Les microarn (mirna, mir) 1. Introduction 2. Synthèse des mirna 3. mirna et régulation de l expression de gènes : dans le cytosol 4. mirna et régulation de l expression de gènes : dans le nucléoplasme 5. Régulations de la synthèse des mirna 6. Rôles en Biologie et pathologies Master Tronc commun Novembre 2009 Pierre Cau INSERM U910 Faculté de Médecine Laboratoire de Biologie Cellulaire, Hôpital La Timone Marseille pierre.cau@univmed.fr
sirna (small interferent) et mirna (micro) : 1. Introduction Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. 1993. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 75, 843. Nobel Physiologie Médecine 2006 Andrew Z. Fire Craig C. Mello «Pour leur découverte de l ARN interférence, l inhibition de l expression (silencing) de gènes par un ARN double brin» http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/
1. Introduction Une animation sur le site web de Nature : http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html
2. Synthèse 1. gènes de mirna 2. pré-mirna 3. 1 er clivage (Drosha) 4. exportation 5. 2 ème clivage (Dicer) 6. complexe RISC 7. P bodies Cau et Seïte, 2007 Cours de Biologie cellulaire Editions Ellipses Figure 12/12
1. Organisation génomique des mirna : 2. Synthèse 20% avec promoteur indépendant 40% dans introns (gènes codant ou non pour protéines) avec ± la même orientation que le gène dans lequel le gène mir est inclus 10% dans exons Environ 10% dans séquences répétées Alu du génome Zhao et Srivastava, 2007, TIBS, 32, 189
2. Synthèse Basé sur les 232 mirna de mammifères dans la base de données Sanger (en 2004) Rodriguez et al., 2004, Genome Res., 14, 1902
2. Synthèse Certains gènes de mirna sont organisés en clusters Le cluster en 14q.32.31 est soumis à l empreinte génomique parentale : expression maternelle Williams, 2008, Cell. Mol. Life Sci., 65, 545
2. Synthèse 2. Transcription par ARN Pol II avec épingle à cheveu (ARN Pol III pour mir dans séquences répétées Alu) pré-mirna 1-2 Kb avec coiffe en 5 et polya en 3 Zhao et Srivastava, 2007, TIBS, 32, 189
2. Synthèse 3. Premier clivage 70 nt par complexe comportant RNase de type III (Drosha) + protéine DGCR8 (délétée dans une forme de syndrome de DiGeorge, 0MIM 188400) (5 phosphate, 3 : 2 nt dépassent) Nomenclature des domaines : Saunders et al., 2007, PNAS, 105, 3300 Zhao et Srivastava, 2007, TIBS, 32, 189 4. Exportation au travers du pore nucléaire grâce à exportine 5 (+ protéine G Ran)
2. Synthèse 5. Deuxième clivage par Dicer Ribonucléase de type III avec domaine hélicase 19-23 nt double brin : 5 phosphate, 3 : 2 nt dépassent (KO de Dicer léthal chez l embryon. KO conditionnel viable) 6. Association dans complexe RISC : RNA-Induced Silencing Complex : un seul brin, l autre (MIR*) dégradé protéines argonaute dont Ago2 dénomination à partir de la forme de Arabidopsis thaliana (avec mutation du gène Ago) ressemblant au nautile (céphalopode) Zhao et Srivastava, 2007, TIBS, 32, 189
8 gènes codant pour protéines 2. Synthèse Ago chez l homme : seule Ago2 = RNase (souris KO : arrêt développement à E5,5) reconnaissance du 5 phosphate et des 2 nucléotides qui dépassent en 3 nombreuses protéines associées : 20 pour Ago2 (voir tableau 2, Peters et Meister, 2007, Mol. Cell, 26, 611) dont FRX1 et 2 (Fragile X related protein) Ago (archaebactérie) (Ago dans toutes les cellules sauf germinales : protéines PIWI) Seto et al., 2007, Mol. Cell, 26, 603 Ago2 humain Höck et Meister, 2008, Genome Biol., 9, 210
1/ 2 ou 3 Rôles des mirna dans le cytosol : 3. mir cytosol Dégradation de l ARNm par clivage Inhibition de la translation par action sur le ribosome : mécanisme? -Ago = initiateur de la translation = elf-2c2 -de l élongation, -détruit les peptides naissants ± Déadénylation, enlèvement de la coiffe et dégradation de l ARNm déstabilisé Höck et Meister, 2008, Genome Biol., 9, 210
