Imager dans la profondeur des tissus : les microscopies biphotoniques

Imager dans la profondeur des tissus : les microscopies biphotoniques L imagerie optique constitue un outil primordial pour la biologie. Cependant, la forte diffusion de la lumière par les tissus épais empêche leur observation à l aide des techniques optiques classiques. Récemment, de nouvelles microscopies de balayage basées sur des phénomènes optiques non linéaires ont été développées, comme les microscopies de fluorescence biphotonique et de génération du second harmonique. Elles permettent l imagerie en profondeur des tissus épais et l application in vivo des techniques optiques jusque là limitées aux échantillons in vitro. Introduction La microscopie optique joue depuis son existence un rôle central en biologie, en donnant accès aux constituants du vivant invisibles à l œil nu. Elle permet au XIX ème siècle la découverte de la cellule, du noyau, de nombreuses études de morphologie. Le XX ème siècle voit notamment l avènement des techniques de fluorescence basées sur l absorption de lumière par des colorants intrinsèques ou extrinsèques suivie d émission de lumière à une longueur d onde plus longue. Mais les propriétés diffusives des tissus biologiques brouillent l imagerie d un objet enfoui en profondeur, et la lumière d excitation, dont l intensité est augmentée pour atteindre des profondeurs plus importantes, endommage l échantillon. Comme nous allons le voir, les microscopies basées sur des interactions non linéaires entre la lumière et les colorants permettent de contourner en partie ces difficultés, et d acquérir des images jusqu à une profondeur d environ 400 microns. Nous allons nous concentrer particulièrement sur les interactions non linéaires biphotoniques (i.e. à deux photons), qui sont de deux natures possibles (figure 1). Une molécule peut absorber simultanément deux photons pour passer de son état électronique de repos à un état excité ; une partie de l énergie absorbée, contenue dans des vibrations moléculaires, est rapidement transmise à l environnement (~ 10 12 s), puis au terme de la durée de vie de l état excité (~ 10 9 s), la molécule retombe vers son état de repos en réémettant un photon, qui produit le signal de fluorescence biphotonique. Une molécule peut également diffuser instantanément deux photons incidents en un seul photon ; la molécule n échange pas d énergie avec son environnement au cours de ce processus. L énergie du photon émis, donc la fréquence de radiation correspondante est alors exactement le double de celle des photons incidents, on parle alors de génération du second harmonique. Ces deux types de signaux non linéaires vont nous permettre d obtenir des informations complémentaires sur l échantillon. TPEF SHG Figure 1 - Diagrammes de Jablonski représentant les niveaux d'énergie de la molécule (traits horizontaux) et les processus de fluorescence excitée à deux photons (TPEF) et de génération du second harmonique (SHG). Article proposé par : Thomas Pons, thomas.pons@espci.fr Jérome Mertz, jmertz@bu.edu Laboratoire de Neurophysiologie et Nouvelles Microscopie INSERM/CNRS/ESPCI. Les auteurs remercient Laurent Moreaux, Serge Charpak (Laboratoire de Neurophysiologie et Nouvelles Microscopies), et Mireille Blanchard-Desce (Laboratoire de Synthèse et Electro-Synthèse Organique, CNRS) pour leur participation à ces travaux. 159

Microscopie de fluorescence biphotonique L absorption simultanée de deux photons par une molécule a été prédite théoriquement en 1931 par Maria Göppert Mayer, mais seuls les développements technologiques récents notamment des sources laser à impulsions ultrabrèves ont permis l avènement de la microscopie biphotonique en 1990. Ses applications sont depuis en essor considérable. Elle possède plusieurs avantages sur les techniques classiques de fluorescence à un photon, qui rendent son utilisation intéressante pour l imagerie biologique. Tout d abord, la longueur d onde d excitation est située dans l infra-rouge proche, typiquement vers 800-1000 nm, qui est une plage de plus grande transparence des tissus biologiques. Les photons infra-rouge sont moins diffusés par le tissu que les photons UV ou visibles utilisés dans les techniques d excitation à un photon. Le faisceau excitateur pénètre donc mieux dans le tissu et permet une imagerie de couches plus profondes. Mais l avantage de l excitation bi-photonique réside surtout dans le confinement de l excitation