APPORTS DU NGS DANS L UTILISATION DES THERAPIES CIBLEES ANTITUMORALES Emmanuel KHALIFA Unité de Pathologie Moléculaire 13/05/2016
LE SCREENING MOLECULAIRE FACE A L INNOVATION PHARMACEUTIQUE Pratique clinique courante 17 thérapies ont une AMM conditionnée à un test moléculaire Multiplication des biomarqueurs prédictifs Recherche pharmaceutique et clinique Nouvelle molécules en développement+++ Nécessité d un développement rapide Inclusion des patients porteurs d anomalies sur des gènes potentiellement ciblables Buzyn et al, Nature Review, 2016
LE SCREENING MOLECULAIRE FACE A L INNOVATION PHARMACEUTIQUE Pratique clinique courante 17 thérapies ont une AMM conditionnée à un test moléculaire Multiplication des biomarqueurs prédictifs Recherche pharmaceutique et clinique Nouvelle molécules en développement+++ Nécessité d un développement rapide Inclusion des patients porteurs d anomalies sur des gènes potentiellement ciblables Buzyn et al, Nature Review, 2016
LE SCREENING MOLECULAIRE FACE A L INNOVATION PHARMACEUTIQUE Pratique clinique courante 17 thérapies ont une AMM conditionnée à un test moléculaire Multiplication des biomarqueurs prédictifs Recherche pharmaceutique et clinique Nouvelle molécules en développement+++ Nécessité d un développement rapide Inclusion des patients porteurs d anomalies sur des gènes potentiellement ciblables Buzyn et al, Nature Review, 2016
QUELQUES DEFINITIONS ADN: polymère constitué d une suite de nucléotides de 4 sortes A/T/G/C 1 gène: segment d ADN correspondant à une unité fonctionnelle Exons: fragments retenus par le processus d épissage de l ARN Introns: fragments excisés par le processus d épissage de l ARN Les exons sont porteurs des régions codantes du génome
QUELQUES DEFINITIONS ADN: polymère constitué d une suite de nucléotides de 4 sortes A/T/G/C 1 gène: segment d ADN correspondant à une unité fonctionnelle Exons: fragments retenus par le processus d épissage de l ARN Introns: fragments excisés par le processus d épissage de l ARN INTERET DE SEQUENCER LES REGIONS EXONIQUES: INTERPRETATION PLUS FACILE Les exons sont porteurs des régions codantes du génome
QUELQUES DEFINITIONS Exome: totalité des exons du génome humain (1% soit 75 millions de nucléotides) GÉNOME Génome: totalité de l ADN humain (3 milliards de nucléotides) Surtout constitué de régions intergéniques non codantes Gènes Transcriptome: ensemble des ARN issus de la transcription des gènes du génome Variable en fonction des tissus et du temps Exons Séquençage génétique: Détermination de l ordre d enchaînement des nucléotides d un fragment d ADN donné Mutation: variation pathogène de la séquence nucléotidique
TYPES DE MUTATIONS DETECTEES PAR LE SCREENING MOLECULAIRE MICROLESIONS MACROLESIONS MUTATIONS PONCTUELLES COPY NUMBER VARIANT (CNV) GENES DE FUSION EML4 ALK
DES TECHNIQUES CONVENTIONNELLES DE SEQUENCAGE AU NGS
Séquençage Sanger: principe Utilisation d un brin d ADN matrice par une polymérase
Séquençage Sanger: principe Utilisation d un brin d ADN matrice par une polymérase Incorporation aléatoire de didésoxynucléotides terminaux marqués A T G C Synthèse de fragments de toutes les tailles possibles marqués à leur extrêmité par une des 4 bases
Séquençage Sanger: principe Utilisation d un brin d ADN matrice par une polymérase Incorporation aléatoire de didésoxynucléotides terminaux marqués A T G C Synthèse de fragments de toutes les tailles possibles marqués à leur extrêmité par une des 4 bases
Séquençage Sanger: principe Utilisation d un brin d ADN matrice par une polymérase Incorporation aléatoire de didésoxynucléotides terminaux marqués A T G C Synthèse de fragments de toutes les tailles possibles marqués à leur extrêmité par une des 4 bases Débit de séquençage limité
Séquençage Sanger: principe Utilisation d un brin d ADN matrice par une polymérase Incorporation aléatoire de didésoxynucléotides terminaux marqués A T G C Synthèse de fragments de toutes les tailles possibles marqués à leur extrêmité par une des 4 bases Débit de séquençage limité Faible sensibilité de détection Cellularité tumorale faible Hétérogénéité intratumorale