L accessibilité du mirna au 3 UTR de son ARNm cible : rôle des nt 2 à 7 en 5 = seed Zhao et Srivastava, 2007, TIBS, 32, 189 3. mir cytosol Dégradation d ARNm + : mir (10a) se fixe sur la région 5 non-codante d ARNm codant pour des protéines ribosomales et en augmente la traduction : Ørom et al., 2008, Mol. Cell, 30, 460
3. mir cytosol Remarques : 2 mécanismes de dégradation des ARNm chez eucaryotes : - enlèvement de la coiffe en 5 et digestion de 5 3 (XNR1 =5-3 exoribonucléase - déadénylation (3 ) et digestion de 3 5 (Exosome + ) Localisation dans P bodies Eulalio et al., 2007, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 8, 9
2/ P bodies : 3. mir cytosol - Complexe protéiques cytosoliques contenant Ago2, LSM2, GW182 (anticorps disponibles) - Plusieurs rôles : sites de destruction «en vrac» (bulk) des ARNm (déadénylation et digestion 5 3 ) destruction des ARNm avec codon stop : Premature Termination Codon (PTC) par le mécanisme NMD (Non-sense Mediated RNA Decay) silencing de gènes via mirna Höck et Meister, 2008, Genome Biol., 9, 210
3/ mirna et leurs ARNm cibles : 3. mir cytosol Un site web dédié : 695 mirna (septembre 2008) humains http://microrna //microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtmlshtml Environ 35000 gènes cibles des mirna (septembre 2008) chez l homme : un même mirna peut cibler plusieurs ARNm! Programme de recherche de cibles sur le web : Sanger : TargetScan : miranda : Diana MicroT : RegRNA : http://microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/targets/v5/search.pl http://www.targetscan.org/ http://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/micro_t.cgi http://regrna.mbc.nctu.edu.tw/html/prediction.html
http://microrna //microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtmlshtml
http://microrna //microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/targets/v5/search.pl Choisir le mirna Choisir le génome ou le gène
http://www.targetscan targetscan.org/
miranda : http://cbio //cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl
http://www.diana diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/micro_t edu/cgi-bin/micro_t.cgi
http://regrna //regrna.mbc.nctu.edu.tw/ html/prediction.html
4/ Effet des mirna au niveau protéique : 3. mir cytosol 2 articles montrent un effet faible mais sur plusieurs centaines de protéines : Baek et al., 2008, Nature, 455, 64 Spécificité de la réponse??? Selbach et al., 2008, Nature, 455, 58 : - surexpression de 5 mir dans cellules HeLa, ou KO de mirna endogènes - marquage des protéines par méthode SILAC (Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Culture) : culture témoin : marquage des lysines avec 12 C (light) HeLa transfectées avec mirna ; lysines marquées avec 13 C (heavy) - digestion trypsique, spectrométrie de masse : analyse de 5000 protéines : les peptides marqués au au 13 C sont plus lourds de 6 Da par rapport aux peptides marqués au 12 C Résultats : - surexpression de mirna baisse de environ 30% des protéines - KO surexpression de protéine : ex : Dicer après KO de mir let-7b
Méthode SILAC : Stable Isotope Labeling with Aminoacids in Culture 3. mir cytosol 12 C et 13 C Ong et Mann, 2006, Nature Protocols, 1, 2650
4. mir noyau Les mirna sont importés dans le nucléoplasme et agissent sur la transcription des gènes et l épissage des ARNm (1): 1/ Importation de mirna (sirna) dans le nucléoplasme : Guang et al., 2008, Science, 321, 537 : C. elegans En présence de sirna, la protéine Argonaute NRDE-3 se fixe au sirna dans le cytosol, l importe dans le nucléoplasme (signal de localisation nucléaire NLS ), blocage de pré-arnm dans le nucléoplasme. Berezhna et al., 2008, PNAS, 103, 7682 : pénétration dans le nucléoplasme de sirna (sens et antisens marqués aavec fluorochromes rouge et vert) dirigés contre ARN 7SK pénétration ou non (selon type cellulaire et durée d incubation) de sirna dirigés contre le réplicon du virus de l hépatite C (HCV). Si pénétration nucléaire, élimination du brin sens.
