Petrifilm Test Listeria dans l Environnement Guide d Interprétation Ce document est destiné à vous apporter une aide pour l interprétation des résultats obtenus à partir du test M Petrifilm Listeria dans l Environnement. Pour plus d information, veuillez contacter votre représentant habituel M en produits de microbiologie. Le test Petrifilm Listeria dans l Environnement (LE) est un système qui contient un milieu de culture sélectif, des nutriments, un agent gélifiant soluble dans l eau froide et un indicateur chromogène qui facilite le dénombrement et/ou la mise en évidence de Listeria spp. Les tests Petrifilm LE ont été conçus pour analyser des échantillons environnementaux et pour accroître l efficacité du suivi du plan de nettoyage et désinfection. La présence d un indicateur tel que Listeria innocua apporte la preuve que les conditions sont réunies dans l environnement pour le développement de L. monocytogenes. Le test Petrifilm LE détecte la majorité des Listeria présentes dans l environnement, à savoir Listeria monocytogenes, Listeria innocua, et Listeria welshimeri.* De nombreux germes présents dans l environnement peuvent être stressés par les conditions du milieu ambiant ou les produits de nettoyage. L eau peptonée tamponnée (EPT) est utilisée comme milieu de revivification avec le test Petrifilm LE pour revivifier les Listeria stressées sans en augmenter leur nombre. Cette revivification en EPT n est pas une étape d enrichissement. 1 1. Test Petrifilm LE sans colonie visible après 28h d incubation. L analyse est terminée. Résultat Quantitatif : nombre de colonies de Listeria sur ce test: <1. Se reporter au paragraphe «Echantillonnage quantitatif» du présent document pour calculer la quantité de Listeria dans l échantillon de l environnement analysé. aux standards internes de l usine (par exemple : haut, moyen, bas, ou acceptable et non acceptable). Résultat Qualitatif : Listeria non détectée. 2 2. Test Petrifilm LE comportant uniquement des colonies rouge-violet intense après 28h d incubation. L analyse est terminée. Résultat Quantitatif : nombre de colonies de Listeria sur ce test : 11. Se référer au paragraphe «Echantillonnage Quantitatif» du présent document pour calculer la quantité de Listeria dans l échantillon de l environnement analysé. aux standards internes de l usine (par exemple : haut, moyen, bas, ou acceptable et non acceptable). Résultat Qualitatif : Listeria détectée. * Pour plus d information sur la prévalence des espèces de Listeria, veuillez contacter votre représentant habituel M en produits de microbiologie. L. ivanovii, L. grayi/murrayi et L. seeligeri se développent mais ne forment pas des colonies typiques.
La vitesse à laquelle l indicateur chromogène devient rouge-violet intense dépend de plusieurs facteurs, comme par exemple la nature de la souche et le degré de stress auquel le microorganisme a été soumis. a. a. Avant 0h d incubation, si certaines colonies sont présentes mais ne sont pas rouge-violet intense (par exemple, gris ou rose clair, comme montré en a), poursuivre l incubation jusqu à 0h. Après un maximum de 0h d incubation, les colonies qui ne sont pas devenues rouge-violet (colonies restant gris ou rose clair, comme montré en a) ne doivent pas être interprétées comme Listeria. Résultat Quantitatif : nombre de colonies de Listeria sur ce test: <1. Se reporter au paragraphe «Echantillonnage quantitatif» du présent document pour calculer la quantité de Listeria dans l échantillon de l environnement analysé. aux standards internes de l usine (par exemple : haut, moyen, bas, ou acceptable et non acceptable). Résultat Qualitatif : Listeria non détectée. b. b. Après un maximum de 0h d incubation, les colonies qui étaient gris à rose-clair et sont devenues rougeviolet intense pendant l incubation (comme montré en b) doivent être interprétées comme Listeria. Résultat Quantitatif : nombre de colonies de Listeria sur ce test:. Se reporter au paragraphe «Echantillonnage quantitatif» du présent document pour calculer la quantité de Listeria dans l échantillon de l environnement analysé. aux standards internes de l usine (par exemple : haut, moyen, bas, ou acceptable et non acceptable). Résultat Qualitatif : Listeria non détectée. Remarque : Ne pas compter les colonies sur le pourtour en mousse, la sélectivité du milieu y est modifiée.
