P. : 1/14 Table des matières 1 Objet et domaine d application...3 2 Définitions et abréviations...3 3 Principe de la méthode...4 4 Sécurité...4 5 Prélèvement des échantillons...4 6 Réception, circulation stockage et évacuation des échantillons...4 7 Partie expérimentale...4 7.1 Les produits chimiques, solvants et réactifs...4 7.2 Equipement et matériel de laboratoire...5 7.3 Conditions d environnement...5 7.4 Préparation des solutions...6 7.5 Préparations des solutions étalons...6 7.6 Extraction et purification des échantillons...7 7.6.1 Echantillons inconnus...7 7.6.2 Echantillon de contrôle (QC) à 1 ML...7 7.6.3 Echantillon «blanc réactif» ou BR...7 7.6.4 Echantillon «blanc matrice» ou BM...8 7.6.5 Echantillons pour les droites d étalonnage en mattrice...8 7.7 Conditions expérimentales...8 7.7.1 Conditions chromatographiques...8 7.7.2 Fonctionnement du spectromètre de masse (Quattro Micro2)...9 7.8 Programmes de mesures...11 8 Validation des résultats...11 8.1 Blanc matrice...11 8.2 Echantillon de contrôle (QC) à 1 ML...11 8.3 Standards en matrice ( à 2 ML)...11 8.4 Echantillons inconnus...12 9 Calculs...12 1 Validation des méthodes...12 11 Rapports d essai...12 12 Contrôles de qualité...12 13 Normes et références...13
P. : 2/14 Annexe: Chromatogramme QC à 1 x ML...14
P. : 3/14 1 Objet et domaine d application Il s agit d un développement d une méthode d analyse par LC-MS/MS destinée à identifier (screening) et/ou confirmer (identification et quantification) la présence des coccidiostatiques dans les aliments pour poulets. Ce développement est réalisé en vue de permettre la participation de l ISP à l étude interlaboratoires organisée par le Laboratoire Européen de Référence pour les Additifs Alimentaires (EURL-FA control) et ayant pour but d évaluer l aptitude des laboratoires participants à déterminer correctement les coccidiostatiques dans les aliments potentiellement contaminés. Les coccidiostatiques concernés par cette étude sont : monensin, decoquinate, robenidine, lasalocid A, narasin, salinomycin, maduramicin, diclazuril, nicarbazin et semduramicin. Nigericin et nicarbazin-d 8 sont utilisées comme standards internes. Cette méthode quantitative devrait permettre, après validation, la détermination de la teneur en coccidiostatiques dans une gamme de concentration allant jusqu à deux fois les limites autorisées ( 2 ML). Ces limites sont reprises dans le tableau suivant : Additif(s) alimentaire(s) Substance(s) active(s) Limite maximum de contamination (mg/kg) Coxidin Monensin 1,25 Elancoban G,, G2, /Elancogram Deccox Decoquinate,4 Cycostat 66G Robenidine,7 Avatec 15G Lasalocid A 1,25 Monteban, Monteban G Narasin,7 Sacox 12G, 12µG,7 Salinomax 12G Kokcisan 12G Salinomycin Cygro 1, Cygro 1G Maduramicin,5 Glinacox,5 Premix Diclazuril,1 Glinacox,5 Premix Maxiban G16 Narasin Nicarbazin,7 1,25 Nicarbazin 25 g/kg Nicarbazin 1,25 Aviax 5 Semduramycin,25 2 Définitions et abréviations Liste des abréviations: SOP = Standard Operating Procedure HPLC = high performance liquid chromatography ACN = acetonitrile MethOH = methanol ML = Maximum Limit LC-MS/MS = chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem ppb = μg/kg ou ng/g IS (IS) = Internal Standard IR = Ion ratio rpm = tours par minute RT = Retention Time RRT = Relative Retention Time TIC = Total Ion Current ESI = ionisation par mode électrospray ISP = Institut de Santé Publique AFSCA : Agence Fédérale pour la Sécurité de la chaîne Alimentaire.
