Protocoles biochimiques «consensus» Table ronde: diagnostic des maladies mitochondriales Dr Anne Lombès CRICM U975 4ème colloque «Meetochondrie» Aussois, 9-12 mai 2010
Les protocoles biochimiques dans les maladies mitochondriales Buts? Méthodes? Résultats?
Buts : 1) Diagnostic (pronostic, traitement) Les maladies mitochondriales sont dues à une altération des oxydations phosphorylantes (OXPHOS) High lactate 2% 17% 4% ± suggestive, muscle morphology 10% 24% 15%) 2% Defective activity 100% RRF, COX- 50% Genetic identification
Méthodes : complexité des OXPHOS Les oxydations phosphorylantes impliquent de multiples facteurs, de multiples étapes, dans un contexte intramembranaire http://www.genome.jp/kegg/pathway/map/map00190.html
Diversité des protocoles POLAROGRAPHIE Consommation d oxygène en présence de substrats o Avantages : Analyse globale avec couplage o Inconvénients : Tissu frais, Faible sensibilité SPECTROPHOTOMETRIE Consommation ou production de substrat (densité optique) o Avantages : Etapes séparées, Sensibilité, Tissu congelé o Inconvénients : Pas d étude du couplage, Vmax HISTOCHIMIE Précipitation de sel couplée à une oxydo-réduction o Avantages : Etapes séparées, Sensibilité, Tissu congelé Quantité tissulaire minime o Inconvénients : Seulement CII and IV, (V?), faible sensibilité AUTRES : Spectre des cytochromes, Production d ATP, Substrats radiomarqués
Méthodes différentes entre centres diagnostiques Méthodes employées Spectrophotométrie Histochimie Polarographie Protocoles des méthodes Type de tissu (muscle, foie, fibros) Frais ou congelé Population urbaine Centre diagnostique
Évaluation des conséquences de la diversité des protocoles pour les essais spectrophotométriques Citrate Synthase COX! 5000 5000! 4000 4000! 3000 3000! 2000 2000! 1000 1000! 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0! 1! 2! 3! 4! 5! 6! 7! 8! 9! Activités en nmoles/min/mg proteines mesurées sur une préparation unique de mitochondries de cœur de boeuf
Tentative de consensus pour les essais spectrophotométriques 1) DISCUSSIONS BUTS : Activité spécifique élevée, Cinétique linéaire, Proportionnalité vitesse/quantité de protéines MÉTHODES : Température, tampons, concentrations 2) VALIDATION EXPÉRIMENTALE Mitochondries de cœur de bœuf, Quadriceps de souris, Muscle humain, Fibroblastes cutanés humains F. Medja, S. Allouche, P. Frachon, C. Jardel, M. Malgat, B. Mousson de Camaret, A. Slama, J. Lunardi, J.P. Mazat, A. Lombès (Mitochondrion, 2009)
Quelques surprises Beef heart mitochondria Activity (nmol.min -1.mg -1 ) 5000 4000 3000 2000 1000 0 MAN CPT CCA Citrate synthase Complex IV
Quelques surprises IV activity (nmol.min -1.mg -1 ) 80 60 40 20 0 Human muscle 0 25 50 75 100 Phosphate 80 60 40 20 0 Human fibroblasts 0 25 50 75 100 Phosphate
Des difficultés plus attendues 80 60 Complexe IV Absorbance 2.5 2.0 1.5 1.0 Cœur de boeuf 40 20 0 0 50 100 150 200 Cyt c (µm) Muscle humain 0.5 0 1 2 3 15000 12000 9000 6000 3000 Time (minutes) 0 0 2 4 6 8 10 Protein (µg/assay)
Résultats : 1)Protocoles et leur validation mis à disposition http://lbbma.univ-angers.fr/fmdn 2)Reproductibilité entre centres démontrée Human muscle (n=89 1 / 39 2 / 26 3 ) Human liver (n=30 1 / 21 2 ) I II III IV 42±16 / 42±8 / 56±31 27±12 / 36±12 61±22 / 68±20 / 79±38 125±59 / 169±24 166±72 / 301±77 / 252±119 84±35 / 80±28 184±64 / 210±42 / 205±98 69±31 / ND La Salpêtrière Paris 1, CHU d'angers 2, CHU de Caen 3
Résultats : 3)Application des protocoles En France Angers, Bordeaux, Caen, Grenoble, Lille, Paris (La Salpêtrière), Rennes A l étranger Padoue (Italie), Barcelone (Espagne), Afrique du Sud, Hongrie 4)Discussion, échanges entre centres Lots commerciaux, erreurs dans les protocoles, Comparaison/discussion des résultats
Conclusion-Perspectives 1) CONTRÔLE DE QUALITÉ - Indispensable pour accréditation - Echantillons contrôles normaux et pathologiques? - Centres n appliquant pas les protocoles «consensus»? 2) AMÉLIORATION DES PROTOCOLES - Spectrophotométrie (complexe III) - Autres : Polarographie Préparation des mitochondries (complexe V) Gels natifs
Conclusion-Perspectives 3) NÉCESSITÉ DE L APPROCHE «CONSENSUS»? - Un seul centre de référence? Incidence des maladies mitochondriales ~ 1/5000, des mutations pathogènes de l ADN mit ~ 1/1000 160 nouveaux patients/an, ~ 1000-2000 patients à analyser/an «débrouillage» indispensable - Chacun fait selon son protocole? Diversité considérable des maladies elles-mêmes Organisation diagnostique (EPU, réseaux ) Projets «ciblés» (recrutement multi-centrique indispensable)