CHAPITRE 5 : LES VIRUS BACTÉRIOPHAGES I) Caractéristiques générales 1.1. Présentation On ne peut pas parler d'organismes, car ils ne sont pas capables de se reproduire ou de se diviser indépendamment dans la nature. Cette division intervient au sein d'une cellule hôte au cours de la réplication. Les virus sont les microorganismes les plus petits que l'on connaisse. Leur étude présente un intérêt puisqu'ils sont responsables en pathologie humaine des pandémies majeures. 1.2. Découverte des virus Au début on a remarqué que certains agents sont filtrables même avec des filtres de très petit calibre ne permettant pas le passage des plus petites bactéries. Ivanovski travaillait sur la mosaïque du tabac, agent qui filtrable et résistant à la chaleur de la sève des plantes infectées. Berckefeld remarqua le premier que les agents qui détruisaient les plantes et ruinaient les agriculteurs étaient des agents infectieux capables de léser et de se multiplier à l'intérieur des tissus des jeunes plantes. 1.3. Caractéristiques principales Ces structures sont capables de se multiplier par activité intracellulaire : - réplication à l'intérieur d'une cellule pour tous les virus - tourne la machinerie cellulaire entièrement à son profit À partir d'une cellule infectée, on peut récupérer jusqu'à 300 nouveaux virus en 3 min. Ce mécanisme ne correspond pas à une division, mais à une réplication. L'information génétique du virus est portée par un acide nucléique qui est localisé dans une nucléocapside protéique. Le virion est la partie infectieuse virale, c'est-à-dire la partie du virus qui attaque la cellule et qui est capable de développer une pathologie. Les virus ont ainsi 3 caractéristiques remarquables : - ils sont incapables de se multiplier indépendamment d'une cellule hôte - ce sont des structures simples - leur information génétique est codée soit par de l'arn soit par de l'adn 1.4. Origines possibles Plusieurs hypothèses sont plausibles pour l origine des virus : - Apparition parallèlement aux microorganismes ou même avant les bactéries. Cette hypothèse se base sur le support de l'information génétique virale. Enfin effet on peut supposer que le monde à ARN a précédé le monde à ADN, puisque la synthèse des nucléotides de l'adn sont produit à partir de ceux de l'arn (la thymine est synthétisée à partir de l'uracyle), et certains ARN sont doués d'activités enzymatiques. Hors les virus sont les seules entités qui portent l'ensemble de leur information sur l'arn pour certains. - Apparition à partir d'un microorganisme infecté par un autre microorganisme, et donc transformation en structure plus simple => hypothèse de révolution rétrograde. - Combinaison de différents morceaux d'acides nucléiques et de protéines de façon aléatoire conduisant à la formation d'une structure.
II) Structure Les virus sont visibles en microscopie électronique (ME). La taille des virus est très variable, allant de la taille d'un ribosome et contenant seulement 4 ou 5 gènes, alors que d'autres sont visibles en MO (microscopie optique). La morphologie des capsides est très variable : - Structure à symétrie icosaédrique : environ 200 faces différentes, composée d'une à deux protéines seulement (unité répétitive) ; le génome est indépendant de la capside (pas d'interactions) : possibilité de capsides vides - Structure à symétrie hélicoïdale : 1 seule protéine répétée plusieurs fois (ex de la mosaïque du tabac = 1 protéine répétée 2850 fois), formation de l'hélice autour de l'acide nucléique - Structure enveloppée : présence d'une membrane autour de la capside provenant de la cellule hôte ayant servie à la réplication et permettant d'échapper au système immunitaire de l'individu infecté ; enveloppe avec spicule (projection permettant la reconnaissance cellulaire) : - Neuraminidase (N) : permet de traverser les couches de muqueuse des épithéliales - Hémagglutinine (H) : permet au virus de s'attacher à la surface des globules rouges (GR), elle permet de quantifier le nombre de virus présent dans le sang par technique d'agglutination des GR - Virus complexes : 1 tête contenant le génome du virus (soit icosaédrique soit hélicoïdale) et 1 corps basal permettant l'attachement à la surface des cellules, avec des appendices reconnaissant la surface des cellules ou des bactéries
