production d hepcidine par le foie. La mutation p.cys282tyr, à l état homozygote, explique environ 80 % des cas d hémochromatose en France. Le test génétique est l examen clé pour confirmer le diagnostic d hémochromatose HFE. Une enquête sur les pratiques de huit laboratoires référents français a été réalisée. Les principaux enseignements de cette enquête sont les suivants : 1) la mutation p.cys282tyr doit être recherchée en première intention pour établir le diagnostic d hémochromatose HFE, suivant ainsi les recommandations de la Haute autorité de santé (HAS) qui, en 2005, a considéré que seule l homozygotie pour la mutation p.cys282tyr associée, au minimum, à une élévation du coefficient de saturation de la transferrine permettait d établir le diagnostic d hémochromatose HFE ; 2) en association avec la mutation p.cys282tyr (génotypes hétérozygotes composites), les variants p.his63asp et p.ser65cys peuvent contribuer à la survenue d une surcharge en fer modérée ; 3) la réalisation d une enquête familiale après la détection d un sujet homozygote pour la mutation p.cys282tyr devrait être systématique. Mots clés : hémochromatose, HFE, diagnostic, mutation, fer Abstract. HFE-related hemochromatosis (HFE hemochromatosis) or type 1 hemochromatosis is an autosomal recessive disease characterized by progressive iron overload usually expressed in adulthood. The HFE gene, located on the short arm of chromosome 6 (6p21.3), encodes a protein that plays a crucial Origine du travail. Travail à l initiative du groupe de veille fer et hémochromatose de la SFBC, sous-groupe point de vue du biologiste : biologie moléculaire (Anne-Marie Jouanolle, Victoria Gerolami, Patricia Aguilar Martinez (coordonnateur)). Les autres membres du groupe de veille SFBC sont par ordre alphabétique : Carole Beaumont, Muriel Bost, Joël Corberand, Gérard Dine, Isabelle Fajardy, Véronique David, Henri Michel, Daniel Seifer, Jérôme Pfeffer, Martine Ropert- Bouchet, Victor Sieso, Catherine Vallat, Jean-Pierre Vinel. Pour citer cet article : Jouanolle AM, Gérolami V, Ged C, Grandchamp B, Le Gac G, Pissard S, Rochette J, Aguilar-Martinez P. Recommandations pour la (bonne) pratique du diagnostic moléculaire de l hémochromatose liée au gène HFE *. Ann Biol Clin 2012 ; 70(3) : 305-13 doi:10.1684/abc.2012.0704 305

role in iron metabolism by modulating hepcidin synthesis in the liver. Homozygosity for the p.cys282tyr mutation accounts for nearly 80% of cases of hemochromatosis in France. Genetic testing is the key investigation to confirm the diagnosis of HFE hemochromatosis. A survey on routine practices was carried out among the eight reference laboratories of the French national network on genetic iron disorders. The main findings from this survey are as follows: 1) the p.cys282tyr mutation must be searched for as an initial step to establish the diagnosis of HFE hemochromatosis. This is in agreement with the recommendations of the French Health Authority (HAS) published in 2005. In these recommendations, homozygosity for the p.cys282tyr mutation with at least elevated transferrin saturation, is considered the only genotype that confirms of the diagnosis of HFE hemochromatosis; 2) in combination with the p.cys282tyr mutation (compound heterozygous genotypes), the p.ser65cys and the p.his63asp variants may contribute to the occurrence of mild iron overload; 3) family screening is mandatory following the detection of homozygous individuals for the p.cys282tyr mutation. Key words: hemochromatosis, HFE, diagnosis, mutation, iron En 1935, Sheldon formulait l hypothèse que l hémochromatose, décrite par Trousseau en 1865, était un trouble inné du métabolisme du fer. En 1975, Simon et al. démontraient l existence d une association entre le gène de l hémochromatose et le locus HLA-A sur le bras court du chromosome 6, ainsi