Catalogue des prestations et services

PLATEFORME GÉNOME-TRANSCRIPTOME DE BORDEAUX Catalogue des prestations et services CONTACTS Site internet de la Plateforme : https://www4.bordeaux-aquitaine.inra.fr/pgtb Responsables des sites : Cestas (Pierroton) - salin@pierroton.inra.fr Villenave d Ornon - cecile.bres@bordeaux.inra.fr Bordeaux (Carreire) - christophe.hubert@u-bordeaux2.fr Direction : Pascal SIRAND-PUGNET - sirand@bordeaux.inra.fr Patricia FERGELOT-MAURIN - patricia.fergelot@chu-bordeaux.fr Responsable Qualité : Sarah MONLLOR - monllor@pierroton.inra.fr

Plateforme Génome-Transcriptome Sommaire Présentation P. 1 Vous souhaitez P. 2 Séquencer P. 2 Génotyper P. 3 Utiliser les autres services de la Plateforme P. 4 Séquençage P. 5 Sanger ABI3130xl P. 5 ABI3730 P. 6 NextGen Préparation de librairies et GAIIX (Illumina) P. 7 Préparation de librairies et PGM (LifeTechnologies) P. 8 Mise à disposition du GS Junior (Roche) P. 9 Nouveautés : MiSeq et PROTON P.10 Génotypage P.11 Génotypage de microsatellites ABI3130xl P.11 ABI3730 P.12 Licors P.13 Génotypage de SNP Sequenom MassARRAY P.14 Roche LC480 (HRM, TaqMan, Kaspar) P.15 TILLING P.16 Autres services P.17 Dosage d acides nucléiques Dosage sur Bordeaux P.17 Dosage sur Pierroton P.18 PCR et commandes d oligos PCR simplex ou multiplex P.19 qpcr P.19 Commandes d oligos P.19 Mise à disposition des thermocycleurs P.19 Construction de librairies PippinPrep P.20 Nouveauté : Fluidigm P.20 Construction de librairies et Robotique Purification en billes paramagnétiques P.21 Robotique CHEMAGICSTAR et STARLET (Hamilton) P.22 Analyse bioinformatique P.23 Demande de prestation et engagements P.24 Nous situer P.25

Plateforme Génome-Transcriptome Présentation Bienvenue sur la Plateforme Génome-Transcriptome de Bordeaux! La Plateforme Génome-Transcriptome est une des sept plateformes du Centre de Génomique Fonctionnelle de Bordeaux (CGFB). Elle est organisée sur trois sites : Bordeaux (Carreire), Villenave d'ornon et Cestas (Pierroton). Elle a vu le jour par fusion de deux plateformes : la plateforme Génotypage-Séquençage et la plateforme Transcriptome en 2009 et a été labellisée «plateforme stratégique» la même année par le GIS-IBiSA et par l INRA. Dans le domaine de la génomique, la Plateforme Génome-Transcriptome a pour vocation de satisfaire les besoins en génotypage, séquençage et TILLING liés aux activités de recherche des laboratoires, et d être un centre ouvert à l ensemble de la communauté scientifique académique (INRA, CNRS, INSERM, Universités ) et industrielle. De ce fait, notre Plateforme propose différents services : la mise à disposition d outils de hautes technicités, la formation des utilisateurs aux nouvelles technologies, les collaborations pour des projets de recherche et développement et les prestations de service. Le personnel de la Plateforme met tout en œuvre pour assurer son bon fonctionnement à tous niveaux : organisation de l'activité, formation par compagnonnage, suivi des projets et des analyses, gestion du matériel et des équipements. Pour ce faire, notre Plateforme est engagée dans une démarche qualité et est certifiée ISO 9001 : 2008 depuis février 2012. Cette démarche qualité a pour vocation de garantir la qualité des manipulations réalisées et des données produites, et de satisfaire les exigences des collaborateurs de la Plateforme. Dans ce catalogue vous trouverez toutes les informations et recommandations concernant les services proposés par notre Plateforme. Toutes ces activités sont réalisées dans le cadre de prestations de service ou de mise à disposition d outils. Toutefois, certaines activités peuvent être réalisées dans le cadre de projet de recherche et développement, notamment pour l installation de nouveaux équipements. S'il vous reste des questions à l issue de votre lecture, n'hésitez pas à vous rapprocher du personnel Plateforme et nous pourrons ensemble étudier la faisabilité de votre projet. De plus vos éventuelles remarques nous seront utiles dans le cadre de l'amélioration continue de nos services. Le personnel de la Plateforme

Plateforme Génome-Transcriptome Vous souhaitez Bas et moyen débits (Sanger) Séquencer Haut débit (Séquençage Nouvelle Génération) Analyse bioinformatique Voir P.23 ABI3130xl ABI3730 PGM GS Junior GAIIX Voir P.5 Voir P.6 Voir P.8 Voir P.9 Voir P.7 Nouveauté PROTON Voir P.10 Nouveauté MiSeq Voir P.10 Nous contacter Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Site de Bordeaux christophe.hubert@u-bordeaux2.fr La Plateforme propose de nombreuses solutions de séquençage à bas, moyen et haut débit (NGS) qui s adapteront à votre projet de recherche. N hésitez pas à nous contacter afin d étudier ensemble la faisabilité de votre projet. Page 2

