Stress oxydant et Vieillissement Module de Gérontologie Fondamentale Isabelle Petropoulos Equipe Biologie Cellulaire du Vieillissement UR4, Vieillissement, stress et Inflammation 18 janvier 2011
Le Vieillissement 77,5 ans pour les hommes 84,4 ans pour les femmes Augmente d un trimestre tous les ans 16,2 % des personnes en France ont plus de 65 ans Chiffres INSEE 2007 Les 3 âges de la femme, Klimt Vieillissement : Processus progressif et irréversible de modification des structures et des fonctions de l organisme et de sa capacité d adaptation aux conditions de l environnement. Altération voire perte des fonctions physiologiques Augmentation de la susceptibilité de l apparition des maladies Diminution de la résistance au stress
Théorie des radicaux libres Usure de l organisme suite d altérations subies au cours du temps à l accumulation Les changements associés au vieillissement sont dus à l accumulation des dommages produits pas les Espèces Réactives de l Oxygène (ERO). Production des ERO Défenses antioxydantes Systèmes de maintenance qui aident la cellule à répondre au stress oxydant
Effet de l hyperoxie (Baret et al., 1994) L hyperoxie entraîne une diminution de la durée de vie des drosophiles et accélère le processus de vieillissement Pas de modification du taux métabolique (respiration) mais des ERO Les altérations dues à l oxygène (oxydations) représentent une part importante dans le vieillissement normal
Origine et réponses cellulaires aux ERO Sources endogènes Mitochondries Péroxysomes Lipoxygénases NADPH oxydase Cytochrome P450 Sources exogènes Défenses antioxydantes Systèmes enzymatiques : CAT, SOD, GPx Systèmes non-enzymatiques : Glutathion vitamines (A, C et E) UV, Radiations ionisantes polluants Xénobiotiques oxydants inflammation (cytokines) ONOONO2 ERO H2O2 NO. Taux basal ROO. O.2 Homéostasie Croissance normale métabolisme normal OH. Taux élevé Altération des fonctions physiologiques vieillissement maladie mort cellulaire
Production mitochondriale des ERO
Systèmes de défenses cellulaires O2 - + O2 - + 2H+ H2O2 + H2O2 H2O2 + 2GSH ROOH + 2GSH SOD CAT GPx H2O2 + O2 2 H2 O + O 2 GSSG + 2 H2O GSSG + H2O + ROH
Les principales cibles des ERO L ADN - Mutations : la guanine peut réagir avec 1 radical hydroxyl - 8-OH-dG : 8 hydroxydesoxyguanine - Coupures simple brin et double brins - Délétions (ADN mitochondrial) Les lipides Oxydation des phospholipides des membranes. Formation de peroxydes lipidiques Aldéhydes - 4-hydroxynonenal (4-HNE) - malonaldéhyde (MDA) Les protéines
Principales modifications oxydatives de l ADN
L oxydation de l ADN peut provoquer des mutations 8-hydroxyguanine O HN N H2N N N N H O HN N OH H2N 8 OH -Gu a (en ol) NH N N H O 8 oxo-gu a (k et o) Basepai r s A T H N H2N O N HN O H NH N N 8 O H -G u a N H H N G C H H N Aden i n e 8 OHdG A
Oxydation des acides gras insaturés. OH
Stress oxydant et mitochondries Théorie mitochondriale du Vieillissement, notion de cercle vicieux Inhibition des complexes Mutations dans l ADNmt Dégradation des membranes ROS Changement d'état stationnaire ATP ADN mitochondrial plus sensible à l oxydation Mutations et délétions de l ADN mitochondrial associées au vieillissement
Surexpression de la catalase dans les mitochondries H2 O 2 Fe, Cu Ca tala s OH Muscle e H2O Fibroblastes Effets de la surexpression de la catalase humaine spécifiquement dans : les péroxysomes Le noyau Les mitochondries (Schriner et al., 2005)