que le mode de transmission autosomique récessif de la maladie [1, 2]. Il fallut attendre 1996 pour que Feder et son équipe identifient le gène responsable de l hémochromatose [3]. Le clonage du gène HFE et la mise en évidence d une mutation principale, la substitution d une cystéine par une tyrosine en position 282 de la protéine HFE, permettait enfin la mise en place d un test génétique qui allait contribuer à faciliter le diagnostic de la maladie. Cette mutation, connue sous le nom de C282Y [1], doit être actuellement dénommée p.cys282tyr selon la nomenclature de l HGVS (Human genome variation society ; http://www.hgvs.org). A l état homozygote (deux allèles mutés) la mutation p.cys282tyr explique près de 80 % des cas d hémochromatose en France. Le gène HFE code une protéine qui joue un rôle essentiel dans le métabolisme du fer en modulant la production, par le foie, d une hormone régulatrice, l hepcidine [4]. A l état homozygote, la mutation p.cys282tyr est responsable d une diminution de la synthèse hépatique d hepcidine à l origine de la surcharge en fer par un double mécanisme : augmentation de l absorption duodénale du fer et augmentation de la libération du fer macrophagique dans le courant sanguin. La surcharge en fer primaire, induite par cette mutation du gène HFE, est appelée hémochromatose HFE ou hémochromatose de type 1. Pour affirmer ou infirmer le diagnostic d hémochromatose HFE le test génétique est l examen clé. Il doit être prescrit devant une élévation du coefficient de saturation de la transferrine (CS-Tf) plasmatique, perturbation biologique la plus précoce dans la maladie. Cette élévation s accompagne secondairement d une élévation de la ferritinémie qui signe la constitution de la surcharge martiale tissulaire. Nous avons réalisé une enquête auprès des membres du réseau national des laboratoires référents impliqués dans le diagnostic par biologie moléculaire de maladies rares du métabolisme du fer afin d établir un bilan des pratiques, de faciliter l interprétation des résultats, voire de guider les démarches pour un recours aux laboratoires spécialisés. Méthode Un questionnaire a été adressé, en décembre 2010, aux membres du réseau national des laboratoires référents impliqués dans le diagnostic des surcharges génétiques en fer, rares. Le questionnaire (Annexe 1) comportait les rubriques suivantes : le matériel biologique et les méthodes de diagnostic utilisés, les mutations recherchées et leur intérêt dans la démarche diagnostique, les commentaires associés aux génotypes identifiés, la mise en place et le suivi du conseil génétique, les problèmes réglementaires liés à la réalisation de tests génétiques et la participation aux contrôles de qualité. Les 8 membres du réseau national ont répondu à l enquête. Résultats Les méthodes diagnostiques Types de prélèvements et méthodes d extraction de l ADN Les membres du réseau privilégient le sang total prélevé sur EDTA. Les méthodes d extraction sont le plus souvent 306 Ann Biol Clin, vol. 70, n 3, mai-juin 2012

Bonnes pratiques pour la réalisation du test génétique HFE manuelles, certains laboratoires sont dotés d automates d extraction. Dans tous les cas, la méthode dite de référence, au phénol-chloroforme, est devenue marginale, elle a laissé place aux méthodes qui évitent l utilisation de solvants toxiques. Certains laboratoires s affranchissent de l extraction et effectuent le génotypage à partir de prélèvements sanguins ou buccaux déposés sur support cellulosique (Whatman 10531018, Whatman FTA) [5]. Recensement des méthodes de génotypage Le choix des méthodes dépend le plus souvent de l équipement du laboratoire. Les méthodes peuvent être propres à chaque laboratoire mais dans tous les cas, elles font l objet d un contrôle de qualité intra et inter- laboratoires. Principales techniques «maison» utilisées