BIO 57 - Année 2007-08 Connaissance et Technique du Gène ( Gene Science pour les anglophones) L1 SV, L1 BIM, L2 SME Semestre d Automne Responsable : Professeur Keith DUDLEY
- 2 - CONNAISSANCE ET TECHNIQUE DU GENE L1, S1 Au cours de ces enseignements vous allez voir l organisation et l expression de l information génétique ainsi que la manipulation de l ADN l importance du clonage des gènes pour répondre aux questions biologiques. Les cours ainsi que les travaux dirigés se feront en les groupes d environ 40 étudiants. Donc 5 enseignants vont enseigner en parallèle le même sujet. Avec des groupes de 40 (au lieu de 200 dans un amphithéâtre) c est plus facile d enseigner, c est plus agréable pour vous et nous pouvons répondre à vos questions plus facilement. VOUS ETES FORTEMENT ENCOURAGES À POSER DES QUESTIONS PENDANT LES COURS. Soit l enseignant peut répondre tout de suite soit il/elle peut proposer de se voir à la fin du cours. Néanmoins notre expérience montre que si un étudiant n a pas compris une partie du cours, il y a sûrement plusieurs autres, plus timides, qui veulent poser la même question. L importance de ces cours et ces travaux dirigés s explique ci-dessous : L ADN contient toute l information qui donne le phénotype d une cellule Dans le génome des hommes et des souris, par exemple, il y a environ 30 000 gènes Pour comprendre la fonction de chaque gène, il faut tout d abord l isoler Pour l isoler il faut le cloner Pour faire le clonage il faut : extraire l ADN des cellules il faut le couper en morceaux il faut coller tous les fragments d ADN individuellement dans un vecteur qui peut se répliquer chez des bactéries ou chez la levure il faut des stratégies pour identifier et isoler un clone spécifique parmi tous les clones après avoir isolé le gène il faut des stratégies pour comprendre la fonction Quel que soit l organisme qui vous intéresse (homme, souris, drosophile, plante, bactérie) le clonage se fait de la même manière. Donc le clonage est fondamental pour les biologistes. A. Explications sur l organisation des cours et des TD 1. Les semaines 1 à 7 a) La structure et la fonction de l ADN : comment lire la séquence de l ADN pour produire dans un premier temps un ARNm et ensuite une protéine. Vous allez voir les détails l année prochaine donc pendant cette partie on aborde les grands principes et on parle brièvement de la complexité de cette opération. Par exemple, comment mettre 2 mètres d ADN dans un noyau avec un diamètre de 20 micromètres? Comment un gène peut-il coder pour plus d une seule protéine? 4 heures b) Les principes de base sur le clonage. Les plasmides, les enzymes de restriction, la ligase, la transformation des bactéries. 2 heures c) Le TP. Un cours sur le TP que vous allez faire pour que vous ayez tout compris avant d arriver dans les salles de TP et que vous arriviez à cloner des molécules.2 heures d) La structure et la fonction de l ADN : la suite y compris la réplication de l ADN. 4 heures
- 3 - e) Le clonage : la suite. Les stratégies pour maximiser le nombre de molécules recombinantes. La sélection bleu-blanc avec X-gal. La structure du plasmide pbluescript comme exemple. 2 heures f) La production d ADNc par la transcriptase inverse et son clonage dans un vecteur, soit un g) plasmide soit un bactériophage. Biologie des bactériophages. 4 heures h) Les banques génomiques et la marche chromosomique. La production des sondes et l idée de stringence 2 heures i) La Polymerase Chain Reaction (PCR). Comment faire et pourquoi faire? 2 heures j) Importance des anticorps dans l analyse de la fonction des gènes. Hybridation in situ pour savoir où s exprime un gène. 2 heures 2. La semaine 8: examen partiel sous forme de QCM d une heure, obligatoire ; voir ci-dessous. 