Effets sur la longévité des souris catalase péroxysomale catalase nucléaire catalase mitochondriale de 20% de la durée de vie moyenne de 10% de la durée de vie maximale
Protection contre le stress oxydant Production d ERO Oxydation et lésions de l ADN
Qu est-ce que l oxydation des protéines? Modifications covalentes des protéines provoquées par des espèces réactives de l oxygène ou par des dérivés induits par le stress oxydant Oxydation Protéine active Protéine oxydée non fonctionnelle
Modification oxydatives des protéines Oxydation Tous les acides aminés Hydroxyls R-OH Carbonyls R-C-H, R-C-R, Protéine native O O Disulfide cys-s-s-cys Methionine sulfoxide MeSO Lysine Arginine Glycation Conjugaison avec des produits de péroxydation lipidique (e.g. HNE, MDA) Produits d Amadori Glycoxydation AGEs N N N R H Pentosidine N H R R Histidine Cystéine Lysine NH CH2 COO - Carboxymethylysine
Produits d oxydation des protéines Acide aminé Produits d oxydation Cysteine Disulfides, mixed disulfides (e.g., glutathiolation), acides cystéiques Methionine Methionine sulfoxide, methionine sulfone Tyrosine Dityrosine, nitrotyrosine, chlorotyrosines, DOPA Tryptophane Hydroxy- and nitro-tryptophans, kynurenines Phenylalanine Hydroxyphenylalanines Valine, Leucine Hydroperoxides Histidine 2-Oxohistidine, asparagine, aspartate Glutamyl acide oxalique, acide pyruvique Proline Hydroxyproline, pyrrolidone, glutamic semialdehyde Threonine Acide 2-Amino-3-cetobutyrique Arginine semialdehyde glutamique, chloramines Lysine semialdehyde, chloramines,
Maladies et situations dans lesquelles est impliquée l oxydation des protéines Athérosclérose (LDL) Arthrite rhumatoïde (IgG) Ischemie-reperfusion cardiaque et cérébrale Emphysème pulmonaire (inhibiteur de l a -1-proteinase, elastase) Maladies neurodegeneratives - Alzheimer - Parkinson Dystrophie musculaire Syndrome de détresse respiratoire Vieillissement Progeria/syndrome de Werner Alcoolisme Cataracte (a-crystallines) Cancer
Rôle de l oxydation des LDL dans l athérogenèse Les LDL oxydées représentent un facteur de risque majeur dans l athérogenèse et sont impliquées dans les événements précoces de formation de la plaque : - Attraction dans la paroi des cellules mononuclées (macrophages et lymphocytes T) - Formation de cellules spumeuses - Migration et prolifération des cellules musculaires lisses - Dysfonction endothéliale (apoptose et nécrose) - Potentialisation des effets toxiques des LDL oxydées par inhibition du protéasome
Exemple de l α1-antitrypsine Synthétisée dans les hépatocytes. Présente dans le parenchyme pulmonaire. Protection de la matrice alvéolaire contre l activité de l élastase (sérine protéase). L oxydation de cette enzyme est mise en cause dans l emphysème pulmonaire du fumeur (maladie pulmonaire caractérisée par une destruction des bronchioles)
Inactivation de l α1-antitrypsine par oxydation Cigarette (H202, phénol) cigarette Régulation de l activité élastase
ELIMINATION DES PROTEINES OXYDEES LE PROTEASOME Rôles dans le vieillissement et les maladies liées à l âge
Oxydation des protéines et systèmes de maintenance O2 ERO. O2 H2O2. OH Modifications irréversibles carbonylation Dégradation modifications réversibles Réparation Thiorédoxine/Thiorédoxine R. Sulfirédoxine Méthionine Sulfoxide Réductases Protéasome (Cytoplasme / Noyau)