Apports du NGS dans le screening moléculaire tumoral
SEQUENCAGE MASSIF EN PARALLELE (NEXT GENERATION SEQUENCING) Parallélisation et massification du séquençage Multiplexage Miniaturisation Débit+++ Moindre coût Ion torrent Illumina Puissance des outils de la bioinformatique En un temps limité, compatible avec le temps clinique Plusieurs types de NGS Approche ciblée (panel de gènes) Approche globale (exome, Whole Genome Etude de l expression (RNA seq)
SEQUENCAGE MASSIF EN PARALLELE (NEXT GENERATION SEQUENCING) Parallélisation et massification du séquençage Multiplexage Miniaturisation Débit+++ Moindre coût Ion torrent Illumina Puissance des outils de la bioinformatique En un temps limité, compatible avec le temps clinique Plusieurs types de NGS Approche ciblée (panel de gènes) Approche globale (exome, Whole Genome Etude de l expression (RNA seq)
ETAPES CLES DU NGS
ENRICHISSEMENT PAR PCR MULTIPLEX: PREPARATION DE LA LIBRAIRIE Chaque couple d amorce permet l amplification d un fragment d intérêt
AMPLIFICATION CLONALE But: amplification sert à rendre les brins «détectables» au moment du séquençage
AMPLIFICATION CLONALE ION TORRENT But: amplification sert à rendre les brins «détectables» au moment du séquençage
REACTION DE SEQUENCAGE
ION TORRENT: PYROSEQUENCAGE REACTION DE SEQUENCAGE
ANALYSE BIOINFORMATIQUE Conversion des données brutes en informations pertinentes pour le choix thérapeutique Notion de pipeline Pabinger et al, 2012
Pabinger et al, 2012 ANALYSE BIOINFORMATIQUE
ANALYSE BIOINFORMATIQUE Profondeur de lecture: Nombre de fois qu un nucléotide est lu à une position donnée Pabinger et al, 2012
ANALYSE BIOINFORMATIQUE Profondeur de lecture: Nombre de fois qu un nucléotide est lu à une position donnée Pabinger et al, 2012 Couverture: Pourcentage de la région ciblée réellement séquencée à une profondeur donnée
ANALYSE BIOINFORMATIQUE Pabinger et al, 2012 Annotation: Nomenclature Consultation de bases de données en ligne Consultation de logiciel bioinformatique Tri des variants Par valeur théranostique Par type de gène Par nature de variant
AVANTAGES DU NGS EN ONCOLOGIE Exhaustivité du screening Détection de mutation à faible pourcentage Economie de matériel biologique
APPLICATIONS EN ROUTINE CLINIQUE
AMM DES ANTI EGFR DANS LES CANCERS COLORECTAUX METASTATIQUES ET LES ADENOCARCINOMES BRONCHIQUES Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research panel v2 Panel de 22 gènes Gènes impliqués dans l oncogénèse les plus fréquemment mutés Régions porteuses des hot spots mutationnels Screening dans le cadre de l AMM des anti EGFR (KRAS, NRAS, EGFR)
AMM DES ANTI EGFR DANS LES CANCERS COLORECTAUX METASTATIQUES ET LES ADENOCARCINOMES BRONCHIQUES Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research panel v2 Panel de 22 gènes Gènes impliqués dans l oncogénèse les plus fréquemment mutés Régions porteuses des hot spots mutationnels Screening dans le cadre de l AMM des anti EGFR (KRAS, NRAS, EGFR) Gènes ciblables dans les essais cliniques de médecine personnalisée Gènes impliqués dans des mécanismes de résistance
APPLICATIONS EN RECHERCHE CLINIQUE
ESSAIS DE TYPE UMBRELLA (NGS+++) Test d un panel prédéfini de thérapies ciblées Essais guidés par la génomique tumorale Etude du profil génomique tumoral Thérapies commercialisées hors AMM Thérapies non commercialisées Un type histologique Plusieurs types histologiques Un type histologique Non randomisés SAFIR01 (Unicancer) (clos) Randomisés MOST (Centre Léon Bérard), SHIVA (Institut Curie) (clos) SAFIR02 Lung (Unicancer) SAFIR02 Breast (Unicancer)
PROGRAMMES DE SCREENING MOLECULAIRE Carte d identité de la tumeur Techniques de haut débit Enrichissement d essais de phase I/II avec des patients porteurs d une cible moléculaire adéquate Accélérateur du développement des thérapies ciblées Schwaederle et al, J Clin Oncol, 2015
PROGRAMME BIP (BERGONIE INSTITUTE PROFILING)