3. Les semaines 9, 10, 11 : les TD Pendant les cours vous avez vu les idées fondamentales sur le clonage. En TD nous allons parler plutôt de ce que l on fait avec le gène qui a été isolé. Les 5 TD sont : a) Les méthodes de blotting essentielles pour en savoir plus sur la structure des gènes (surtout où se trouvent les sites de restriction) et sur l expression. Pour la partie expression on veut savoir très souvent où s exprime le gène (quel tissu, quel type de cellule ; chez l embryon, chez l adulte) au niveau soit des ARNm (Northern blot) soit des protéines (Western blot). L idée d une sonde sera très importante : les sondes sont soit des acides nucléiques, soit des anticorps qui se fixent d une façon très spécifique sur un ARN, un ADN ou une protéine et qui permettent l identification de votre molécule d intérêt. (DC) b) Du gène à la protéine et aux applications en médecine. On commence avec une séquence d ADN et on finit avec une molécule disponible chez la pharmacie. Quelles sont les étapes pour arriver à produire une telle molécule. (MB) c) La transgénèse permet aux chercheurs d ajouter un gène dans les cellules d un organisme pour voir, par exemple, comment cela change le phénotype. La transgénèse se fait chez la souris ainsi que chez la drosophile et un jour, probablement, chez l homme pour le traitement des maladies (la thérapie génique). Exemple chez la souris : on ajoute le gène pour l hormone de croissance pour avoir une expression plus forte. Est-ce qu on peut produire les souris géantes? (heureusement, non!). (KD). d) Le RNAi. La technologie RNAi permet aux chercheurs de poser la question suivante : si on efface la fonction du gène X, quel est le phénotype? Cette technologie est en plein développement chez la souris, la drosophile et les plantes. En quelque sorte les expériences RNAi sont l inverses des expériences de transgénèses, où l on ajoute une fonction. (PC). e) Les puces à ADN. Cette technologie permet l analyse de l expression d un très grand nombre de gènes à la fois. Par exemple quels sont les gènes qui s expriment dans les cellules cancéreuses?(sc) En plus des TD faits par les enseignant-chercheurs, vous allez avoir deux TD assurés par les moniteurs. Ce sont des étudiants qui font une thèse et qui connaissent très bien le sujet. Ils vont faire des TD de révision, plutôt des exercices pour vérifier que vous ayez compris les cours. Je ferai en plus une dernière séance dans un amphi début décembre pour répondre aux questions sur les cours/posters/tp. B. Vous avez un TP : Vous allez faire un TP de deux fois 4 heures où vous allez cloner des molécules d ADN et ensuite analyser les clones que vous avez produits. Une polycopié qui
- 4 - explique en détail ce TP est disponible auprès de Mme Guasp au département de Biologie 4 ème étage TPR2. Vous devez signer pour obtenir votre exemplaire (gratuit) du polycopié ; De plus nous allons faire un cours sur ce TP pour que vous puissiez tout comprendre avant d arriver dans les salles de TP. Vous allez écrire un rapport de 4 pages selon les consignes fournies par l équipe des enseignants. Votre présence au TP est obligatoire. Si vous êtes absent vous aurez zéro (0) pour l UE même si vous avez 20/20 pour le partiel, le poster et l épreuve de décembre. C. Vous allez faire un Poster : avec les présentations orales, les posters sont des moyens importants pour la présentation des résultats de la recherche. Nous allons vous donner une liste de sujets et vous allez en choisir un. Vous allez travailler en binômes. Pour vous aider nous allons vous montrez les posters qui ont été fait par les étudiants de l année dernière. Vos posters seront affichés dans le Grand hall et notés par les enseignants. Vous ferez une explication orale de votre poster et vous serez noté sur la qualité de votre poster ainsi que sur votre capacité d expliquer le sujet. Les deux membres du binôme doivent être présents, et n auront pas nécessairement la même note. L absence sera sanctionnée par un zéro au poster. D. La Notation de l UE : a) Pour la première session : Vous serez noté sur le partiel, le rapport du TP, le poster et l épreuve terminale en décembre (donc, avant les vacances de Noël). Partiel : 20% TP : 15% Poster : 20% Epreuve finale : 45% (les questions porteront sur l ensemble des cours, TD et TP) b) Pour la seconde session (en juin) : l examen sera sous forme de QCM ; aucune note de TP, poster ou partiel ne sera reportée entre les deux sessions. En revanche, si vous redoublez, la note de TP et la note de poster, si elles sont supérieures ou égales à 10/20, seront conservées. E. L évaluation de l enseignement : A la fin de cette UE nous allons vous demander de répondre à un questionnaire, une évaluation de l enseignement et de l organisation générale. Nous avons besoin de vos commentaires (qui seront anonymes) pour encore améliorer l UE l année prochaine. F. Les Enseignants Keith Dudley ( dudley@ibdm.univ-mrs.fr) Sophie Chauvet ( chauvet@ibdm.univ-mrs.fr) Patrice Crété ( crete@luminy.univ-mrs.fr) Christophe Bordi ( bordi@ibsm.cnrs-mrs.fr ) Dominique Charmot(dominique.bensimon@univmed.fr) Marion Benoist (marion.benoist@univmed.fr) Keith Dudley, responsable de l UE BIO57
- 5 - BIO57 QUELQUES INFORMATIONS INDISPENSABLES A CONNAITRE Partie 1. Le décor : les cellules et les macromolécules biologiques Quel est le domaine de compétences de la biologie moléculaire? - expliquer les relations entre la structure et la fonction des molécules biologiques - expliquer la manière dont les molécules biologiques contribuent aux processus biochimiques Que faut-il étudier? - les macromolécules - les complexes macromoléculaires de l ADN, l ARN et des protéines - la réplication, la transcription, la traduction Comment a-t-on pu procéder à ces études? Production de fragments d ADN Liaison de ces fragments à un support moléculaire Introduction du vecteur dans une cellule hôte pour en faire de multiples copies (= pour l amplifier) Sélection du fragment que l on veut étudier Quelles sont les conséquences du développement de la biologie moléculaire? - des connaissances dans le domaine fondamental - des applications pratiques : o production de protéines d intérêt médical o vaccins o diagnostic en médecine o plantes et animaux transgéniques L ADN, c est le support de l information génétique d une cellule. MAIS, qu est-ce que c est qu une cellule? Sont-elles toutes identiques?? On verra successivement, et brièvement : - l anatomie d une cellule bactérienne (procaryote) - l anatomie d une cellule animale (eucaryote) ou végétale (idem) - et les notions de : o différentiation cellulaire o coordination des activités entre les tissus et organes chez les organismes multicellulaires nécessité de disposer de molécules de signalisation, et de systèmes de communication chimiques
- 6 - L ADN, c est le support de l information génétique d une cellule. QU EST-CE QU UNE CELLULE? Tous les organismes : - utilisent le même principe de code génétique - stockent l information génétique sous forme d un acide nucléique (en général de l ADN) - transmettent l info génétique de l ADN à l ARN puis aux protéines - utilisent des protéines comme catalyseurs des réactions chimiques (parfois de l ARN) - synthétisent les protéines à la surface des ribosomes - produisent de l énergie par la dégradation de sucres simples - utilisent de l adénosine triphosphate (ATP) comme transporteur d énergie - ont leur cytoplasme isolé de l environnement par des membranes de phospholipides - ont des pompes, des transporteurs, des canaux dans leur membrane Toutes les cellules ne sont pas identiques. Les eucaryotes Cytoplasme compartimenté (avec des organites et un noyau) ; le matériel génétique est dans le compartiment nucléaire Et un cytosquelette Uni- ou pluricellulaires (env. 10 14 celle pour un être humain Des groupes de procaryotes Pas de compartiment Donc pas de noyau Donc le matériel génétique n est pas isolé des constituants de la cellule Pas de cytosquelette unicellulaire Les deux photos ne sont pas à la même échelle