P. : 4/14 3 Principe de la méthode Les coccidiostatiques sont extraits de la matrice à l aide d un mélange d acetonitrile/méthanol, 9/1 (v/v). Après homogénéisation et centrifugation, le surnageant contenant des coccidiostatiques est récupéré par filtration. Le filtrat est ensuite déposé sur une cartouche SPE Si et récupéré dans un tube en verre avant d être évaporé à sec 4 C. Cette récupération directe du filtrat est basé sur le principe que les coccidiostatiques sont hydrophobes et ne sont pas retenus par la cartouche Si. Après la reprise des résidus dans l acetonitrile acidifié, l extrait est dégraissé à l aide d hexane saturé en acetonitrile. Lors de la séparation de phases obtenue successivement par agitation, centrifugation et décantation les coccidiostatiques (rendus ionisés en milieu acide) restent dans la phase «acetonitrile». Cette phase est finalement prélevée, filtrée avant d être transférée dans une fiole en vue de son analyse par LC-MS/MS. La séparation chromatographique se fait sur une colonne Symmetry C8 en utilisant un mode d élution par gradient, la phase mobile étant constituée d acetonitrile (solvant A) et de formiate d ammonium acidifié par.1 d acide formique. Les coccidiostatiques sont détectés en combinant l ionisation par électro-spray négatif/positif à l acquisition des données en mode MRM (Multiple Reaction Monitoring). Sur base des critères définis par la Décision «22/657/EC», l identification des coccidiostatiques présents dans un échantillon suspect s effectue en comparant le chromatogramme de l échantillon en question avec celui d un échantillon de contrôle, les critères de comparaison étant les temps de rétention relatifs et les rapports ioniques. En cas de détection, la teneur en coccidiostatiques(s) peut être déterminée en utilisant une droite de calibration en matrice. Cependant, cette méthode devra encore être validée selon les critères de performance décrire dans la Décision 22/657/EC sans quoi, les résultats quantitatifs ne permettent pas de statuer sur la (NON) CONFORMITE de l échantillon. 4 Sécurité Il est recommandé de porter des gants lors de la préparation des solutions standards ainsi que lors de la manipulation des échantillons durant l extraction. Toutes les précautions doivent être prises lors de la manipulation des échantillons et des solutions étalons afin d éviter toute contamination. L extraction doit être effectuée sous une hotte bien ventilée. L élimination des solvants organiques et des solutions se fera dans les bidons prévus à cet effet. En ce qui concerne les déchets organiques, ils seront stockés dans les poubelles jaunes appropriées en attendant d être éliminés 5 Prélèvement des échantillons Les échantillons sont prélevés par le demandeur de l analyse et placés dans des récipients/sacs étanches. 6 Réception, circulation, stockage et évacuation des échantillons. Les échantillons sont réceptionnés à l accueil de l ISP et par le service de dispatching selon la procédure SOP I/3/12/F et DOC 4/DIS/3/NF. Ils sont ensuite gérés et préparés au sein du Service Résidus Toxiques et Pharmacologiques selon la procédure 22/31/F. Les échantillons sont stockés réfrigérés. La date de réception, le suivi et le résultat des analyses, ainsi que tout transfert des échantillons sont enregistrés dans le système STARLIMS (SOP 2/26/F et SOP 2/27/F).. 7 Partie expérimentale 7.1 Les produits chimiques, solvants et réactifs Eau (qualité Milli-Q) Acétonitrile (HPLC grade) = ACN Méthanol (HPLC grade)
