Dosage des acides aminés par spectrophotométrie différentielle H N Ac-Tyr-NH 2 (120 µm) H NH 2 N-acétyl-tyrosinamide ph 7 Ac-Trp-NH 2 (20 µm) NH NH 2 H N N-acétyl-tryptophanamide 73 Ac-Trp-NH 2 ph 7 rdre zéro: A = f(λ) A 1 er ordre: = f (λ) 74
2 e ordre: = f ( λ) 2 2 3 e ordre: = f ( λ) 3 3 4 e ordre: = f ( λ) 4 4 75 ph 7 2 e ordre: = f ( λ) 2 2 4 e ordre: = f ( λ) 4 4 76
ph 13 Tyr A (u.a.) H pk a = 10.1 H - ph 13 ph 13 289 nm 292 nm... 285.5 nm 77 Choix de la longueur d onde pour la quantification du Trp en présence d autres acides aminés * Source: rapport de laboratoire CHM 3173 Selon les moyennes et écart-types: 1 er choix 289 nm 2 e choix 285.5 nm H N Ac-Phe-Et 78
Détermination du Trp dans le lysozyme Échantillon de lysozyme (MM 14 600 Da): Le lysozyme contient 6 résidus Trp, 3 Tyr et 4 Cys. A 280nm ε 280nm = 3.78 10 4 M -1 cm -1 [lysozyme] = 10,4 µm d 4 A/dl 4 (u.a.) 0.0E+00-5.0E-08-1.0E-07-1.5E-07-2.0E-07-2.5E-07-3.0E-07 λ=285.5 nm y = -0.0027x + 2E-10 R 2 = 0.997 0.0E+00 2.0E-05 4.0E-05 6.0E-05 8.0E-05 1.0E-04 Concentration Ac-Trp-NH 2 (M) 79 2.1.2 Méthodes colorimétriques pour le dosage des protéines Pour déterminer la concentration totale de protéines dans un mélange complexe par spectrophotométrie d absorption, des méthodes colorimétriques sont souvent employées. Ces méthodes sont basées sur la réaction d agents chromophores avec les liens peptidiques ou avec certains acides aminés des protéines. Cette réaction donne lieu à une coloration (dans la région visible) dont l intensité (l absorbance) est directement proportionnelle à la concentration de la protéine. Les méthodes les plus utilisées pour quantifier les protéines sont celles de Biuret, Lowry et Bradford. 80
Méthode de Biuret Principe: Les ions Cu 2+ (ajoutés sous forme de sulfate de cuivre) se lient aux atomes d azote des liens peptidiques de la protéine dans des conditions de ph alcalin, produisant ainsi un complexe de couleur mauve avec absorption maximale à 540-550 nm. 1. Chélation: Cu 2+ /H - + protéine complexe [Cu 2+ -protéine] couleur mauve 2. Réaction rédox: Cu 2+ + (acides aminés polaires, Trp, Tyr) red Cu + + (acides aminés) ox Un temps d attente d environ 30 min est nécessaire pour le développement de la couleur. Méthode utilisée pour mesurer des concentrations élevées de protéines en solution: 1-5 mg/ml 81 La formation d un complexe requiert au moins une structure dipeptidique. Les acides aminés ne réagissent pas. Les ions Cu 2+ se lie directement au squelette peptidique des protéines. La complexation du Cu 2+ ne dépend donc pas de la séquences des acides aminés. Spectre d absorption du complexe cuivre-protéine Les acides nucléiques n interfèrent pas (ils n ont pas de structure peptidique). L ammoniac et certaines amines peuvent interférer (eg. tampon TRIS, sels d ammonium sulfate). (D après D.J. Holme, H. Peck, 82 Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)
Méthode de Lowry Principe: Cette méthode couple les réactions impliquées dans la méthode de Biuret avec une 2 e réaction rédox (couleur). 1. Complexation d ions Cu 2+ avec les atomes d azote des liens peptidiques de la protéine dans des conditions de ph alcalin. Le Cu 2+ est ainsi réduit au Cu + : Cu 2+ /H - + protéine complexe [Cu 2+ -protéine] Cu 2+ + (acides aminés polaires, Trp, Tyr) red Cu + + (acides aminés) ox 2. Les ions Cu + et les radicaux du Trp, Tyr et Cys réduisent le complexe acide phosphotungstique/acide phosphomolybdique (couleur jaune) contenu dans le réactif Folin-Ciocalteau (Na 2 Mo 4 + Na 2 W 4 + H 3 P 4 ), produisant ainsi une couleur bleue. Cu + + (F-C) ox Cu 2+ + (F-C) red bleu 83 L absorbance peut être mesurée soit à 540 nm ou à 720 nm. Un temps d attente d environ 40 min est nécessaire pour le développement de la couleur. Des courbes d étalonnage non-linéaires sont obtenues due à la décomposition du réactif F-C à ph alcalin. Sensibilité: requiert seulement 10 à 200 µg de protéine (1 µg/ml à 1.5 mg/ml) Un bon choix pour doser des protéines qui contient des chromophores (flavines, hèmes, etc.) Interférents: K +, Mg 2+, EDTA, phénols, détergents, agents réducteurs Des variations de la composition des acides aminés ont une influence sur le développement de la couleur. n doit préparer une courbe d étalonnage avec une protéine dont la composition est similaire à celle de l inconnu. Des variations de préparation du réactif F-C, de température et du temps d attente avant de prendre une mesure nécessitent la préparation d une courbe d étalonnage pour chaque analyse. 84
Méthode de Bradford Principe: Un colorant, le Coomassie Brilliant Blue G-250, est ajouté à la solution de protéine dans des conditions de ph acide. Le Coomassie se lie à la protéine par des interactions non-covalentes (ponts hydrogène, interactions hydrophobes et interactions ioniques) et sa longueur d absorption maximale augmente de 465 nm (rouge) à 595 nm (bleu). 85 Détection de protéine de 1 µg/ml à 1.5 mg/ml Courbe d étalonnage non-linéaire L absorbance varie de protéine à protéine Méthode simple et rapide (5 min), ajout d un seul réactif Spectre d absorption du complexe Coomassie-protéine Coomassieprotéine Coomassie (D après D.J. Holme, H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) 86
2.1.3 Spectres d absorption et structure secondaire de polypeptides Poly-L-lysine ph 10.8 & 52 C ph 6.0 & 25 C ph 10.8 & 25 C (D après I. Tinoco, K.Sauer & J.C. Wang, Physical Chemistry: Principles & Applications in Biological Sciences, 3è éd, 1995) 87