4. mir noyau sirna sens sirna antisens DAPI Cible : ARN 7K Hépatome HU-7 2h après transfection Cible : ARN HCV Berezhna et al., 2008, PNAS, 103, 7682
4. mir noyau Les mirna sont importés dans le nucléoplasme et agissent sur la transcription des gènes et l épissage des ARNm (2): 2/ Transcription de gènes : Place et al., 2008, PNAS, 105, 1608 : mir-373 se fixe sur le promoteur des gènes E-cadhérine et CDC2 (Cold Shock domaine containing protein 2 = Pippin) Cellules PC3 (cancer prostate) : transfection de mir-373 mrna des 2 gènes E-cadhérine ADN brin sens Séquence du mir-373 complémentaire de celle de l ADN
RT-PCR 4. mir noyau mir-373 et dsecadh-640 (complémentaire du site cible de mir-373) : ARNm E-Cadhérine x 7 protéine E-Cadhérine Pas d effet additif des deux dsrna immunoblot qrt-pcr
2 autres papiers antérieurs : 4. mir noyau des RNA double brin (dsrna) artificiels ciblant le promoteur induisent l expression de gènes = phénomène de RNAa = RNA activation E-cadhérine p21 VEGF PNAS, 2006, 103, 17337-17342 Récepteur de la progestérone Nature Chemical Biology, 2007, 3, 166-173
4. mir noyau Les mirna sont importés dans le nucléoplasme et agissent sur la transcription des gènes et l épissage des ARNm (3): 3/ Transcription de gènes : Kim et al., 2008, PNAS, 105, 16230 : le gène mir-320 localisé dans le promoteur du gène POLR3D (sous-unité de l ARN polymérase III) mir-320 bloque la transcription du gène POLR3D 4/ Régulation de l épissage : Boutz et al., 2007, Gene Develop., 21, 71 : mir-133 et mir-1/206 facteur d épissage nptbp (Polypyrimidine trac binding protein, développement, muscle) Makeyev et al., 2007, Mol. Cell, 27, 435 : mir-124 différenciation neuronale par régulation d un épissage alternatif cerveau-spécifique via PTBP (Revue : Makeyev et Maniatis, 2008, Science, 319, 1789)
1/ L expression des gènes de mirna est régulée comme celle de gènes plus classiques (1) : 5. Régulations mir Régulation par des voies de signalisation intercellulaire : TGF-bêta, BMP4 induisent (via SMAD) mir21 contrôlant via l ARNm PDCD4 (Programmed cell death 4) la différenciation de cellules musculaires lisses de parois vasculaires Davis et al., 2008, Nature, 454, 56 La nicotine induit mir-140 qui cible l ARNm de la dynamine 1 : endocytose pour récupération de membrane après exocytose Huang et Li, 2008, Int. J. Neuropsychopharmacol., 10 octobre, 1-10 Monocytes : NF-κB induit mir-146 en réponse à des endotoxines bactériennes : Taganov et al., 2006, PNAS, 103, 12481 Régulations génomiques (Copy Number Variants) et épigénétiques (méthylation ADN, acétylation des histones) dans le cancer de l ovaire humain : Zhang et al., 2008, PNAS, 105, 7004
1/ L expression des gènes de mirna est régulée comme celle de gènes plus classiques (2) : 5. Régulations mir SNP dans gènes codant pour les mir : Saunders et al., 2007, PNAS, 104, 3300 65 SNP dans 49 pré-mirnas, soit densité de 1,3 SNP/kB (un peu plus faible que régions voisines) Localisation des SNP dans les domaines Hu et al., 2008, J. Clin. Invest., 118, 2600 Correlation entre SNP dans gènes de mirna et survie de cancers non à petites cellules du poumon mirna et Copy Number Variants (CNV) : Wong et al., 2007, Am. J. Hum. Genet., 80, 91 (CGH microarray) RNA éditing des mirna : adénosine (A) inosine (I) Amariglio et Rechavi, 2007, Blood Cells, 39, 151
