Microscopie I : Bases de la Microscopie

Microscopie I : Bases de la Microscopie 1. Nature de la lumière 1.1 Le photon : définition D une manière générale, la lumière est constituée par des trains d ondes électromagnétiques. Ces trains d ondes sont émis par les atomes de la source lumineuse et vont se propager dans l espace jusqu à ce qu ils viennent en contact avec de la matière. Ces trains d ondes sont caractérisés par leur fréquence ν (nombre de cycles par seconde), leur phase (signature temporelle de leur émission par les atomes de la source) et leur polarisation (orientation du plan de vibration). Dans la pratique on ne réfère pas à la fréquence n d un train d ondes lumineux (grandeur absolue) mais à sa longueur d onde λ (distance séparant deux maxima), grandeur dépendante de la vitesse de propagation c du milieu traversé, et inversement proportionnelle à la fréquence ν. E longueur d onde (λ) E B B Sens de propagation Axe de vibration Figure 1. Onde électromagnétique. Elle correspond à la propagation dans l espace de la variation sinusoïdale concomitante du champ électrique E et du champ magnétique B selon des plans orthogonaux. Dès que ces trains d ondes interagissent avec de la matière, on ne les considère plus comme des ondes mais comme des particules discrètes dotées d une énergie cinétique inversement proportionnelle à la longueur d onde. On nomme ces corpuscules des photons. Par abus de langage, on utilise également le terme de photon pour nommer les trains d ondes. 1.2 Chromatisme Un rayon lumineux est donc un faisceau de trains d ondes électromagnétiques. L intensité du rayon sera proportionnelle au nombre de photons le composant. Si tous les photons ont une même longueur d onde, on dira que le rayon est monochromatique. Si le rayon est composé de photons ayant des longueurs d ondes différentes, le rayon sera nommé polychromatique. Dans le cas particulier où toutes les longueurs d ondes du visible sont représentées à proportions égales, la lumière sera dite «blanche». En termes de perception, les longueurs d onde visibles se répartissent entre 400 nm et 700 nm, en dessous de 400 nm commence le domaine ultraviolet (UV); au dessus de 700 nm s étend le domaine infrarouge (IR). Les différentes longueurs d ondes visibles seront perçues comme : violettes de 400 nm à 450 nm, bleues de 450 à 510 nm, vertes de 510 à 530 nm, jaunes de 530 à 550 nm, oranges de 550 nm à 600 nm et enfin rouges de 600 nm à 700 nm. 1

1.3 Cohérence La définition de la cohérence de la lumière peut recouvrir plusieurs notion différentes. En effet on peut effectuer une distinction entre cohérence spatiale et cohérence temporelle. Un rayon lumineux est dit incohérent lorsque les trains d ondes qui la composent sont émis de manière irrégulière et désordonnée. C est le cas des sources de lumière conventionnelles où les photons sont émis au gré de l agitation thermique des atomes de la source. Une source est dite cohérente lorsqu il existe une relation régulière de phase entre les trains d ondes émis. C est le cas d une source laser où tous les photons émis à un temps donné sont tous en phase. 2. Interactions lumière matière 2.1 Absorption Lorsqu un rayon lumineux traverse un matériau, les trains d ondes vont interagir avec la matière. Certains photons vont être absorbés par les molécules du matériau. En conséquence, l intensité I de la lumière mesurée en sortie du matériau sera inférieure à l intensité I0 mesurée avant le matériau. Le rapport I0/I constitue l absorbance du matériau. Pour certains matériaux, l absorbance peut varier en fonction de la longueur d onde. Cette propriété permet de filtrer la lumière afin de ne retenir qu un certain contingent de longueurs d onde. On peut ainsi réaliser des filtres de plusieurs catégories : passe-court (SP, short-pass) transmettant les courtes longueurs d onde, passe-long (LP, long-pass) transmettant les grandes longueurs d onde, passe-bande (BP, band-pass) transmettant les longueurs d onde intermédiaires et enfin réjecteur (notch filter) qui élimine les longueurs d onde intermédiaires. 2.2 Réfraction/Réflexion La lumière se propage différemment suivant les milieux traversés. En fait chaque milieu est caractérisé par un indice de réfraction n, c est-à-dire par une vitesse de propagation de la lumière. Ainsi deux trains d onde de même fréquence et en phase qui traversent respectivement des milieux ayant des indices de réfraction différents seront ou bien accélérés ou freinés. En sortie des milieux les deux trains d ondes ne seront plus en phase. l n 2 Sens de propagation Déphasage Φ Figure 2. Réfraction. La lumière subit un changement de vitesse de propagation dans le milieu n2. Le rayon en sortie du milieu n2 est déphasé de Φ par rapport à un autre rayon n ayant pas traverse le milieu n2. Le déphasage dépendra de l indice n2 et de la longueur l du milieu traversé. Lorsque la lumière traverse l interface (nommé dioptre) entre deux milieux d indices différents, elle peut être déviée de sa trajectoire initiale si celle-ci n est pas perpendiculaire à l interface. La déviation dépendra de l angle d incidence du rayon et du rapport entre les indices de réfractions n1 et n2. 2

