Régulation de l Expression du Génome S. Bourgerie L. Mollet C. Hano Sujet d examen 1 ère session 2004-2005 (1h) CORRECTION Question n 1 : rappeler le principe de la régulation exercée par le complexe CRP-AMPc ; présenter un exemple. Le glucose est la source d énergie favorite d E. coli ; elle utilisera donc ce sucre avant de métaboliser tout autre sucre présent dans son environnement. Si E. coli est en présence d un mélange de glucose et de lactose, la cellule métabolisera tout le glucose avant de métaboliser le lactose si l on considère le fait que le répresseur lac n est plus fixé à son opérateur. Dans ces conditions il apparaît donc que de forts taux en glucose répriment l opéron lac c est à dire empêche son expression. Cet effet est défini sous le terme de répression catabolique ; elle se sur ajoute à la régulation négative normale de l opéron lac. La répression catabolique est médiée par la protéine CAP ( catabolite activator protein ), un régulateur positif de l opéron lac. en absence de glucose, CAP se fixe en une région de chromosome d E. coli située en amont de l endroit où l ARN pol. se fixe au promoteur et stimule la transcription ; ceci en l absence de la protéine répresseur lac. en présence de glucose, CAP ne peut se fixer à cette région en amont et la transcription ne peut se produire ; même si le répresseur lac est absent. Le glucose n affecte pas directement les propriétés de fixation de CAP ; le glucose joue en fait sur la synthèse d une molécule effecteur appelée AMPc. Pour que la protéine CAP se fixe à l ADN elle doit d abord interagir directement avec l AMPc. Quand le taux de glucose est haut, la concentration intracellulaire en AMPc est faible et à l inverse quand le taux de glucose est bas, la concentration en AMPc est forte. Par conséquence quand le taux de glucose est faible la CAP interagit avec l AMPc formant un complexe AMPc-CAP lequel se fixe sur le chromosome d E. coli juste en amont de l endroit où l ARN polymérase se fixe au promoteur. A l inverse quand le taux de glucose est fort, le taux d AMPc étant faible, il n y a pas de complexe AMPc-CAP qui peut se former. Sans ce complexe, très peu de transcription se produit même en présence de lactose. La répression catabolique n est pas au sens strict du terme une répression ; elle n est pas médiée par un co répresseur lequel mène à l inhibition de la transcription via une protéine répresseur ou activateur. La répression catabolique correspond plutôt à une voie possible pour un mécanisme de régulation positive pour lequel la fixation d une molécule effecteur (AMPc) active une protéine activatrice (CAP). Question n 2 : analyse de la figure n 1 4 constructions différentes ont été réalisées pour lesquelles un segment d ADN du gène secb situé en amont de la partie codante (segment renfermant un promoteur putatif) a été placé devant un cistron rapporteur lacz codant la β-galactosidase, protéine dont l expression est facile à évaluer. Les ADN plasmidiques contenant ces fragments ont été introduits dans une souche bactérienne (= transformation) afin de quantifier l activité β-gal pour trois conditions de culture différentes : avec du glycérol ou du glucose comme seule source de carbone, ou bien avec du glucose et de l AMPc. La 1 ère construction (pts101) réalisée correspond à un segment situé en amont du site de restriction HindIII (donc avant -315) : il apparaît un même niveau d activité β-galactosidase pour les trois conditions testées ; s il y a une activité β-galactosidase, c est que dans ce fragment se trouvent des éléments de séquence en mesure de promouvoir