à un volume focal (voir encadré 1). Cette résolution tridimensionnelle de l excitation augmente de manière drastique le rapport signal/bruit dans un milieu épais. En effet, avec une excitation à un photon la fluorescence est générée sur tout le trajet de l illumination, le signal de fluorescence au focus est noyé dans le bruit de fond constitué par la fluorescence hors focus. En microscopie bi-photonique, toute la fluorescence émise par l échantillon provient du volume focal, formant un «pixel» d environ 1 µm 3. La collecte du signal doit être alors optimisée pour récolter le maximum de fluorescence malgré sa diffusion par le tissu. Le faisceau est ensuite balayé à travers l échantillon et la fluorescence est acquise point par point pour en former une image tri-dimensionelle. Comme l excitation est limitée à un petit volume, cette technique diminue grandement les problèmes d endommagement liés à l excitation de colorants, qui sont d une part le photoblanchiment des colorants, qui sont détruits ou rendus inutilisables suite à de nombreux cycles excitation-fluorescence, d autre part la libération de radicaux libres toxiques pour le tissu, qui limite la durée de vie de l échantillon. Le confinement de l excitation bi-photonique des colorants au Encadré 1 Microscopie à balayage laser La probabilité d excitation biphotonique varie en fonction du carré de l intensité incidente, elle est donc très sensible à la distribution spatiale comme temporelle de l intensité d un faisceau laser excitateur. Dans cet encadré, nous considérerons l aspect spatial de cette excitation ; nous verrons comment l aspect temporel intervient dans l encadré suivant. Lorsqu un faisceau laser de faible puissance est focalisé par un objectif de microscope, l intensité lumineuse est telle que l excitation biphotonique ne se produit de manière significative que dans un petit volume autour du point focal. Ce volume d excitation peut donc être considéré comme un «pixel» en trois dimensions (parfois dénommé un «voxel»). La taille de ce pixel dépend de la capacité de focalisation de l objectif, caractérisée par l ouverture numérique (n sin θ, ou n est l indice de réfraction du milieu et θ le demi-angle d ouverture du cône lumineux). Plus l ouverture numérique est grande, plus le volume d excitation est petit. Typiquement, en imagerie biologique, la taille de ce volume est de l ordre de 0.5 µm latéralement et de 2 µm axialement. Ces dimensions définissent la résolution spatiale d un microscope biphotonique. Notons en comparaison que la taille typique d une cellule biologique est de d ordre de 10 µm ou plus. Afin de générer une image tridimensionnelle, le volume d excitation doit être balayé en trois dimensions dans l échantillon (voir figure). Ceci s effectue soit en déplaçant l échantillon, soit en déplaçant le point focal du faisceau laser (en rouge). En général, pour des raisons de vitesse et de commodité expérimentale, il est préférable de balayer le point focal. Le balayage latéral du point focal dans l échantillon est le plus souvent réalisé à l aide d un scanner constitué de deux miroirs pivotants, et conduit à la reconstruction d une image plane (en pointillé). Le déplacement axial est ensuite obtenu en translatant l objectif, permettant une focalisation plus ou moins profonde dans l échantillon. La détection du signal provenant de l échantillon (en vert) s effectue à l aide de détecteurs sensibles, typiquement des tubes photomultiplicateurs (PMT). La détection du signal se propageant en sens inverse du laser (direction «épi») nécessite l utilisation d une lame dichroïque (D) qui ici transmet la longueur d onde du signal (typiquement dans le visible ou ultraviolet) et réfléchit celle de l excitation (typiquement dans le proche infrarouge). La détection du signal propageant dans la direction transmise nécessite un filtre passe bas bloquant complètement le faisceau laser. On peut éventuellement sélectionner différentes longueurs d onde d émission par des filtres passebandes. LASER miroirs pivotants PMT filtre PMT D objectif 0.5 µm 2 µm Figure - Schéma d'un microscope à fluorescence biphotonique avec détention en épi-fluorescence ou en transmission. 160

