UNIVERSITÉ PERPIGNAN VIA DOMITIA Spécialité : Biologie Ecole doctorale : Énergie et Environnement Étude de la variabilité phénotypique, sous influence environnementale, chez Schistosoma mansoni, parasite de l homme : implication de l épigénome par une approche globale Thèse de doctorat présentée par Julie M.J. LEPESANT En vue de l obtention du grade de DOCTEUR DE L UNIVERSITÉ DE PERPIGNAN VIA DOMITIA Sous la direction de M. Christoph Grunau, Maître de conférence Membres du Jury Mme Cristina VIEIRA, Professeur (rapporteur) M. Christoph GREVELDING, Professeur (rapporteur) Mme Ana RIVERO, Chargée de recherche (examinateur) M. Guillaume MITTA, Professeur (examinateur) M. Christoph GRUNAU, Maître de conférence (directeur de thèse) 12 Novembre 2012
Résumé La bilharziose est une maladie parasitaire humaine qui se trouve au second rang mondial, après la malaria, en termes de morbidité et de mortalité induites par le parasite. Plus de 200 millions de personnes sont infestées dans 74 pays et plus de 200 000 personnes décèdent par an (Chitsulo et al. 2004; Gryseels et al. 2006). Schistosoma mansoni, ici étudié, est responsable de la bilharziose intestinale. Ce parasite possède un cycle de vie complexe, passant obligatoirement à travers deux hôtes : un hôte intermédiaire mollusque d eau douce et un hôte définitif humain ou murin. Lors du cycle de développement, les différents stades sont exposés à divers environnements. Par exemple, les stades larvaires peuvent être confrontés à plusieurs hôtes intermédiaires (souche de mollusque) ou définitifs (humain ou murin). Mes travaux de thèse concernent l influence de l environnement sur l épigénome de Schistosoma mansoni. L information épigénétique est une source supplémentaire pour la création de variants phénotypiques, nous proposons que certains de ces variants puissent être hérités et sélectionnés, et ainsi conférer un avantage au parasite. Pour investir cette hypothèse nous avons décidé de modifier l environnement du parasite de façon biotique et abiotique, lorsqu il se développe au sein de l hôte définitif ou lorsqu il est au contact de l hôte intermédiaire. En effet, Schistosoma mansoni est un endoparasite donc chaque hôte, dans lequel il va se maintenir, représente son environnement direct. Pour cela nous avons utilisé une drogue anti-helminthe et un hôte intermédiaire allopatrique. La réponse du parasite aux différents changements d environnements a été analysée de la population (traits d histoire de vie) à la molécule (génome, épigénome, transcriptome). Les nouvelles techniques de biologie moléculaire et de séquençage massif nous ont permis de réaliser des études globales. Lors de ces travaux de thèse, les différentes évolutions expérimentales ont mené à deux énigmes : (1) «Adaptation rapide de Schistosoma mansoni à une drogue anti-helminthes» et (2) «Adaptation rapide de Schistosoma mansoni à l Amérique du Sud». Les résultats obtenus pour cette dernière ont amené une troisième énigme : (3) «Différenciation sexuelle en l absence de gène W-spécifique dans un système ZW».
Abstract The schistosomiasis is a parasitic human disease which ranks second only after the malaria, in term of morbidity and mortality. More than 200 million people are infested in around 74 countries and more than 200.000 death per year (Chitsulo et al. 2004; Gryseels et al. 2006). The study model, Schistosoma mansoni, is responsible for the intestinal schistosomiasis. The life cycle of this parasite is complex with the passage through two obligatory host, a fresh water snail as intermediate host, and human or rodents as definitive hosts. During the life cycle, all the stages could be exposed to various environments. For example, the larval stage could be exposed to different intermediate or definitive hosts. The aim of my research is to study the influence of the environment on the epigenome of Schistosoma mansoni. The epigenetic information is a supplementary resource to generate phenotypic variants and we propose that some variants could confer advantage to the parasite, could be selected and heritable through generations. To investigate this assumption, we decide to modify the environment, essentially the host environment, using biotic and abiotic modifications. Because Schistosoma mansoni is an endoparasite, each host in which he will develop, represents his direct environment. In this study we have modified the definitive host environment using antihelminth drugs, and the intermediate host environment using an allopatrique strain. The adaptive response of the parasite to various environment is analysed from population level (life history traits) to the molecular level (genome, epigenome, and transcriptome). New technics of molecular biology and massive sequencing allowed us to do whole genome analyses. During this PhD, different experimental evolution lead to three different enigma: (1) «Rapid adaptation of Schistsoma mansoni to antihelminth drug», (2) «Rapid adaptation of Schistosoma mansoni to South America» and (3) «Sexual differenciation without W-specific genes, in a ZW system».