4 4. Comme le test Petrifilm LE peut être interprété de trois façons différentes, aucun intervalle de comptage n est suggéré. Quand un grand nombre de colonies s est développé, interpréter le résultat (qualitatif ou semi-quantitatif) ou estimer le résultat (quantitatif) comme décrit ci-dessous. Résultat Quantitatif : le nombre estimé de colonies de Listeria sur ce test est de 600. Quand de nombreuses colonies sont présentes, estimer leur nombre en comptant les colonies dans un ou plusieurs carrés représentatifs. Calculer le nombre moyen par carré et multiplier par 42. La surface inoculée du test fait environ 42cm 2. aux standards internes de l usine (par exemple : haut, moyen, bas, ou acceptable et non acceptable). Résultat Qualitatif : Listeria détectée. 5 5. Quand un grand nombre de colonies se développe, les tests Petrifilm LE peuvent présenter de nombreuses colonies petites et peu distinctes et/ou une coloration rose à brune de l ensemble de leur surface. Résultat Quantitatif : les colonies de Listeria sur ce test sont trop nombreuses pour être dénombrées (environ 10 4 sur cette image). aux standards internes de l usine (par exemple : haut, moyen, bas, ou acceptable et non acceptable). Résultat Qualitatif : Listeria détectée. 6 6. La couleur de fond du test peut varier en fonction de la présence de poussière, terre, sable ou autre particules contenus dans l échantillon de l environnement, ou du type de matériel utilisé pour le prélèvement et/ou de l eau peptonée tamponnée (milieu de revivification). Interpréter ou dénombrer toutes les colonies de couleur rouge-violet intense comme Listeria. Résultat Quantitatif : nombre de colonies de Listeria sur ce test : 11. Se référer au paragraphe «Echantillonnage Quantitatif» du présent document pour calculer la quantité de Listeria dans l échantillon de l environnement analysé. aux standards internes de l usine (par exemple : haut, moyen, bas, ou acceptable et non acceptable). Résultat Qualitatif : Listeria détectée.
M Petrifilm Listeria dans l Environnement Pour des informations détaillées concernant Mises en garde, Responsabilité de l utilisateur, Garantie limitée, Limitation de responsabilité de M, Stockage et destruction, Mode d emploi se reporter à la Notice d utilisation. Fiche d Utilisation Stockage Petrifilm Petrifilm Petrifilm 1 2 Stocker réfrigérées ou congelées les poches non ouvertes de tests Petrifilm LE à une température 8 C ( 46 F). Utiliser les tests Petrifilm LE avant la date d expiration indiquée sur l emballage. Il est préférable de laisser les poches atteindre la température ambiante avant ouverture afin d éviter l apparition de condensation. Préparation Pour refermer les poches de tests, replier l extrémité et fermer à l aide d un ruban adhésif ou d une pince. Pour éviter toute exposition à l humidité, ne pas placer les poches refermées au réfrigérateur. Conserver les poches refermées dans un endroit frais et sec pendant un mois au maximum. Eviter d exposer les tests à une température supérieure à 25 C (77 F) et/ou une humidité relative supérieure à 50%. Ajouter aseptiquement 2ml (écouvillon) 4 5 6 ou 5ml d EPT (milieu de revivification) Collecter les échantillons d environnement à l aide d un écouvillon (ou équivalent), une chiffonnette ou tout autre dispositif de prélèvement. Le milieu liquide d hydratation doit être de l eau stérile, de l eau peptonée tamponnée (EPT) ou, si des agents désinfectants sont présents, un bouillon neutralisant comme le Letheen est recommandé. Pour tout ces diluants, en utiliser un volume inférieur ou égal à 10 ml. stérile à 20-0 C (68 F-86 F) aux échantillons prélevés. Ne pas utiliser de bouillon d enrichissement sur ces tests. Mélanger vigoureusement, passer au Stomacher ou au Vortex l échantillon collecté avec l EPT pendant approximativement une minute. Laisser l échantillon à température ambiante, 20-0 C (68 F-86 F), entre une heure et une heure et demi au maximum, puis mélanger à nouveau. Cette étape est nécessaire à la revivification des Listeria stressées. Ensemencement Placer le test Petrifilm sur une surface Avec une pipette électronique M ou 7 8 9 horizontale. Soulever le film supérieur. une pipette équivalente, tenue perpendiculairement au test Petrifilm LE, déposer ml de l échantillon au centre du film inférieur. Recouvrir délicatement avec le film supérieur de manière à éviter l introduction de bulles d air.