la transcription du cistron rapporteur ; un (premier) promoteur est donc contenu dans cette région. La 2 nde construction (pts102) correspond à la fusion transcriptionnelle pour laquelle a été placé, devant le gène lacz, le fragment entouré des sites BamHI & EcoRV, c est à dire de -5 à +130 : pour les 3 conditions de culture utilisées, il n apparaît (presque) aucune activité β-galactosidase : clairement, ce segment d ADN n est pas capable de promouvoir la transcription du gène rapporteur, donc il ne contient pas de promoteur. La troisième construction (appelée pts103) comprend le fragment HindIII / EcoRV (donc de -315 à +130) de secb placé devant lacz. Pour les trois conditions de culture, une activité β-galactosidase est mise en évidence ; fait intéressant, l activité mesurée la plus forte est celle lorsque la culture est menée en présence
de glycérol ; elle diminue de manière significative (d un facteur x3 environ) quand on est en présence de glucose et le nombre d unité double quand à ce milieu +Glc est rajouté de l AMPc. Il se trouve donc dans cette région un promoteur (nécessairement différent de celui trouvé dans le fragment en amont de HindIII) dont la force est modulée : il est soumis à régulation négative par le Glc, inhibition partielle levée par l ajout d AMPc. A ce niveau, nous en déduisons qu il existe deux promoteurs dans la région de secb soumis à analyse ; l un situé avant le site HindIII, non soumis à régulation ( = on parle de promoteur constitutif) et l autre placé entre les sites HindIII et BamHI (et pas jusqu à EcoRV : voir pts102) qui est sujet à régulation négative par le glucose, répression partiellement levée lors de l ajout d AMPc. La 4 ème construction (pts104) comprend le fragment entier à analyser placé devant le cistron lacz : pour les trois conditions testées, une activité β-galactosidase est mesurée ; cette activité est le reflet de l activité des deux promoteurs présents ; il y a donc une activité moindre en présence de glucose, répression partiellement levée quand de l AMPc est rajouté. Question n 3 : analyse de la figure n 3 La figure 3 relate une expérience de retard sur gel ; lorsque le fragment d ADN analysé se trouve reconnu par la protéine CRP, sa migration électrophorétique est modifiée : il est retardé (donc plus proche du pôle (- )) : donc en bas du gel (près du pôle (+)) se trouvent les fragments d ADN libres c est à dire non retardés alors qu en haut du gel on retrouve les ADN sur lesquels la protéine CRP s est fixé. 3 segments d ADN ont été analysés : 1- Pr-46 : ce fragment couvre toute la région depuis l amont du site reconnu par la CRP jusqu en aval du +1 : il constitue à priori la cible de CRP ; des quantités croissantes de CRP sont ajoutées (de 0,2 à 3,2nM). Avec ce fragment plus il y a de CRP, plus apparaît en quantité d ADN retardé dans sa migration ; il s est donc formé le complexe attendu CRP-ADN car sur ce fragment se trouve présent le site reconnu par cette protéine. 2- Pr-47 : ce fragment, légèrement plus court renferme également le site de fixation de la CRP : un profil électrophorétique comparable est observé à ce qui est obtenu avec le fragment Pr-46 ; c est une expérience de confirmation. 