volume focal permet de préserver l échantillon : alors qu avec une excitation à un photon, on excite inutilement des colorants dans tout l échantillon, en dehors de la zone observée, l excitation est ici optimisée puisque tous les colorants excités contribuent au signal d intérêt. Des observations longues sont rendues possibles. L efficacité de l absorption bi-photonique dépend à la fois du laser d excitation, (sources à impulsions ultrabrèves, voir encadré 2), et de la molécule excitée. Il existe quelques protéines endogènes (intrinsèques) capables de fluorescence excitée à deux photons (NADH, GFP...). Les colorants organiques artificiels sont souvent bien plus efficaces et offrent une grande variété spectrale (variété de longueurs d onde d excitation et d émission) et de fonctionnalités (sensibilité à l environnement chimique, au potentiel transmembranaire...). Une utilisation courante de la microscopie de fluorescence bi-photonique en biologie est l imagerie calcique. En effet, le calcium est un important médiateur de phénomènes cellulaires. Sa concentration intracellulaire subit d importantes variations spatiales et temporelles et reflète l activité de la cellule. L utilisation d un colorant dont les propriétés optiques (spectre, efficacité d absorption ou d émission) dépendent de la concentration calcique en permet une mesure optique résolue spatialement et temporellement. Ceci est illustré dans la figure 2, montrant une cellule mitrale du bulbe olfactif in vivo chez le rat. La capacité d imagerie en profondeur et la résolution tridimensionnelle de la microscopie bi-photonique permettent l enregistrement du calcium intracellulaire dans différents compartiments d un neurone situé à plusieurs centaines de microns sous la surface du cerveau. Pour acquérir une telle image, un animal anesthésié est placé sous l objectif du microscope après avoir subi une craniotomie. Une pipette d électrophysiologie est remplie d un colorant sensible au calcium dilué dans une solution proche du milieu intracellulaire d un neurone. La pipette est descendue en aveugle dans la région ciblée du cerveau jusqu à ce qu on reconnaisse la signature électrique indiquant la pénétration de la pipette dans un neurone. Le colorant diffuse alors pour remplir toute la cellule en une quinzaine de minutes. On peut ensuite observer la morphologie du neurone (voir figure 2), puis enregistrer simultanément son potentiel électrique au soma (corps cellulaire) et les changements de la concentration de calcium dans différents compartiments du neurone, comme le soma ou les dendrites (permettant au neurone de recevoir des informations d autres neurones), suite à une stimulation (application d odeurs, stimulation électrique du nerf olfactif, stimulation électrique intracellulaire...). Ce type d étude permet de mettre en lumière la réponse d un neurone in vivo à divers stimuli, et le fonctionnement des structures neuronales mises en jeu. Microscopie à génération du second harmonique Une autre interaction non linéaire entre la lumière et un colorant impliquant deux photons est la génération du second harmonique (SHG). La SHG repose sur la sommation cohérente des diffusions hyper-rayleigh (i.e. de deux photons incidents en un seul réémis) provenant d une population de colorants à faible illumination. On peut considérer Figure 2 - a) Neurone (ici une cellule mitrale) du bulbe olfactif du rat remplie de colorant par une pipette d'enregistrement électrophysiologique intracellulaire. Cette image est la projection d'une pile d'images prises à différentes profondeurs (l'acquisition prend 5 µs/pixel, soit environ 1 s par section horizontale de 200 µm 200 µm, et 3 min pour une reconstruction tri-dimensionnelle sur 400 µm de profondeur). On voit la pipette qui plonge de la surface à gauche du champ de vue vers le soma à droite à environ 400 µm de profondeur. La longue dendrite apicale remonte vers la gauche et se termine par le bouquet dendritique vers 100 µm. La barre représente 50 µm. b) Enregistrement simultané du calcium intracellulaire et du potentiel électrique. Les potentiels d'action spontanés enregistrés dans le soma (trace du bas) induisent des entrées de calcium dans le bouquet dendritique (trace du haut). (Extrait de Charpak et al., PNAS, 98:1230-1234). 161

