abc Ann Biol Clin 2009 ; 67 (4) :

garde sa place et la classification du groupe French American British (FAB) reste la classification de l urgence des hémopathies aiguës. Mais la cytologie a ses inconvénients qui sont, outre la relative difficulté de recourir à un expert, l absence de traçabilité (l immense majorité des frottis sanguins n est pas mémorisée) et son caractère chronoarticle original abc Ann Biol Clin 2009 ; 67 (4) : 419-24 Analyse d image en cytologie hématologique : automate CellaVision DM96 TM Automated cell recognition in hematology: CellaVision DM96 TM system C. Surcouf D. Delaune T. Samson V. Foissaud Service de biologie, Hôpital d Instruction des Armées Percy, Clamart <cmonps@hotmail.fr> Article reçu le 13 avril 2009, accepté le 5 juin 2009 Résumé. La morphologie cellulaire garde une place prépondérante dans le diagnostic des hémopathies malgré les progrès de la cytométrie de flux, de la cytogénétique et de la biologie moléculaire. La société Roche Diagnostics distribue le CellaVision DM8/96 TM, microscope motorisé piloté par un logiciel d analyse d image. Ce système effectue une reconnaissance des leucocytes et des principales anomalies morphologiques des hématies et des plaquettes à partir du frottis sanguin coloré au May Grünwald Giemsa. Les données sont soumises au cytologiste pour validation biologique. L étude s est déroulée au laboratoire de biologie de l Hôpital d instruction des armées Percy sur 99 frottis de routine dont 9 aplasies thérapeutiques. Elle révèle des performances très satisfaisantes sur plusieurs points : bonne reconnaissance cellulaire, rapidité d exécution avec environ 30 % de temps gagné par rapport à l analyse au microscope traditionnel, identités sécurisées par la connexion bidirectionnelle. Les innovations sont nombreuses, principalement la traçabilité complète des images, l efficacité sur les frottis sanguins d aplasie, le potentiel en terme d enseignement et les capacités de télémédecine. Mots clés : analyse d image, cytologie, hémopathie, microscopie motorisée Abstract. Cellular morphology has a predominant place in diagnosis of hematological malignancies in spite of flow cytometry, cytogenetic and molecular biology progresses. CellaVisionDM8/96 TM is automated microscope and image analysis software which are able to characterize white and red blood cells morphology and to perform platelets counts in peripheral blood smears. Validity of results is always submitted to the cytologist agreement. We routinely analyzed 99 peripheral blood smears, included 9 therapeutic cytopenias, stained with May-Grünwald-Giemsa. DM8/96 TM is highly efficient in the cellular identification with great security of identity management and timesaving (30% faster than manual microscopy). Major innovations are the complete slides recording, efficiency on cytopenias processing, education functionalities and the networking ability. Key words: image analysis, cytology, malignant hematological disease, automated microscopy doi: 10.1684/abc.2009.0349 Les progrès des automates de numération, de la cytométrie de flux et de la biologie moléculaire n ont jamais détrôné la cytologie. L étude de la morphologie cellulaire Tirés à part : C. Surcouf Ann Biol Clin, vol. 67, n o 4, juillet-aout 2009 419

article original phage notamment chez l aplasique. Cette discipline n attendait plus de grande nouveauté et pourtant la société Roche Diagnostics distribue un matériel innovant, le CellaVision DM8/96 TM, qui propose une analyse morphologique du frottis sanguin pour les lignées leucocytaire, érythrocytaire et une aide à la numération plaquettaire. Le cytologiste garde le contrôle du résultat qu il visualise àl écran afin de le corriger et de le valider. Nous avons testé ce matériel pendant trois jours sur 99 frottis générés par l activité de routine dans le but d évaluer ses performances, sa praticabilité et son intérêt potentiel dans les laboratoires de cytologie. Présentation du CellaVision DM8/96 TM Le CellaVision DM8/96 TM est constitué d un microscope motorisé dont la partie optique est équipée de trois objectifs x10, x50, x100, les deux derniers à immersion