Plateforme Génome-Transcriptome Vous souhaitez Génotyper Analyse bioinformatique SNP Microsatellites TILLING Voir P.23 Voir P.16 LC480 Sequenom Licors ABI3130xl ABI3730 Voir P.15 Voir P.14 Voir P.13 Voir P.11 Voir P.12 Nous contacter Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Site de Bordeaux christophe.hubert@u-bordeaux2.fr Site de Villenave cecile.bres@bordeaux.inra.fr La Plateforme offre une diversité de services de génotypage sur ces trois sites. N hésitez pas à nous contacter afin d étudier ensemble votre projet scientifique et déterminer la technique la plus adaptée à vos besoins. Page 3

Plateforme Génome-Transcriptome Vous souhaitez Construction de librairies PippinPrep Voir P.20 Nouveauté Fluidigm Access Array Voir P.20 Utiliser les autres services Robotique Hamilton CHEMAGICSTAR et STARLET Voir P.22 Purification en billes paramagnétiques manuelle/robotique sur Beckman NX Voir P.21 Dosages d acides nucléiques Nanodrop Bioanalyzer Spectrofluorimètre (Picogreen) Voir P.17 et 18 PCR, qpcr PCR Commande d oligos Mise à disposition des thermocycleurs Voir P.19 LC480/ABI 7500 (qpcr) Voir P.17 et P.19 Analyse bioinformatique Voir P.23 La Plateforme dispose de services complémentaires pour le contrôle et la préparation de vos échantillons. Ces activités sont mises à disposition des utilisateurs ou réalisées par le personnel de la Plateforme. Nous contacter Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Site de Bordeaux christophe.hubert@u-bordeaux2.fr Site de Villenave cecile.bres@bordeaux.inra.fr Page 4

Site de Bordeaux christophe.hubert@u-bordeaux2.fr Séquençage Sanger ABI3130xl Séquençage complet Le séquençage est réalisé à partir de plusieurs matrice de départ possible : PCR, plasmide, ADNg (bactérie ou levure). Il comprend la purification des matrice (PCR), la réaction de séquence, la purification des réactions de séquence, et la préparation de la plaque de dépôt par l utilisateur ou le personnel de la Plateforme. La migration est prise en charge uniquement par le personnel de la Plateforme. Dans le cadre du séquençage complet par le personnel de la Plateforme, l utilisateur devra fournir entre 20 et 100 µl de produits PCR (même volume pour tous les échantillons) et devra fournir les amorces (à 10 µm) utilisées pour la PCR préséquençage. Dans le cas de la réalisation du séquençage par le personnel de la Plateforme, les échantillons peuvent être déposés ou livrés selon les modalités définies. Dans le cadre d un passage sur séquenceur et du séquençage complet par le personnel de la Plateforme, l utilisateur dépose ses échantillons dans le réfrigérateur dédié aux dépôts d échantillon. Si l utilisateur désir mettre des noms spécifiques à ces échantillons. Le plan de nom doit nous parvenir avant le dépôt des échantillons à l adresse suivante : Plateforme.sequencage@u-bordeaux2.fr Passage sur séquenceur Comprend la migration des séquences prêtes au dépôt (culots purifiés resuspendus dans la formamide). Le contrôle est ajouté par la Plateforme. Rendu des résultats Les séquençages sont disponibles via un serveur FTP pendant 3 semaines. Les données sont ensuite supprimées. Contrôles Un échantillon de plasmide pgem est séquencé en même temps que les échantillons à analyser pour chaque run. Ceci est un contrôle de bonne réalisation de la migration. La séquence du contrôle sera acceptée si la longueur de lecture est de 650 pb. Je n oublie pas D envoyer la fiche de demande de séquençage à Plateforme.sequencage@u-bordeaux2.fr De laisse le puits A1 libre pour les dépôts en plaque. Logiciel d analyse disponible P.23 Page 5

Site de Pierroton Séquençage pgtp@pierroton.inra.fr Sanger ABI3730 Séquençage complet Comprend la purification de produits PCR ou de plasmides, la réaction de séquence, la purification des réactions de séquence, et la préparation de la plaque de dépôt par l utilisateur ou le personnel de la Plateforme. La migration est prise en charge uniquement par le personnel de la Plateforme. Pour une demie-plaque 96, les échantillons sont placés dans les colonnes impaires et le puits H11 doit être laissé libre pour le contrôle. Pour une plaque 96 complète, les puits H11 et H12 doivent être libre laissés libres pour les contrôles. L utilisateur vient avec ses échantillons sur la Plateforme pour réaliser le séquençage et le plan de plaque (via une macro et selon les modalités). Dans le cas de la réalisation du séquençage par le personnel de la Plateforme, les échantillons en plaque peuvent être déposés ou livrés selon les modalités définies. La PCR avant séquençage n est pas comprise dans cette prestation, mais peut toutefois être réalisée par l utilisateur dans nos locaux ou par le personnel de la Plateforme (cf. Prestation PCR et Mise à disposition d outils). Passage sur séquenceur Migration des séquences prêtes au dépôt (culots purifiés resuspendus dans la formamide). Le contrôle est ajouté par la Plateforme. Logiciel d analyse disponible P.23 Dans le cadre du séquençage complet par le personnel de la Plateforme, l utilisateur devra fournir entre 20 et 100 µl de produits PCR (même volume pour tous les échantillons) et devra fournir les amorces (500 µl à 2 µm) utilisées pour la PCR pré-séquençage. Dans le cadre d un passage sur séquenceur et du séquençage complet par le personnel de la Plateforme, l utilisateur dépose ou envoie sa plaque au personnel de la Plateforme. Il devra transmettre par mail le plan de plaque et le gel de contrôle de la PCR au personnel de la Plateforme. Contrôles Je n oublie pas Un échantillon de plasmide pgem est séquencé en même temps que les échantillons à analyser pour chaque run. Ceci est un contrôle de bonne réalisation de la migration. La séquence du contrôle sera acceptée si la longueur de lecture est de 650 pb. De laisser les puits H11 et H12 libres de tout échantillon pour les contrôles et d utiliser la macro disponible sur le NAS pour réaliser le plan de plaque. Page 6