Les techniques utilisées par les huit laboratoires qui composent le «réseau Fer» sont présentées dans le tableau 1. L amplification-restriction (ou «PCR-RFLP») [6] est nettement majoritaire puisqu elle est utilisée dans 5 sites Coffrets commerciaux Les seuls coffrets commerciaux évalués par les laboratoires interrogés sont les kits Hybridation reverse sur bandelettes (Viennalab). Deux coffrets ont été testés par 4 laboratoires référents : i) l un permettant l identification de la mutation p.cys282tyr, et des variants p.his63asp (H63D) et p.ser65cys (S65C) du gène HFE, (hemochromatosis strip assay B) ; ii) l autre permettant l identification de 12 mutations du gène HFE, 4 du gène TFR2 et2du gène SLC40A1 codant la ferroportine (hemochromatosis strip assay A). De l avis des membres du réseau, le second coffret n est pas adapté au diagnostic de routine de l hémochromatose HFE. Il recherche un nombre limité de mutations privées (c est-à-dire observées chez un seul malade ou dans une seule famille), du gène HFE et d autres gènes impliqués dans les surcharges en fer. La pertinence du choix de ces mutations est discutable. Les contrôles de qualité Dans le cas des tests génétiques, l intérêt des contrôles de qualité est double, évaluer la méthode utilisée par le laboratoire mais également évaluer la qualité des commentaires proposés en fonction du génotype identifié. Des contrôles de qualité nationaux et européens sont accessibles sur inscription. Contrôle de qualité national L Afssaps (Agence française de sécurité sanitaire des produits de santé) propose depuis 2005 un contrôle de qualité national annuel pour le diagnostic génétique de l hémochromatose HFE. Deux prélèvements d ADN sont proposés aux participants avec des informations clinico-biologiques. La ou les mutation(s) à rechercher est (sont) précisée(s) (mutation p.cys282tyr seule ou mutations p.cys282tyr et Tableau 1. Principales méthodes de génotypage HFE. Méthodes de génotypage utilisées dans les laboratoires du réseau national des laboratoires référents impliqués dans le diagnostic des surcharges génétiques en fer rares pour la mise en évidence des mutations p.cys282tyr et p.his63asp du gène HFE. Méthode - Principe Amplification-restriction (PCR-RFLP) Une mutation peut créer ou abolir un site de reconnaissance pour une enzyme de restriction Hybridation spécifique d allèle La présence d un mésappariement sur un fragment de taille réduite abaisse significativement la température de fusion Amplification réfractaire (ARMS) La Taq polymérase ne peut pas allonger un oligonucléotide dont la dernière base en 3 n est pas parfaitement hybridée Fusion haute résolution (HRM) Utilisation d un fluorochrome intercalant qui sature complètement les structures double brins et permet de distinguer des variations d une seule base selon le profil de dénaturation Principales étapes Amplification de la séquence cible Digestion des amplimères par l enzyme de restriction dont le site est modifié par la variation de séquence Séparation électrophorétique des produits de digestion. Le nombre et la taille des fragments visualisés dépend de la variation de séquence et permet de discriminer les homozygotes et hétérozygotes Amplification de la séquence cible Hybridation des amplimères avec des sondes marquées. Une sonde est spécifique de l allèle muté, l autre de l allèle normal. Un hétérozygote donne un signal avec les deux sondes Amplification de la séquence cible en utilisant deux couples d oligonucléotides. L un permettant l amplification de la séquence normale, l autre l amplification de la séquence mutée Identification des allèles soit par détection de fluorescence soit après migration électrophorétique [7] Amplication de la séquence cible en présence du fluorochrome Dénaturation des amplimères sur une montée en température très progressive Identification des allèles par analyses des courbes de fusion Ann Biol Clin, vol. 70, n 3, mai-juin 2012 307