<70 F Incubation Interpretation 10 Exercer une légère pression sur le diffuseur placé au centre du film supérieur au dessus de l inoculum. Ne pas appuyer, tourner ou faire glisser l étaleur. Retirer l étaleur. Attendre au minimum dix minutes pour permettre au gel de se former. Remarque : si l échantillon s étale de lui-même, l utilisation de l étaleur n est pas nécessaire. 11 12 Placer les tests Petrifilm LE dans un incubateur, le film supérieur vers le haut, sans empiler plus de 10 unités. Incuber pendant 28 heures ± 2 heures à 5 C ± 1 C ou à 7 C ± 1 C. Ne jamais dépasser 0 heures d incubation. Une incubation plus longue que celle recommandée peut conduire à des résultats douteux. Lire les tests Petrifilm LE à l oeil nu ou à l aide d un système permettant une amplification visuelle ou lumineuse. Ne pas compter les colonies sur le pourtour en mousse, la sélectivité du milieu y est modifiée. Le test M Petrifilm Listeria dans l Environnement peut être utilisée comme méthode quantitative, semi-quantitative ou qualitative. Pour un résultat quantitatif, Pour une analyse semi-quantitative, 1 dénombrer et enregistrer toutes les 14 enregistrer les résultats en se basant 15 colonies rouge-violet intense. Vous choisirez éventuellement ce mode d analyse quantitative si vous devez prendre des actions correctives différentes en fonction du nombre de colonies présentes. sur le niveau relatif de colonies rougeviolet intense présentes. Vous choisirez éventuellement ce mode d analyse semi-quantitative si vous devez prendre des actions correctives différentes en fonction du niveau relatif de colonies présentes, et si un nombre de colonie précis n est pas requis. Pour une analyse qualitative, enregistrer les résultats comme positif (détecté) ou négatif (non détecté) d après la présence ou l absence de colonies rouge-violet intense. Vous choisirez éventuellement ce mode d analyse qualitative si une réponse oui/non est suffisante et appropriée pour le rapport d analyse. Négatif (non détecté) Nombre de colonies de Listeria sur ce test : 16 Se référer au paragraphe «Echantillonnage Quantitatif» du présent document pour calculer la quantité de Listeria dans l échantillon de l environnement analysé. Le niveau de Listeria doit être enregistré en catégories adaptées au lieu de prélèvement et aux standards internes de l usine (par exemple : haut, moyen, bas, ou acceptable et non acceptable). Positif (détecté) 16 Optionnel Pour isoler une colonie en vue d une identification plus poussée, soulever le film supérieur et prélever la colonie.