sin α 1 = n 2 sin α 2 α 1 α 1 α 1 α 2 n 2 α 2 n 2 n1 n 2 > n 2 < n 2 angle critique -> réflexion Figure 3. Déviation et réflexion de la lumière au passage d un dioptre. De plus l angle de déviation dépendra de la longueur d onde de la lumière. Ainsi dans un prisme, de la lumière blanche va être décomposée en un éventail de rayons dont les longueurs d onde s étendront de façon monotone de 400 nm à 700 nm. 2.3 Diffraction Lorsqu un rayon lumineux arrive sur une petite structure ou sur le bord d un objet, une fraction des trains d ondes va se trouver dispersée à l intérieur d un cône centré sur la direction de propagation du rayon. L ouverture du cône dépendra d une part de la longueur d onde de la lumière et d autre part de la dimension de la structure ou de l acuité du bord. Plus la structure est petite ou le bord fin, plus le cône est ouvert. Ces rayons diffractés vont pouvoir interférer avec d autres rayons ce qui aura pour conséquence d altérer le contraste et la résolution des images formées par un microscope. Cependant ce qui apparaît à première vue comme un défaut peut être mis à profit pour extraire de l information ou créer des contrastes (microscopies à contraste interférentiel). x I franges d interférence Figure 4. Interférence de rayons diffractés. Ecran 2.4 Transfert d énergie, fluorescence 3

e 1 = hν 1 e 1 > e 2 λ 1 < λ 2 e 2 = hν 2 Noyau Noyau Orbitale basse état de repos Orbitale haute état excité Absorption Emission Figure 5. Principe de la fluorescence. A gauche, l énergie e1 du photon incident est absorbée et place l électron périphérique sur une orbitale correspondant à un état excité. A droite, l électron revient vers l orbitale de repos et libère de l énergie sous la forme d un nouveau train d onde de moindre énergie. La longueur d onde du photon émis est plus grande que la longueur d onde du photon absorbé. 3. Formation de l image par une lentille 3.1 Optique géométrique Dans un microscope l image agrandie de l objet est formée par la lentille de l objectif. L objet à observer est placé au voisinage du foyer objet de la lentille. L image agrandie se construit au-delà du foyer image de la lentille. Le grandissement dépendra de la distance du foyer de la lentille au centre de la lentille. Plus cette distance est courte, plus fort est le grossissement. Cependant, il n est pas possible d agrandir infiniment un objet en réduisant la distance du foyer. Le pouvoir séparateur de la lentille est limité par la diffraction de la lumière. Autrement dit, si par construction géométrique on peut imaginer obtenir des grossissements supérieurs à 100x, ceux-ci n ont aucun sens car à partir de 100x on améliore plus la résolution et l on ne fait que grossir du flou! objet Fo objectif Fi axe optique image agrandie Figure 6. Agrandissement par un objectif de microscope. Fo : foyer objet, Fi : foyer image 3.2 Optique ondulatoire La formation d une image dans un microscope est la résultante de deux fonctions de répartition de la lumière: - la fonction d étalement du point dans le plan focal conditionnant la résolution latérale (en X et Y). - la fonction de défocalisation conditionnant le résolution axiale (en Z). La fonction d étalement du point (ou PSF pour Point Spread Function) est la description mathématique de l image du disque d Airy (Fig.7) obtenue lorsque l on observe un point lumineux idéal (infiniment petit) au travers d un objectif. Cette image familière présentant un maximum d intensité entouré d anneaux de plus en plus sombres résulte de l incapacité de la lentille à collecter la lumière dispersée au-delà d un angle donné α (demi angle d ouverture du cône de lumière entre le foyer et la lentille). 4

