TP DE BBSG M1 (2011-2012) Production de protéines recombinantes dans Escherichia. coli Etudes structurales et fonctionnelles (C. Bordi, M-S aschtgen)

TP DE BBSG M1 (2011-2012) Production de protéines recombinantes dans Escherichia. coli Etudes structurales et fonctionnelles (C. Bordi, M-S aschtgen)

Introduction Le vecteur d'expression procaryote pqe31-dsred3 (pred) est porteur d un variant du gène de la «Enhanced Green Fluorescent Protein» (EGFP, isolé de la méduse Aequorea victoria). Grâce à des séquences fluorophores cette protéine est excitable dans le spectre du visible émet une couleur fluorescente rouge (pred). Ce vecteur porte en outre le gène de résistance à l'ampicilline Amp r sélection de bactéries sur milieux sélectifs. L'ADN codant pour une protéine d intérêt P, peut donc être inséré dans le site de multiclonage (MCS) en amont ou en aval et en phase avec le gène de cette protéine afin de créer une protéine de fusion (chimère) entre la protéine P et la red-gfp. L expression de cette chimère est sous le contrôle d un promoteur dérivé de l opéron lactose (plac) et donc inductible par l'isopropyl-ß-d-thiogalactopyranoside (IPTG). Ainsi, la protéine P pourra être produite sous la forme d'une protéine de fusion fluorescente rouge. La synthèse de la protéine d intérêt peut alors être induite par l'iptg, après transformation d E. coli. La protéine de fusion ainsi synthétisée peut ensuite être purifiée par exemple, par chromatographie-métal (nickel ou cobalt), grâce à la séquence hexa-histidine (His-Tag) se trouvant à l extrêmité N-terminale ou C-terminale des protéines de fusion. Dans le cadre de ce TP la protéine d intérêt que nos allons fusionner à la red-gfp est la «DNA binding protein Fur». Fur est un régulateur, impliqué dans la répression directe de l expression plusieurs gènes impliqués la capture du fer chez Escherichia coli parmi lesquels on retrouve le gène sira. Durant ce TP nous allons purifier la protéine fur-gfp-red, rechercher les résidus importants pour sa fixation par une mutagenèse aléatoire couplée à des expériences de gel retard.

Jour J1 : Les objectifs de la première journée seront : - Amplification de la séquence codante du gène fur par PCR et purification - Purification du plasmide pqe31-dsred3 - Coupure par les enzymes de restriction de l insert et du vecteur 1. Amplification par PCR de la séquence codante du gène fur Afin de pouvoir cloner la séquence codante du gène fur dans le plasmide pqe31- DsRed3 cette dernière va être amplifiée par PCR en utilisant les amorces 1 et 2 1- Ajouter dans deux tubes Eppendorf de 500 µl à parois fines: - 0,5 µl de la solution ADN génomique bactérien - 2 µl de dntp PCR mix (datp+dttp+dctp+dgtp), 10 mm - 5 µl tampon PCR 10X (vert fluo) - 2 µl de l'amorce 1 (10 µm) [voir séquence en annexe] - 2 µl de l'amorce 2 (10 µm) [voir séquence en annexe] - 0, 25 µl de Taq polymérase (GoTaq) - Compléter à 50 µl par de l'eau milli Q, autoclavée (eau Biomol). 2- Bien vortexer 3- Placer les tubes dans le thermocycleur. * Programme choisi: 1 cycle [1'30: 95 C] 20 cycles [0'30: 95 C/ 1': 55 /1': 72 C] 1 cycle [3': 72 C] Fin 2. Purification du plasmide pqe31-dsred3 Le plasmide pqe31-dsred3 est contenu dans la bactérie E. coli. Nous allons réaliser l extraction du plasmide par l utilisation d un kit de Miniprep NucleoSpin afin de pouvoir le couper avec les enzymes de restriction et y insérer la séquence codant du gène fur. 1- Ajouter 250 µl de tampon A1 au culot bactérien puis resuspendre ce culot de façon homogène en utilisant le vortex ou par pipetage.