3- Pr-60 : ce fragment encore plus court commence (environ) au milieu du site de fixation de la CRP : il n apparaît pour les trois concentrations en CRP utilisées aucune fixation : pas de retard sur gel. Le fragment Pr-60 ne renferme pas la cible de la CRP. Résultat attendu avec le fragment Pr-102 Le fragment Pr-102 correspond à la région de secb qui commence à +1 et se poursuit quelques dizaines de nucléotides en aval. Ce fragment ne contient pas le site de fixation de la protéine CRP ; pour les trois concentrations en CRP utilisées, il n y aura pas de fixation possible : le profil électrophorétique attendu se présentera donc comme celui observé avec le fragment Pr-60. Pr-102 - [CRP] (nm) 0,2 0,8 3,2 + Question n 4 : schéma de l autoradiogramme 4 mutations ont été réalisées au niveau de l ADN du site de reconnaissance de la CRP : ces mutations abolissent la fixation de la protéine CRP. L autoradiogramme devra donc donner les résultats suivants : quelque soit la concentration en CRP, il ne pourra y avoir fixation de celle-ci ; pour cette série d expériences, un seul fragment d ADN (libre) sera
visible sur l autoradiogramme (vers le bas du gel, près du pôle (+)) ; il faudra prévoir les témoins suivants : - un témoin (+) où c est le fragment sauvage qui sera utilisé ; - un second témoin où pour ce même fragment (sauvage) il n y aura pas de CRP rajouté ; - un troisième témoin où le fragment muté sera placé sans addition de CRP. CRP-wt CRP-mut - 0 3,2 0 0,2 0,8 3,2 + [CRP] (nm) Question n 5 : analyse de la figure n 4 Etude in vivo de l activité transcriptionnelle de secb par l utilisation de fusion secb-lacz ; ceci sur deux souches, la souche ZK4 (souche sauvage) et la souche mutante RH77 (crp-déficiente) ; pour cette dernière, il n y pas de protéine CRP de produite. Après perméabilisation des cellules l activité β-galactosidase produite est évaluée, ceci pour les deux souches, pour deux constructions différentes et sous deux conditions différentes de culture. Les résultats sont présentés sur l histogramme de la figure 4 où sont présentées les activités β-galactosidase relatives. Avec la construction pts104 (qui correspond à la fusion où devant lacz se trouve le fragment entier de secb c est à dire avec les deux promoteurs) : il apparaît une activité β-galactosidase plus forte lorsqu au Glc est rajouté de l AMPc : ceci est conforme à ce que l on attend : une levée de la répression exercée par le Glc quand de l AMPc est rajouté ; cet effet n est pas observé quand on est dans la souche crp-déficiente ; en effet la fonction de l AMPc s exerce via l intervention de la protéine CRP : en l absence de la CRP (car la souche est déficiente) l AMPc rajouté n a plus d effet. Les légères fluctuations observées pour l activité β- galactosidase sont le reflet des incertitudes des mesures effectuées. Avec la construction pts102 : il s agit d une expérience témoin : en effet cette construction correspond à celle où le fragment de secb placé en amont de lacz ne renferme pas de promoteurs ; donc comme attendu pour les deux souches et les deux conditions testées, presque aucune activité β-galactosidase n est mesurée : il n y a pas de transcription possible du cistron lacz et donc pas de protéine produite, aux incertitudes près (= bruit de fond). Question n 6 : schéma récapitulatif En conclusion, deux promoteurs gouvernent la transcription du cistron secb ; promoteurs mis en évidence grâce à la réalisation de différents systèmes rapporteurs. Le premier promoteur (appelons-le P1) situé le plus loin du +1 est constitutif : son activité n est pas soumise à régulation : dans toutes les conditions testées, il dirige la transcription d éléments de séquence situés devant lui. Le second promoteur (appelons-le P2) situé le plus près du +1 est soumis à régulation : son activité est réprimée en présence de Glc et cette répression est en partie levée par un apport exogène en AMPc. Il a été montré pour P2 que le complexe CRP-AMPc exerce un effet.