Soumission des nouveaux dossiers en RCP moléculaire «essais précoces» Vérification de l éligibilité au screening Décision médicale en RCP moléculaire Mise à disposition de matériel tumoral Altération moléculaire ciblable Screening (CGH + NGS) Extraction d ADN
Soumission des nouveaux dossiers en RCP moléculaire «essais précoces» Vérification de l éligibilité au screening Décision médicale en RCP moléculaire Délai moyen: 9 semaines Activité multipliée par 6 entre 2013 et 2015 2015 Rendement du screening: 20% Mise à disposition de matériel tumoral Base de données clinico-biologique Altération moléculaire ciblable Screening (CGH + NGS) Extraction d ADN
ENJEUX DU SCREENING DANS LES ESSAIS DE MEDECINE PERSONNALISEE EN CANCEROLOGIE
Soumission des nouveaux dossiers en RCP moléculaire «essais précoces» Vérification de l éligibilité au screening Décision médicale en RCP moléculaire Absence d altération moléculaire ciblable Mise à disposition de matériel tumoral Altération moléculaire ciblable Screening (CGH + NGS) Extraction d ADN NO
NGS: Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (50 gènes) CGH Agilent (détection des Copy Number Variants)
NGS: Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (50 gènes) CGH Agilent (détection des Copy Number Variants) NGS Oncomine ADN: Mutations + CNV
NGS: Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (50 gènes) CGH Agilent (détection des Copy Number Variants) NGS Oncomine ADN: Mutations + CNV ARN: Transcrits de fusion/anomalies d épissage
Soumission des nouveaux dossiers en RCP moléculaire «essais précoces» Vérification de l éligibilité au screening Décision médicale en RCP moléculaire Absence d altération moléculaire ciblable Mise à disposition de matériel tumoral Mauvaise réponse au traitement malgré une approche personnalisée Altération moléculaire ciblable Screening (CGH + NGS) Extraction d ADN NO
Screening large et multidimensionnel Priorisation des mutations «pilotes» ou «drivers»
CAS CLINIQUE
Mme A 2007: Diagnostic d un carcinome du sein lobulaire invasif ER+, RP-, HER2- (T2N0M0) Chimiothérapie néoadjuvante Mastectomie avec curage axillaire Radiothérapie/Hormonothérapie Mai 2010: Détection de métastases hépatiques Echec de plusieurs lignes de chimiothérapie dont 9 mois capecitabine Mai 2014: Soumission du dossier en RCP moléculaire Biopsies des métastases hépatiques
LISTE DES VARIATIONS GENETIQUES RETROUVEES EN NGS
VISUALISATION DES READS SUR L EXON 21 DE HER2
PREDICITION BIOINFORMATIQUE DE PATHOGENICITE DE LA L869Q Elaboration d un score de pathogénicité «in silico»
HER2: RECEPTEUR A ACTIVITE TYROSINE KINASE
HER2: RECEPTEUR A ACTIVITE TYROSINE KINASE
PROBLEME AUCUNE ETUDE FONCTIONNELLE NI CLINIQUE NE PROUVE QUE L869Q EST UNE MUTATION ACTIVATRICE DE ERBB2
HYPOTHESE: ANALOGIE ENTRE ERBB2:L869Q ET EGFR:L861Q EGFR: la mutation L861Q est une mutation activatrice de EGFR L861Q est un biomarqueur prédictif de réponse aux TKI anti-egfr dans les CBNPC non épidermoïdes
HYPOTHESE: ANALOGIE ENTRE ERBB2:L869Q ET EGFR:L861Q ERBB2 EGFR 869 861 EGFR: la mutation L861Q est une mutation activatrice de EGFR L861Q est un biomarqueur prédictif de réponse aux TKI anti-egfr dans les CBNPC non épidermoïdes
HYPOTHESE: ANALOGIE ENTRE ERBB2:L869Q ET EGFR:L861Q ERBB2 EGFR 861 EGFR: la mutation L861Q est une mutation activatrice de EGFR L861Q est un biomarqueur prédictif de réponse aux TKI anti-egfr dans les CBNPC non épidermoïdes L869Q interprétée comme une mutation probablement activatrice de ERBB2/HER2 869
TRAITEMENT PAR TKI ANTI ERBB2: LAPATINIB Très bonne réponse tumorale pendant 18 mois Case report renforçant la thèse d un effet activateur de la L869Q Grellety et al, Annals of Oncology, 2016
TAKE HOME MESSAGES Le NGS et les autres technologies de haut débit mèneront à une médecine de plus en plus personnalisée Evolution exponentielle des capacités de séquençage Penser assez tôt au screening moléculaire en vue d essais cliniques de médecine personnalisée
MERCI DE VOTRE ATTENTION