les deux phénomènes, d absorption et de diffusion de deux photons, comme se produisant de manière simultanée et indépendante pour une même population de colorant. Les photons diffusés ont une énergie exactement double de celle des photons incidents, ce qui permet de choisir une longueur d onde d excitation telle que la raie d émission SHG et le spectre d émission de fluorescence soient disjoints. La probabilité d une telle diffusion est, comme l absorption biphotonique, proportionnelle au carré de l intensité incidente. Lorsqu un faisceau est focalisé dans un échantillon, l émission du signal est confinée à un volume focal, et la résolution tridimensionnelle est la même que celle de la fluorescence bi-photonique. On peut ainsi imager simultanément le même échantillon en fluorescence bi-photonique et en génération du second harmonique. Mais la génération du second harmonique est un phénomène cohérent (voir encadré 3). Les champs électriques diffusés par chacun des colorants vont interférer entre eux. D autre part, la parité du processus est telle que la génération de SHG, comme les autres phénomènes de diffusion d un nombre pair de photons, est interdite pour une répartition centro-symétrique des colorants. Là où le signal de fluorescence nous renseigne sur le nombre total de colorants excités, le signal SHG nous fournit donc une information complémentaire sur le degré d asymétrie des colorants. En particulier, les colorants doivent posséder une structure électronique sans centre de symétrie. Les colorants dits «push-pull» offrent une telle asymétrie, avec un donneur et un accepteur d électron à chaque extrémité d un pont électronique. Comme la phase du champ diffusé à la fréquence double dépend de l orientation du colorant, les émissions de deux colorants proches orientés anti-parallèlement interféreront destructivement tandis que celles de deux colorants orientés parallèlement interféreront constructivement. L équipe de Mireille Blanchard-Desce, du laboratoire de Synthèse et Electrosynthèse organique (Université Rennes 1), a synthétisé des colorants push-pull amphiphiles (avec des affinités à la fois hydrophiles et hydrophobes) capables Encadré 2 Calcul du signal de fluorescence Puisque la génération d un photon de fluorescence nécessite l absorption de deux photons d excitation, le taux d émission de fluorescence F varie quadratiquement avec l intensité incidente I. Nous écrivons donc F = 1/2σ I 2. Le paramètre moléculaire σ reliant F et I s appelle la section efficace active (en anglais «action cross-section»). Le facteur 1/2 est inséré par convention quand F est exprimé en unité de photons/s, et I en unité de photon/s/cm. Le facteur σ est le plus souvent exprimé en Göppert-Mayer (1 GM = 10-50 cm 4 -s/photons) en hommage à Maria Göppert-Mayer, une physicienne autrichienne qui établit le fondement de la théorie de l absorption biphotonique dans les années 1930. Notons que l unité de la section efficace biphotonique est plus compliquée qu une simple aire. Celle-ci dépend aussi de la longueur d onde d excitation. En règle générale, les colorants organiques les plus souvent utilisés en microscopie biologique se situent entre 1 et 100 GM, les protéines fluorescentes (GFP,...) vers 10 GM, et les nano-cristaux vers 10 4-10 5 GM. Nous sommes en mesure maintenant de calculer la fluorescence émise par une molécule située exactement au point focal d un faisceau laser. Comme nous le verrons dans cet exemple, il est très intéressant d utiliser un faisceau laser à impulsions. Imaginons que le laser émette des pulses de lumière de durée τ à une cadence r (dénommée «taux de répétition» du laser). Si l intensité impulsionelle, ou crête, au point focal est Î 0 où nous notons 0 pour le point focal et ^ pour la crête), le taux de fluorescence pendant la durée de l impulsion est F 0 = 1 2 σ Î 2 0. La fluorescence générée par pulse est donc τ F 0, et le taux moyen de fluorescence est F 0 = rτ F 0. Il est souvent préférable de réécrire ceci en termes d intensité moyenne I 0 = rτ Î 0 du faisceau laser. Nous obtenons alors F 0 = 1 2 σ(rτ) 1 I 2 0. De loin, le laser le plus répandu en microscopie biphotonique est le Ti : saphir mode-locké, émettant des pulses de largeurs τ 10 13 s avec une cadence proche de r 10 8 Hz, d où (rτ) 1 10 5. En comparaison, (rτ) = 1 pour un laser continu (non-impulsionel). L utilisation d un laser à impulsions est donc très intéressante, bien que la durée de vie de l état excité d une molécule fluorescente dans l eau soit typiquement 1 ns, impliquant que pendant environ 90 % du temps la molécule est en état d attente d excitation. Prenons un exemple concret. La section efficace active de la fluorescéine excitée à une longueur d onde de 1 µm dans l eau est environ 10 GM. Ajustons notre faisceau laser de telle façon qu une puissance moyenne de 1 mw soit focalisée sur une surface de 1 µm 2. L