p.his63asp). Les commentaires doivent être rédigés en tenant compte du contexte clinique. Le bilan est adressé aux participants avec un commentaire type adapté au résultat et au contexte clinique. Contrôle de qualité européen Mis en place par l EMQN (European molecular genetics quality network), ce contrôle de qualité représente un certain coût (frais d inscription : 55 D et frais de participation au contrôle HFE : 290 D). Trois échantillons d ADN sont transmis avec les cas cliniques. Les mutations p.cys282tyr et p.his63asp doivent être recherchées. Ce contrôle de qualité présente un inconvénient pour les francophones car les résultats et commentaires doivent être rédigés en anglais. Quand l analyse du gène HFE doit-elle être envisagée? En 2005, la HAS a recommandé de pratiquer le test génétique HFE devant une élévation du CS-Tf > 45 %. Les membres du réseau constatent que la demande d analyse du gène HFE est souvent prescrite devant une augmentation de la ferritine sérique et n est pas toujours accompagnée de la détermination du coefficient de saturation de la transferrine. Deux rappels sont essentiels : plus de 90 % des hyperferritinémies peuvent être expliquées par des causes secondaires (acquises), aux premiers rangs desquelles : le syndrome inflammatoire, la lyse cellulaire, la consommation excessive d alcool et le syndrome métabolique [8]. Le diagnostic de ces formes secondaires d hyperferritinémie repose sur des éléments simples, pour l essentiel d ordre biologique [9] ; l élévation du CS-Tf étant le meilleur paramètre d orientation diagnostique de l hémochromatose HFE, aucun test génétique ne devrait être demandé quand le CS-Tf est normal en l absence de tout syndrome inflammatoire. En effet, un syndrome inflammatoire peut masquer l élévation du CS-Tf, il est donc important d associer un dosage de CRP à sa détermination [10]. L élévation du CS-Tf n est cependant pas spécifique de l hémochromatose HFE, elle peut s observer en cas de cytolyse, d insuffisance hépato-cellulaire ou de surcharge d origine transfusionnelle. La concentration d hémoglobine, le dosage des transaminases, ainsi que le taux de prothrombine, permettent d éliminer ces causes d élévation du CS-Tf. Quelles mutations rechercher? La mutation p.cys282tyr (C282Y) La mutation p.cys282tyr est la principale mutation en cause dans l hémochromatose HFE. L homozygotie p.cys282tyr (p.[cys282tyr];[cys282tyr] selon la nomenclature HGVS du 17/08/2011) explique, en France, près de 80 % des cas d hémochromatose HFE. La fréquence de l homozygotie est élevée dans les populations d origine caucasienne (jusqu à 1 individu sur 260 dans certaines populations). La pénétrance clinique de ce génotype est faible et pourrait n atteindre que 1 % chez les femmes et 28 % chez les hommes, ce qui suggère l existence de cofacteurs, génétiques ou acquis, susceptibles de moduler son expression [11-15]. Depuis mai 2007, la recherche de la mutation p.cys282tyr est cotée B180 à la nomenclature des actes de biologie médicale (JO décision du 24 janvier 2007). Les variants p.his63asp (H63D) et p.ser65cys (S65C) Deux variants fréquents, p.his63asp et p.ser65cys, ont été identifiés sur le gène HFE. La fréquence allélique du variant p.his63asp est assez élevée dans les populations caucasiennes (environ 15 %), elle n est que de 0,5 % pour p.ser65cys. La présence de ces variants à l état hétérozygote ou homozygote n a pas de traduction pathologique. Il est actuellement admis, par la plupart des auteurs, que le génotype d hétérozygotie composite p.[cys282tyr]; [His63Asp] peut conduire à une surcharge en fer modérée, qui restera sans conséquence clinique en l absence de facteurs de co-morbidité, génétiques ou acquis [8, 16, 17]. Mura et al. [18] ont décrit des formes modérées de surcharge en fer associées au génotype composite p.