P. : 5/14 Hexane (HPLC grade) acide formique (98- VWR) Monensine (Sigma-Aldrich) Decoquinate (Chemos) Robenidine (Dayang chemicals) Lasalocide A (Sigma-Aldrich) Narasin (Sigma-Aldrich) Salinomycin (Sigma-Aldrich) Maduramicin (Chemos) Diclazuril (Chemos) Nicarbazin (Lilly.Res. Lab.) Semduramicin (Exygen) Nicabazine-d8 (Witega) Nigéricine (Sigma-Aldrich) Remarque : des standards, réactifs et solvants de qualité équivalente peuvent être utilisés 7.2 Equipement et matériel de laboratoire Verrerie classique de laboratoire Micropipette à volume variable (Socorex) 5-2 μl Micropipette à volume variable (Socorex) 2- μl Dispensettes 1 ml, 5 ml Tubes Falcon coniques de 5 ml (VWR) Tube en verre 1 ml (Duran) Balance de précision pour les solutions de standard (Sartorius A 2 S) Balance pour les échantillons et réactifs (Sartorius) Vortex (EuroScientific) Filtres papiers sans cendre 11 mm (Euroscientific) Filtres PVDF.45 μm, 13 mm (Euroscientific) Seringue Terumo 2 ml pour filtres (VWR) Centrifugeuse ALC 4236 (Analis) Centrifugeuse Jouan BR4 (VWR) Agitateur orbital Reax (Heidolph instruments, VWR) Reacti-therm heating module (Pierce) Flacon 2 ml en verre brun (ouverture 9 mm, short-thread) + bouchons avec septum pré percé (Waters quality, Gracevydac) Inserts en verre.1 ml Inserts en verre de.1ml (Gracevydac) Chromatographe Liquide à Haute Performance «Alliance 2695» (Waters) Spectromètre de masse en tandem triple quadripôle «Quattro Micro» (Waters) Logiciel de pilotage MassLynx 4.1 Cartouches SPE Si Colonne Symmetry C8, 2.1 x 5 mm, 3.5 μm (Waters) Précolonne Symmetry C8 x 2.1 mm, 1cm 7.3 Conditions d environnement La préparation des échantillons se fait dans les conditions ambiantes de température et de pression. L analyse LC-MS/MS doit se dérouler dans les conditions de température recommandées pour le bon fonctionnement de l instrument de mesure et décrites dans le «log book» de ce dernier.
P. : 6/14 7.4 Préparation des solutions Acetonitrile : utilisé pour l extraction et comme phase mobile A Phase mobile B : formiate d ammonium 5 mm acidifié Dissoudre.16g de formiate d ammonium dans 5 ml d eau Milli-Q; y ajouter 5 µl d acide formique 99; bien mélanger. La solvant est stable pendant au moins 1 semaine et se conserve à température ambiante Solvant d extraction ACN/MethOH :9/1 (v/v) Dans un verre à pied de ml mélanger 9 ml d acetonitrile avec ml de méthanol. Verser le mélange dans une bouteille en verre et bien fermer et mélanger. Le solvant est utilisé jusqu à l épuisement et se conserve à température ambiante. Hexane saturé en acetonitrile Dans un Erlen/tube de 5 ml, ajouter le volume nécessaire d hexane ; y verser un volume croissant d acetonitrile tout en mélangeant. L hexane est saturé quand une phase d acetonitrile se dépose au fond.de l Erlen/tube. La phase d hexane (supérieure) est immédiatement utilisée pour le dégraissage. ( 7.6.1) ACN +,1 acide formique Mélanger ml d acetonitrile avec 1 ml d acide formique 99. Le solvant s utilise jusqu à l épuisement et se conserve à température ambiante. 