intensité du laser au point focal est environ 10 5 W/cm 2, ce qui correspond à 5 10 23 photons/s/cm 2. La molécule émettra donc environ 1000 photons de fluorescence par seconde. Notons que ce calcul est idéal dans la mesure où nous avons supposé que la molécule se situe exactement au point focal, où l intensité du faisceau laser est maximale, ce qui ne correspond pas à la situation de molécules en solution. Prenons le cas plus général d une concentration C de molécules en solution. Si le volume d excitation est V, le nombre moyen de molécules excitées à un instant donné est N = CV. Par exemple, si C = 1 µm et V = 1 µm 3, alors N 600. Ces molécules sont distribuées aléatoirement dans le volume d excitation, et non au point focal. En conséquence, le taux de fluorescence par molécule doit être corrigé par un facteur γ, souvent appelé «facteur de contraste» du volume d excitation, typiquement entre 0.2 et 0.3. Le taux total de fluorescence provenant des N molécules est donc F total = Nγ F 0. Pour l exemple ci-dessus, nous trouvons finalement F total 2 10 5 photons/s. 162

de s insérer dans des membranes lipidiques (figure 3). Lorsqu ils sont perfusés dans le milieu extracellulaire, ils s insèrent dans le feuillet externe des membranes, comme des lipides. Cette insertion assurant une orientation parallèle de tous les colorants, les émissions SHG des colorants interfèrent constructivement, et l intensité du signal SHG est proportionnelle au carré de la densité de colorants. Les colorants éventuellement internalisés par la cellule ne possèdent pas ce degré d organisation élevé, et ne produisent pas de signal SHG. Le contraste membranaire est donc bien plus important qu en fluorescence (voir figure 4). Encadré 3 Cohérence de la génération du second harmonique L agitation thermique a tendance à équilibrer la composition des deux feuillets d une membrane. Bien que, comme pour un lipide, le retournement de ces colorants («flip-flop») vers le feuillet interne soit ralenti par le passage énergétiquement coûteux de la tête polaire à travers le cœur hydrophobe de la membrane, nous atteignons finalement une situation d équilibre centro-symétrique dans laquelle les interférences entre les émissions des colorants deviennent destructives et le signal de second harmonique s éteint. Puisque le signal SHG est sensible à la différence de population entre les deux feuillets et celui de fluorescence à la population totale de colorants dans la membrane, nous avons ainsi La génération du second harmonique (SHG) est similaire à la fluorescence induite par une absorption biphotonique. Dans les deux cas, deux photons incidents sont «convertis» en un photon d émission. Néanmoins, ces phénomènes diffèrent fondamentalement : pour générer de la fluorescence, une molécule absorbe de l énergie lumineuse et la libère ensuite après un temps indéterminé sous la forme d un photon de fluorescence. La phase de ce photon est donc aléatoire. En revanche, pour générer un photon par interaction SHG, une molécule n absorbe pas l énergie incidente mais la diffuse plutôt, de manière non-linéaire (en convertissant deux photons en un). Cette diffusion est quasi-instantanée, et donc la phase de l émission est bien prescrite. Nous devrons alors considérer les amplitudes lumineuses plutôt que les intensités. En effet, dans l approximation dipolaire électrique, l interaction SHG est décrite par µ 2ω = 1 2 â E 2 ω, où E ω représente l amplitude incidente à la fréquence fondamentale ω, et µ 2ω le moment dipolaire induit de la molécule à la fréquence double 2ω. Ce dipôle induit rayonne ensuite un champ SHG, d amplitude E 2ω proportionnelle à µ 2ω. Les champs électriques E 2ω et E ω sont des vecteurs complexes. La phase du premier est prescrite par la phase du second via le tenseur complexe â, appelé hyperpolarisabilité de la molécule. Notons que â contient aussi une phase qui, en règle générale, dépend de l orientation de la molécule. Considérons la SHG provenant de plusieurs molécules, et étudions trois cas où ces molécules sont orientées de manière 1) aléatoire, 2) unidirectionnelle, ou 3) tête-bêche : 1) Dans le cas où les molécules sont orientées aléatoirement, par exemple si elles sont en solution, la phase du tenseur â et donc la phase de E (n) 2ω sont aléatoires pour chaque molécule. L émission SHG est alors analogue à la génération de fluorescence : la puissance totale émise est proportionnelle au nombre N de molécules dans le volume d excitation. Dans le cas d orientation aléatoire, l émission de second harmonique est dite incohérente, ou hyper-rayleigh. 