Site de Bordeaux christophe.hubert@u-bordeaux2.fr Séquençage Nextgen Préparation de librairies et GAIIX (Illumina) Préparation des librairies Comprend la prise en charge des échantillons à partir de l ADN génomique ou de l ARN total. Les étapes de fragmentation, de ligation des adapateurs, d enrichissement, de validation sur Bioanalyzer sont gérées par le personnel de la plateforme ou par les utilisateurs après mise en autonomie. La manipulation des appareils cbot et GAIIx est elle piloté essentiellement par le personnel de la plateforme. Les librairies paired end, mate-pair, Sureselect et RNA-seq sont disponibles sur la plateforme. Séquençage GAIIX Flowcell complète : SR et PE, de 50 à 100 pb 25 à 49 Gbases, 245 millions reads. Une lane : SR et PE, de 50 à 100 pb 3,5 à 7 Gbases, 35 millions reads. Covaris La fragmentation des échantillons est réalisée par ultrasonication via un Covaris S2. Les tailles obtenues sont de 175 à 600 pb pour les librairies paired end et 2000 à 5000 kb pb pour les librairies mate-pair. Contrôles de construction de librairie Une première validation du matériel est réalisée avant la construction de la librairie. L utilisateur est contacté dans le cas où un problème serait détecté sur un échantillon. La validation de la construction des librairies est faite sur puce High Sensitivity d Agilent sur Bioanalyzer 2100. Conservation des constructions de librairie Les librairies sont stockées avant séquençage à une concentration de 20 pm à -20 C. Après validation du séquençage les librairies sont éliminées. L utilisateur doit nous faire part avant le séquençage de son désir de conserver les librairies. Contrôles de séquençage Une lane est dédiée au contrôle de séquençage. Elle contient une librairie de PhiX fourni par la société Illumina. La validation du bon fonctionnement du séquençage sur l appareil est conditionné par l obtention des valeurs suivantes sur cette lane contrôle : Taux de clusterisation > 400k / title. % de reads qui passent les filtres constructeur (PF) > 80%. % des reads PF qui s'alignent sur la référence PhiX > 80%. PE/SR-ADN : 1 µg minimum à 33 ng/µl PE/SR-ARN : 5 µg minimum à 33 ng/µl Mate pair : 10 µg minimum à 33 ng/µl SureSelect : 3 µg minimum à 33 ng/µl Les échantillons doivent être correctement identifiés et déposés en main propre à un personnel de la plateforme. Rendu des résultats Les données d analyse de séquençage sont disponibles via un serveur FTP pendant une durée de 1 mois à compter de la fin de l analyse bioinformatique. Le run minimal est conservé pendant 6 mois. Logiciel d analyse disponible P.23 Page 7

Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Séquençage NextGen Préparation de librairies et PGM (LifeTechnologies) Le PGM Ion séquenceur est idéal pour le séquençage de petits génomes, un ensemble de gènes, une approche de métagénomique, du Chip-Seq, les approches ampliseq Cancer panel Préparation des librairies Comprend la prise en charge des échantillons à partir de l ADN génomique ou d amplicons (ARN possible en projet R&D) pour du séquençage de novo. Les étapes de fragmentation, de ligation des adapateurs, d enrichissement, de validation sur Bioanalyzer sont gérées par le personnel de la plateforme ou par les utilisateurs après mise en autonomie. Contrôles des librairies Une première validation du matériel est réalisée avant la construction de la librairie. L utilisateur est contacté dans le cas où un problème serait détecté sur un échantillon. La validation de la construction des librairies et de l enrichissement est faite sur puce High Sensitivity d Agilent sur Bioanalyzer 2100 et sur Qubit (QC des empcr = [10-30 %]). Séquençage Le volume de données générées est variable selon la puce utilisée : - 314 : 400-550 milliers de reads, - 316 : 2-3 millions de reads, - 318 : 4-5.5 millions de reads. Soit de 30 Mégabases (kit 200 pb sur puce 314) à 1 Gigabases (kit 200 pb sur puce 318). La taille des fragments séquencés varie de 200 à 400 pb. Logiciel d analyse disponible P.23 Validation du run Le run est validé lorsque : - le nombre de reads est conforme aux spécificités de chaque puce (voir ci-contre dans Séquençage), -% Ion Sphere Particles enrichies > 90 %, - % des 50AQ17 > 75 %. Les échantillons doivent être correctement identifiés et déposés en main propre à un personnel de la plateforme. Ils doivent répondre à des critères de qualité et de quantité minimales (ratio 260/280 = [1.8-2] et quantité d au moins 1µg). Je n oublie pas De prévenir le personnel de la Plateforme des dates de manipulations, afin que celle-ci puisse prévoir dans son planning les maintenances des équipements et le lancement des runs. Page 8

Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Séquençage NextGen Mise à disposition du GS Junior (Roche) Adapté pour l approche «Targeted Resequencing» et l approche métagénomique, le GS junior vous fournira plus de 100 000 séquences de 450 bp par Run Séquençage Le GS Junior est un séquenceur nouvelle génération mis à disposition des utilisateurs sur la Plateforme, après une formation à la partie humide. La maintenance de l équipement avant et après run est prise en charge par la Plateforme. Le volume de données générées est de 20 Mégabases à 2 Gigabases pour des fragments de 200 bp ou de 400 bp. Les préparations des librairies et des runs sont prises en charge par l utilisateur. Les kits sont commandés par l utilisateur via sa tutelle. Les échantillons sont gérés par l utilisateur. Ils peuvent être stockés sur la Plateforme le temps du projet. Contrôle des librairies Le contrôle des librairies est un contrôle d enrichissement du complexe billes/adn. Si la quantité billes/adn est dans la fenêtre d enrichissement, l utilisateur réalise la préparation de la puce et la Plateforme se chargera du lancement du run. Dans le cas où la quantité billes/adn n est pas dans la fenêtre d enrichissement, nous recommandons de ne pas poursuivre les manipulations. Toutefois si l utilisateur souhaite poursuivre son analyse, la Plateforme décline toute responsabilité en cas d échec du run. Je n oublie pas De prévenir le personnel de la Plateforme des dates de manipulations, afin que celle-ci puisse prévoir dans son planning les maintenances avant et après run du GS Junior. Logiciel d analyse disponible P.23 Validation du run Le run est validé lorsque : - 40Mbases minimum (ce qui fait environ 80 000 séquences environ selon la longueur). Attention, il s agit d une valeur indicative pouvant varier selon la longueur des séquences, - dot + mixed < 10-15 %, - short quality <= 30 %. Page 9

Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Site de Bordeaux christophe.hubert@u-bordeaux2.fr Séquençage NextGen Nouveautés MiSeq (Illumina) Mis en service depuis Juin 2013 sur le site de Bordeaux 15 millions de lectures, Longueur de 250 pb x 2, 7,5 Gigabases Applications : Métagénomique 16S, séquençage de novo de petits génomes, DNA-Seq et RNA-Seq ciblés Complément Le MiSeq est un séquenceur nouvelle génération de la société illumina. Ces capacités représentent 1/10 du GAIIx. Le séquençage de 2 X 250 pb peut être réalisé en 36h avec génération des données brutes (FASTQ). Le séquenceur est associé à son programme d analyse MiSeq reporter qui permet de réanalyser ses données en fonction de ses besoins. PROTON (LifeTechnologies) Mis en service depuis Mai 2013 sur le site de Pierroton Des runs de près de 80 Gigabases Applications : RNA-Seq, RAD-Seq, séquençage de novo d exomes et de génomes Complément Le Proton est le grand frère du séquenceur PGM. Sa capacité accrue permet d'envisager le séquençage de génomes plus conséquents. Basé sur la technique de détection de protons, il fonctionne avec 2 types de puces déterminant la quantité de séquences : puce PI : 10 GigaBases et puce PII : 80 GigaBases (09/2013). Les séquences font en moyenne 200base de long. Page 10

Site de Bordeaux christophe.hubert@u-bordeaux2.fr Génotypage Génotypage de microsatellites ABI3130xl Migration de fragments en simplex ou multiplex, QMF, Typage cellulaire, SnapShot Passage sur séquenceur Comprend la migration des produits de PCR avec un marqueur de taille interne. Les marqueurs de taille disponibles sur la plateforme sont : ROX350, ROX500, ROX1000, LIZ120, LIZ600, ILS600. Différents temps d injection peuvent être programmés en fonction du matériel à analyser. Chaque temps d injection donnera lieu à la facturation d une injection. Pour toute analyse un volume minimal de 5 µl est demandé. Plusieurs injections seront réalisées pour obtenir la meilleure gamme dynamique Si l utilisateur désire mettre des noms spécifiques à ses échantillons, le plan de noms doit nous parvenir avant le dépôt des échantillons. L utilisateur dépose ses échantillons dans le réfrigérateur dédié aux dépôts d échantillon ou nous les envoie par voie postale. Rendu des résultats Les séquences sont disponibles via un serveur FTP pendant 3 semaines. Les données sont ensuite supprimées. Contrôles Le contrôle est le marqueur de taille interne (utilisé pour les échantillons) resuspendu dans la formamide (0,3 µl dans 8,7 µl de formamide). Je n oublie pas De spécifier le marqueur de taille que je veux. Logiciel d analyse disponible P.23 Page 11