Levine and Stadtman, 2001, Exp. Gerontol., 36:1495-1502 (fibroblastes humains, cristallin human, cerveau humain, foie de rat, mouche)
Oxydation des protéines et systèmes de maintenance O2 ERO. O2 H2O2. OH Modifications irréversibles carbonylation Dégradation modifications réversibles Réparation Thiorédoxine/Thiorédoxine R. Sulfirédoxine Méthionine Sulfoxide Réductases Accumulation des protéines oxydées Stress oxydant / Vieillissement Protéasome (Cytoplasme / Noyau)
Le protéasome : machinerie d élimination des protéines endommagées α β β α Protéasome 20S Chymotrypsine-similaire Hydrolase post-glutamique Trypsine-similaire
Les protéasomes Protéasome 26S Protéasome 20S Dégradation des protéines oxydées Dégradation des protéines marquées par les chaînes de polyubiquitines Rôles physiologiques importants dans: Le cycle cellulaire (dégradation des cyclines) la présentation de l antigène L inflammation (activation de NFkB) L apoptose (p53) La réparation de l ADN (PARP)
Protéasome et vieillissement de la peau Vieillissement intrinsèque chronologique et génétique Vieillissement extrinsèque Stress oxydant, photo-vieillissement Diminution du renouvellement cellulaire, sénescence Dégradation de la matrice extra-cellulaire Endommagement des macromolécules cellulaires Oxydation des protéines au cours du vieillissement de l épiderme Rôle du protéasome dans les processus de vieillissement
Modification oxydative des protéines Oxydation globale des protéines dans les kératinocytes ** * Mise en évidence des protéines carbonylées par Oxyblot O protéine DNP DNP Anticorps Anti-DNP kda 97.4 68 120 84 47.8 Anti-HNE âg és in te rm éd i ai re s DNPH je un es protéine oxydée DNP DNPprotein ** ** *
CT-like pmol AMC/min. per mg Altération du protéasome 100 80 80 60 60 40 40 20 20 PGPH pmol NA/min. per mg 100 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 âge du donneur (années) Diminution des activités CT et PGPH dans les kératinocytes âgés Modification de l expression Modification de la structure ph3 20 30.6 kda 21kDa α b β ph10 SDS-PAGE kda 33.2 e m so s s s a n n é rifié an a a t o 17 50 67 Pr pu IEF
Effet de l âge sur les activités du protéasome espèce tissu âge effet sur l activité 21-30 ans vs 65-85 ans Chymotrypsine clair vs cataracte Chymotrypsine Foie 3-8 mois vs 24-34 mois Chymotrypsine Trypsine PGPH Coeur Poumon Cerveau 3 mois vs 28 mois Chymotrypsine 4 mois vs 34 mois Chymotrypsine Trypsine PGPH Humain Lymphocytes T Cristallin Rat muscle
Effet de l âge sur l expression du protéasome Analyse de transcriptome espèce tissu Humain Fibroblastes souris Muscle squelettique âge Effet sur l expression 8 ans vs 92 ans α2, α7 (protéasome 20 S) sous-unités du 19S (protéasome 26S) 5 mois vs 30 mois β2, β7 (protéasome 20 S) sous-unités du 19S (protéasome 26S) restriction calorique
Inhibition du protéasome dans les cerveaux de patients Alzheimer Accumulation de protéines oxydées Dégénérescence cellulaire Mort neuronale
Inhibition du protéasome et sénescence + Mg132 ou Epoxomycin Inhibition du protéasome Induction de la sénescence
Inhibition du protéasome 26S Rpt2 CT-Like Activity (AFU) sections de cortex d animaux de 6 semaines Profils de cortex de 2, 3 et 6 semaines de souris contrôles et mutantes
Inhibition du protéasome 26S Neurodegeneration Lewy bodies in post-mortem brain (Bedford et al., 2008)