[cys282tyr];[ser65cys]. La présence de facteurs de co-morbidité associés expliquerait les formes plus sévères [19, 20]. Nous rappelons cependant que seule l homozygotie p.cys282tyr associée à une élévation du CS-Tf permet de porter le diagnostic d hémochromatose HFE. La présence de génotypes d hétérozygotie composite peut conduire à des interprétations erronées et le recours aux laboratoires spécialisés est parfois nécessaire. Commentaire en fonction du génotype HFE Homozygotie p.cys282tyr, génotype p.[cys282tyr];[cys282tyr] Chez un patient présentant des signes biologiques et/ou cliniques de surcharge en fer, l homozygotie pour la mutation p.cys282tyr permet d affirmer le diagnostic d hémochromatose HFE. Le patient doit bénéficier d une prise en charge conformément aux recommandations de la HAS 2005 [21]. L hémochromatose étant une maladie à transmission autosomique récessive, un dépistage familial doit être proposé aux apparentés du premier degré. Hétérozygotie p.cys282tyr, génotype p.[cys282tyr];[=] Les hétérozygotes p.cys282tyr (porteurs d un seul allèle muté) ne développent pas de surcharge en fer en l absence 308 Ann Biol Clin, vol. 70, n 3, mai-juin 2012

Bonnes pratiques pour la réalisation du test génétique HFE de facteurs de risque acquis associés (maladie hépatique, alcool, etc.). La «simple» hétérozygotie p.cys282tyr ne permet donc pas de poser le diagnostic d hémochromatose HFE. Cependant, une enquête familiale est recommandée aux apparentés du premier degré afin d identifier d éventuels homozygotes p.cys282tyr. Autres génotypes Les autres génotypes ne permettent pas de poser le diagnostic d hémochromatose HFE selon les critères de la HAS. En l absence d étiologie secondaire évidente, il est indispensable d adresser ces patients à une consultation spécialisée afin que soit envisagée une analyse génétique complémentaire (recherche de mutations rares sur le gène HFE ou sur les autres gènes responsables de surcharge en fer) (tableau 2). En pratique Chez un patient qui présente un bilan martial évocateur d hémochromatose, mais qui n est pas homozygote pour la mutation p.cys282tyr, l interprétation du test génétique HFE doit intégrer des données cliniques et biologiques complémentaires afin d évaluer les facteurs de co-morbidité. Quand plusieurs bilans biologiques ont été réalisés dans de bonnes conditions, que les causes fréquentes de surcharge en fer acquise ont été éliminées (apport excessif de fer, lyse cellulaire, syndrome dysmétabolique, alcool, syndrome inflammatoire aigu ou chronique), que la surcharge hépatique en fer a été confirmée (IRM, biopsie, quantification rétrospective après saignées), le patient doit être orienté vers une consultation spécialisée car une analyse génétique plus exhaustive peut être envisagée. Depuis juillet 2007, des consultations spécialisées sont accessibles pour les pathologies rares du métabolisme du fer au sein du centre de référence clinique et des huit centres de compétences régionaux (www.centre-referencefer-rennes.org). L étude génétique exhaustive, réalisée dans les laboratoires spécialisés du réseau, inclut la recherche de mutation(s) rare(s) du gène HFE [17, 22] et/ou l analyse d autres gènes Tableau 2. Surcharges en fer héréditaires primitives non liées au gène HFE. Forme Transmission Gène Protéine Autosomique HJV Hémojuvéline Juvéniles récessive HAMP Hepcidine Juvénile ou adulte Adulte Autosomique récessive Autosomique dominante TFR2 Récepteur 2 de la transferrine SLC40A1 Ferroportine impliqués dans la survenue de surcharges en fer non-hfe [23]. En effet, d autres formes de surcharge en fer non liées au gène HFE sont répertoriées (tableau 2). Problèmes réglementaires Seuls les praticiens agréés pour la réalisation de