7.5 Préparations des solutions étalons Solutions stocks individuelles de coccidiostatiques à +/- 1mg/ml dans ACN Peser séparément environ 1 mg de chaque coccidiostatiques dans un matras de 1 ml et mettre au trait avec ACN. Calculer et noter la concentration exacte en tenant compte de la pureté du produit, selon la formule : Conc.exacte (mg/ml) = [(masse pesée (mg) x pureté ()/) / volume (ml)] Solutions intermédiaires individuelles à 75 µg/ml dans ACN (sauf maduramicin et diclazuril) Diluer séparément chaque solution stock individuelle afin d obtenir une solution dont la concentration finale est de 75 µg/ml Solutions intermédiaires individuelles à 7,5 µg/ml dans ACN pour maduramicin et diclazuril Diluer séparément les solutions stock individuelles de maduramicin et de diclazuril afin d obtenir une solution dont la concentration finale est de 7,5 µg/ml Solution Mix1 coccidio de travail à 1xML dans ACN Dans un matras de 5 ml, ajouter un volume de chacune des solutions intermédiaires individuelles (75 µg/ml et 7,5 µg/ml). Mélanger et mettre au trait avec ACN. Solutions stocks de standards internes individuels (nigéricine et nicarbazine-d 8 ) à +/-1 mg/ml dans ACN Peser séparément environ 1 mg de chaque substance dans un matras de 1 ml et mettre au trait avec ACN. Calculer et noter la concentration exacte en tenant compte de la pureté du produit. Solutions intermédiaires de standards internes individuels (nigericin et nicarbazin-d 8 ) à 75 µg/ml dans ACN Diluer séparément chaque solution stock individuelle afin d obtenir une solution dont la concentration finale est de 75 µg/ml
P. : 7/14 Solution Mix de standards internes de travail à 7,5 µg/ml dans ACN Dans un matras de 1 ml, diluer es 2 solutions intermédiaires de standards interne afin d obtenir une concentration finale en chaque substance de 7,5 µg/ml. SOL test à 1xML dans ACN Dans un matras de 1 ml, ajouter respectivement 1 ml de la solution Mix1 coccidio (1xML) et 1 ml de la solution Mix de standards internes (7,5 µg/ml). Bien mélanger et mettre au trait avec ACN 7.6 Extraction et purification des échantillons 7.6.1 Echantillons inconnus Peser 3g d échantillon, dans un tube Falcon de 5 ml Ajouter 3 µl de la solution Mix des 2 standards intenes à 7,5 µg/ml Vortexer 1 min Laisser s imprégner 1 min Ajouter 8 ml de solvant d extraction ACN/MethOH : 9/1 Vortexer 3 s Homogénéiser par agitation rotative pendant 1 min Centrifuger 1 min à 4rpm, 5 C Filtrer le surnageant à l aide d un papier filtre dans un nouveau tube Falcon de 5 ml Conditionner les cartouches SPE Si en faisant passer 6 ml ACN suivi d un séchage sous vide maximal pendant 3 min Placer les tubes en verre pour récolter directement le filtrat Charger progressivement la totalité du surnageant Laisser s écouler par capillarité A la fin de l écoulement, augmenter progressivement la pression pour assécher la cartouche Rincer la cartouche avec 1 ml ACN Evaporer sous flux d azote à 4 C Ajouter 6 µl ACN +,1 acide formique Vortexer 3 s Ajouter 2 ml d hexane saturé en ACN Vortexer 3 s Centrifuger 5 min à 2 rpm Laisser équilibrer 5 min Pipeter 4 µl de la phase inférieure (acetonitrile) Filtrer (PVDF.45 μm, 13 mm) Mettre 2 µl dans un insert Injecter 4 µl 7.6.2 Echantillon de contrôle (QC) à 1 ML Peser 3g d échantillon, dans un tube Falcon de 5 ml Ajouter 3 µl de la solution Mix 1 coccidio Ajouter 3 µl de la solution Mix des 2 standards internes à 7,5 µg/ml Suivre la suite de la procédure d extraction comme décrite au.7.6.1 7.6.3 Echantillon «blanc réactif» ou BR Remplace les 3 g d échantillon par 3 g d ACN Ajouter 3 µl de la solution Mix des 2 standards internes à 7,5 µg/ml Suivre la suite de la procédure d extraction comme décrite au.7.6.1