III) Propagation et quantification Les protéines de la capside sont liées de façon non covalente, permettant ainsi un contact surface virus/surface cellulaire. Chaque virus a sa propre cellule hôte, il y a donc reconnaissance spécifique de la cellule, ce qui permet une classification des virus en fonction du type cellulaire cible. Si la conséquence de la réplication des virus est la lyse cellulaire, alors on peut voir l'infection virale par développement de zones de nécrose ou mort des bactéries. Les virus peuvent également attaquer une cellule, et rester en "cohabitation" avec elle. Il y a donc une période assez longue où le virus n'est pas visible et ou il ne se réplique pas. Par induction, son expression va un jour se faire, et pour sortir de la cellule, il va utiliser la lyse cellulaire. Ce sont des virus responsables des maladies chroniques. L'étude des virus est importante en biologie moléculaire et pour le génie génétique, car il est facile à analyser, et l'hypothèse dans les années 70 que les virus étaient responsables du développement des cancers a été un facteur stimulant pour son étude. Par centrifugation différentielle, il est possible de séparer les virus en fonction de leur gradient de césium. Les précipitations permettent aussi de compter les virus. On utilise les particularités propres aux virus, comme la reconnaissance immunologique ou les molécules capables de reconnaître les structures virales. La densité des virus dans une solution est de 10-14 pour 1 ml contre 10-10 pour les bactéries. Cette notion permet le comptage des bactéries par dilution, il suffit de mélanger une solution d'un bactériophage purifié et de l'introduire dans une solution bactérienne dont on connaît la concentration en bactéries. Ensuite, on réalise la culture en gélose du mélange. Si le bactériophage est au contact des cellules, on notera une zone de nécrose correspondant à une zone de lyse bactérienne. On compte donc le nombre de colonies négatives restantes. IV) Organisation du génome viral Les génomes peuvent être très petit (3000 à 4000 paires de bases) ou au contraire très développés (200 à 300 kb), allant respectivement de 3 à quelques centaines de gènes. Le support de l'information génétique peut être soit de l'adn (sb ou db) soit de l'arn (sb ou db). Cette caractéristique penche en faveur de l'hypothèse que les virus sont à l'origine de la vie. Si le génome est un ARNsb: - soit il est de configuration positive - soit il est de configuration négative - pendant la réplication, il y a formation d'un ARNdb correspondant à la forme réplicative du génome - si le brin est de polarité +, et qu'il possède une coiffe de méthylguanosine, il peut être directement traduit Il peut y avoir regroupement de gènes: - ARNm précoce nécessaire pour assurer la synthèse des protéines utiles tout de suite - ARNm tardif : protéines nécessaires plus tard dans la réplication
V) Taxinomie Elle est polyphylétique. Grâce à une multiplication très rapide, les virus sont capables d'accumuler un grand nombre de mutations très rapidement, ceci implique que l on ne peut pas établir le portrait d'un virus ancestral du fait de leur grand potentiel mutagène. Il n'y a pas de bonne classification pour les virus. On a répertorié jusqu'à 50 familles de virus différents, on les nomme viridae. Ils sont également classés en une sous famille nommé virinae. l'espèce quant à elle est dénommée virus. Il n'existe pas d'unité virale, il faut toujours savoir quel type d'acide nucléique compose le virus, il faut également savoir s'il est sb ou db et connaître le type de capside. Après la réplication, on peut obtenir jusqu'à 400 nouveaux phages. VI) Multiplication des phages Les bactériophages, ubiquitaires de nature, persistent dans le monde bactérien sous deux états distincts : en tant que phage virulent (qui se réplique dans une cellule bactérienne réceptive) ou sous forme lysogène (inséré dans le génome sous la forme d un prophage, il devient partie intégrante du génome de l hôte). Tous les virus bactériophages ont un cycle lytique (infectieux) pendant lequel le virus, incapable de se reproduire par ses propres moyens, injecte son matériel génétique dans la bactérie. Grâce aux enzymes et aux ribosomes de l'hôte, le virus peut être répliqué à plus de cent exemplaires avant que l'hôte n'éclate. Dans le cas de phages tempérés, le matériel génétique s'intègre au chromosome de la bactérie qui le transmet à ses descendants (lysogénie) et, dans un cas pour cent mille, l'adn viral est activé et entame un cycle lytique.
