Utilisation des enzymes de détoxication cellulaire comme marqueurs de la qualité physiologique des semences oléagineuses Marie-Hélène WAGNER, Christophe BAILLY, Françoise CORBINEAU, Sylvie DUCOURNAU, Joël LÉCHAPPÉ Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 1
Plan de la présentation Plan de la présentation Objectifs du projet Contextes économique et biologique Rôle des enzymes de détoxication cellulaire Lien avec la tolérance à la germination au froid chez le tournesol Lien avec l aptitude à la conservation chez le colza Conclusion - Perspectives Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 2
Objectifs du projet Objectifs Développer des tests rapides et complémentaires aux tests actuels d appréciation de la qualité germinative des semences de colza et de tournesol Identifier le rôle des enzymes de détoxication cellulaire Dans l aptitude à la conservation (colza) Dans la tolérance au froid (tournesol) Travaux antérieurs sur Tournesol: Bailly et al., Physiologia Plantarum1998, Seed Science Research 2002, in The Biology of Seeds 2003 Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 3
Contexte économique Importance économique des 2 cultures oléagineuses En Europe Contexte économique En France Sources : Eurostat et Commission UE - COCERAL Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 4
Cycle du colza d hiver G r o u p e d É t u d e e t d e c o n t r ô l e Contexte biologique Contexte biologique Lots de report Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 Source: CETIOM 5
Contexte biologique Tendance aux semis plus précoces Contexte biologique Risques de températures faibles au semis Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 6
Rôle des enzymes de détoxication cellulaire Rôle des enzymes Les altérations dues aux FAO Free Radicals/Reactive Intermediates Lipids Proteins DNA Oxidation of Thiol oxidation vitamin E Carbonyl formation Lipid peroxidation Damage to Ca 2+ and other ion transport systems Membrane damage Disruption of normal ion gradients Activation/deactivation of various enzyme systems Adapted from: Kehrer JP, 1993 Adapté de Kehrer JP, Lipids 1993 DNA damage Altered gene expression Depletion of ATP and NAD(P)H Cell Injury H 2 O 2 O.- 2 Superoxyde. OH Hydroxyl RO. 2 Peroxyl RO. Alkoxyl HO. 2 Hydroperoxyl Peroxyde d hydrogène HOCl - Acide hypochlorique O 3 Ozone 1 O 2 Oxygène singulet ONOO - Peroxynitrite Giorgio et al., 2007. Nature Reviews Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 7
Le système de détoxication cellulaire G r o u p e d É t u d e e t d e c o n t r ô l e H 2 O Rôle des enzymes de détoxication cellulaire CAT SOD O 2 -. H 2 O 2 ASA APX MDHAR OH + O 2 + OH - Fenton reaction MDHA H 2 O Rôle des enzymes SOD: superoxide dismutase CAT: catalase APX: ascorbate peroxidase MDHAR: monodehydroascorbate reductase DHAR: dehydroascorbate reductase GR: glutathione reductase ASA: ascorbate MDHA: monodehydroascorbate DHA: dehydroascorbate GSSG: oxidized glutathione GSH: reduced glutathione NADP NADPH GSSG NADPH DHAR GR DHA GSH NADP electron transport Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 8
Lien avec la tolérance à la germination au froid chez le tournesol Germination au froid - Tournesol Matériel végétal 2 variétés présentant des sensibilités au froid différentes 12 lots au total Caractérisation physiologique Cinétique de germination à 5 C Test au froid: sable 14% H 2 0, 7 jours à 5 C puis 7 jours à 20-30 C Faculté germinative: terreau, 7 jours à 20-30 C Dosages biochimiques Enzymes détoxifiantes(sod, CAT et GR) Peroxyde d hydrogène MDA (malondialdhédyde, produit de dégradation lipidique) Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 9
Tolérance au froid Germination au froid - Tournesol Cinétique à 5 C Germ ination (% ) 100 80 60 40 20 0 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 360 384 408 432 456 480 504 Durée à 5 C (heures) T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 M1 M2 M3 M4 M5 Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 10
Tolérance au froid Germination au froid - Tournesol Test au froid Taux de plantules normales (%) 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 M1 M2 M3 M4 M5 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 Lots FG TF Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 11
Lien avec l'activité catalase Germination au froid - Tournesol Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012