Site de Pierroton Génotypage pgtp@pierroton.inra.fr Génotypage de microsatellites ABI3730 Génotypage d échantillons en simplex ou multiplex Génotypage complet Préparation de la dilution et de la plaque de dépôt par l utilisateur ou le personnel de la Plateforme. La migration est obligatoirement prise en charge par le personnel de la Plateforme. Pour une demi-plaque 96, les échantillons sont placés dans les colonnes impaires et le puits H11 doit être libre d'échantillon pour le contrôle. Pour une plaque 96 complète, les puits H11 et H12 doivent être libre d'échantillon pour les contrôles. L utilisateur vient avec ses échantillons sur la Plateforme pour réaliser le génotypage et le plan de plaque (via la macro et selon les modalités). Dans le cas de la réalisation du génotypage par le personnel de la Plateforme, les échantillons en plaque peuvent être déposés ou livrés selon les modalités définies. L utilisateur devra également informer le personnel de la Plateforme de la dilution à réaliser. Dans le cadre du génotypage complet par le personnel de la Plateforme et d un passage sur séquenceur, l utilisateur devra fournir 10 µl de produits PCR. Il devra également transmettre par mail le plan de plaque et le gel de contrôle de la PCR au personnel de la Plateforme. Pour toutes analyses, l utilisateur déposera entre 1 et 3 µl de produits PCR à la bonne dilution dans 10 µl de formamide. Passage sur séquenceur Migration des produits PCR dilués et déposés en plaque AB2400 avec contrôle(s) déjà déposé(s). L utilisateur dépose ou envoie sa plaque prête au dépôt. Logiciel d analyse disponible P.23 Contrôles Le contrôle est le marqueur de taille (utilisé pour les échantillons) resuspendu dans la formamide (0,1 µl dans 10 µl de formamide). Les marqueurs de taille disponibles sur la Plateforme sont le Liz-600 et le Liz-1200. Je n oublie pas De laisser les puits H11 et H12 libres de tout échantillon pour les contrôles et d utiliser la macro disponible sur le NAS pour réaliser le plan de plaque. Page 12

Site de Villenave cecile.bres@bordeaux.inra.fr Génotypage Génotypage de microsatellites Licors Génotypage La prestation peut être réalisée tout ou en partie par l utilisateur ou par le personnel plateforme (test des primers, préparation de la PCR marquée, dilution et dépôt sur le séquenceur). Dans le cas de réalisation par l utilisateur, une mise en autonomie est réalisée par le personnel plateforme pour l utilisation des séquenceurs Licors et des appareils annexes tels que les thermocycleurs ou le robot pipeteur (seulement pour du moyen ou haut débit) Passage sur séquenceur Migration jusqu à 192 échantillons/gel en deux dépôts. Contrôles Dans le cadre de la mise en autonomie, l utilisateur sera formé afin de pouvoir déterminer la dilution à effectuer en fonction des résultats de sa PCR. Ainsi, aucun puits ne sera réservé à un contrôle de la plateforme. Seul le fichier de sortie de séquenceurs sera conservé par la plateforme en contrôle du bon déroulement du run. Test de polymorphisme Screening population en ségrégation Page 13

Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Génotypage Génotypage de SNP Sequenom MassARRAY Génotypage de SNP par spectrométrie de masse. Réalisation de puces Génotypage SNP de 382 échantillons minimum (ou 191 pour un nombre paire de multiplex). L utilisateur peut réaliser le génotypage sur la Plateforme (depuis le design des multiplex jusqu à l analyse des résultats). Le spotting et le run d analyse sont réalisés uniquement par le personnel de la Plateforme. Possibilité de réalisation partielle ou totale de la partie «humide» et de l analyse par le personnel de la Plateforme. Les commandes d oligos sont obligatoirement réalisées par la Plateforme pour des raisons de qualité (IDT). Contrôles Le contrôle positif est un plex de 3 SNP validés qui suit le même process que les échantillons à analyser. Le contrôle négatif est le mix oligos + eau (utilisée pour la préparation des mix). La Plateforme analyse les contrôles et les transmets aux utilisateurs. Ils font foi du bon déroulement de la partie «humide». 10 µl d ADNg traités à la Rnase à 15 ng/µl en plaque 96. Les échantillons doivent être fournis en plaque si possible code-barrée. Les plans de plaque doivent être fournis par mail au personnel de la Plateforme. L utilisateur devra également fournir les résultats de dosage des échantillons par mail. Le personnel de la Plateforme peut prendre en charge le dosage et la dilution des échantillons (cf. Prestation Quantit et Robotique). Je n oublie pas De laisser libres les puits H11 et H12 de ma première plaque 96 (sur les 4 à fournir) pour les contrôles internes, dans le cas d un génotypage de 382 échantillons simultanés. Dans le cas d un génotypage de 191 échantillons simultanés, je n oublies pas de laisser libre le puits H11 de ma première plaque 96 (sur les 2 à fournir) pour les contrôles internes. Logiciel d analyse disponible P.23 Page 14

Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Génotypage Génotypage de SNP Roche LC480 Par HRM ou TaqMan/KASPar, analyse de 1 SNP en simplex. Génotypage SNP par HRM Technique basée sur l'analyse de la dénaturation en haute résolution (HRM: «high-resolution melting») de l'adn. Génotypage SNP de 96 ou 384 échantillons. L utilisateur vient avec ses échantillons sur la Plateforme pour réaliser le génotypage. Réalisation par l utilisateur uniquement. 10 µl d ADNg traités à la Rnase à 15 ng/µl en plaque 96 ou 384. Les plans de plaque doivent être fournis par mail au personnel de la Plateforme. Contrôles Les contrôles sont faits par l'utilisateur grâce à des réplicats. Génotypage SNP par TaqMan/Kaspar Technique basée sur l hybridation allèle spécifique. TaqMan : marquage fluorescent spécifique. KASPar : marquage fluorescent universel. Génotypage SNP de 96 ou 384 échantillons. L utilisateur vient avec ses échantillons sur la Plateforme pour réaliser le génotypage. Réalisation par l utilisateur uniquement. 10 µl d ADNg traités à la Rnase à 15 ng/µl en plaque 96 ou 384. Les plans de plaque doivent être fournis par mail au personnel de la Plateforme. Contrôles Les contrôles sont faits par l'utilisateur grâce à des réplicats. Page 15

Site de Villenave cecile.bres@bordeaux.inra.fr Génotypage TILLING Le TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) a pour but la détection de mutations inconnues chez des gènes cibles sur la population de mutants MicroTom. Génotypage Après l envoi de la séquence d intérêt par le collaborateur, nous effectuons une analyse de celleci afin de sélectionner la partie du gène (1,5 kb) présentant la plus forte probabilité de présenter un KO (Knock Out). La collection est ainsi génotypée sur cette portion du gène et les familles présentant des mutations d intérêts sont isolées. Après confirmation par séquençage, les résultats sont envoyés au collaborateur. L'équipe Génomique Fonctionnelle du Développement du Fruit de l'umr Biologie du Fruit a développé une collection de mutants fortement mutagénéisés par l'ems qui comprend 8 500 familles de mutants M2 chez la tomate miniature MicroTom ainsi qu'une base de données phénotypiques associée (MMDB) décrivant près de 3 500 familles M2 de mutants (soit 42 000 plantes). Page 16

Site de Bordeaux christophe.hubert@u-bordeaux2.fr Autres services Dosage d acides nucléiques Dosage sur le site de Bordeaux Dosage et détermination de la qualité d ADN, d ARN et de fragments de PCR PCRq ABI 7500 Applied Biosystems Dosage sur Nanodrop L utilisateur vient pour ses dosages spectrophotométriques. Les pipettes et les cônes sont mis à sa disposition Analyse PCRq L appareil est mis à disposition. L utilisateur vient avec sa ou ses plaques prêtes à être analysées. Les analyses suivantes peuvent être réalisées : Quantification relative et absolue Dosage de 1 à 12 échantillons par puce (11 pour ADN High Sensitivity). L appareil accepte les plaques 96 puits avec film de couverture optique PCR Je n oublie pas De contacter la plateforme par mail ou par téléphone pour réserver les appareils au moins 48h à l avance. Dosage sur Bioanalyzer Technique basée sur la micro-fluidique permettant de doser et déterminer la qualité de fragments de PCR et d ARN. Fourniture des réactifs et consommables pour la réalisation par l utilisateur d une puce ADN, ARN ou ADN High Sensitivity. Possibilité de réalisation par le personnel de la Plateforme. Dosage de 1 à 12 échantillons par puce (11 pour ADN High Sensitivity). Contrôles Pour chaque type de puce, l échelle de taille et le marqueur interne du kit font office de contrôle du bon fonctionnement du kit et de l appareil. Page 17

Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Autres services Dosage d acides nucléiques Dosage sur le site de Pierroton Détermination de la quantité et de la qualité d ADN, d ARN et de fragments de PCR Dosage sur Nanodrop Technique basée sur la mesure de la densité optique. Dosage à l'échantillon ou par plaque 96. Réalisation par l utilisateur uniquement. Dans le cadre de dosage par le personnel de la Plateforme, les échantillons doivent être fournis en plaque 96. Dosage sur Bioanalyzer Technique basée sur la micro-fluidique permettant de doser et déterminer la qualité de fragments de PCR et d ARN. Fourniture des réactifs et consommables pour la réalisation par l utilisateur d une puce ADN, ARN ou ADN High Sensitivity. Réalisation uniquement par le personnel de la Plateforme. Dosage de 1 à 12 échantillons par puce (11 pour ADN High Sensitivity). Contrôles Pour chaque type de puce, le marqueur de taille et le témoin de migration sont utilisés pour valider la puce. Dosage Picogreen (Spectrofluorimètre TECAN) Technique basée sur la fluorescence permettant de doser et déterminer la qualité d ADN. Fourniture des réactifs et consommables. Possibilité de réalisation par le personnel de la Plateforme. Dosage jusqu à 376 échantillons en parallèle. Les échantillons doivent être fournis en plaque 96. Contrôles Le r 2 de la gamme étalon fait office de contrôle de la bonne préparation des échantillons pour leur dosage. Page 18

Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Autres services PCR et commandes d oligos PCR simplex ou multiplex PCR simplex et multiplex Fourniture des réactifs et consommables pour la réalisation uniquement par l utilisateur d une PCR simplex ou multiplex pour 94 échantillons minimum. Sont compris dans la prestation : dosage au Nanodrop et dilution des échantillons, amplification, et électrophorèse de contrôle des produits de PCR sur gel d agarose. Contrôles La PCR est réalisée avec un témoin négatif (mix PCR + eau) et un témoin positif (fournis par l'utilisateur). Ils seront placés respectivement en H11 et H12 pour une plaque 96. L utilisateur gère ses échantillons. Ceux-ci peuvent être stockés sur la Plateforme le temps du projet. Je n oublie pas De laisser les puits H11 et H12 libres de tout échantillon pour les contrôles. qpcr qpcr (ROCHE LC480) Fourniture des réactifs et consommables pour la réalisation sur la Plateforme de PCR quantitative par SYBRGreen. Réalisation par l utilisateur uniquement. Contrôles Les contrôles sont faits par l'utilisateur grâce à des réplicats. Commandes d oligos Commandes d oligos Possibilité de prise en charge par la Plateforme des commandes d oligos marqués ou non-marqués dans le cadre des applications standards de la Plateforme. Cette prestation est obligatoire dans le cadre de manipulations Sequenom (IDT). Mise à disposition des thermocycleurs Thermocycleurs Tétrade et Veriti 3 blocs 96 et 1 bloc 384 sont à disposition des utilisateurs sur la tétrade et 2 blocs 96, 2 blocs 384, et 1 bloc 96 FAST sont disponibles sur les Veriti. Page 19

Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Autres services Construction de librairies PippinPrep Sélection par la taille de fragments d acides nucléiques PippinPrep Cet équipement permet de sélectionner dans une solution d ADN les fragments d une taille choisie (dans la gamme possible de taille pour un type de cassette donné) en 50 à 120 min. Les cassettes proposées sont soit des 2% permettant une sélection entre 100 bp et 600 bp; soit des 1,5 % qui permettent une sélection entre 250 bp et 1500 bp. Les échantillons sont fournis en tube 1,5 ml en solution dans l eau (milliq) ou du TE dans un volume de 40 µl minimum. La quantité d ADN de l échantillon sera compris entre 120 ng et 10 µg. Les échantillons seront systématiquement dosés au Nanodrop. Un volume de l échantillon initial est conservé pour un contrôle. Contrôles La cassette utilisée est contrôlée en interne par la machine. Le «sizing» est réalisée grâce à la comigration d un ladder. Le contrôle de sélection est réalisé après sélection et purification Ampure par un run sur bioanalyzer par comparaison avec l échantillon de départ qui est déposé sur la même puce. Nouveautés Fluidigm Multiplexage PCR pour séquenceur Next Gen Acces Array System (Fluidigm) Targeted Resequencing PCR en microfluidique (48 échantillons x 48 adaptateurs) pour la préparation des librairies. Equipement accessible en R&D dès maintenant sur le site de Pierroton! Page 20

Site de Bordeaux christophe.hubert@u-bordeaux2.fr Autres services Construction de librairies et Robotique Purification en billes paramagnétiques manuelle/robotique sur Beckman NX Purification de produits PCR et réactions de séquences Purification billes magnétiques Comprend soit : - Purification de produits de PCR par billes paramagnétiques. - Purification des réactions de séquençage par billes paramagnétiques. La prise en charge d un projet par la robotique dépend du nombre d échantillon et des formats d entrée / sortie (compatibilité des consommables avec la robotique) Du tube 0,2 ml à la plaque 96 puits. Le volume minimal de PCR est de 20 µl et le volume minimal de réaction de séquence est de 10 µl. Je n oublie pas D identifier correctement mes tubes et/ou mes plaques. Page 21

Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Autres services Robotique CHEMAGICSTAR et STARLET (Hamilton) Dilution, réarrangement, compactage, transfert d échantillons et distribution de mix ou d ADN Robot CHEMAGICSTAR Permet de diluer des échantillons à partir d une ou plusieurs plaque(s) source(s) avec un diluant au choix (eau, TE ), vers une ou plusieurs plaque(s) destinataire(s). Permet le réarrangement d échantillons de plusieurs plaques sur une ou plusieurs plaque(s) différente(s). Permet le transfert d échantillons de tubes (2 ml Eppendorf ou tubes 500 µl à vis) à une plaque PCR (AB2400). Manipulations possibles par le personnel de la Plateforme sous réserve de leur disponibilité. Robot STARLET Permet de compacter 4 plaques sources d ADN ou de produits PCR en 1 à 5 plaques 384. Permet de préparer une plaque 384 (ADNc et mix Q-PCR) pour un run de Q-PCR sur le LC 480 de Roche. Les échantillons doivent être fournis en plaque 96 (Thermo AB2400), ou en tubes (2 ml Eppendorf ou tubes 500 µl à vis) pour le passage de tubes à plaques. Le volume minimum d échantillon à fournir doit être de 10 µl. Les volumes de pipetage doivent être compris entre 2 et 50 µl pour une meilleure précision. Je n oublie pas De contacter le personnel de la Plateforme pour vérifier les types de plaques sources utilisables en robotique. Dans le cadre de manipulations réalisées par l utilisateur les plaques de destination et les cônes des robots vous seront fournis. Avant toutes manipulations, des fichiers Excel de programmation sont à compléter avec les coordonnées et les volumes à pipeter de vos échantillons. Ces fichiers vous seront fournis par mail. Manipulations possibles par le personnel de la Plateforme sous réserve de leur disponibilité. Page 22