P. : 8/14 7.6.4 Echantillon «blanc matrice» ou BM Peser 3g d échantillon négatif (matériel de référence), dans un tube Falcon de 5 ml Ajouter 3 µl de la solution Mix des 2 standards internes à 7,5 µg/ml Suivre la suite de la procédure d extraction comme décrite au.7.6.1 7.6.5 Echantillons pour les droites d étalonnage en matrice La droite en matrice se prépare à partir des solutions de travail Mix1 coccidio (1 x ML) et Mix de 2 standards internes à 7,5 µg/ml. Les concentrations finales à atteindre sont l équivalent de : x ML, ½ x ML, 1 x Ml, 1,5 x Ml et 2 x ML. Préparer 5 tubes Falcon contenant 3 g d échantillon négatif (matériel de référence). Dans chaque tube, ajouter 3 µl de la solution Mix de 2 standards interne 7,5 µg/ml ainsi qu un volume de la solution Mix1 coccidio (1 x ML) choisi en fonction de la concentration finale à atteindre. Faire suivre la procédure d extraction comme décrite au.7.6.1. Le volume de la solution Mix1 coccidio à pipeter est repris dans le tableau suivant : Tube Description Solution de travail Volume à pipeter (µl) 1 CAL x ML Mix 1 coccidio 2 CAL ½ x ML Mix 1 coccidio 15 3 CAL 1 x ML Mix 1 coccidio 3 4 CAL 1,5 x ML Mix 1 coccidio 45 5 CAL 2 x ML Mix 1 coccidio 6 7.7 Conditions expérimentales 7.7.1 Conditions chromatographiques Il convient de respecter la disposition des solvants sur le chromatographe «Alliance 2695». Avant toute utilisation, les lignes de solvants doivent être amorcées et l injecteur purgé. La méthode chromatographique intitulée «coccifeed» est principalement caractérisée par les éléments suivants Solvants o Solvant A : acetonitrile (ligne A) o Solvant B : Formiate d ammonium 5mM +,1 acide formique (ligne B) Conditions de pompage o Degasser : continious o Stroke volume : 13 µl o Ramp flow : 2 o Flow (ml/min) :,35 o Stop time (min) : 15 o Column temperature ( C) : 3 o Column temperature limit ( C) : 5 o Minimum pressure (bar) : o Maximum pressure (bar) : 3 o Pre-column volume (µl) : o Column position : column 1 Gradient time table containing 6 entries Time (mis) A() B() Flow (ml/min) Curve 2 98,35 1 2 2 98,35 6 3 98 2,35 6 9 98 2,35 6 1 2 98,35 6 15 2 98,35 6
P. : 9/14 Les chiffres dans la colonne «curve» indiquent la manière dont le pompage doit être effectué : (1) nécessite que la composition des solvants soit immédiatement atteinte au temps programmé ; (6) indique une évolution progressive de l état initial vers l état final dans l intervalle de temps fixé. Avant l utilisation pour analyse, il y a lieu de vérifier le bon fonctionnement de l instrument et de la méthode en injectant une solution standard contenant les analytes recherchés. Les paramètres à contrôler sont notamment la pression et les temps de rétention des analytes. Une pression trop faible peut signifier la présence d une fuite alors qu une pression trop élevée signifierait une obstruction soit au niveau du circuit de pompage (tête de pompe, ligne de solvant, ) soit au niveau de la colonne. Toute irrégularité au niveau de l écoulement des fluides peut affecter l élution des analytes et fausser leur identification. 