avec distribution d huile automatique. L ensemble est placé à l abri de la poussière sous carrosserie métallique (figure 1). Ce microscope est piloté par un logiciel d acquisition et de classification CellaVision Blood Differential TM installé sur ordinateur PC sous système d exploitation Windows. Deux modèles sont disponibles, le DM8 TM et le DM96 TM capables d embarquer respectivement 8 et 96 lames par série. Le système est conçu pour lire des frottis minces étalés et colorés au May Grünwald Giemsa (MGG) par un étaleur colorateur type SP-1000i Sysmex TM ou des frottis manuels si leur minceur est suffisante. L informatique pilote le microscope en trois temps : 1) détermination au x10 d une zone «monocouche» d hématies, Figure 1. Analyseur DM96 TM Automate avec tiroir de dépôt des lames et écran de validation. 2) repérage au x50 des éléments à photographier, 3) puis retour sur chaque élément pour une photographie au x100. L utilisateur peut demander la recherche de 100 à 400 éléments nucléés par frottis. Le logiciel effectue une reconnaissance morphologique et un classement en 12 populations leucocytaires : neutrophiles précurseurs, neutrophiles matures, éosinophiles, basophiles, lymphocytes, monocytes, promyélocytes, myélocytes, métamyélocytes, cellules blastiques, variantes de lymphocytes et plasmocytes. À ces catégories s ajoutent les cellules non identifiées, érythroblastes, thrombocytes géants, agglutinations thrombocytaires, cellules à corbeilles et artefacts. La morphologie érythrocytaire est étudiée par production d un score de 0 à 3 points pour 6 anomalies : polychromasie, hypochromasie, anisocytose, microcytose, macrocytose et poïkilocytose. L opérateur peut ajouter les anomalies suivantes : codocytes, schizocytes, drépanocytes, sphérocytes, elliptocytes, ovalocytes, dacryocytes, stomatocytes, acanthocytes, échinocytes, corps de Howell-Jolly, corps de Pappenheimer, hématies ponctuées, parasites ainsi que 10 autres catégories qu il peut définir selon ses besoins. La concentration plaquettaire peut être évaluée avec participation de l opérateur par comptage dans un aperçu d image. Les résultats bruts - avant validation biologique - sont produits à la cadence théorique de 30 frottis à l heure sur une centaine de cellules. Les données brutes de la formule leucocytaire sont affichées sur un écran plat de 19 pouces sous forme d images unitaires de leucocytes groupées selon les catégories morphologiques et d un champ d hématies pour apprécier la morphologie érythrocytaire. Une étude d imprécision (données fabricant) effectuée sur 219 échantillons avance un écart standard de 4,7 % sur les neutrophiles et 5,0 % sur les lymphocytes. L automate ne travaille pas en automatisme, c est-à-dire qu il ne valide pas seul son travail. Le cytologiste doit consulter l ensemble des images, apporter ses corrections éventuelles et valider les résultats. Les dossiers, numération et images, sont archivés sur disque dur avec sauvegarde possible sur cédérom (graveur). Le système est interfaçable en réseau à travers une licence de consultation System Review ou par doublement du système et partage de données (télémédecine). Le DM96 TM peut transmettre ses images par email au format jpg. Grâce à une connexion bidirectionnelle à la chaîne Alpha (automate XE-2100 Sysmex TM + étaleur colorateur SP-1000i TM ), le SP-1000i TM imprime le n de demande en code à barre sur chaque lame. Ainsi le DM96 TM lit le numéro de demande, télécharge la numération depuis le concentrateur de résultats MPL Roche Diagnostics TM et transmet en retour la formule validée par le cytologiste. Le DM96 TM peut aussi fonctionner à partir de frottis manuels, à condition que ceux-ci soient très minces et très réguliers. L utilisateur doit alors coller un code à barre d identification sur 420 Ann Biol Clin, vol. 67, n o 4, juillet-aout 2009