Stress oxydant et Vieillissement Module de Gérontologie Fondamentale Isabelle Petropoulos Equipe Biologie Cellulaire du Vieillissement UR4, Vieillissement, stress et Inflammation 18 janvier 2011 1
Le Vieillissement 77,5 ans pour les hommes 84,4 ans pour les femmes Augmente d un trimestre tous les ans 16,2 % des personnes en France ont plus de 65 ans Chiffres INSEE 2007 Les 3 âges de la femme, Klimt Vieillissement : Processus progressif et irréversible de modification des structures et des fonctions de l organisme et de sa capacité d adaptation aux conditions de l environnement. Altération voire perte des fonctions physiologiques Augmentation de la susceptibilité de l apparition des maladies Diminution de la résistance au stress 2
Théorie des radicaux libres Usure de l organisme suite d altérations subies au cours du temps à l accumulation Les changements associés au vieillissement sont dus à l accumulation des dommages produits pas les Espèces Réactives de l Oxygène (ERO). Production des ERO Défenses antioxydantes Systèmes de maintenance qui aident la cellule à répondre au stress oxydant 3
Effet de l hyperoxie (Baret et al., 1994) L hyperoxie entraîne une diminution de la durée de vie des drosophiles et accélère le processus de vieillissement Pas de modification du taux métabolique (respiration) mais des ERO Les altérations dues à l oxygène (oxydations) représentent une part importante dans le vieillissement normal 4
Origine et réponses cellulaires aux ERO Sources endogènes Mitochondries Péroxysomes Lipoxygénases NADPH oxydase Cytochrome P450 Sources exogènes Défenses antioxydantes Systèmes enzymatiques : CAT, SOD, GPx Systèmes non-enzymatiques : Glutathion vitamines (A, C et E) UV, Radiations ionisantes polluants Xénobiotiques oxydants inflammation (cytokines) ONOONO2 ERO H2 O 2 NO. Taux basal ROO. O.2 Homéostasie Croissance normale métabolisme normal OH. Taux élevé Altération des fonctions physiologiques vieillissement maladie mort cellulaire 5
Production mitochondriale des ERO 6
Systèmes de défenses cellulaires O2 - + O2 - + 2H+ H2O2 + H2O2 H2O2 + 2GSH ROOH + 2GSH SOD CAT GPx H2O2 + O2 2 H2O + O2 GSSG + 2 H2O GSSG + H2O + ROH 7
Les principales cibles des ERO L ADN - Mutations : la guanine peut réagir avec 1 radical hydroxyl - 8-OH-dG : 8 hydroxydesoxyguanine - Coupures simple brin et double brins - Délétions (ADN mitochondrial) Les lipides Oxydation des phospholipides des membranes. Formation de peroxydes lipidiques Aldéhydes - 4-hydroxynonenal (4-HNE) - malonaldéhyde (MDA) Les protéines Modifications oxydatives multiples (carbonyles) 8
Principales modifications oxydatives de l ADN 9
L oxydation de l ADN peut provoquer des mutations 8-hydroxyguanine O HN N H2N N N N H O HN N OH H2N 8 OH -Gu a (en ol) NH N N H O 8 oxo-gu a (k et o) Basepai r s A T H N H2N O N HN G C H 8 OHdG A NH N N 8 O H -G u a N H H N H H N Aden in e O 10
Oxydation des acides gras insaturés. OH 11
Stress oxydant et mitochondries Théorie mitochondriale du Vieillissement, notion de cercle vicieux Inhibition des complexes Mutations dans l ADNmt Dégradation des membranes ROS Changement d'état stationnaire ATP ADN mitochondrial plus sensible à l oxydation Mutations et délétions de l ADN mitochondrial associées au vieillissement 12
Surexpression de la catalase dans les mitochondries H2 O 2 Fe, Cu Ca tala se OH Muscle H2 O Fibroblastes Effets de la surexpression de la catalase humaine spécifiquement dans : les péroxysomes Le noyau Les mitochondries (Schriner et al., 2005) 13