Echantillonnage Quantitatif et Interprétation Si vous avez choisi d utiliser le test Petrifilm Listeria dans l Environnement de manière quantitative, se reporter à la notice d utilisation, et calculer le nombre d unités formant colonie (UFC) par zone comme montré ci-dessous. Vous considérerez éventuellement aussi les points suivants: Un protocole adapté est la clé pour obtenir une information fiable au niveau des contrôles d environnement. Utilisez toujours la même procédure d échantillonnage. Idéalement, utilisez le même matériel et la même technique de prélèvement. La taille de la zone de prélèvement peut être définie par la réglementation locale, des standards internes, et/ou le lieu de prélèvement. Par exemple, vous pourrez utiliser une zone plus grande pour les produits finis car la contamination bactérienne attendue est faible. Plus d information sur les échantillons d environnement peut être trouvée à l aide des références citées ci-dessous, et dans la brochure M Procédures de Contrôle de l Environnement. POUR DETERMINER la quantité de Listeria par surface analysée, vous aurez besoin de noter: 1) la surface de la zone analysée 2) le volume de liquide d hydratation dans le dispositif de prélèvement ) le volume d eau peptonée tamponnée ajouté 4) le volume déposé 5) le nombre de colonies compté APPLIQUER l équation ou utiliser le tableau suivant pour déterminer le nombre d UFC/surface analysée. Des exemples figurent dans les pages suivantes. Se reporter à la Notice d utilisation et à la Fiche d utilisation pour tous les détails concernant la méthode. Vous pourrez aussi déterminer le résultat par échantillon. Par exemple : UFC / canalisation. UFC / surface = (nombre de colonies x [ml liquide d hydratation + ml EPT] / ml) / surface analysée A. Nombre total de ml d EPT + liquide d hydratation: A B. Nombre de ml déposés sur le test Petrifilm LE: ml B C. Diviser la ligne A par la ligne B: C D. Nombre de colonies dénombrées: D (si le nombre de colonies dénombrées est égal à zéro, inscrire «<1» dans la ligne D) E. Multiplier la ligne C par la ligne D: E F. Surface analysée: F G. Diviser la ligne E par la ligne F: G La ligne G donne le nombre d UFC / surface analysée OU Les méthodes quantitatives de prélèvement d échantillons de l environnement sont conformes aux références suivantes: Standard Methods for the Examination of Dairy Products, Section.7D, American Public Health Association, Washington D.C., 1992. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, Section.512 and.521, American Public Health Association, Washington D.C., 2001.
Interprétation Quantitative Exemple : méthode de prélèvement par écouvillonnage, ou équivalent. 1 2 4 Utiliser un écouvillon ou équivalent imbibé de 1mL de liquide d hydratation (voir ligne A) pour écouvillonner la zone choisie. Pour cet exemple, on a choisi une surface de 50cm 2 (voir ligne F). Replacer l écouvillon dans son contenant stérile. Ajouter 2ml d eau peptonée tamponnée (voir ligne A). Après l étape de revivification, déposer ml sur un test Petrifilm LE (voir ligne B). A. Nombre total de ml d EPT + liquide d hydratation: 1 + 2 = A B. Nombre de ml déposés sur le test Petrifilm LE: B C. Diviser la ligne A par la ligne B: 1 C D. Nombre de colonies dénombrées: 50 D E. Multiplier la ligne C par la ligne D: 50 E F. Surface analysée: 50 cm 2 F G. Diviser la ligne E par la ligne F: 1 UFC/cm 2 G Après incubation, dénombrer les colonies. Pour cet exemple, on dénombre 50 colonies (voir ligne D). Exemple : Méthode de prélèvement par chiffonnette (ou éponge) 1 2 4 Utiliser une chiffonnette (ou éponge) humidifiée par 10 ml de liquide d hydratation, faire le prélèvement sur la surface choisie (voir ligne A). Pour cet exemple, la surface sera de 50cm 2 (voir ligne F). Replacer la chiffonnette (ou l éponge) dans son contenant stérile et ajouter 5ml d eau peptonée tamponnée (voir ligne A). Après l étape de revivification, déposer ml sur un test Petrifilm LE (voir ligne B). A. Nombre total de ml d EPT + liquide d hydratation: 10 + 5 = 15 A B. Nombre de ml déposés sur le test Petrifilm LE: B C. Diviser la ligne A par la ligne B: 5 C D. Nombre de colonies dénombrées: 10 D E. Multiplier la ligne C par la ligne D: 50 E F. Surface analysée: 50 cm 2 F G. Diviser la ligne E par la ligne F: 1 UFC/cm 2 G Après incubation, dénombrer les colonies. Pour cet exemple, on dénombre 10 colonies (voir ligne D).
Commentaires Additionnels M propose une ligne complète de produits pour effectuer une large gamme d analyses microbiologiques. Pour plus d information sur nos produits, connectez-vous à notre site Internet: www.m.com/microbiology Référence du document Date Version Octobre 2005 1.0 Département Microbiologie Laboratoires M Santé Boulevard de l Oise 95029 Cergy Pontoise Cedex France Tél: 01 0 1 85 77 Fax: 01 0 1 85 78 Europe Laboratoires M Santé Boulevard de l Oise 95029 Cergy Pontoise Cedex France Tel: + (0) 1 0 1 85 71 Fax: + (0) 1 0 1 85 78 Cachet du distributeur M et Petrifilm sont des marques déposées de M. M Santé 2005