2- Ajouter 250 µl de tampon A2 et mixer gentiment par inversion 5 à 8 fois (ne pas vortex) et incuber 5 min sur la paillasse. 3- Ajouter 300 µl de tampon A3 et mixer gentiment par inversion 5 a 8 fois (ne pas vortex). Un précipité blanc devrait se former. 4- Centrifuger 5 min à 14000 rpm 5- Assembler une colonne de purification et un tube collecteur. é 6- Prélever délicatement avec une pipette le surnageant sans toucher le précipité et déposer le liquide sur la colonne de purification (max 750 µl) 7- Centrifuger 1 min à 14000 rpm puis jetez le filtrat présent dans le tube collecteur et remettez la colonne dans le tube collecteur 8- Ajouter 600 µl de tampon de lavage A4 puis centrifuger 1 min à 14000 rpm 9- Jetez le filtrat présent dans le tube collecteur et remettez la colonne dans le tube collecteur 10- Sécher la membrane de silice en centrifugeant la colonne et le tube collecteur 2 min à 14000 rpm 11- Placer la colonne de purification dans un eppendorf propre de 1.5 ml et ajout 50 µl d eau au centre de la colonne et incuber 1 min à température ambiante. 12- Eluer le plasmide en centrifugeant 1 min à 14000 rpm 13- Placer le tube eppendorf contenant le plasmide dans la glace 3. Purification du produit d amplification de PCR. Après l étape d amplification par PCR le produit obtenu doit être nettoyé pour éliminer le tampon, les dntp non incorporé et les amorces. Pour cela nous utiliserons le Kit d extraction d ADN QIAquick PCR Purification Kit. 1- Associer dans un tube eppendorf de 1.5 ml le contenu des deux tubes de réaction de 50 µl de PCR 2- Ajouter 500 µl de tampon PB au 100 µl de réaction PCR puis vortexer pour homogénéiser le mélange. 3- Assembler une colonne de purification et un tube collecteur puis déposer sur la colonne la totalité du mélange PCR + PB buffer (environ 600µl)

4- Centrifuger 1 min à 14000 rpm puis jetez le filtrat présent dans le tube collecteur et remettez la colonne dans le tube collecteur 5- Ajouter 750 µl de tampon de lavage PE puis centrifuger 1 min à 14000 rpm 6- Jetez le filtrat présent dans le tube collecteur et remettez la colonne dans le tube collecteur 7- Sécher la membrane de silice en centrifugeant la colonne et le tube collecteur 2 min à 14000 rpm 8- Placer la colonne de purification dans un eppendorf propre de 1.5 ml et ajout 40 µl d eau au centre de la colonne et incuber 1 min à température ambiante. 9- Eluer le produit PCR en centrifugeant 1 min à 14000 rpm 10- Placer le tube eppendorf contenant le produit dans la glace 4. Vérification de la purification de l ADN par électrophorèse en gel d'agarose 1- Peser et faire fondre 1% d agarose dans 100 ml de tampon TBE (Tris-Borate- EDTA, fourni) (un binôme fera les gels de tout le monde) 2 -Dans le premier puit de gauche, déposer 10 µl de marqueurs de taille (1 kb DNA ladder) 3 Répartir 5 µl de produit PCR et du plasmide dans les 2 puits suivant. * Dès que le front de migration aura atteint les 3/4 du gel, arrêter l'électrophorèse et repérer, sous UV, la bande d'adn amplifiée et le plasmide. A FAIRE EN PRESENCE DE L'ENSEIGNANT. 5. Double digestion du vecteur et de l'insert par les enzymes de restriction. Afin de réaliser le clonage de la séquence codant du gène fur dans le vecteur pqe31- DsRed3 nous allons couper le vecteur et l insert par les enzymes SacI/HindIII - Dans tube eppendorf de 0,5 ml ajouter Insert (ADN produit PCR purifié) ou Vecteur pgfpuv 24 µl HindIII 1,5 µl SacI 1,5 µl Tampon de digestion 3 µl