7.7.2 Fonctionnement du spectromètre de masse (Quattro Micro2) Avant tout utilisation, il y a lieu de contrôler différents élément : alimentation en gaz dont l azote et argon ; le niveau d huile dans la pompe : «ballaster» ou en ajouter si nécessaire ; la température du local ; la connexion automatique avec le chromatographe «Alliance» par le logiciel Masslynx Les paramètres de fonctionnement propre au spectromètre de masse (Tune Parameters) utilisé sont répertoriés dans le fichier «coccifeed.ipr» dont les principaux éléments sont les suivants : Source (ESI + /ESI -) o Calibration statique 2 o Capillary (kv) : 3,6 o Cone (V) : 21, variable en cours d analyse et en fonction de l analyte recherché o Extractor (V) : 3 o RF Lens (V) :,5 o Source Temperature ( C) :12 o Desolvation Temperature ( C) : 4 o Cone Gas Flow (L/H) :65 o Desolvation Gaz Flow (L/H): 65 o LM 1 Resolution: 14, o HM 1 Resolution: 14, o Ion Energy 1:,5 o Entrance: -1 o Collision: 2 o Exit: 1 o LM 2 Resolution: 14,5 o HM 2 Resolution: 14,5 o Ion Energy 2: 2, o Multiplier (V): 65 o Syringe Pump Flow (µl/min):3. o Gas Cell Pirani Pressure(mbar): 2,93x1-3 (1x1-4 quand a vanne d argon est fermée) L acquisition des données se fait en mode MRM (Multiple Reaction Monitoring) dont les principales caractéristiques sont reprises dans le fichier «coccifee.exp». Function 1 o Scans in function: 18 o Cycle time (secs):,99 o Inter Scan Delay (secs):,1 o Inter Channel Delay (s): Automatic o Span (Da):,5 o Start and End Time(min):, to 12 o Ionization mode: ES+ o Data type: MRM data o Function type: MRM of 4 channels
P. : 1/14 Channel Reaction Dwell (s) Cone (V) Col. Energy (ev) 1 336 > 138,8 3 2 2 336 > 14,8 3 25 3 418,3 > 24,1,8 3 38 4 418,3 > 372,3,8 3 2 Compound Robenidin Decoquinate Function 2 o Scans in function: 179 o Cycle time (secs):,81 o Inter Scan Delay (secs):,1 o Inter Channel Delay (s): Automatic o Span (Da):,5 o Start and End Time(min):, to 12 o Ionization mode: ESo Data type: MRM data o Function type: MRM of 5 channels Channel Reaction Dwell Cone Col. Energy Compound (s) (V) (ev) 1 31 > 17,3,8 28 4 Nicarbazin 2 31 > 137,2,8 28 12 3 39,2 > 14,9,8 32 12 Nicarbazin-d 8 4 44,8 > 334,8 25 17 Diclazuril 5 46,8 > 336,8 25 17 Function 3 o Scans in function: 179 o Cycle time (secs): 1,99 o Inter Scan Delay (secs):,1 o Inter Channel Delay (s): Automatic o Span (Da):,5 o Start and End Time(min):, to 12 o Ionization mode: ES+ o Data type: MRM data o Function type: MRM of 9 channels Channel Reaction Dwell Cone Col. Energy Compound (s) (V) (ev) 1 613,3 > 377,5,6 55 35 Lasalocid A 2 613,3 > 577,5,6 55 35 3 693,4 > 461,5,6 5 5 Monensin 4 693,4 > 675,5,6 5 38 5 742,4 > 657,6,6 3 3 Nigericin 6 773,3 > 431,4,6 55 5 Salinomycin 7 773,3 > 531,3,6 55 55 8 787,5 > 431,5,6 55 53 Narasin 9 787,5 > 531,5,6 55 45 1 895,3 > 833,5,6 22 28 Semduramicin 11 895,3 > 851,3,6 22 28 12 934,8 > 629,2,6 21 16 Maduramycin 13 934,8 > 647,5,6 21 16 Lors de l acquisition des données, chaque ion précurseur est suivi en enregistrant les réponses de ses 2 ions filles d intérêt. Ce qui permet, d une part, de calculer le rapport ionique nécessaire pour l identification de l ion précurseur (et par conséquent de l analyte recherché) et, d autre part, à quantifier en utilisant les