6.1. Cycle lytique (exemple du phage T4) 1 - Adsorption du phage par l'intermédiaire des récepteurs spécifiques à la surface des bactéries 2 - Passage de l'adn du phage (à travers la queue lorsqu'elle existe) dans la bactérie (éclipse), réplication du génome grâce aux gènes précoces. 3 - Conversion de la bactérie infectée en une cellule productrice de phages. La bactérie arrête sa croissance et perd la capacité de répliquer son acide nucléique ou de le transcrire. Cette phase peut présenter des différences selon les phages 4 - Production de l'acide nucléique et les protéines du phage qui sont synthétisés en grande quantité - production des ARNm précoces qui permettent la synthèse d'enzyme prenant le contrôle du métabolisme de la bactérie, la réplication de l'acide nucléique du phage et la synthèse des ARNm tardifs - production des ARNm tardifs qui permettent la synthèse des protéines de capsides, la synthèse des protéines catalytiques d'assemblage et la synthèse des protéines permettant la lyse de la bactérie - imbrication des phages 3 ou 4 5 - Assemblage du phage ou morphogenèse qui nécessite la présence de protéines de capsides mais aussi de protéines catalytiques qui participent à l'assemblage, sans faire partie de la structure du phage 6 - Libération des phages (200 à 1000) grâce à des enzymes lytiques (lysozyme qui dégrade le peptidoglycane, membranases qui dégradent les membranes)
Phase 1 : phase précoce, se déroule en 4 étapes: - Reconnaissance du récepteur cellulaire - Liaison au récepteur = attachement - Pénétration (endocytose ou fusion ou les 2) - Décapsidation Phase 2 : phase d'éclipse, on ne peut plus observer le virus. Cette phase correspond à la phase de réplication des génomes soit en utilisant la machinerie cellulaire, soit en synthétisant les protéines précoces qui sont nécessaires à cette réplication. Fait suite à cette phase la phase tardive, ou le virus va synthétiser les protéines tardives virales structurales, ces protéines subissent une maturation, le virus s'assemble, et on remarque un bourgeonnement à la membrane cellulaire. Phase 3 : phase de latence correspondant au relargage et libération des virions conduisant à la lyse cellulaire. Chez le phage T4 seul le génome pénètre dans la cellule, puisque il s'agit une injection : les appendices permettent de reconnaître la cible cellulaire, la partie hélicoïdale se contracte et injecte l'adn dans la cellule. 6.2. Cycle lysogène (exemple du phage λ) 1 - intégration de l'adn dans la bactérie après fixation du phage λ sur son récepteur spécifique (protéine LamB qui est une porine spécialisée de la membrane externe, servant à l'importation du maltose) 2 - période de transcription nécessaire pour synthétiser un système d'intégration, la transcription est alors interrompue par un répresseur qui réprime toutes les fonctions phagiques, seul s'exprime le système d'intégration 3 - la molécule d'adn du phage est intégrée dans le chromosome de la bactérie sous forme de prophage, préférentiellement entre les gènes codant pour l'utilisation du galactose et ceux codant pour la synthèse de la biotine, il s'agit d'une recombinaison spécifique de site 4 - le prophage se réplique lors de la multiplication bactérienne et est transmis à la descendance comme n'importe quel autre gène bactérien Une bactérie lysogène possède 2 propriétés essentielles: - elle est immune et ne peut être réinfectée par le même phage, car les fonctions phagiques sont réprimées par le répresseur qui inhibe la transcription. - après de nombreuse génération, la bactérie lysogène peut subir une induction spontanée ou provoquée => entrée dans un cycle lytique.