- 7 - QUELS SONT LES CARACTERES DISTINCTIFS DES CELLULES EUCARYOTES PAR RAPPORT AUX CELLULES PROCARYOTES? 1. les cellules eucaryotes sont compartimentées 2. les cellules eucaryotes ont un cytosquelette À propos du noyau : - l information génétique y est stockée - circulation contr QUELS SONT LES PRINCIPAUX INVARIANTS DES CELLULES VIVANTES? 1. l information génétique, contenue dans des séquences linéaires d ADN (parfois d ARN), est répliquée et transmise aux cellules filles 2. la séquence linéaire d ADN code à la fois la séquence linéaire et la structure en 3D des ARN et des protéines 3. des macromolécules sont assemblées à partir de sous-unités 4. des interactions entre signaux et récepteurs orientent les constituants cellulaires 5. les constituants cellulaires migrent 6. les récepteurs et les mécanismes de signalisation 7. des mécanismes de rétrocontrôle moléculaire régulent QUELLES SONT LES STRUCTURES MOLECULAIRES IMPORTANTES DANS UNE CELLULE? - l eau - les protéines - les acides nucléiques - les glucides - les lipides L EAU Ion + Ion -
- 8 - Pourquoi ces associations? Parce que dans l eau liquide, l atome d oxygène a une charge partielle et les atomes d hydrogène ont une charge partielle + Ces interactions permettent la dissolution des sels : dans de l eau liquide, les ions + et (comme Na+ et Cl-) sont séparés les uns des autres. LES PROTEINES : C EST QUOI? un groupement aminé H H 2 N C C un groupement carboxylique O une chaîne latérale R OH Parfois, R peut subir une modification chimique (phosphorylation, méthylation) : c est une manière de contrôler la fonction de la chaîne latérale, et donc du polypeptide. En solution aqueuse, les groupements terminaux sont ionisés : NH3 + et COO - LES PROTEINES : QUELLE EST LEUR STRUCTURE? Comment se forme un dipeptide? O O NH2 --- CH C OH H N CH C OH R1 H R2 O O NH2 --- CH C ------------------- N CH C OH R1 H R2 Extrémité N-ter(minale) extrémité C-ter(minale) - hélice α, représentée par une spirale - feuillet β, représenté par un ruban orienté Schéma d un polypeptide
- 9 - LES ACIDES NUCLEIQUES : C EST QUOI? Un nucléotide, c est : - une base azotée - un sucre - un phosphate niveau 1 : niveau 2 : niveau 3 : base base + sucre = nucléoside base + sucre + groupement phosphate = nucléotide LES GLUCIDES : C EST QUOI? Un glucide simple = un ose - ribose - désoxyribose QU EST-CE QU UN BIOPOLYMERE? Les polymères de petites molécules sont capables d assurer des fonctions très diverses et nombreuses C est le cas : - des acides aminés les protéines - des nucléotides les acides nucléiques - QUELLES SONT LES LIAISONS CHIMIQUES DONT ON VA REPARLER DANS CE COURS ET DANS LE COURS DE BIOCHIMIE STRUCTURALE 1? Quand des atomes individuels forment des liaisons chimiques entre eux, ils donnent naissance à des molécules.
- 10 - La liaison covalente Elle est formée quand les électrons de deux atomes sont mis en commun La liaison covalente polaire C est cette liaison que l on trouve entre O et H dans l eau Quelles sont les interactions non covalentes qui déterminent la structure 3D des protéines et des acides nucléiques? Les interactions faibles jouent un rôle très important La liaison hydrogène SI l hydrogène est impliqué dans une liaison covalente polaire, ALORS il porte une charge positive partielle. Cette δ+ va attirer et s associer avec des molécules (ou des parties de molécules) qui portent une charge partielle négative δ-. Des liaisons H peuvent s établir : - entre atomes d une même molécule - ou entre atomes de molécules différentes La liaison hydrophobe Appelée aussi liaison non polaire Les composés non polaires ne peuvent se mélanger à l eau. Exemple : CH3 CH2 O δ- CH2 CH2 O δ- CH2 O δ- O δ- La liaison ionique Les électrons ne sont pas mis en commun Les électrons sont associés plus étroitement au noyau de l atome d oxygène (= les électrons passent «plus de temps» à proximité du noyau d oxygène)
- 11 - Quand il y a seulement C et H les liaisons ne sont pas polaires car c et H partagent à égalité leurs électrons. Les 4 liaisons formées par le carbone montrent une symétrie tétrahédrale. Résumé des effets des interactions non covalentes sur la structure 3D d une chaîne polypeptidique L effet de ces interactions est de contraindre une chaîne linéaire à se replier Exemple d une chaîne polypeptidique Liaisons H Liaison Acides aminés chargés - + - - Forces de Van Der Waals Groupe Cycles (anneaux