Effets sur la longévité des souris catalase péroxysomale catalase nucléaire catalase mitochondriale de 20% de la durée de vie moyenne de 10% de la durée de vie maximale 14
Protection contre le stress oxydant Production d ERO Oxydation et lésions de l ADN 15
Qu est-ce que l oxydation des protéines? Modifications covalentes des protéines provoquées par des espèces réactives de l oxygène ou par des dérivés induits par le stress oxydant Oxydation Protéine active Protéine oxydée non fonctionnelle 16
Modification oxydatives des protéines Oxydation Tous les acides aminés Hydroxyls R-OH Carbonyls R-C-H, R-C-R, Protéine native O O Disulfide cys-s-s-cys Methionine sulfoxide MeSO Lysine Arginine Glycation Histidine Cystéine Lysine Conjugaison avec des produits de péroxydation lipidique (e.g. HNE, MDA) Produits d Amadori Glycoxydation AGEs N N N R H N H R R NH CH2 - COO Carboxymethylysine Pentosidine 17
Produits d oxydation des protéines Acide aminé Produits d oxydation Cysteine Disulfides, mixed disulfides (e.g., glutathiolation), acides cystéiques Methionine Methionine sulfoxide, methionine sulfone Tyrosine Dityrosine, nitrotyrosine, chlorotyrosines, DOPA Tryptophane Hydroxy- and nitro-tryptophans, kynurenines Phenylalanine Hydroxyphenylalanines Valine, Leucine Hydroperoxides Histidine 2-Oxohistidine, asparagine, aspartate Glutamyl acide oxalique, acide pyruvique Proline Hydroxyproline, pyrrolidone, glutamic semialdehyde Threonine Acide 2-Amino-3-cetobutyrique Arginine semialdehyde glutamique, chloramines Lysine semialdehyde, chloramines, 18
Maladies et situations dans lesquelles est impliquée l oxydation des protéines Athérosclérose (LDL) Arthrite rhumatoïde (IgG) Ischemie-reperfusion cardiaque et cérébrale Emphysème pulmonaire (inhibiteur de l a -1-proteinase, elastase) Maladies neurodegeneratives - Alzheimer - Parkinson Dystrophie musculaire Syndrome de détresse respiratoire Vieillissement Progeria/syndrome de Werner Alcoolisme Cataracte (a-crystallines) Cancer 19
Rôle de l oxydation des LDL dans l athérogenèse Les LDL oxydées représentent un facteur de risque majeur dans l athérogenèse et sont impliquées dans les événements précoces de formation de la plaque : - Attraction dans la paroi des cellules mononuclées (macrophages et lymphocytes T) - Formation de cellules spumeuses - Migration et prolifération des cellules musculaires lisses - Dysfonction endothéliale (apoptose et nécrose) - Potentialisation des effets toxiques des LDL oxydées par inhibition du protéasome 20
Exemple de l α1-antitrypsine Synthétisée dans les hépatocytes. Présente dans le parenchyme pulmonaire. Protection de la matrice alvéolaire contre l activité de l élastase (sérine protéase). L oxydation de cette enzyme est mise en cause dans l emphysème pulmonaire du fumeur (maladie pulmonaire caractérisée par une destruction des bronchioles) 21
Inactivation de l α1-antitrypsine par oxydation Cigarette (H202, phénol) cigarette Régulation de l activité élastase 22
ELIMINATION DES PROTEINES OXYDEES LE PROTEASOME Rôles dans le vieillissement et les maladies liées à l âge 23
Oxydation des protéines et systèmes de maintenance O2 ERO. O2 H2O2. OH Modifications irréversibles carbonylation Dégradation modifications réversibles Réparation Thiorédoxine/Thiorédoxine R. Sulfirédoxine Méthionine Sulfoxide Réductases Protéasome (Cytoplasme / Noyau) 24