Analyse d image en cytologie hématologique chaque lame et recopier ses résultats sur l informatique centrale. Les lames de verre doivent être à coins rodés et polis. Contexte de l étude et méthodes L appareil testé au laboratoire de biologie de l Hôpital d instruction des armées (HIA) Percy est un DM96 TM réglé pour l occasion sur la recherche de 200 cellules par frottis ; 99 étalements sont prélevés sur la routine du laboratoire (tableau 1) ; 87 sont étalés par le SP-1000i TM et 12 frottis d un même sang sont étalés manuellement par 3 opérateurs sensibilisés à la nécessaire finesse du frottis (chacun 4 lames). Tous les étalements sont colorés par le SP-1000i TM au May Grünwald Giemsa à ph 7,2. Les lames sont expertisées en parallèle par le même cytologiste en microscopie traditionnelle (méthode de référence) et sur le DM96 TM. Les délais opératoires sont mesurés pour les deux méthodes depuis l instant où le frottis est disponible sur l étaleur colorateur jusqu à la fin de la validation technique sur MPL TM. On considère pour cet essai que le DM96 TM est connecté au MPL TM. Résultats et discussion Praticabilité Les frottis sont disposés par portoir de 8 lames provoquant le démarrage automatique de la lecture dès la fermeture du tiroir. Après lecture, les lames sont restituées dans leur portoir recouvertes d une goutte d huile à essuyer avant archivage. L interface logicielle est très intuitive. Il faut moins d une heure pour appréhender l essentiel des fonctionnalités du système sous Windows. L appareil est conçu pour lire des frottis très minces, mais il n a refusé qu une lame sur les 12 frottis étalés manuellement. Il n est pas possible de faire varier la lumière ni la mise au point du microscope. L image numérique semble un peu plus «dure», plus contrastée qu au microscope traditionnel. Précisons que la caméra numérique du DM8/96 TM est calibrée avec une coloration «usine» au MGG à ph 6,8 (tendance rose) alors que le ph de notre coloration est de 7,2 (tendance bleue), ce qui contribue à l accentuation du contraste des granulations. Il est sans doute préférable de s approcher du ph préconisé pour optimiser la lecture. Cadence de travail La vitesse de lecture est remarquable puisque le DM96 TM photographie 200 éléments en 2 min 30 s environ, hors aplasies, soit une cadence supérieure à celle d un opérateur entraîné (tableau 2). Pour chaque frottis, le nombre de cellules étudiées par le DM96 TM (100 à 400) est plus important qu en cytologie de routine où l on examine rarement plus de 100 cellules hormis le contexte particulier des hémopathies au diagnostic. Cette capacité de comptage peut contribuer au dépistage d événements morphologiques rares, s ils se trouvent dans la zone mince du frottis. Reconnaissance d images leucocytaires Après lecture et classement par l automate des cellules au sein des différentes catégories énumérées ci dessus, le cytologiste procède à une correction (figure 2). Le DM96 TM a placé en moyenne 6,6 cellules par dossier dans la catégorie des cellules «non identifiées». Le reclassement d une image vers sa vraie lignée d appartenance s effectue très simplement avec la souris en «glissédéposé». La notion de band cells étant peu utilisée en routine, ces cellules ont été reclassées par le cytologiste dans les neutrophiles matures ou les métamyélocytes selon leur morphologie. On constate que les erreurs du DM96 TM sont mineures pour les numérations leucocytaires supérieures à 2 G/L si l on excepte les hémopathies malignes. Les granuleux ne font pas l objet d erreur de lignée, les éosinophiles sont bien identifiés et le système reconnaît même certains éosinophiles éclatés. Le regroupement des lymphocytes à l écran offre une grande sensation de confort visuel qui facilite la mise en évidence d anomalies morphologiques récurrentes. Les lymphocytes activés contrastent nettement avec les lymphocytes normaux. Rappelons que le système ne propose pas de diagnostic à partir des atypies lymphocytaires. Il classe en «corbeille» et/ou en «artefact» les cellules éclatées ou les débris cellulaires et nous n avons pas observé de leucocytes normaux dans ces deux catégories. Les agrégats plaquettaires sont très bien identifiés. On est surpris de la fréquence des macroplaquettes chez la plupart des patients. Il est d ailleurs prudent de fixer un seuil de signalement élevé. Les seules erreurs récurrentes dans notre population sont des myélémies par excès, quelques confusions entre artefacts de grande taille et polynucléaires basophiles et le passage de petits blastes dans Tableau 1. Échantillons de l étude. Frottis totaux Étalés par SP-1000i TM Étalés manuellement Colorés par SP-1000i MGG ph 7,2 Numération leucocytaire de 1 à 75 G/L Aplasiques < 1 G/L 99 87 12 99 88 11 1 Échecs de lecture Ann Biol Clin, vol. 67, n o 4, juillet-aout 2009 421