2) Dans le cas d un marquage membranaire où les N molécules sont orientées de manière unidirectionnelle, le tenseur â est identique pour chaque molécule. Les amplitudes et les phases des champs E (n) 2ω dépendent donc entièrement du champ électrique E (n) ω du faisceau laser incident sur chaque molécule. En sommant ces champs E (n) 2ω et prenant en compte les déphasages supplémentaires dus aux positions relatives des molécules, nous obtenons le champ total émis par les molécules. Si N molécules sont dans la zone d excitation, le champ total SHG est proportionnel à N. L intensité totale est donc proportionnelle à N 2 (en contraste avec le cas précédent). Notons que cette technique de calcul du champ émis par plusieurs molécules est analogue à celle utilisée pour calculer le rayonnement provenant d une antenne à réseau phasé en télécommunication. Selon le principe de la conservation d impulsion, l émission de SHG est principalement vers l avant, la détection s effectue donc en général dans la direction transmise. 3) Examinons maintenant le cas où la moitié des molécules pointent dans une direction, et l autre moitié dans la direction opposée. Ce cas est illustré par la figure, montrant des images simultanées en fluorescence et en SHG de deux vésicules adhérentes. Le marquage des vésicules a été effectué par perfusion dans le milieu extérieur, donc les colorants membranaires sont insérés dans le feuillet externe, et pointent tous vers l extérieur des vésicules (orientation localement unidirectionnelle). En revanche, les colorants dans la zone d adhésion présentent une configuration centro-symétrique. Puisque les phases respectives de â s opposent, la SHG s annule complètement. En revanche, comme la phase de la fluorescence est aléatoire, indépendamment de l orientation des molécules, elle reste sensiblement inchangée dans la zone d adhésion. Cet exemple illustre bien la nature cohérente de l émission SHG. Figure - Deux vésicules géantes adhérentes marquées par un colorant membranaire. Dans la zone d'adhésion, la fluorescence est présente mais pas la SHG. 163

α D e transfert électronique lors de l excitation feuillet externe A + flip-flop - feuillet interne 3-4 nm Figure 3 - Les marqueurs membranaires push-pull possèdent une structure électronique asymétrique avec un accepteur (A) et un donneur (D) d'électrons. Leurs chaînes carbonées et leur tête polaire à leurs extrémités les rendent amphiphiles : lorsqu'ils sont perfusés en solution, ils sont ainsi capables de s'insérer dans le feuillet externe des membranes lipidiques, avec un certain angle d'insertion α, puis s'équilibrent en typiquement 2h entre les feuillets par flip-flop. accès à la répartition des colorants. Ceci nous permet par exemple de suivre dans le temps le flip-flop des colorants dû à l agitation thermique (on obtient des constantes de temps de l ordre de quelques heures à température ambiante), ou d étudier des phénomènes de flip-flop provoqués par des changements de conformation photo-induits des colorants. Une application majeure de la microscopie SHG est la mesure optique du potentiel transmembranaire. Elle permet une mesure rapide et résolue spatialement du potentiel membranaire d une population de neurones ou à différents endroits d une même cellule. En effet, l intérieur des neurones possédant un potentiel électrique inférieur de plusieurs dizaines de millivolts au milieu extracellulaire, la membrane est traversée par un champ électrique statique important ( 10 7 V/m). Ce champ électrique fournit une nouvelle source d asymétrie et modifie effectivement le signal SHG des colorants membranaires. Afin d avoir accès aux mécanismes responsables de ces variations de SHG, et de pouvoir caractériser différents colorants, nous avons développé un protocole utilisant des vésicules géantes artificielles de 50-100 µm de diamètre. En mesurant l angle moyen d insertion des colorants dans la membrane, nous avons mis en évidence deux mécanismes : d une part une réponse électronique modifiant les propriétés optiques des colorants, dite électro-optique, d autre part un changement d orientation des colorants membranaires conduisant à améliorer ou à dégrader les interférences entre les différents colorants. Chaque colorant répond à un changement de potentiel transmembranaire à l aide d un des mécanismes