Levine and Stadtman, 2001, Exp. Gerontol., 36:1495-1502 (fibroblastes humains, cristallin human, cerveau humain, foie de rat, mouche) 25
Oxydation des protéines et systèmes de maintenance O2 ERO. O2 H2O2. OH Modifications irréversibles carbonylation Dégradation modifications réversibles Réparation Thiorédoxine/Thiorédoxine R. Sulfirédoxine Accumulation des protéines oxydées Méthionine Sulfoxide Réductases Stress oxydant / Vieillissement Protéasome (Cytoplasme / Noyau) 26
Le protéasome : machinerie d élimination des protéines endommagées α β β α Chymotrypsine-similaire Hydrolase post-glutamique Trypsine-similaire Protéasome 20S 27
Les protéasomes Protéasome 26S Protéasome 20S Dégradation des protéines oxydées Dégradation des protéines marquées par les chaînes de polyubiquitines Rôles physiologiques importants dans: Le cycle cellulaire (dégradation des cyclines) la présentation de l antigène L inflammation (activation de NFkB) L apoptose (p53) La réparation de l ADN (PARP) 28
Protéasome et vieillissement de la peau Vieillissement intrinsèque chronologique et génétique Vieillissement extrinsèque Stress oxydant, photo-vieillissement Diminution du renouvellement cellulaire, sénescence Dégradation de la matrice extra-cellulaire Endommagement des macromolécules cellulaires Oxydation des protéines au cours du vieillissement de l épiderme Rôle du protéasome dans les processus de vieillissement 29
Modification oxydative des protéines Oxydation globale des protéines dans les kératinocytes ** * Mise en évidence des protéines carbonylées par Oxyblot O protéine DNP Anticorps Anti-DNP ** * DNPprotein âg és in te rm éd i ai re s DNPH je un es protéine oxydée DNP * * DNP kda 97.4 68 120 Anti-HNE 84 47.8 30
CT-like pmol AMC/min. per mg Altération du protéasome 100 80 80 60 60 40 40 20 20 PGPH pmol NA/min. per mg 100 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 âge du donneur (années) Diminution des activités CT et PGPH dans les kératinocytes âgés Modification de l expression Modification de la structure ph3 IEF ph10 e 20 17 50 s an 67 s an om as fié é ot ri Pr pu 30.6 kda 21kDa α b β SDS-PAGE kda 33.2 s an 31
Effet de l âge sur les activités du protéasome espèce tissu âge effet sur l activité 21-30 ans vs 65-85 ans Chymotrypsine Cristallin clair vs cataracte Chymotrypsine Foie 3-8 mois vs 24-34 mois Chymotrypsine Trypsine PGPH Coeur Poumon Cerveau 3 mois vs 28 mois Chymotrypsine muscle 4 mois vs 34 mois Chymotrypsine Trypsine PGPH Humain Lymphocytes T Rat 32
Effet de l âge sur l expression du protéasome Analyse de transcriptome espèce tissu Humain Fibroblastes souris Muscle squelettique âge Effet sur l expression 8 ans vs 92 ans α2, α7 (protéasome 20 S) sous-unités du 19S (protéasome 26S) 5 mois vs 30 mois β2, β7 (protéasome 20 S) sous-unités du 19S (protéasome 26S) restriction calorique 33
Inhibition du protéasome dans les cerveaux de patients Alzheimer Accumulation de protéines oxydées Dégénérescence cellulaire Mort neuronale 34
Inhibition du protéasome et sénescence + Mg132 ou Epoxomycin Inhibition du protéasome Induction de la sénescence 35
Inhibition du protéasome 26S Rpt2 CT-Like Activity (AFU) sections de cortex d animaux de 6 semaines Profils de cortex de 2, 3 et 6 semaines de souris contrôles et mutantes 36
Inhibition du protéasome 26S Neurodegeneration Lewy bodies in post-mortem brain (Bedford et al., 2008) 37