article original la population lymphocytaire. Le zoom sur une cellule est possible, mais il s agit d un zoom numérique à quantité de pixels fixe. Il permet de mieux détailler une anomalie type corps d Auer ou corps de Döhle. Notons que les ombres de Gumprecht peuvent être, selon le contexte, reclassées par le cytologiste parmi les lymphocytes. Ainsi les images sont d assez bonne qualité pour permettre le reclassement de quelques cellules avec certitude (en dehors d hémopathies) et aucune lame n a demandé de corrections importantes. Qualité des formules leucocytaires Nous avons choisi de comparer la formule leucocytaire établie à l aide du DM96 TM à celle obtenue par microscopie traditionnelle en excluant les aplasies, évoquées à part, et les hémopathies malignes étudiées en microscopie traditionnelle. L effectif de lame devient n = 62. En raison de la présence d images de cellules «non identifiées» dans les résultats bruts du DM96 TM, nous considérons ses résultats après validation par le cytologiste en ayant recours à deux méthodes statistiques de comparaison : l étude de corrélation associée à un test t montre une très bonne corrélation pour l ensemble des lignées entre DM96 TM après validation et microscopie pour toutes les populations leucocytaires (tableau 3). Les meilleures performances sont obtenues avec les cellules morphologiquement «simples» que sont les granuleux (polynucléaires + précurseurs) et les lymphocytes normaux. Kratz et al. ont publié des données similaires [1]. L étude de corrélation pour les polynucléaires basophiles est peu Figure 2. Exemple d échantillon lors d une sortie d aplasie (de haut en bas : polynucléaires, lymphocytes, monocytes, métamyélocytes, promonocytes, blastes, macroplaquettes). Écran après correction par le cytologiste. Tableau 2. Comparaison des temps opératoires, de la lecture du frottis au rendu du résultat dans le SIL. Le cytologiste travaillant en série continue (lames étalées et colorées par le SP-1000i TM, automate DM96 TM connecté au concentrateur MPL TM ). Jour d étude Nombre de lames Temps DM96 Temps microscopie traditionnelle J1 19 lames 0 h 59 1 h 23 29 % J2 22 lames 1 h 05 1 h 41 36 % J3 21 lames 0 h 58 1 h 18 26 % Gain de temps avec DM Tableau 3. Comparaison des formules rendues par le DM96 TM et par le cytologiste (n = 62) (NS = non significatif). Facteur de corrélation r2 Test z Polynucléaires neutrophiles 0,9007 (p < 0,001) NS Polynucléaires éosinophiles 0,7865 (p < 0,001) NS Immatures granuleux 0,6591 (p < 0,001) NS Lymphocytes 0,9184 (p < 0,001) p = 0,02 Monocytes 0,5516 (p < 0,001) NS pertinente étant donné leur faible pourcentage (entre 0 et 3 %) sur les échantillons analysés ; l étude de comparaison d échantillons appareillés à l aide du test z montre l absence de différence significative entre les populations leucocytaires excepté pour les lymphocytes (p = 0,02). Cette différence faiblement significative doit être tempérée car elle repose sur les résultats très dispersés de seulement deux frottis dont les valeurs diffèrent jusqu à 20 % entre cytologiste, DM96 TM et automate XE-2100 TM. On incrimine l effet frange déjà observé [2] avec les étaleurs colorateurs vis-à-vis duquel le DM96 TM ne propose pas, à notre connaissance, de stratégie lors de la saisie d image. Ces deux tests statistiques traitent uniquement de l aspect quantitatif des formules sans tenir compte de l interprétation biologique. Ainsi on pourrait conclure que les résultats du DM96 TM sont excellents. C est vrai mathématiquement. La réalité est plus complexe puisque l apport théorique d une formule leucocytaire n est pas seulement quantitatif, il est aussi morphologique avec des anomalies que va omettre le DM96 TM sans jamais bousculer la «corrélation», telles que dysgranulopoïèse, dysmonopoïèse, corps de Döhle, ou toute autre anomalie fine. D autres anomalies peuvent au contraire modifier profondément la formule comme la nécessité de compter les ombres de Gumprecht en tant que lymphocytes dans la leucémie lymphoïde chronique. Le cytologiste reste donc maître du résultat final en ajoutant la touche morphologique que n apporte pas encore la reconnaissance d image et les hémopathies restent l apanage du microscope traditionnel, au moins au diagnostic. 422 Ann Biol Clin, vol. 67, n o 4, juillet-aout 2009