P. : 11/14 réponses de l ion fille la plus intense. 7.8 Programmes de mesures La méthode est développée pour l analyse quantitative des coccidiostatiques dans les aliments de poulets. Cette quantification fait appel à l utilisation des droites de calibration en matrice. La succession des échantillons dans une série d analyse testée lors de la phase de développement est la suivante : E1 Solvant E2 Solution test à 1 ML E3 Solvant = E1 E4 Standard en matrice à ML E5 Standard en matrice à ½ ML E6 Standard en matrice à 1 ML E7 Standard en matrice à 1,5 ML E8 Standard en matrice à 2 ML E9 Solvant = E1 E1 Blanc matrice E11 QC (aliment fortifié à 1 ML) E12 QC (aliment fortifié à 1 ML) E13 Solvant E14 Echantillon inconnu 1/a E15 Solvant = E1 E16 Echantillon inconnu 1/b E17 Solvant = E1 E18 Echantillon inconnu 2/a E19 Solvant = E1 E2 Echantillon inconnu 2/b E21 Exx Succession Solvant/Echantillon/Solvant Exx+1 Solution test à 1 ML Exx+2 Solvant La succession «Solvant/Echantillon/Solvant» sert à éviter le «carry-over» pouvant entraîner la contamination des échantillons inconnus différents. Les coccidiostatiques sont en effet hydrophobes et ont tendance à se coller sur le circuit d injection et sur la colonne. 8 Validation des résultats 8.1 Blanc matrice Le blanc matrice sert à vérifier que le matériel de référence ne contient pas de coccidiostatiques. Le chromatogramme du blanc matrice ne devrait pas présenter, au temps de rétention d un coccidiostatiques, un pic avec un rapport signal/bruit supérieur à 3. 8.2 Echantillon de contrôle (QC) à 1 ML Le QC correspond à un échantillon blanc fortifié au niveau de concentration maximale autorisée. Il sert à vérifier la présence des ions diagnostiques (2 ions filles) et d en évaluer leurs intensités et temps de rétention respectifs. 8.3 Standards en matrice ( à 2 ML) Ils servent à établir des droites d étalonnage pour la quantification. En règle générale et pour une méthode validée, ces droites doivent avoir un coefficient de corrélation supérieur ou égal à,99.
P. : 12/14 8.4 Echantillons inconnus La présence d un coccidiostatique dans un échantillon inconnu est évaluée en comparant le temps de rétention relatif (RRT) du pic observé sur le chromatogramme de l échantillon suspect avec le temps de rétention relatif du coccidiostatique sur le QC. La concordance des temps de rétention seule ne suffit pas. Elle doit être conjuguée avec la concordance des rapports ioniques ou «Ion ratios» (aire de pic l ion moins intense/aire de pic de l ion plus intense). Lors de ces comparaisons, les critères à vérifier imposés par la Décision 22/657/EC sont les suivants : une tolérance maximale de 2,5 sur le RRT une déviation de l IR comprise dans un intervalle fixé et variable selon la réponse des ions diagnostiques mesurée sur le chromatogramme du QC le rapport signal/bruit de l ion moins intense doit être supérieur ou égale à 3 9 Calculs La réponse d un coccidiostatique dans les standards en matrice est portée en graphique en fonction des concentrations pour obtenir une droite d étalonnage. La réponse est le rapport de l aire du pic du coccidiostatique (ion fille la plus intense) sur l aire du pic du standard interne. Le logiciel TargetLynx (module du MassLynx) calcule automatiquement la teneur par extrapolation de la droite d étalonnage. La concentration finale du coccidiostatique dans l échantillon inconnu est obtenue en corrigeant la concentration automatiquement calculée par le rendement du même coccidiostatique dans le QC. 1 Validation des méthodes La méthode doit encore être validée avant d être utilisée pour l analyse des échantillons officiels comme les prélèvements entrant dans le cadre du plan de contrôle AFSCA. 