5. Régulations mir Distribution des Copy Number Variants (CNV) mirna cancer 3 4 5 individus Wong et al., 2007, Am. J. Hum. Genet., 80, 91
5. Régulations mir mirna et Copy Number Variants (CNV) Wong et al., 2007, Am. J. Hum. Genet., 80, 91
2/ Les cellules pourraient échanger/échangent des mirna (signalisation intercellulaire) (1) : 5. Régulations mir Découvertes d abord dans C. elegans, deux protéines SID-1 et 2 ont des homologues dans le génome humain : SID-1 = perméase (11 domaines transmembranaires) permettant la traversée de la membrane plasmique par des dsrna Feinberg et Hunter, 2003, Science, 301, 1545 Winston et al., 2002, Science, 295, 2456. Duxbury et al., 2005, Biochem Biophys Res Commun. 331, 459 Jose et Hunter, 2007, Ann. Rev. Genet., 41, 305 SID-2 = un seul domaine transmembranaire indispensable aussi (C. elegans) Winston et al., 2007, PNAS, 104, 10565
2/ Les cellules échangent des mirna (signalisation intercellulaire) (2) : 5. Régulations mir Nouveau mécanisme de communication intercellulaire par transfert, via les exosomes, d ARNm fonctionnels (traduits dans les cellules qui ont incorporé les exosomes (endocytose, fusion?) et de mirna (fonctionnels?) : chaque mirna pourrait interagir avec 200 ARNm différents
5. Régulations mir Attention : problème de nomenclature (!!!) : Exosome = complexe enzymatique de dégradation des ARNm (3 5 ) Exosome = vésicule générée dans les endosomes tardifs = corps mutivésiculaires = MVB (MultiVesicular Bodies) 3 types de mastocytes (humains, murins) produisent des exosomes ces exosomes contiennent des ARNm et des microarn (en plus de protéines membranaires et cytosoliques) les exosomes sont «captés» par des cellules «cibles» (endocytose, fusion?) le contenu des exosomes passe dans le cytosol des cellules cibles les ARNm sont traduits en protéines (homme/souris!)
Les exosomes sont produits dans les endosomes tardifs et exocytés : Endosomes et présentation des antigènes par le CMH de type II aux lymphocytes T CD4+ dans les cellules " présentatrices d'antigènes " < 100 nm Cau et Seïte, 2007 Cours de Biologie cellulaire Editions Ellipses Figure 10/39 Protéines membranaires (CMH II ) + cytosol de la cellule productrice
Nouveau mécanisme de communication intercellulaire par transfert via les exosomes, d ARNm fonctionnels (traduits dans la cellule «cible») : - 1300 ARNm (8% des 16 000 présents dans cellule source) - 270 ARNm présents dans exosomes et non dans cellule source et de mirna (fonctionnels?) : chaque mirna pourrait interagir avec 200 ARNm différents Attention : «Contamination» de cultures cellulaires (sérum ) 5. Régulations mir Revue sur les exosomes : Schorey et Bhatnagar, 2008, Traffic, 9, 871
3/ Des mirna dans la circulation sanguine (signalisation intercellulaire) (3) : 5. Régulations mir Mitchell et al., 2008, PNAS, 105, 10513 Cancer de la prostate expression de plusieurs mir retrouvé dans la circulation sanguine : de 9000 copies/µl (mir-15b) à 133 000 copies/µl (mir-24) protégé de la dégradation par les Rnases endogènes Détection du cancer?
