LES NUMERATIONS GLOBULAIRES
But de la numération Déterminer la concentration sanguine en globules rouges, globules blancs et plaquettes. La numération est un paramètre étroitement régulé par l hématopoïèse et le vieillissement cellulaire normal. Il y a donc des valeurs de référence par tranche d âge et par sexe. Tout Le changement taux de dilution dans appliqué la numération sera adapté traduira au type un phénomène cellulaire pathologique en évolution. décompté
Principe de la numération directe Échantillon de sang prélevé avec un anticoagulant Dilution taux adapté au type cellulaire dénombré 10 12 /L pour GR dilution F : 200 10 9 /L pour GB et Thr dilution F : 100 Décompte au microscope : reconnaissance visuelle d où numération directe : n cellules concentration cellulaire = n cellules/volume de décompte
Matériel de dilution : unopette - Réservoir hermétiquement bouché, contenant un volume précis de diluant capillaire Diluteur à usage unique - micropipette permettant de prélever un volume précis de sang - Capuchon Réservoir Diluant Capuchon Micropipette
L unopette sert à réaliser une dilution standardisée et précise du sang. Il existe des unopettes pour hématies, leucocytes et plaquettes
Matériel de comptage : hématimètre Ce sont d épaisses lames de verre, creusées de rigoles qui délimitent des plates-formes Il existe plusieurs types d hématimètre ils se différencient par leur quadrillage et leur volume total
une plate-forme centrale légèrement abaissée, sur laquelle sont gravés un ou deux quadrillages Deux plates-formes latérales élevées qui supporteront une lamelle épaisse et plane
Le quadrillage de l hématimètre de MALASSEZ Le quadrillage est constitué d un grand rectangle ( A B C D ) de L = 2,5 mm et l = 2 mm Il est divisé en 100 rectangles égaux de 250 µm 200 µm 25 rectangles (ABCD) divisés en petits carrés (abcd) 25 rectangles clairs 50 rectangles divisés en bandes Lorsque la lamelle plane est fixée sur la plate-forme centrale, la profondeur ou distance entre le quadrillage et la lamelle est de 0,2 mm.
Volume total de la chambre de comptage de Malassez (grand rectangle A B C D ) V = L x l x h = 2,5 x 2 x 0,2 = 1 mm3 = 1 µl = 1.10-6 L Volume correspondant à chaque rectangle ABCD V = 0,25 x 0,2 x 0,2 = 0,01 mm3 = 0,01 µl
Une chambre de comptage permet une numération directe précise grâce : au quadrillage qui délimite une surface précise qui donne le repère visuel et permet ne pas compter 2 fois la même cellule à la profondeur précise (distance lamelle quadrillage permet de disposer d un volume exact
Préparation de l hématimètre A faire avant de mettre les gants Par précaution : -Rincer à l eau distillée - rincer à l alcool -Sécher sans frotter
Faire adhérer la lamelle sur les plates formes latérales en les humectant légèrement Poser la lamelle sur les plateaux en prenant soin de ne pas la graisser avec les doigts.
En appuyant avec les deux pouces sur cette lamelle au niveau des plateaux latéraux, exercer un mouvement de va-et-vient jusqu à perception d une résistance et apparition de franges irisées, sans appuyer sur la partie centrale Poser l hématimètre à plat sur la paillasse Placer sur la platine, faire la mise au point au grossissement 100 (objectif 10)
Réalisation de la dilution Mettre des gants et les lunettes de sécurité Préparer le poste de travail
Perforer largement le réservoir de l unopette avec le capuchon, enlever et jeter le capuchon Bien homogénéiser le sang dans le tube de prélèvement
Maintenir la micropipette horizontale et faire monter le sang par capillarité. Le dispositif est calibré de telle sorte que le sang s arrêtera tout seul et le volume prélevé sera juste si la micropipette est bien horizontale
Il faut enlever le sang qui est sur la paroi extérieure du capillaire ( erreur par excès) Incliner Essuyer légèrement soigneusement le capillaire vers le sang l arrière à l extérieur pour fairede la descendre le sang micropipette de quelques à l aide millimètres de papier filtre Boucher avec l index l extremité de la micropipette Essuyer soigneusement avec un papier sec Faire attention à ne pas aspirer le sang contenu dans le capillaire
- Maintenir le réservoir fortement comprimé - Maintenir l index sur la micropipette - Introduire jusqu au blocage la micropipette dans le réservoir - Relâcher la pression au niveau du réservoir puis enlever l index (le vide créé aspire le sang) Presser et relâcher 2 à 3 fois les parois du réservoir pour rincer la micropipette sans déborder, agiter pour homogénéiser.
Attendre 15 minutes pour les leucocytes et les thrombocytes avant de mettre en hématimètre temps de lyse des hématies et de turgescence des plaquettes Pas de temps d attente pour la numération des hématies
Mise en hématimètre Mettre les lunettes de sécurité Homogénéiser la dilution Sortir la micropipette délicatement la retourner et la positionner sur le réservoir Jeter les premières gouttes de dilution
Attention: Ne pas toucher la lamelle avec le capillaire Décollement de la lamelle Bris du capillaire Placer l extrémité de la micropipette, légèrement inclinée, sur le plateau central près de la lamelle et remplir par capillarité la chambre de l hématimètre Sans débordement dans les rigoles et sans bulles d air. Le plateau quadrillé doit être rempli en entier en 1 fois
Le remplissage doit être rapide, réalisé en une seule fois, sans Laisser sédimenter, l hématimètre bien horizontal sur la platine du microscope 10 minutes pour les hématies 20 minutes pour les thrombocytes et les leucocytes
Décompte Vérifier à x 10 l homogénéité de répartition (sinon nettoyer et recommencer la mise en hématimètre) mettre à x 40 (1 rectangle ABCD occupe un champ entier) Compter les cellules pour les GR : 4 rectangles quadrillés dans des zones différentes pour les GB : toute la chambre de comptage (100 rectangles) pour les Thr : trois bandes complètes ( 30 rectangles)
Dans les cas des érythrocytes on obtient n 1, n 2, n 3 et n 4 La dispersion entre les 4 rectangles est : n fort -n faible n moyen X 100 n moyen Ce pourcentage ne doit pas dépasser 10%
Compter avec un parcours méthodique Compter les cellules présente dans chaque carrée élémentaire (A B C D ) La répartition des cellules sur le quadrillage entraine une erreur technique dans la numération Il ne faut compter que la moitié des bords pour limiter cette erreur On comptera toutes les cellules chevauchant en haut et à droite
Calcul N= X. F. 10 6 n.v X = somme des cellules comptées dans l ensemble des rectangles pris en compte F = facteur de dilution n = nombre de rectangles comptés V = volume d un rectangle = 0,01 µl = 0,01 mm 3 10 6 pour obtenir le résultat par litre de sang
Expression du résultat Le résultat s exprimera sous la forme : N +/- 2u c u c = 0,1.10 12 /L pour les érythrocytes u c = 0,2.10 9 /L pour les leucocytes u c = 30.10 9 /L pour les thrombocytes
Rangement Dès la fin du décompte Faire tremper l hématimètre 10 minutes en RBS 2% Mettre des gants Récupérer à la main l hématimètre et sa lamelle Faire tremper 15 minutes dans de l eau de javel 1,2 chlorométrique Récupérer à la main l hématimètre et sa lamelle Rincer abondamment à l eau distillée Rincer à l alcool pour améliorer le séchage Éponger sans frotter avec du papier joseph Ranger l hématimètre avec sa lamelle ( lamelle sous l hématimètre)