Analyse d image en cytologie hématologique Tableau 4. Échantillons de sujets en aplasie (< 1 G/L) - nombre d événements bruts et de leucocytes réels photographiés par le DM96 TM. Numération leucocytaire G/L 0,02 0,02 0,02 0,08 0,13 0,33 0,53 0,88 0,99 Nombre d images demandées 200 200 200 200 200 200 200 200 200 Nombre d événements bruts photographiés 124 41 20 40 40 100 143 205 308 Nombre de leucocytes réels validés 0 2 2 17 30 62 87 162 157 Cas particulier de l aplasie Le système parvient à photographier au moins 30 leucocytes à partir d une numération de 0,2 G/L et presque 90 leucocytes à partir de 0,5 G/L (tableau 4), donc il couvre l ensemble des formules leucocytaires utiles si l on considère qu en deçà de 0,2 G/L la nature des leucocytes «normaux» versus blastes devient moins intéressante. L examen et la validation technique de 9 frottis d aplasie sont effectués en environ 30 minutes, performance hors de portée d un cytologiste appliqué. Ainsi le DM96 TM permet de suivre quotidiennement et rapidement les patients les plus fragiles au moment où la numération des granulocytes conditionne la vulnérabilité aux infections bactériennes et fongiques. C est un apport singulier du DM96 TM par rapport à l automate d hématologie dont la formule automatisée chez l aplasique est presque toujours affublée de messages d alarme. Lignée érythrocytaire Nous n avons pas évalué les performances en analyse de morphologie érythrocytaire, mais le DM96 TM propose un champ d hématies avec une fonction zoom suffisante pour étudier la morphologie unitaire assortie d un classement Figure 3. Comparaison des cellules du patient (à gauche) avec des images de référence (à droite en haut : tricholeucocytes, à droite en bas : plasmocytes). semi quantitatif des anomalies. L ajout de catégories au vu des images est facile, de même que la rédaction de commentaires libres, même si nous doutons de la possibilité de transmettre intégralement ces commentaires dans l informatique du laboratoire à travers le concentrateur MPL TM. Validation du dossier Le cytologiste doit visualiser toutes les images et corriger les erreurs. Il faut rarement plus d une minute par lame pour reclasser des images en présence d anomalies courantes, telles que myélémie, éosinophilie, érythroblastémie, basophilie, syndrome mononucléosique, dystrophies des granuleux (pseudo-pelger-huet), ombres de Gumprecht, etc. La difficulté peut venir de la qualité de certaines images gênant la reconnaissance cellulaire. Notons que la courte expérience de la machine ne nous a pas permis de nous familiariser totalement avec les images les plus délicates et que notre ph de coloration à 7,2 n était pas optimum vis-à-vis de la calibration de la caméra. Ces détails étant réglés, le DM96 TM permettra de valider l immense majorité de la série quotidienne de lames. Les plus difficiles seront examinées en microscopie traditionnelle mais malgré tout mémorisées. Le gain de temps total déjà observé par d autres équipes [2-4] est estimé à 30 % sur la cytologie classique. L impression des données chiffrées est possible depuis le MPL TM. Elle est horodatée et précise les résultats relatifs (%) et absolus de la formule sanguine, ainsi que l étude morphologique des hématies. Traçabilité Elle est complète, révolution en cytologie, puisque la formule est archivée avec toutes ses images. Cet archivage peut se révéler utile dans le suivi d une hémopathie ou l observation rétrospective d un cas. Enseignement Le gain de convivialité est considérable puisque la vocation du système est d être installé sur paillasse à proximité de l automate et de l étaleur colorateur. L image est alors immédiatement disponible pour les techniciens et cytologistes. Le système affiche sur demande des «cellules de référence» (figure 3). Ces images fournies par le cons- Ann Biol Clin, vol. 67, n o 4, juillet-aout 2009 423