Io x plan image Disque de Airy et distribution en intensité objectif plan objet Figure 7. Formation de l image dans un microscope. L image d un point infiniment petit (en réalité d une taille très inférieure à la résolution) est en fait une tache de diffraction (disque d Airy) ou fonction d étalement du point résultant de l interférence entre les ondes diffractées. Le cône de lumière entre le foyer et la lentille définit l ouverture numérique (NA) de l objectif. La formule de l ouverture numérique s écrit comme suit NA = n sin α, où α est le demi-angle du cône et n est l indice de réfraction du milieu. Par exemple, pour un objectif à immersion dans l huile (n=1,515) ayant un demi-angle α de 67,5 on obtient une ouverture numérique de 1,40. 3.3 Résolution La résolution conférée par un objectif est dite limitée en diffraction. Elle résulte des interférences au niveau du plan image, des ondes lumineuses diffractées le long du trajet des rayons. d xy = 0.61 l / NA d Figure 8. Définition de la résolution (pouvoir séparateur) : capacité à discriminer deux disques d Airy. La résolution telle qu elle est définie par Rayleigh (d min Rayleigh), correspond à la distance entre deux points objets pour laquelle le maximum d intensité du disque d Airy du premier point correspond au premier minimum d intensité du disque d Airy du second point. Elle est égale en théorie à: d min = 0,61 λ / NA. Cette définition n est valable que si l objectif collecte de la lumière provenant d un condenseur ayant la même ouverture numérique. Fort heureusement, en épi-illumination cette condition est parfaitement assurée puisque l objectif joue également le rôle de condenseur. 3.4 Ouverture numérique L ouverture numérique (NA) est une caractéristique essentielle d un objectif. C est elle qui est directement responsable de la luminosité et de la résolution d un objectif. Elle dépend directement de 1 ) l indice de réfraction du milieu et 2 ) de l angle formé par trois points particuliers qui sont : le centre de la lentille, le foyer objet de la lentille et le bord de la lentille. Plus cet angle sera grand et meilleures seront la luminosité (plus de rayons lumineux se trouvent collectés) et la résolution. Deux autres caractéristiques de l objectif dépendent de l ouverture numérique : ce sont la distance de travail D et la profondeur de champ z. Un objectif de haute qualité sera caractérisé par une x 5

grande ouverture numérique (1,0<NA<1,45) ce qui a comme conséquence une distance de travail limitée (90 à 180 µm) et une profondeur de champ réduite (effet de sectionnement optique). α D iris α D iris α D z z z Figure 9. Ouverture numérique : elle est caractérisée par l angle α et détermine la distance de travail D et la profondeur de champ z. Un iris placé devant la lentille permet de faire varier l ouverture numérique sans changer le grandissement et d augmenter la profondeur de champ. D une manière générale, les objectifs de faible grossissement (5x à 20x) sont dotés d une faible NA (0,5 à 0,75), ils offrent une grande distance de travail et une grande profondeur de champ. Les objectifs de grandissement supérieur (40x à 100x) ont une NA supérieure à 0,75 et offrent une excellente résolution mais une faible profondeur de champ. Pour obtenir une ouverture numérique effective supérieure à 0,75 les objectifs doivent être à immersion (fig.10). Certains objectifs disposent d un iris qui permet de régler l ouverture numérique. Ceci permet d augmenter la profondeur de champ en réduisant l ouverture de l iris. Bien entendu, cela entraîne une dégradation de la finesse de l image. C B A n2 C B A n3 n1 n1 n2 n1 n3 = n1 Figure 10. Ouverture numérique et immersion. A gauche la différence entre les indices de réfraction n2 et n1 est grande, les rayons lumineux A,B et C se trouvent déviés vers l extérieur lors du passage du milieu de montage à l air. Les rayons les plus externes seront perdus. A droite : on utilise un liquide d immersion d indice n3 très proche de n1. Les rayons ne sont plus déviés et peuvent tous être collectés par la lentille. Relation profondeur de champ ouverture numérique : z = λ n 2 NA 4 1 1 n 2 3.5 Aberrations géométriques et chromatiques 6