tests génétiques visant à la détermination des caractéristiques génétiques d un individu, exerçant dans des structures agréées, peuvent réaliser les tests HFE suivant la réglementation en vigueur (décret 2008-321, article R.1131-6). Cet agrément est attribué pour 5 ans par l Agence de la biomédecine. Attestation de consultation, consentement Le décret n 2008-321 du 4 avril 2008 a redéfini les obligations réglementaires en matière de prescription et de réalisation des examens des caractéristiques génétiques d un individu à des fins médicales. Il stipule notamment que le médecin consulté délivre une attestation certifiant qu il a apporté à la personne concernée les informations définies à l article R. 1131-4 et qu il en a recueilli le consentement dans les conditions prévues au même article. Cette attestation est remise au praticien agréé réalisant l examen mentionné et le double est versé au dossier médical de la personne concernée (figure 1). Le praticien agréé doit donc s assurer que l attestation de consultation, stipulant que le consentement du patient a été recueilli, est jointe au prélèvement. Si ce n est pas le cas, une copie du consentement signé par le patient, sur lequel figure la pathologie concernée, doit accompagner le prélèvement. A qui adresser le résultat? Selon l article R1131-19 du 4 avril 2008, le compte rendu des analyses «est commenté par le praticien agréé». C est le médecin prescripteur qui communique les résultats de l examen des caractéristiques génétiques à la personne concernée, ou à son représentant légal, dans le cadre d une consultation médicale individuelle. Le conseil génétique Le conseil génétique doit être proposé aux apparentés de premier degré, à savoir les frères et sœurs, les ascendants (père et mère), les descendants (fils et filles) s ils sont majeurs. C est en principe le patient qui doit informer ses apparentés de leur risque génétique ; il y est largement incité dans le cadre des nouvelles lois de bioéthique. Le conseil génétique comporte la réalisation du test HFE et du bilan martial sérique (CS-Tf et ferritine). Pour les enfants mineurs, le test génétique sera réalisé uniquement en cas d élévation des marqueurs sériques du bilan martial. En revanche, en l absence d anomalie du bilan martial, le test HFE ne doit pas être proposé chez les enfants mineurs. Ann Biol Clin, vol. 70, n 3, mai-juin 2012 309

CONSENTEMENT POUR EXAMEN DES CARACTERISTIQUES GENETIQUES A DES FINS DIAGNOSTIQUES DANS LE CADRE D UNE ANOMALIE DU METABOLISME DU FER Coordonnées du médecin Médecin (nom, prénom) Signature Adresse N téléphone Coordonnées du patient Patient (nom, prénom) Date naissance Date du consentement Madame, Monsieur, Un prélèvement de votre sang est nécessaire dans le cadre du diagnostic* / du suivi * de votre trouble du métabolisme du fer. Sur ce prélèvement, un examen de vos caractéristiques génétiques sera réalisé à des fins uniquement diagnostiques. Un tel examen nécessite votre accord. Donnez-vous cet accord? OUI* - NON* Signature Nous vous informons que le reliquat du prélèvement pourra être conservé par le laboratoire en vue d une utilisation ultérieure éventuelle dans le cadre exclusif de votre prise en charge. *barrer la mention inutile Figure 1. Exemple de consentement pour examen des caractéristiques génétiques d un individu (test HFE). En effet, selon la législation, les examens génétiques ne peuvent être prescrits chez un mineur que si celui-ci peut bénéficier personnellement de mesures préventives ou curatives immédiates. Contrairement aux autres pathologies génétiques, les apparentés des patients hémochromatosiques diagnostiqués sont rarement adressés à une consultation de génétique. De ce fait, le conseil génétique reste le point faible dans l hémochromatose et devrait être amélioré. Conclusion Le test HFE est l un des tests