Site de Pierroton pgtp@pierroton.inra.fr Analyse bioinformatique Analyse bioinformatique Les logiciels et les postes informatiques suivants sont mis à disposition des utilisateurs. N hésitez pas à nous contacter pour votre formation aux logiciels! Séquençage SANGER Séquençage Nouvelle Génération 1 PC d analyse avec : - CLC BIO - Roche data analysis 454 1 serveur de calcul avec : - Serveur Galaxy 1 PC d analyse avec : - CondonCode Génotypage de microsatellites Génotypage de SNP par Sequenom Génotypage de SNP par LC480 (qpcr) 2 PC d analyse avec : - Genemapper - GenomeStudio (module génotypage) - Logiciel Light Cycler LC480 1 PC d analyse avec : - MassARRAY Typer4 Sequenom Je n oublie pas De réserver le poste informatique du logiciel que je souhaite utiliser. Page 23

Plateforme Génome-Transcriptome Demande de prestation et engagements Vous souhaitez réaliser un projet ou une analyse Afin que nous étudions votre demande, veuillez contacter par mail ou par téléphone le responsable de site concerné par l analyse que vous souhaitez faire ou par la technique que vous voulez utiliser. Veillez à préciser le nombre et le type d échantillons, la technique ou l équipement à utiliser et toute autre information que vous jugez utile de nous préciser. Après étude de faisabilité et décision commune du type de projet (prestations de service réalisées par le personnel Plateforme ou par vous-même, ou projet R&D), nous vous remettrons quelques documents à compléter pour que votre projet soit engagé. Dès lors, nous vous informerons des conditions à respecter concernant le transport et le stockage de vos échantillons, ainsi que des conditions biologiques (volumes, concentrations ). Dans le cas où vous seriez amenés à travailler sur notre Plateforme, nous vous assurerons une visite des locaux avec toutes les consignes d hygiène et de sécurité, et d accès et d utilisation des laboratoires. Nos engagements La Plateforme et son personnel s engagent à : - mettre à disposition du personnel formé et compétent afin de fournir tout conseil et expertise nécessaire pour la définition, la mise en œuvre et la conduite de votre projet, - proposer des équipements performants et entretenus (maintenances, calibrations ), et mettre à votre disposition le matériel et les techniques nécessaires à la réalisation du projet et des analyses en découlant, - former les utilisateurs désignés à la réalisation des analyses et leur apporter une assistance technique autant que possible, - mettre en œuvre, par l amélioration continue de notre système de management de la qualité, tous les moyens nécessaires pour démontrer notre aptitude à conduire les projets et les analyses conformément à vos exigences et aux exigences réglementaires applicables, - vous informer de l état d avancement de votre projet, - restituer les résultats d analyses dès que possible, - respecter la confidentialité sur la nature des projets réalisés. Les engagements des utilisateurs Les utilisateurs s engagent à : - fournir au responsable du site et au personnel de la Plateforme, toutes les informations sur le projet nécessaires pour mener à bien les analyses en découlant, - respecter les consignes d utilisation de la Plateforme, ses équipements, et les règles d hygiène et de sécurité, - régler les montants correspondants aux activités réalisées sur la Plateforme (décrits dans la demande de prestation), - mentionner l implication de la Plateforme dans toute valorisation scientifique du projet, notamment les publications scientifiques, soit dans les remerciements (cas des prestations simples), soit en associant comme co-auteur le personnel de la Plateforme ayant participé au projet (cas des collaborations). La Plateforme Génome-Transcriptome se réserve le droit d interrompre le projet ou d interdire l accès à la Plateforme à toute personne ne respectant pas l un de ces engagements. De même, un projet pourra être refusé ou interrompu si ces garanties ne sont pas réunies, ou s il semble non conforme à la loi ou éthiquement non recevable. Page 24

Plateforme Génome-Transcriptome Nous situer Site de Bordeaux Adresse : CGFB - Université Bordeaux Segalen 146 rue Léo Saignat 33076 Bordeaux Cedex France Responsable de site : Christophe HUBERT - christophe.hubert@u-bordeaux2.fr - 05 57 57 47 89 Site de Pierroton Adresse : Bâtiment ARTIGA 69 route d Arcachon F-33612 Cestas Cedex France Responsable de site : Franck SALIN - salin@pierroton.inra.fr - 05 57 12 27 77 L'ensemble du personnel : pgtp@pierroton.inra.fr Site de Villenave d Ornon Adresse : UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie Centre de Recherche INRA de Bordeaux 71, Avenue Edouard Bourlaux CS 20032-33882 Villenave d'ornon Cedex France Responsable de site : Cécile BRES - cecile.bres@bordeaux.inra.fr - 05 57 12 25 45 Page 25

A très bientôt sur la Plateforme Génome-Transcriptome