Dégradation lipidique froid Germination au froid - Tournesol Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012
Lien avec l aptitude à la conservation Aptitude à la conservation - Colza Matériel végétal chez le colza 9 lots de report et 9 lots récoltés en 2006 Conditions de vieillissement Détérioration contrôlée : 45 C-16% TE 10 C, 50%HR ; 30 C, 75%HR Caractérisation physiologique Germination : 7 jours à 20 C, buvard PP, lumière Conductimétrie: 16h à 20 C Dosages biochimiques Catalase; Glutathion réductase; Superoxide dismutase Peroxide d hydrogène Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 14
Aptitude à la conservation - Colza TG: taux de germination CM: conductivité G r o u p e d É t u d e e t d e c o n t r ô l e Qualité physiologique et systèmes enzymatiques / Détérioration contrôlée CAT: Catalase GR: Glutathion réductase SOD: Superoxide dismutase H2O2: Peroxide d hydrogène 1 lot ajusté à 16% d humidité et détérioré à 45 C pendant 0, 24, 36, 48 ou 72 heures. Lien entre catalase, germination et 1/Cm après détérioration Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 15
Qualité physiologique et systèmes enzymatiques / Aptitude à la conservation - Colza Conductivité (µs.cm -1.g -1 MS) 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Détérioration contrôlée Echantillons non ajustés Echantillons ajustés à 12% de TE 0 96 168 240 336 0 48 72 96 168 0 24 36 48 72 Durée du vieillissement à 45 C (heures) Echantillons ajustés à 16% de TE 16
Aptitude à la conservation - Colza Activité CATALASE (nmol H 2 O 2.min -1.mg prot -1 ) 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 G r o u p e d É t u d e e t d e c o n t r ô l e Qualité physiologique et systèmes enzymatiques / Détérioration contrôlée TE initiale de 6% TE ajustée à 12 % TE ajustée à 16 % 0 240 336 0 48 72 96 168 0 24 36 48 72 Durée de vieillissement à 45 C (heures) 17
Aptitude à la conservation - Colza Faculté germinative (%) 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 G r o u p e d É t u d e e t d e c o n t r ô l e Qualité physiologique au cours de la conservation 0.0 0.0 0 2 4 6 8 10 12 Durée de conservation (mois) 350.0 300.0 250.0 200.0 150.0 100.0 50.0 Lots 2006 30 C Lots de report 30 C 18 lots à 10 C Lots 2006 (CM) Lots de report (CM) 18 lots à 10 C (CM) 18 Conductivité (µs.cm -1.g -1 )
Qualité physiologique au cours de la conservation Aptitude à la conservation - Colza Faculté germinative (%) 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 Conservation à 30 C-75% HR 0 2 4 6 8 10 12 Temps conservation (mois) A1 A2 A4 A5 R1 R2 R6 Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 19
Aptitude à la conservation - Colza G r o u p e d É t u d e e t d e c o n t r ô l e Qualité physiologique et systèmes enzymatiques / Conservation des semences Catalase Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 20
Aptitude à la conservation - Colza G r o u p e d É t u d e e t d e c o n t r ô l e Qualité physiologique et systèmes enzymatiques / Conservation des semences Glutathion réductase Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 21
Aptitude à la conservation - Colza Faculté germinative après conservation (%) 60 50 40 30 20 10 0 G r o u p e d É t u d e e t d e c o n t r ô l e Qualité physiologique et systèmes enzymatiques / Conservation des semences Corrélation CATALASE et FG après 6 mois à 30 C Dosage initial CAT y = -8.2375x + 76.427 R 2 = 0.6676 Dosage CAT après 2 mois à 30 C y = -10.314x + 102.08 R 2 = 0.8928 4 5 6 7 8 9 10 Activité spécifique catalase (nmoles H 2 O 2.min -1. mg -1 protéines totales) 22
Conclusion - Synthèse 23
Conclusion - Perspectives Peroxydations lipidiques (MDA) liées à la réponse au froid chez le tournesol Vieillissement des graines de colza lié à une baisse d'activité de la CATALASE Catalase H2O2 lipides membranaires (phospholipides) Perspectives de valider ces résultats sur davantage de variétés et de lots, et de standardiser le dosage de la catalase Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 24
Remerciements UFS : I. Pauchet-Mattler GEVES : M. Durand, L. Ledroit, M. Lemaire, P. Garreau, M.C. Gâtineau, M. Moron, S. Stievenard Stagiaires : C. Bogucki, M. Da Costa, F. Florance, L. Gaboriau Financement : Ministère de l'agriculture et de la Pêche Sylvie Ducournau Séminaire CTPS du 23 Novembre 2012 25
Merci de votre attention