Quelques exemples significatifs 6. Rôles Biol./Pathol. 1/ Développement : Autorenouvellement et pluripotence de cellules souches Facteur de régulation de la transcription REST (RE1-Silencing Factor) : Répression de l expression de gènes neuronaux dans cellules non neuronales REST exprimé dans cellules ES souris : REST expression de mir-21 Singh et al., 2008, Nature, 453, 223 Système nerveux (developpement et au stade adulte) : C. elegans Fiore et al., 2008, BBA, 1779, 471 2/ Pathologies acquises : Maladies neurodégénératives : Bushait et Cohen, 2008, C.O. Neurobiol., 18, 292 Démence fronto-temporale et SNP dans la région 3 UTR d un gène (progranuline) cible de mir-659: Rademakers et al., 2008, Hum. Mol Genet., 17, 3631
6. Rôles Biol./Pathol. Blocage de l expression des Gènes neuronaux dans cellule non-neuronale (REST) Différenciation neuronale Fiore et al., 2008, BBA, 1779, 471
Fonctionnement neuronal dans organisme adulte : morphogenèse des épines dendritiques plasticité synaptique 6. Rôles Biol./Pathol. Inactivation de mir-134 en réponse au BDNF Transport des mir ou des précurseurs? Fiore et al., 2008, BBA, 1779, 471
3/ Cancer : La protéine p53 régule plusieurs mirnas : Hermeking, 2007, Cancer Cell, 12, 414 6. Rôles Biol./Pathol. Anomalies génomiques (SNP, CNV) dans cancers de l ovaire : Zhang et al., 2006, PNAS, 103, 9136 SNP de gènes cibles résistance aux traitements : -Dihydrofolate réductase et méthotrexate (lymphomes ): mir 24 Mishra et al., 2007, PNAS, 104, 13513 -p27 (régulateur du cycle cellulaire) et tamoxifène (cancer sein) : Miller et al., 2008, J. Biol. Chem., 283, 29897 -Récepteur des œstrogènes ERα et tamoxifène (cancer sein) Zhao et al., 2008, J. Biol. Chem., 283, 31079 mirna, cancer et diagnostic? Deng et al., 2008, Cell Cycle, 7, 2643 Barbarotto et al., 2008, Int. J. Cancer, 122, 969
6. Rôles Biol./Pathol. Le répertoire des mirna exprimés dans les adénocarcinomes du poumon pourrait avoir une valeur pronostique : Courbes de Kaplan Meier Yanaihara et al., 2006, Cancer Cell, 9, 189
6/10/08 Nobel de Médecine 2008 Harald zur Hausen Françoise Barré-Sinoussi Luc Montagnier Virus Papilloma (cancer du col utérin) Virus du SIDA
Cancer (suite) Cancer du col de l utérus : 6. Rôles Biol./Pathol. - Environ 70 gènes de mirna dérégulés : Lee et al., 2008, Clin. Cancer Res., 14, 2535 - Surexpression de gènes portés par le chromosome 5 dont Drosha : Scotto et al., 2008, Mol. Cancer, 7, 58 4/ Le génome de virus codent pour des mir actifs sur les cellules cibles : Sarcome de Kaposi : Samols et al., 2007, PLoS Pathogens, 3, e65 herpès : Stern-Ginossar et al., 2007, Science, 317, 376 Papilloma : Martinez et al., 2008, Oncogène, 27, 2575 Une revue : Berkhout et Jeang, 2007, J. Biol. Chem., 282, 26641 5/ Des bactéries modifient la réponse mirna de plantes : Navarro et al., 2007, Science, 321, 964. A quand un effet comparable chez l homme?
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