génétiques les plus prescrits en France. L enquête réalisée auprès des membres du réseau national des laboratoires référents impliqués dans le diagnostic des maladies rares du fer a permis d établir un bilan de la réalisation du test HFE en 2011. Cette enquête souligne l importance de rechercher la mutation p.cys282tyr en première intention pour établir un diagnostic d hémochromatose HFE. Rappelons qu en 2005 la HAS a considéré que seule l homozygotie pour la mutation p.cys282tyr associée, au minimum, à une élévation du CS-Tf permettait d établir le diagnostic d hémochromatose HFE. Il n existe pas, en revanche, d arguments suffisants pour une recherche systématique des variants p.his63asp et p.ser65cys. La difficulté du test HFE réside dans l interprétation de certains génotypes, car les données clinico-biologiques accompagnant la prescription sont souvent incomplètes. La participation à un contrôle de qualité devrait être systématique pour les laboratoires qui pratiquent le test. Le point faible souligné par tous les participants, est la mise en place et le suivi des études familiales. L implantation de «Centres de dépistage familial de l hémochromatose» sur le territoire national permettrait d assurer une meilleure prise en charge. Textes réglementaires Journal officiel, décision du 24 janvier 2007 relative à la liste des actes et prestations pris en charge par l assurance maladie (C282Y). 310 Ann Biol Clin, vol. 70, n 3, mai-juin 2012

Bonnes pratiques pour la réalisation du test génétique HFE Décret n 2008-321 du 4 avril 2008 relatif à l examen des caractéristiques génétiques d une personne ou à son identification par empreintes génétiques à des fins médicales Conflits d intérêts : aucun. Références 1. Simon M, Bourel M, Fauchet R, Genetet B. Association of HLA- A3 and HLA-B14 antigens with idiopathic haemochromatosis. Gut 1976 ; 17 : 332-4. 2. Simon M, Bourel M, Genetet B, Fauchet R. Idiopathic hemochromatosis. Demonstration of recessive transmission and early detection by family HLA typing. N Engl J Med 1977 ; 297 : 1017-21. 3. Feder JN, Gnirke A, Thomas W, Tsuchihashi Z, Ruddy DA, Basava A, et al. A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis. Nat Genet 1996 ; 13 : 399-408. 4. Nicolas G, Viatte L, Lou DQ, Bennoun M, Beaumont C, Kahn A, et al. Constitutive hepcidin expression prevents iron overload in a mouse model of hemochromatosis. Nat Genet 2003 ; 34 : 97-101. 5. Jouanolle AM, Fergelot P, Raoul ML, Gandon G, Roussey M, Deugnier Y, et al. Prevalence of the C282Y mutation in Brittany : penetrance of genetic hemochromatosis? Ann Genet 1998 ; 41 : 195-8. 6. Jouanolle AM, Gandon G, Jézéquel P, Blayau M, Campion ML, Yaouanq J, et al. Haemochromatosis and HLA-H. Nat Genet 1996 ; 14 : 251-2. 7. Pissard S, Huynh LT, Martin J, Goossens M. HFE genotyping by amplification refractory mutation system-denaturing HPLC. Clin Chem 2002 ; 48 : 769-72. 8. EASL clinical practice guidelines for HFE hemochromatosis. European Association For The Study Of The Liver. J Hepatol 2010 ; 53: 3-22. 9. Deugnier Y, Bardou-Jacquet E, Le Lan C, Brissot P. Hyperferritinemia not related to hemochromatosis. Gastroenterol Clin Biol 2009 ; 33 : 323-6. 10. Brissot P, Le Lan C, Troadec MB, et al. Hémochromatose HFE : approche pathogénique et diagnostique. Transfus Clin Biol 2005 ; 12 : 77-82. 11. Allen KJ, Gurrin LC, Constantine CC, Osborne NJ, Delatycki MB, Nicoll AJ, et al. Iron-overload-related disease in HFE hereditary hemochromatosis. N Engl J Med 2008 ; 358 : 221-30. 12. Laine F, Jouanolle AM, Morcet J, Brigand A, Pouchard M, Lafraise B, et al. Phenotypic expression in detected C282Y homozygous women depends on body mass index. J Hepatol 2005 ; 43 : 1055-9. 13. Aguilar-Martinez P, Bismuth M, Blanc F, Blanc P, Cunat S, Dereure O, et al. The Southern French registry of genetic hemochromatosis : a tool for determination of clinical prevalence of the disorder and genotype penetrance. Haematologica 2010 ; 95 : 551-6. 