Vol final 30µl - Incuber la nuit à 37 C (Etuve thermostatée)

Jour J2 : Les objectifs de la seconde journée seront : - Purification des ADN couper les enzymes HindIII et SacI - Ligation et transformation des bactéries compétentes - préparation des cultures pour l expression de la protéine recombinante redgfp-fur 6. Purification des ADN coupés les enzymes HindIII et SacI Avant de pouvoir réaliser l étape de ligation du fragment PCR du gène fur dans le vecteur d expression il est nécessaire de purifier le produit PCR et le plasmide afin d éliminer les enzymes de restriction et le tampon de digestion. Pour cela nous utiliserons le Kit d extraction d ADN QIAquick PCR Purification Kit. 1- Placer dans deux tubes eppendorf de 1.5 ml séparer les contenu des mélange de digestion du produit PCR et du plasmide 2- Ajouter à chacun des tubes 150 µl de tampon PB puis vortexer pour homogénéiser le mélange. 3- Assembler deux colonnes de purification avec un tube collecteur puis déposer sur chacune des colonnes la totalité du mélange PCR digéré + PB buffer ou du mélange du plasmide digéré + PB buffer 4- Centrifuger 1 min à 14000 rpm puis jeter le filtrat présent dans les tubes collecteurs et remetter les colonnes dans les tubes collecteurs 5- Ajouter 750 µl de tampon de lavage PE puis centrifuger 1 min à 14000 rpm 6- Jeter le filtrat présent dans les tubes collecteurs et remetter les colonnes dans les tubes collecteurs 7- Sécher la membrane de silice en centrifugeant les colonnes et les tubes collecteurs 2 min à 14000 rpm 8- Placer les colonnes de purification dans deux eppendorf propres de 1.5 ml et ajouter 40 µl d eau au centre des colonnes et incuber 1 min à température ambiante. 9- Eluer le produit PCR en centrifugeant 1 min à 14000 rpm 10- Placer les tubes eppendorf contenant les produits purifiés dans la glace

7. Vérification de la purification de l ADN par électrophorèse en gel d'agarose 2- Peser et faire fondre 1% d agarose dans 100 ml de tampon TBE (Tris-Borate- EDTA, fourni) (un binôme fera les gels de tout le monde) 4 -Dans le premier puit de gauche, déposer 10 µl de marqueurs de taille (1 kb DNA ladder) 5 Répartir 5 µl de produit PCR et du plasmide dans les 2 puits suivants. * Dès que le front de migration aura atteint les 3/4 du gel, arrêter l'électrophorèse et repérer, sous UV, la bande d'adn amplifiée et le plasmide. A FAIRE EN PRESENCE DE L'ENSEIGNANT. 8. Ligation Effectuer les combinaisons suivantes: Les volumes d'inserts et de vecteurs à prélever dépendent de la quantité d'adn purifié. Ils seront choisis en fonction de l'intensité des bandes sur le gel. - Vérifier (en présence de l enseignant) l intensité des ADN pour estimer les quantités à utiliser dans l étape de ligation. Voir exemple ci-dessous : TUBES N Vecteur pqe31-gfpred x µl Insert y µl Tampon de ligation (5X) 3 µl T4 DNA ligase 0,5 µl Eau mq autoclavée qsp 15 µl Incuber 2h à 16 C. 9. Transformation des bactéries compétentes Prévoir un bain marie réglé à 42 C 1- Transférer 50 µl de bactéries compétentes (fournies) dans un tube Falcon (14 ml) 2- Ajouter 10 µl du produit de ligation 3- Incuber 30 min dans la glace 4- Effectuer le choc thermique, 45 secondes dans le bain-marie à 42 C 5- Remettre dans la glace 5 min et ajouter 200 µl de milieu LB.