TABLE DES MATIÈRES PRÉAMBULE CHAPITRE 1 : Introduction générale... p 24 1 Contexte scientifique.. p 24 1.1 Relation entre l adaptation et l épigénétique.. p 24 1.1.1 Historique p 24 1.1.2 Adaptation vs Acclimatation... p 27 1.1.2.1 Le corail comme exemple d acclimatation. p 28 1.1.2.2 Les pinsons des Galápagos comme exemple d adaptation. p 29 1.1.2.3 Les tardigrades comme exemple d adaptation p 30 1.1.3 La relation entre génotype, épigénotype, environnement et phénotype. p 31 1.1.4 Les supports de l information épigénétique p 34 1.1.5 L information épigénétique chez S. mansoni : État de l art... p 36 1.1.6 Vers une caractérisation approfondie de l épigénome de S. mansoni.p 38 1.2 Modèle d étude... p 40 1.2.1 Zones de répartition p 40 1.2.2 Bilharziose.. p 41 1.2.3 Cycle de vie et reproduction... p 41 1.2.4 Environnement-hôte p 44 1.2.5 S. mansoni comme modèle en adaptation évolutive... p 47 1.2.6 Traitements. p 48 1.2.6.1 Traitements à succès p 48 1.2.6.2 Traitements en échec... p 49 1.2.7 Phénomène de compatibilité p 52 1.3 Évolutions expérimentales sous pression de sélection : drogues anti-helminthes et hôte intermédiaire allopatrique. p 55 2 Objectifs de la recherche doctorale p 57
CHAPITRE 2 : Matériel et Méthodes 1 Matériel biologique p 60 1.1 Énigme 1 «Adaptation rapide de S. mansoni à une drogue anti-helminthe» p 60 1.2 Énigme 2 «Adaptation rapide de S. mansoni à l Amérique du Sud» p 62 1.3 Énigme 3 «Différenciation sexuelle en l absence de gène W-spécifique dans un système ZW» p 64 2 Analyses statistiques et de génétique des populations p 64 3 Traits d histoire de vie p 64 4 Techniques de biologie moléculaire et cellulaire... p 65 4.1 Sexage et génotypage des stades larvaires..p 65 4.2 ImmunoPrécipitation de la Chromatine (ChIP). p 66 4.3 Extractions des ARNs totaux. p 69 4.3.1 Pour les analyses de transcriptomique par RNA-seq. p 69 4.3.2 Pour les quantifications relatives ciblées par PCRq p 70 4.4 FISH (Flurorescent In Situ Hybridization).p 70 5 Techniques d analyses bioinformatiques p 70 5.1 Epigénome global : ChIP-seq. p 70 5.2 Transcriptome global : RNA-seq p 75 5.3 Génome global : gdna-seq p 78 CHAPITRE 3 : Résultats 1 Énigme 1 «Adaptation rapide de S. mansoni à une drogue anti-helminthe». p 80 2 Énigme 2 «Adaptation rapide de S. mansoni à l Amérique du Sud»... p 88 2.1 Étude des candidats génétiques et épigénétiques différents entre deux souches de parasites, issues d isolats géographiques distincts... p 88 2.2 Analyse des séquences promotrices des gènes impliqués dans le polymorphisme de compatibilité, les SmPoMucs. p 93 2.3 Évolution expérimentale de l adaptation d une souche de parasite S. mansoni à différentes souches d hôte intermédiaire.. p 96 2.3.1 Traits d histoire de vie : mesures phénotypiques p 96
2.3.2 Analyse transcriptomique (RNA-seq) et épigénétique (ChIP-seq). p 102 3 Énigme 3 «Différenciation sexuelle en l absence de gène W-spécifique dans un système ZW» p 115 3.1 Analyse des séquences répétitives et de novo assemblage de ces séquences p 116 3.2 Analyse des changements chromatiniens autour des séquences répétitives satellites suggérant un possible mécanisme pour l émergence des chromosomes sexuels... p 122 CHAPITRE 4 : Discussion p 129 CHAPITRE 5 : Conclusions et perspectives. p 159 CHAPITRE 6: Bibliographie p 167 CHAPITRE 7 : Annexes... p 178 1 Publication: Lepesant J.M.J., Boissier J., Climent D., Cosseau C. & Grunau C. (in prep.). Experimental observations of life traits during the life cycle of Schistosoma mansoni infecting sympatric or allopatric intermediate host... p 179 2 Publication: Lepesant J.M.J., Cosseau C., Boissier J., Freitag M., Portela J., Climent D., Perrin C., Zerlotini A. & Grunau C. (2012a). Chromatin structure changes around satellite repeats on the Schistosoma mansoni female sex chromosome suggest a possible mechanism for sex chromosome emergence. Genome Biology, 13, R14. (IF 9,036).. p 199 3 Publication: Lepesant J.M.J., Roquis D., Emans R., Cosseau C., Arancibia N., Mitta G. & Grunau C. (2012b). Combination of de-novo assembly of massive sequencing reads with classical repeat prediction improves identification of repetitive sequences in Schistosoma mansoni. Experimental Parasitology, 130, 470-474. (IF 2,122)... p 215 4 Publication : Lepesant J.M.J., Grunau C. & Cosseau C. (2011). Towards an understanding of the epigenetics of schistosomes: a comparative epigenomic study. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 106, 823-830. (IF 2,058).. p 221 5 Publication : Perrin C., Lepesant J.M.J., Roger E., Duval D., Thuillier V., Alliene J.F., Grunau C., Mitta G. & Cosseau C. (under revision). Promoter regions of duplicated
Schistosoma mansoni gene crucial for infections success undergo rapid epigenetic modifications in varying environments while remaining genetically stable. p 230 6 Curriculum vitae. p 278