article original tructeur peuvent être complétées par les images de la routine au gré du cytologiste. Connexion, archivage des résultats La connexion au concentrateur MPL permet d importer les numérations de l automate. Le DM96 TM constitue ainsi des dossiers complets de numération formule, images comprises, sans risque d erreur d identité. Les fichiers peuvent être sauvegardés sur disque dur externe ou gravés sur DVD. Travail à distance, télémédecine Les Stations Review (logiciel pour PC sous Windows) sont des postes clients permettant la consultation à distance d une formule déjà validée. Le DM96 TM peut également, s il est connecté à un réseau type intranet ou internet, envoyer des images cellulaires par email. La connexion de deux équipements semblables permet de traiter intégralement la validation d une formule leucocytaire à distance, corrections comprises, dans une activité d expertise de type télémédecine. Maintenance Elle est quotidienne avec le nettoyage de la platine au chiffon sec et hebdomadaire avec le nettoyage des objectifs et des guides de lames. L ensemble est d une grande simplicité d autant que le carrossage protège le système optique de la poussière. Limites actuelles du DM96 TM et développements souhaitables Au plan technique, la possibilité de faire varier la mise au point sur certaines cellules contribuerait à une meilleure qualité d image (réglages en «z»). La hiérarchisation des lymphocytes par taille offrirait un confort visuel et des informations morphologiques supplémentaires. Dans l étude des hématies, la saisie de plusieurs champs de grande taille semble indispensable. Elle permettrait d offrir une méthode alternative pour le décompte des schizocytes, domaine très délicat de la cytologie. Au plan matériel, un très grand écran comme il en existe pour certains systèmes d imagerie en anatomopathologie permettrait un meilleur confort d utilisation en limitant le recours aux «ascenseurs» d image. Ajoutons que la lecture du myélogramme n est pas réalisable sur DM96 TM car les frottis sont généralement épais et/ou trop riches pour le repérage des cellules, mais il existe dans ce contexte d autres systèmes de prise d images plus adaptés. Conclusion Au niveau des laboratoires hospitaliers ou privés, dans sa configuration actuelle, le CellaVision DM8/96 TM est un outil de travail et de formation innovant et performant, capable de faire gagner environ 30 % de temps sur les frottis de routine en offrant une traçabilité inconnue en cytologie. Il intéresse tous les laboratoires et notamment ceux qui soutiennent un service d hématologie clinique. L examen du frottis sanguin à distance est une fonctionnalité innovante qui mériterait d être évaluée dans un certain nombre de contextes : structures sanitaires de grande taille, laboratoires isolés et expertise en temps réel par des experts. Références 1. Kratz A, Bengtsson HI, Casey JE, Keefe JM, Beatrice GH, Grzybek DY, et al. Performance evaluation of the CellaVision DM96 system : WBC differentials by automated digital image analysis supported by an artificial neural network. Am J Clin Pathol 2005 ; 124 : 770-81. 2. Cornet E, Perol JP, Troussard X. Performance evaluation and relevance of the CellaVisionTM DM96 system in routine analysis and in patients with malignant hematological diseases. Int J Lab Hematol 2008 ; 30 : 536-42. 3. Ceelie H, Dinkelaar RB, van Gelder W. Examination of peripheral blood films using automated microscopy : evaluation of Diffmaster Octavia and CellaVision DM96. J Clin Pathol 2007 ; 60 : 72-9. 4. Briggs C, Longair I, Slavik M, Thwaite K, Mills R, Thavaraja V, et al. Can automated blood film analysis replace the manual differential? An evaluation of the CellaVision DM96 automated image analysis system. Int J Lab Hematol 2009 ; 31 : 48-60. 424 Ann Biol Clin, vol. 67, n o 4, juillet-aout 2009