6.3. Multiplication des phages à ARN Les virus MS2 ou Qβ sont à ARN monocaténaire, celui ci peut servir directement à la synthèse de protéines. Il y a chevauchement des séquences codantes essentielles : - Protéine A: nécessaire à la maturation et à l'attachement cellulaire. - CoA : codage de la capside / protomère. - Réplicase : nécessaire pour réplication (= ARN polymérase) - Lyse : permet la sortie du virus Le chevauchement de certaines séquences codantes permet d'économiser de la place et donc de coder plus de protéine. Il s'effectue par décalage du cadre de lecture, ce qui permet avec une seule séquence de coder jusqu'à 3 protéines. Ce génome peut être traduit directement par les ribosomes en raison de sa polarité +. La première protéine synthétisée est la réplicase, ce qui va permettre la synthèse du brin -, nécessaire pour faire les copies du brin +. - Phage β : prophage, introduction d'un phage β induit la synthèse d'une toxine dyphtérique (C. dyphteria). - Phage ε : S. typhumonium, si infection => changement de composition du LPS => plus de détection par approches immunitaires => devient tolérante contre les phages virulents. VII) Virus eucaryotes Il y a spécificité tissulaire ou cellulaire, ces virus diffèrent par leurs effets sur les cellules hôtes. On distingue 4 conséquences majeures: - infections latentes : détection de quelques particules virales à la surface cellulaire - infections persistantes : malgré la sortie des virus, la cellule continue la synthèse de nouveaux virions - infections aigues : relargage des virus et lyse cellulaire - formations tumorales (néoplasie) : changement de forme de la cellule et division rapide (virus EBV (carcinome), hépatite B et rétrovirus)
VIII) Autres agents pathogènes 7.1. Oncogènes Ce sont des gènes qui déclenchent une prolifération anarchique des cellules. L'étude du sarcome de Rous a permis de mettre en évidence cette caractéristique des virus. Dans le cas de ce sarcome, il s'agit d'un problème au niveau d'une tyrosine kinase. Dans la cellule saine, la TK phosphoryle d'autre protéine avec une vitesse précise, et permet l'activation de nombreuses voies de signalisation. Lorsque la cellule infectée, le virus apporte une TK défectueuse (mutée) qui ne va pas effectuer sa fonction de base. Elle augmente la vitesse de phosphorylation des protéines et donc entraîne un désordre dans les voies de signalisation, induisant l'apparition de tumeur. 7.2. Viroïdes Il s agit d agents pathogènes qui ne sont composés que d'acide nucléique et ne possèdent pas de capsides. Ils n'ont qu'un seul ARN circulaire possédant des régions complémentaires importantes pour former des structures secondaires double brin plus résistantes aux RNases, cet ARN contient très peu de nucléotides et ne code aucune protéine. Ce sont le plus souvent des parasites des plantes. Après une infection chez les plantes, on peut obtenir jusqu'à 10 000 copies de virus, cependant le mécanisme de réplication reste encore incertain. Si l'acide nucléique est de l'arnsb circulaire, il y a formation d ARNdb par appariement et donc d une structure très stable, le virus peut se développer ce qui induit la formation d'une zone de nécrose. 7.3. Prions Il s agit d une protéine jouant un rôle essentiel dans le repliement d'autres protéines et éventuellement impliquée dans des pathologies nommées «maladies à prions». La protéine prion Prp-c est présente à l état naturel et est impliquée dans le fonctionnement normal de la cellule, elle est résistante à la température. La protéine Prp-c est impliquée dans le développement du système nerveux chez l'embryon. Chez l'adulte, elle est exprimée essentiellement dans le cerveau et la moelle épinière (neurones et glie). Elle est impliquée dans les processus de différenciation et d adhésion des cellules. Elle aurait aussi un rôle protecteur antioxydant et vis-à-vis de la mort cellulaire programmée (apoptose). Cette protéine aurait également un rôle dans le repliement d autres protéines. Des maladies comme l encéphalopathie spongiforme bovine, qui possède une létalité importante et provient de la nourriture animale, résultent de la mutation de ces prions. Il existe en effet une autre forme de cette protéine, la forme scrapie responsable de la maladie et notée PrPsc. Il y a une grande similitude entre la PrPc et la PrPsc, ce qui facilite l'entrée de la forme sc dans la cellule. La différence entre les 2 protéines se situe au niveau de la conformation tertiaire de la protéine et plus particulièrement au niveau des hélices α. Il peut arriver que les 2 molécules PrPc et PrPsc voyagent dans la même vésicule. Donc ce cas, par l'action de différente enzyme, il se peut que la PrPc se transforme en PrPsc. La PrPsc ne peut pas être détruite par les lysosomes et s'accumule dans la cellule, provoquant la maladie.