11 Rapports d essai En principe, le résultat est directement inscrit dans le STARLIMS par l analyste, dans le module dédicacé à cette opération. Le responsable d analyse (ou le chef de projet) vérifie et approuve le résultat avant de l envoyer pour approbation par le Chef de Service ou son suppléant. Il arrive parfois que le responsable d analyse ou le chef de projet effectue toutes les opérations de rapportage. (en tant que remplaçant du chef de service) 12 Contrôles de qualité La première ligne de contrôle de qualité d une analyse se fait en vérifiant plusieurs éléments : L absence de contamination par l examen des chromatogrammes du solvant (contamination des réactifs et/ou du matériel) et du chromatogramme du blanc matrice (contamination du matériel de référence) Le respect des critères par rapport au QC (RRT, IR, rendement). La teneur dans le QC est reprise dans une carte de contrôle pour un suivi dans le temps. Une deuxième ligne de contrôle de qualité pour la méthode est ordonnée, une fois par an, par le responsable d analyse ou le chef de projet. Ce dernier fortifie un échantillon blanc avec une ou plusieurs substance(s) et le fait analyser à l aveugle par l analyste. La teneur trouvée par l analyste doit se trouver dans l intervalle de +/- 2 de la teneur ajoutée. Une troisième ligne de contrôle consiste à participer à des tests de performances (Proficiency Tests) ou des essais interlaboratoires, quand c est possible.
P. : 13/14 13 Normes et références Call for participation in the inter-comparison study for the determination of authorized coccidiostats in feed at cross-contamination levels, Ref ARES/212/279351 of 8/3/21, Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM). Regulation (EC) N 1831/23 on additives for use in animal nutrition Regulation (EU) N 574/211 amending Annex I to Directive 22/32/EC regarding maximum limits for the unavoidable carry-over of coccidiostats of histomonostats. Decision 22/657/EC implementing Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results Internal SOPs
P. : 14/14 Annexe 1: Chromatogramme QC à 1 x ML 6.24 1: MRM of 6 Channels ES+ 418.3 > 372.3 1.74e5 5.85 2: MRM of 5 Channels ES- 46.8 > 336 4.4e3.62 1: MRM of 6 Channels ES+ 6.24 418.3 > 24.1 9.17e4 1: MRM of 6 Channels ES+ 5.3 336 > 14 2.77e4 1: MRM of 6 Channels ES+ 5.3 336 > 138 1.9e4 1.3 2.64 7.52 9.46 1.54 2: MRM of 5 Channels ES- 5.85 44.8 > 334 3.72e3.3 1.171.84 6.52 1.67 11.54 2: MRM of 5 Channels ES- 5.72 39.2 > 14.9 1.5e5 2: MRM of 5 Channels ES- 5.79 31 > 137.2 6.36e5 2: MRM of 5 Channels ES- 5.79 31 > 17.3 4.47e4.62 6.1 8.4 Time Time 212618-11 7.9 693.4 > 675.5 2.58e5 6.96 1.74 6.69 7.16.74 2.27 3.35 4.15 4.28 773.3 > 531.3 2.45e3 8.76 9.5 1.64 11.44 6.96 773.3 > 431.4 3.61e4 6.62 7.76 742.4 > 657.6 2.3e5 7.9 693.4 > 461.5 2.3e5 6.82 613.3 > 577.5 1.12e5 6.82 613.3 > 377.5 1.33e6 Time 7.36 934.8 > 647.5 1.85e4 6.89 7.36 934.8 > 629.2 9.2e3 6.96 9.23 11.4 6.62 895.3 > 851.3 1.5e5 6.62 895.3 > 833.5 4.6e6 7.29 787.5 > 531.5 1.15e4 6.89 7.69 7.29 787.5 > 431.5 2.41e4 Time