Sujet d examen 2 nde session 2004-2005 (1h) CORRECTION Lu Y. & R.L. Switzer (1996) J. Bacteriol. 178(24) 7206-11 Question n 1 (voir COURS) Référence : Merino E. & C. Yanofsky 2005 Trends in Genetics 21(5) 260 La régulation génique par terminaison-antiterminaison de la transcription (appelée aussi atténuation de la transcription) est une stratégie souvent utilisée par les bactéries en réponse à un signal métabolique spécifique, ce qui entraîne l ARN polymérase soit à achever la transcription soit à continuer à transcrire les gène situés en aval sur l opéron. La décision de terminer (ou pas) la transcription repose sur l arrangement sélectif d une des deux structures secondaires de l ARNm, mutuellement exclusives, l antiterminateur et le terminateur. Compléments (hors-sujet): (il y a des exemples où l antiterminateur n est pas l élément essentiel ; dans ces cas, la terminaison dépend d un mécanisme moléculaire autre que la formation d une structure secondaire de l ARNm). Des séquences atténuatrices ont été identifiées parmi les 180 génomes bactériens entièrement séquencés. Ces atténuateurs se retrouvent au niveau de gènes codant des protéines impliquées dans divers processus métaboliques comme la biosynthèse de la thiamine, riboflavine, cobalamine, adénine, guanine, lysine et quelques autres acides aminés ; ils sont aussi utilisés pour les ARNt synthétases. Les différents mécanismes de l atténuation transcriptionnelle (revue par Henkin & Yanofsky 2002 BioEssays 24 : 700) 1- atténuation médiée par un ribosome (exemple de l opéron trp d E. coli) le niveau intracellulaire de l ARNt chargé en Trp détermine si le ribosome réalise une pause lorsqu il est en train de synthétiser le peptide leader TrpL ; cette pause favorise la formation d une structure antiterminatrice plutôt qu une structure terminatrice de la transcription. 2- atténuation médiée par une protéine (exemples de l opéron trp de B. subtilis et de l opéron bgl d E. coli) une protéine se fixant à l ARN interagit avec le transcrit naissant ce qui empêche la formation de la structure antiterminatrice (opéron trp de B. subtilis) ou bien la protéine stabilise la structure antiterminatrice (opéron bgl d E. coli). 3- atténuation médiée par un ARNt (exemple du gène codant les aminoacyl ARNt synthétases des bactéries gram (+)) un ARNt non chargé s apparie directement avec le leader du transcrit, stabilisant ainsi la structure antiterminatrice. 4- atténuation médiée par de petites molécules le leader du transcrit peut fixer de petits ligands ; cette fixation entraîne une sélection entre une des deux structures secondaires mutuellement exclusives qui provoques soit l antiterminaison soit la terminaison. Exemple 1 : fixation à l ARN de l adénosyl cobalamine régulant la transcription des gènes codant les protéines impliquées dans la biosynthèse de la vitamine B12 chez les bactéries à Gram(+) ce qui favorise le repliement de la séquence leader du transcrit en une structure terminatrice (réf : Vitreschak et al. 2003 RNA 9 : 1084) Exemple 2 : cas de la carence en Met chez les bactéries à Gram(+) : la fixation de la S- adénosylméthionine au leader du transcrit favorise la formation d une structure antiterminatrice (réf : MacDaniel et al. 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. 100 : 3083) Question n 2 La matrice n 1 correspond à un fragment d ADN (de pyr) de 591 pb. Cette matrice comprend le promoteur de l opéron pyr, la région leader 5 et les 27 premiers codons du cistron pyrr. L ARN transcrit à partir de cette matrice comprend les régions susceptibles de former le terminateur et la structure compétitrice antiterminatrice, dont l interconversion entraîne la régulation de l expression des gènes situés en aval. Deux produits de transcription sont obtenus à partir de chaque matrice :
- le produit le plus long (450 nt pour la matrice 1) correspond au «read-through transcript» c'està-dire au transcrit correspondant à la lecture de la totalité de la matrice sans arrêt de la machinerie de la transcription ; - le produit le plus court correspond à un produit obtenu du fait d un arrêt prématuré de la transcription. donc dans le 1 er cas, il n y a pas d arrêt de la transcription : une structure anti terminatrice s est mise en place ; dans le second cas, il y a arrêt précoce de la transcription : une structure terminatrice s est formée. 591nt 450 nt 124 nt Question n 3 La figure présente les effets de la protéine PyrR et de l UMP sur les produits de la transcription obtenus à partir de la matrice 1. En haut, on a les transcrits «read-through» (de 450 nt dans le cas de la matrice 1) (transcrit complet). En bas ceux «terminated» (transcrit plus court). Sans UMP, ni PyrR pas de courts transcrits donc pas de structure terminatrice qui apparaît dans ces conditions ; sans UMP mais avec la protéine PyrR, il apparaît le transcrit court : phénomène de terminaison prématurée de la transcription. Ce phénomène est accentué en présence d UMP (associé à PyrR) ; avec cependant pas de différence entre 0,1 & 0,5mM en UMP. La terminaison de la transcription requiert donc à la fois la protéine PyrR & l UMP. Question n 4 Matrice 3 : effet moins net que celui observé avec la matrice 1. UMP (mm) 0 0,1 0,5 PyrR 387 nt - + - + - + 167 nt La structure secondaire stable qui se forme au sein du transcrit le plus court rentre en compétition avec la structure terminatrice en tige-boucle.