6- Incuber à 37 C sous agitation pendant 1h 7- Ensemencer la totalité de la culture bactérienne dans les boîtes de pétri à l'aide de billes de verre (autoclavées). Ces boîtes contiennent du milieu nutritif solide LB-agar, de l'ampicilline 50ug/ml et 1 mm IPTG. Faire rouler les billes dans les boîtes un certain nombre de fois. 8- Incuber les boites de pétri dans la chambre chaude 37 C, pendant une nuit 10. Culture de 50 ml: Prévoir 2 erlen stériles par groupe. Les libeller GFPred-fur et fur-natif et ajouter vos initiales. 1- Verser 900 µl de préculture (voir l enseignant) dans ces erlen contenant 50 ml de LB/Amp préchauffé à 37 C et mettre les cultures à incuber à 37 C sous agitation pendant 2h. 2- Ajouter ensuite l IPTG à la concentration finale de 1 mm. Laisser incuber sous agitation toute la nuit

Jour J3 : Les objectifs de la troisième journée seront : - Purification et analyse des protéines recombinantes redgfp-fur 11. Extraction des protéines GFPred-fur et furnatif Préparation du tampon de lyse - Tampon de base= Tris-HCl 50 mm ph 8 - Tampon de lyse= Tampon de base + 1% Triton X100 - Tampon NLS= Tampon de base + 1,5% NLS (N-Lauryl-Sarcosine) - Tampon chromato : 1% CHAPS et 10 mm d imidazole dans tampon de base + 0,3M NaCl -Tampon d élution 1% CHAPS et 200 mm d imidazole dans tampon de base + 0,3M NaCl * Prévoir centrifugeuse (réfrigérée) et tubes de centrifugation Lyse des bacteries par Sonication 1- A la fin de l incubation, les cellules induites sont sédimentées par centrifugation à 5000 t/min pendant 10 minutes à 4 C, 2- Resuspendre les cellules dans 5 volumes de tampon de lyse et soumettre à trois impulsions de sonication de 10 sec espacées de 30 sec dans la glace. 3- Centrifuger à 25000g pendant 15 min à 4 C et récupérer les surnageants Solubilisation des corps d inclusion (optionnel) Généralement, l essentiel de la protéine de fusion se trouve dans le culot le surnageant 25000g mais une partie peut se trouver dans les «corps d inclusion», sortes de poches dans lesquelles la bactérie stocke les protéines étrangères. 1- Les culots 25000g sont lavés avec 5 volumes de tampon de lyse puis centrifuger à 25000g pendant 15 min à 4 C 2- Répéter l étape précédente encore une fois 3- Resuspendre les culots dans 5 volumes le tampon NLS et incuber sous agitation magnétique pendant 15 min à T ambiante. 4- centrifuger à 25000g pendant 15 min 5- les surnageants sont repris dans 3 volumes CHAPS (3-[3- cholamidopropyl-dimethylammonio]-1-propane sulfonate, fourni) à la concentration finale de 4% afin de renaturer la protéine de fusion extraite des corps d inclusion. 6- Le mélange est incubé 15 min sous agitation (dessus/dessous) avant de procéder à la purification XI) Purification des protéines et analyse en gel de polyacrylamide (SDS/PAGE) 1- Equilibrer les billes de Cobalt-sépharose (gel Talon) dans le tampon de lyse contenant 1% CHAPS et 10 mm d imidazole (tampon chromato)