14. Rochette J, Le Gac G, Lassoued K, Férec C, Robson KJ. Factors influencing disease phenotype and penetrance in HFE haemochromatosis. Hum Genet 2010 ; 128 : 233-48. 15. Island ML, Jouanolle AM, Mosser A, Deugnier Y, David V, Brissot P, et al. A new mutation in the hepcidin promoter impairs its BMP response and contributes to a severe phenotype in HFE related hemochromatosis. Haematologica 2009 ; 94 : 720-4. 16. Dupradeau FY, Pissard S, Coulhon MP, et al. An unusual case of hemochromatosis due to a new compound heterozygosity in HFE (p.[gly43asp;his63asp]+[cys282tyr]): structural implications with respect to binding with transferrin receptor 1. Hum Mutat 2008 ; 29 : 206. 17. Aguilar Martinez P, Grandchamp B, Cunat S, Cadet E, Blanc F, Nourrit M, et al. Iron overloaded in C282Y Heterozygotes at first genetic testing : a step strategy for identifying new rare HFE variants. Haematologica 2011 ; 96 : 507-14. 18. Mura C, Raguenes O, Ferec C. HFE mutations analysis in 711 hemochromatosis probands : evidence for S65C implication in mild form of hemochromatosis. Blood 1999 ; 93 : 2502-5. 19. Holmström P, Marmur J, Eggertsen G, Gåfvels M, Stål P. Mild iron overload in patients carrying the HFE S65C gene mutation: a retrospective study in patients with suspected iron overload and healthy controls. Gut 2002 ; 51 : 723-30. 20. Wallace DF, Walker AP, Pietrangelo A, Clare M, Bomford AB, Dixon JL, et al. Frequency of the S65C mutation of HFE and iron overload in 309 subjects heterozygous for C282Y. J Hepatol 2002;36: 474-9. 21. HAS (Haute autorité de santé). Prise en charge de l hémochromatose liée au gène HFE (hémochromatose de type 1), 2005. www.has-sante.fr. 22. Le Gac G, Gourlaouen I, Ronsin C, Géromel V, Bourgarit A, Parquet N, et al. Homozygous deletion of HFE produces a phenotype similar to the HFE p.c282y/p.c282y genotype. Blood 2008 ; 112 : 5238-40. 23. Jouanolle AM, Douabin-Gicquel V, Halimi C, Loréal O, Fergelot P, Delacour T, et al. Novel mutation in ferroportin 1 gene is associated with autosomal dominant iron overload. J Hepatol 2003;39: 286-9. Ann Biol Clin, vol. 70, n 3, mai-juin 2012 311

Annexe 1 1. Les méthodes diagnostiques pour le test HFE Labo réseau Extraction Méthode utilisée Méthode maison Coffret commercial Sang total Type de prélèvement Cellules buccales Autre Contrôles de qualité National International Coffrets commerciaux testés et avis Labo réseau Coffret Commentaire 2. Quelle(s) mutation(s) rechercher? Evaluer leur intérêt dans la démarche diagnostique Labo réseau p.cys282tyr p.his63asp p.ser65cys Autre(s) 3. Les «comptes-rendus» de résultats Quels sont vos commentaires pour les génotypes suivants : génotype Labo réseau p.[=];[=] p.[c282y];[c282y] p.[c282y];[=] p.[c282y];[h63d] p.[h63d];[h63d] p.[h63d];[=] Autre(s) 312 Ann Biol Clin, vol. 70, n 3, mai-juin 2012

Bonnes pratiques pour la réalisation du test génétique HFE p.[=];[=] : absence de mutation p.[c282y];[c282y] : homozygote p.cys282tyr p.[c282y];[=] : hétérozygote p.cys282tyr p.[c282y];[h63d] : hétérozygote composite p.cys282tyr/his63asp p.[h63d];[h63d] : homozygote p.his63asp p.[h63d];[=] : hétérozygote p.his63asp 4. Problèmes réglementaires Labo réseau Consentement type (joindre copie modèle) Le laboratoire doit il réclamer : consentement ou attestation de consultation ou les 2 5. Cotation Modèle maison autre Attestation Consentement Les 2 Labo réseau Cotation des actes (B/BHN) (préciser votre calcul et/ou source) p.cys282tyr p.his63asp p.ser65cys 2 mutations Autre(s) 6. Conseil génétique Conseil génétique "quel message pour quel génotype" Les enquêtes familiales : Comment les rendre plus efficaces Labo réseau Conseil génétique Ann Biol Clin, vol. 70, n 3, mai-juin 2012 313