Question n 5 Vérification expérimentale en modifiant la séquence de l ADN matrice afin d obtenir une structure moins stable ou bien en utilisant une matrice plus courte toujours capable de former la structure terminatrice ou antiterminatrice mais sans cet élément de séquence en 3 qui interfère. Le phénomène d atténuation de la transcription avec une telle matrice doit être plus sensible aux effets de la protéine PyrR et de l UMP. Question n 6 Schéma récapitulatif ; Il y a un équilibre entre structure terminatrice et anti terminatrice au niveau de la région 5 leader de l ARNm de l opéron pyr. [PyrR] La présence de la protéine PyrR entraîne la formation de la structure terminatrice (action renforcée par la présence d UMP) ; c est probablement la fixation de la protéine PyrR sur l ARNm qui provoque ces changements conformationnels. A titre d information A refined model for transcriptional attenuation of the B. subtilis pyr operon. The RNA sequences shown are from the first pyr attenuation (5 leader) region. The RNA structure at the right is proposed to be the secondary structure allowing read-through and is the more stable structure when PyrR is not bound. The RNA structure at the left is proposed to favor transcription termination. The free energies of formation of the secondary structures shown do not assume any contribution from PyrR binding. The structure at the left is proposed to be stabilized by binding of the PyrR-UMP complex to the AAT stem-loop, which changes the free energy of formation to a value more negative than 32.6 kcal/mol (1 cal = 4.184 J). PyrR binds to pyr mrna only when it is complexed with UMP. from Lu et al. 1996.
Sujet d examen 2 nde session 2006-2007 (2h) CORRECTION Données générales (compléments) La protéine FNR d E. coli est un facteur de transcription qui répond au changement de taux en oxygène du milieu. Dans des conditions d anaérobiose, la protéine FNR renferme un cluster [4Fe-4S] ce qui provoque la dimérisation de la protéine et augmente en conséquence sa fixation à l ADN au niveau de sites spécifiques ; à l inverse, en présence d oxygène (conditions d aérobiose) les clusters fer soufre se désassemblent, ce qui mène à la formation de monomères de FNR, réduisant en conséquence sa fixation à l ADN ce qui éteint les gènes activés normalement par cette protéine. Suite à sa fixation à l ADN, la protéine FNR active la transcription en recrutant l ARN polymérase ou à l inverse, de manière alternative, réprime la transcription en inhibant la formation des interactions favorables à la transcription entre le promoteur et l ARN polymérase. L activation de la transcription est facilitée par la formation de contacts spécifiques protéine-protéine entre les régions activatrices (AR1, AR2 & AR3) de FNR et les régions de l ARN polymérase. La séquence de l ADN reconnue par FNR consiste en une répétition inversée avec la séquence consensus suivante : TTGATnnnnATCAA ; il existe deux formes de base du promoteur reconnu par FNR ; les promoteurs de classe I dont le site FNR est situé en -61,5, -71,5, -82,5 ou -92,5 ce qui permet la formation d un unique contact protéine-protéine entre l AR1 de FNR et le domaine C-terminal de la sous unité α de l ARN polymérase. L architecture la plus commune correspond aux promoteurs de classe II dont le site FNR est centré à -41,5. Ce type d arrangement permet la formation de multiples contacts protéine-protéine entre l ARN polymérase et les 3 AR de FNR. Réponses aux questions posées 1 (2 pts) Puisque FNR est un facteur de transcription, sa séquence cible soit se situer au sein des promoteurs qui sont sous son contrôle (positif ou négatif) ou à proximité de ceux-ci. On peut donc exclure les séquences situées dans les séquences codantes et celles qui ne sont pas d origine bactérienne (les séquences virales intégrées c est à dire les prophages). 