2- Les billes de gel sont sédimentées par centrifugation à 1000 t/min et le tampon de lyse éliminer 3- Ajouter dans un ratio 10:1 (v/v) le surnageant et avec les billes et incuber sous rotation pendant 1h à T ambiante. 4- Les billes de gel sont sédimentées par centrifugation à 1000 t/min et les surnageants gardés dans la glace. 5- Réaliser 3 lavages avec 5 volumes le tampon chromato, 6- Pour éluer la protéine de fusion, resuspendre les billes dans 500 ul de la solution d élution (200 mm imidazole dans le tampon Chromato). Et incuber pendant 30 min sous rotation T ambiante. 7- Séparer les billes de l éluat par centrifugation à 1000t/min. 8- Sauvegarder l éluat. Refaire 3 fois cette opération. Apprécier visuellement (ou mesurer la fluorescence dans un spectrofluorimètre) au fur et à mesure de l élution. 9-. Remarque-1: Avant l étape de l élution, il est possible d observer sur banc UV et/ou au microscope, les billes «enrobées» de fluorescence. Il est possible également de suivre l élution de la protéine fluorescente en temps réel. Remarque-2: Une partie de l extrait N-lauryl-sarcosine peut être dialysé toute la nuit en chambre froide contre le tampon Tris-HCl 50 mm ph8 contenant 1,5% CHAPS. Les extraits seront resuspendus dans 50 µl de tampon d électrophorèse en présence de SDS (conditions dénaturantes) ou en absence de celui-ci (conditions natives) pour vérifier la synthèse des protéines par gel de polyacrylamide 10%. Voir tableau ci-dessous et protocoles affichés dans la salle (Tous les ingrédients sont fournis).

Jour J4 : Les objectifs de la troisième journée seront : - test de la fixation de la protéine Fur sur sont ADN cible par expérience de gel retard. 12. Expérience de gel retard 1- Préparer un gel de polyacrylamide 10% native sans SDS. 2- Sur le temps que les gels polymérisent ajouter dans deux tubes ependorffs de 500µl * Tube 1 : 2 µl d ADN du gène sira, 2µl d ADN compétiteur X µl de tampon de charge et 10 µl de protéine fur-red ou fur-native et complète à XX µl avec de l eau miniq * Tube 2 : 2 µl d ADN du gène sira, 2µl d ADN compétiteur X µl de tampon de charge et complète à XX µl avec de l eau miniq 3- Incuber 30 min à température ambiante 4- Faire pré-migrer les gels polyacrylamide 10% native dans le tampon TBE durant au moins 30 min pour équilibrer les gels 5- Charger 15 µl des tubes 1 et 2 dans les gels et faire migrer 6- Démouler les gels et faire incuber 5 min dans une solution BET et révéler sous le band à UV

Séquence de Fur tacct gtacaatgtcccggtgttcaagtggccttgccgttgtaa atgtaagctgtgccacgtttttattaacaatatttgcca gggacttgtggttttcatttaggcgtggcaattctataa tgatacgcattatctcaagagcaaattctgtcacttctt ctaatgaagtgaaccgcttagtaacaggacagattccgc 1 - atg act gat aac aat acc gcc cta aag aaa 31 - gct ggc ctg aaa gta acg ctt cct cgt tta 61 - aaa atc ctg gaa gtt ctt cag gag ccg gac 91 - aac cat cac gtc agt gcg gaa gat tta tac 121 - aaa cgt ctg atc gat atg ggt gaa gaa att 151 - ggt ctg gct acg gta tat cgc gta ctg aac 181 - cag ttt gac gac gct ggt atc gtc acc cgc 211 - cac aat ttt gaa ggc ggt aaa tcc gta ttt 241 - gaa ctg aca cag caa cat cac cac gat cac 271 - ctg atc tgc ctc gac tgc ggc aag gtt atc 301 - gaa ttt agt gat gat tcc atc gaa gcg cgt 331 - cag cgt gaa att gcc gca aaa cat ggc att 361 - cgc ctg act aac cac agt ctc tat ctt tac 391 - ggt cac tgt gcc gaa ggc gat tgc cgc gaa 421 - gat gaa cat gcg cac gaa ggc aaa taa gccagcctgaacgagaaaagccaacctgcgggttggctt ttttatgcaagggaaataagaaaagcgagagttacagct ctcacttatttgttattactgcgtatttcctgccagact ttatcacaatcggctttcaccgcctgatcatttccggtt tgcgttgcacgcagacactgctgataatccagtacgcgt acact