La réalisation d un objectif de microscope est extrêmement complexe et doit prendre en compte toutes sortes de défauts. En particulier, une lentille est constituée d un dioptre à courbure variable qui va permettre la convergence des rayons lumineux par réfraction. Cependant, nous avons vu que l angle de réfraction varie en fonction de la longueur d onde. Autrement dit, pour un objet éclairé par de la lumière blanche, on obtient une mise au point différente suivant que les parties observées sont rouges, vertes ou bleues. Ce défaut s appelle l aberration chromatique. Dans les objectifs de microscope, on corrige ce défaut en adjoignant des lentilles correctrices en arrière de l objectif. rayon blanc sans correction Fo rayon bleu rayon rouge Fi axe optique avec correction Figure 11. Aberration chromatique. Moitié supérieure : lentille non corrigée, la lumière blanche est décomposée et les rayons rouges, verts et bleus sont focalisés en des points différents le long de l axe optique. Moitié inférieure : lentille corrigée, l adjonction d une lentille divergente compense la dispersion des rayons de longueur d onde différente. Tous sont maintenant focalisés au même point. 4. Les microscopies photoniques 4.1 Rôle du condenseur Le rôle du condenseur dans un microscope est essentiel. Il permet d éclairer de façon homogène le champ du microscope. Le dispositif le plus courant est le condenseur de Köhler constitué d une source lumineuse, suivie d un diaphragme de champ (limitant l illumination au champ microscopique visible) une lentille collectrice qui collecte la lumière de la source, un diaphragme d ouverture permettant d ajuster l ouverture numérique du condenseur en fonction de celle de l objectif utilisé; et enfin la lentille condenseur qui focalise l illumination sur le spécimen. Le réglage des différents paramètres du condenseur est capital pour l obtention d une image résolue et de bon contraste. Le centrage et la focalisation du condenseur doivent être ajustés chaque fois que l on change l objectif. De même l ouverture des deux diaphragmes devra être ajustée à la dimension du champ du microscope. 4.3 Microscopie par contraste de phase et contraste interférentiel 4.3.1 Contraste de phase Le microscope à contraste de phase est un dispositif permettant d observer des préparations qui n ont pas été colorées. Il est donc particulièrement bien adapté à l observation de cellules vivantes. Le principe repose sur la formation d un contraste d intensité créé par l interférence de rayons lumineux auquel on fait subir un déphasage différentiel. Pour cela, on place un anneau de phase dans le condenseur et une plaque de phase dans l objectif du microscope. L anneau de phase permet de créer une illumination de forme particulière qui sera totalement stoppée par l anneau opaque de la plaque de phase. Cet anneau opaque arrête la transmission directe de la lumière et évite l éblouissement de l observateur. Les rayons lumineux diffractés par les structures fines (membranes cellulaires, organites ) traversent la plaque de phase soit dans la zone périphérique, soit dans la zone centrale. La zone centrale est constituée d une lame biréfringente λ/4 dont le rôle est de retarder légèrement les rayons diffractés qui la traverse. Ces rayons retardés vont interférer 7

avec ceux transmis sans retard sur la périphérie. Le déphasage différentiel entre ces rayons, créé le contraste et permet de mettre en évidence les structures cellulaires. Condenseur objet Objectif Oculaire anneau de phase plaque de phase (dans plan focal arrière de l objectif) Figure 12. Microscope à contraste de phase. Le dispositif repose sur un anneau de phase placé dans le condenseur, et une plaque de phase située dans l objectif. La plaque de phase est une lame de verre avec un anneau opaque qui enserre une lame biréfringente quart d onde. 4.3.2 Contraste interférentiel différentiel (DIC) «Normarski» Le contraste interférentiel différentiel (DIC) aussi appelé contraste «Nomarski» est aussi utilisé pour l observation de préparations non colorées. Le principe repose sur la division d un rayon lumineux polarisé en deux rayons de même longueur d onde, mais polarisés orthogonalement et séparés spatialement d une distance très courte (une fraction de la longueur d onde). La séparation en deux rayons est réalisée par un Wollaston (assemblage particulier de deux cristaux biréfringents). Ces deux rayons (nommés respectivement ordinaire et extraordinaire) traversent les spécimens en deux points différents mais très proches. Suivant les milieux traversés par chacun des deux rayons, par exemple cytoplasme pour le rayon ordinaire et la membrane cytoplasmique pour l extraordinaire, ceux-ci subissent un déphasage différent. Après collection par l objectif les deux rayons sont recombinés par un second Wollaston et viennent interférer sur un filtre polariseur. Suivant la différence de phase entre les rayons, un contraste positif ou négatif sera créé révélant ainsi les structures cellulaires. Polariseur Condenseur Wollaston objet Objectif Wollaston Analyseur croisé Figure 13. Microscope à contraste Nomarski. Le condenseur contient un filtre polariseur suivi d un Wollaston qui sépare le rayon ordinaire (trait plein) du rayon extraordinaire (trait pointillé). 8

Après l objectif, les deux rayons sont superposés par un second Wollaston et un filtre polariseur croisé analyse la différence de phase entre les deux rayons. 4.4 Microscopie de fluorescence, épi fluorescence Objectif Filtre d arrêt ou filtre d émission Oculaire Filtre d excitation Miroir dichroïque Condenseur Lampe à vapeur de mercure Figure 14. Microscope de fluorescence par épi-illumination. La source lumineuse est déportée sur le côté et est constituée par une lampe offrant un spectre de longueur d onde étendu vers les UV. Un filtre d excitation permet de sélectionner une bande de longueur d onde adaptée au fluorochrome à visualiser. Un miroir dichroïque réfléchit la lumière d excitation vers l objectif qui joue ici le rôle de condenseur. La fluorescence émise est collectée par l objectif et va traverser le miroir dichroïque. Un filtre d arrêt permet de sélectionner la longueur d onde d émission du fluorochrome. 9