2 (1 pt) Les auteurs ont utilisé une souche lac(-) car c est une souche dépourvue d activité β-galactosidase endogène susceptible d interférée avec l activité du gène rapporteur. (2 + 1 pts) Il s agit de faire les comparaisons des valeurs numériques obtenues en aérobiose et anaérobiose, d identifier les valeurs significatives avec un effet observable dans les conditions attendues c'est-à-dire en anaérobiose. En aérobiose, il n y a quasiment pas de variation importante de l expression du gène rapporteur entre les souches exprimant et celle n exprimant pas la protéine FNR. Deux des 5 gènes testés voient leur expression augmenter dans des conditions d anaérobiose et ceci sous la dépendance de la protéine FNR ; il s agit des gènes yfgf & yhja. 3 (3 pts) commentaire et explications sur les pistes 1 et 2 de la figure 1 Une espèce (radiomarqué, fragment d ADN utilisé) observé au bas du gel, piste 1 Une seule espèce à mobilité électrophorétique moindre observée piste 2 ; cela correspond à la fixation de la protéine à sa séquence cible : il y a formation d un complexe ADN-protéine. 4 (2 pts) Souche sauvage : gain x30 (comparaison aérobiose/anaérobiose) Souche mutante fnr : gain x3 (donc seule la protéine OxyR fonctionne) Souche mutante oxyr : gain x2 (donc seule la protéine FNR fonctionne) Quand l un ou l autre des deux protéines n est pas exprimée, il y a (en anaérobiose) diminution nette de la transcription du gène rapporteur ; ces deux protéines (ensembles) ont donc un rôle dans la régulation observée. (3 pts) Rôle de la protéine OxyR? est ce que OxyR contribue à la régulation de la transcription du gène yhja? Oui, mais de manière un peu moins nette qu avec la protéine FNR. 5 (2 pts) Les auteurs ont réalisé des expériences de retard sur gel avec les deux protéines à la fois ; intérêts? y a-t-il fixation des deux protéines ou compétition pour leur site (c'est-à-dire fixation mutuelle exclusive)? Il apparaît un signal correspondant à une forme de l ADN cible occupé par les deux protéines à la fois. Ainsi la régulation de yhja est dépendant de 2 facteurs de
transcription, qui répondent tous les deux à des signaux incompatibles, l un suite à un manque d oxygène, l autre à un stress du aux peroxydes. 6 (2 pts) Les auteurs ont cherché à apprécier la spécificité de la fixation. Les formes inactivées des sites pour FNR et OxyR ont été testés afin de confirmer l importance de ces séquences comme cibles de ces protéines régulatrices ; pour répondre à la question d un contact effectif entre ces protéines et leurs cibles, requis pour observer l effet constaté. Si le site reconnu est inactivé (c'est-à-dire avec une séquence modifiée), y a-t-il toujours reconnaissance par leurs protéines respectives? apparemment non, donc on a à faire à une séquence cible unique et spécifique en terme de séquence. 7 (1 pt) Les auteurs ont testé la sensibilité (évaluation du nombre de survivants) d un mutant yhja au H 2 O 2 lors d une croissance anaérobie. Il apparaît clairement une diminution du nombre de survivants dès les premières minutes pour le mutant yhja comparé à la souche sauvage se «défendant» mieux contre un tel traitement. (1 pt) Conclusion : en réponse à un stress oxydatif (type traitement aux peroxydes), la cellule déclenche un processus de «défense» ; il y a inactivation d une série de gènes dont les produits sont utiles pour dégrader par exemple le H 2 O 2 (cela correspond à l expression de la CCP).