ou d une combinaison des deux, et on obtient, suivant les colorants, des variations de signal de l ordre de 10 % pour 100 mv. Cette sensibilité est similaire à celle obtenue par des méthodes de fluorescence, mais avec un contraste signal/bruit bien plus important car seuls les colorants insérés dans la membrane produisent du signal SHG. De plus, les mécanismes de réorientation sous champ permettent en théorie des réponses bien supérieures aux mécanismes purement électro-optiques. En revanche, comme dans toutes les méthodes utilisant des colorants exogènes, l utilisation de cette microscopie avec des neurones de mammifères se heurte pour l instant à des problèmes de toxicité photo-induite dus aux colorants. Il existe également des signaux SHG endogènes, ne nécessitant pas l insertion de molécules étrangères éventuellement toxiques. Cependant, les molécules responsables du signal SHG endogène doivent respecter les mêmes contraintes que des colorants exogènes, à savoir présenter une asymétrie électronique et une asymétrie de la répartition spatiale. Cependant, ces contraintes importantes peuvent être un avantage : l origine des signaux est extrêmement Figure 4 - Cellules isolées Ncadl en culture, marquées à l'aide d'un colorant membranaire «push-pull». Le contraste membranaire est bien meilleur en SHG (image de gauche) qu'en fluorescence (image de droite). (Extrait de Moreaux et al. 2001, Biophysical Journal 80:1568). 164

spécifique et permet de visualiser une composante moléculaire précise, éventuellement invisible par des techniques de fluorescence. Deux sources endogènes importantes de signaux SHG peuvent être notamment citées : La triple hélice du collagène possède une structure très organisée et orientée. Les fibres de collagène sont une source importante de second harmonique. L imagerie de ces fibres formant une matrice extracellulaire fournit des informations sur la structure des tissus (muscles, tendons, os...). Les microtubules sont un autre exemple de polymères linéaires orientés, source de SHG endogène. Bien que ces polymères soient abondants dans les tissus biologiques, il existe peu de structures dans lesquelles les microtubules s organisent en «fibres» orientées à l image du collagène. Cependant, les microtubules présents dans les axones, les fuseaux achromatiques qui permettent la séparation des deux groupes de chromosomes lors de la mitose, ou les cils cellulaires présentent des organisations asymétriques, et peuvent émettre du signal SHG. Conclusion Les microscopies non linéaires suscitent un intérêt immense de la part des biologistes, en particulier des neurobiologistes : la possibilité d imager des neurones jusqu à un millimètre de profondeur in vivo procure enfin la possibilité d étudier l activité neuronale à l échelle cellulaire avec l ensemble du réseau neuronal et un environnement physiologique préservés. La profondeur limite de l ordre du millimètre ne donne accès qu aux structures superficielles des tissus, mais cet inconvénient peut être contourné par l utilisation par exemple de sondes endoscopiques. Ces deux types de microscopies biphotoniques, de fluorescence et de génération du second harmonique permettent d une part l extension des techniques de fluorescence en profondeur dans les tissus biologiques (étude de la morphologie, de l environnement chimique,...), mais aussi l obtention d informations sur l organisation moléculaire inaccessibles par des techniques classiques. Les résultats prometteurs sur la sensibilité du signal de second harmonique au potentiel transmembranaire annoncent l émergence prochaine d une technique d imagerie du potentiel plus efficace et mieux résolue. Enfin, le mariage des processus non linéaires avec les techniques classiques les plus complexes (imagerie de la durée de vie de fluorescence, corrélations de fluorescence, transfert résonant de fluorescence...) et le développement de nouveaux colorants, organiques, génétiquement codés ou à base de nanocristaux, procurent aux scientifiques de nouveaux outils performants pour la recherche aussi bien en neuroscience que dans les autres domaines des sciences de la vie. Pour en savoir plus DENK (W.) et al., Science, 1990, 248 :73. ZIPFEL (W.R.) et al., Nature Biotech., 2003, 21 :1369. CHARPAK (S.) et al., PNAS, 2001, 98 :1230. MOREAUX (L.) et al., Biophys. J., 2001, 80 :1568. PONS (T.) et al., J. Biomed. Opt., 2003, 8 :428. CAMPAGNOLA (P.) et al., Nature Biotech., 2003, 21 :1356. 165