MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE. ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Anne-Lise BERTRAND Pour l obtention du diplôme de l Ecole Pratique des Hautes Etudes RETENTION DES STREPTOCOQUES MUTANS SUR DES MATERIAUX ORTHODONTIQUES EN FONCTION DE DIFFERENTS PROCEDES D HYGIENE - ETUDE IN VITRO Soutenu le 13 Décembre 2004 devant le jury suivant : Pr Exbrayat J.M. Dr Bellaton C. Dr Tourneur Y. Pr Morrier J.J. Dr Barsotti O. Président Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Laboratoire de stage : Laboratoire d Etude des Interfaces et des Biofilms en Odontologie EA 637 Faculté d Odontologie Laënnec Rue Guillaume Paradin 69372 Lyon cedex 8 Directeur de laboratoire : Dr Odile Barsotti Responsables de Stage : Pr Morrier J.J. et Dr Barsotti O. barsotti@laennec.univ-lyon1.fr Laboratoire EPHE : Laboratoire Interactions cellulaires, rétrovirus et cancer EPHE UMR 754 INRA ENVL Université Claude Bernard 50, avenue Tony Garnier 69366 Lyon cedex 07 Directeur de laboratoire : Dr Cordier G. Maître de conférence : Dr Bellaton C. bellaton@univ-lyon1.fr ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre EPHE Banque de Monographies SVT 1

RETENTION DES STREPTOCOQUES MUTANS SUR DES MATERIAUX ORTHODONTIQUES EN FONCTION DE DIFFERENTS PROCEDES D HYGIENE - ETUDE IN VITRO -. Anne-Lise BERTRAND Les relations existant entre les appareillages orthodontiques et risque carieux ne sont pas encore clairement définies. La majorité des études, effectuées in vivo, ont montré une augmentation du risque carieux chez les patients ayant un traitement orthodontique ainsi qu une augmentation du nombre de bactéries cariogènes (streptocoques mutans) dans la plaque et la salive. Très peu d études ont été consacrées aux capacités de rétention des différents matériaux utilisés en orthodontie. Les traitements classiques de désinfection et de stérilisation de ces matériaux modifient-ils leurs propriétés de surface et ainsi augmentent-ils l adhérence des streptocoques mutans, agents étiologiques de la carie. Pour répondre à ces questions nous avons évalué et comparé l adhérence de quatre souches de streptocoques mutans (souches de référence et sauvages de S. mutans, S. sobrinus) sur le titane, deux de ses alliages NiTi (Nickel-Titane) et TiMo (Titane-Molybdène) ainsi que sur l acier inoxydable (témoin), après différents traitements d hygiène (désinfection, stérilisation par rayons gamma, stérilisation par autoclavage). L adhérence des souches de S. mutans ( 11000) est plus importante que celle des souches de S. sobrinus ( 2500) et pour chacune des espèces, la souche sauvage (S.m. 12500 et S.s. 3600) adhère en plus grande quantité que la souche de référence (S.m. 8000 et S.s. 1800). Une différence significative a été retrouvée avec les pastilles d alliages NiTi ayant été stérilisées par rayons gamma. C est avec ces alliages et ce mode de stérilisation que nous avons, en effet, retrouvé le plus grand nombre de bactéries adhérentes. Nos résultats indiquent que la stérilisation, par autoclavage est préférable, à la stérilisation par rayons gamma. Nous avons également évalué les propriétés physico-chimiques de surface des souches bactériennes (MATS, Méthode de la goutte posée) et des différents matériaux (Méthodes de la goutte posée et de la bulle captive) étant donné leur rôle dans les phénomènes d adhésion bactérienne. Les surfaces des souches bactériennes testées sont de nature hydrophobes (MATS 65% d adhésion à l hexadécane) et présentent un caractère basique, donneur d électrons (MATS : 95% d adhésion au chloroforme > 46% d adhésion à l éther). Les surfaces des matériaux utilisés sont également de nature hydrophobe (Goutte posée : θeau 80 sans salive et 35 avec salive) avec un caractère basique donneur d électrons (γ + [ 1 mj/m²] < γ - [ 10 mj/m²sans salive et 50 mj/m² avec salive]). L étude de la surface des matériaux, avec et sans salive, nous a également permis d observer que la salive entraîne une homogénéisation des surfaces des matériaux. Nos résultats confirment l intérêt de la détermination des interactions acide-base dans la compréhension des phénomènes d adhésion bactérienne sur les matériaux orthodontiques. MOTS-CLÉS : streptocoques mutans, matériaux orthodontiques, adhérence, MATS, angles de contact, ELS. I - REVUE DE LA LITTERATURE I. 1 Biologie et Microbiologie de la cavité buccale I. 1. 1. La plaque dentaire 1 EPHE Banque de Monographies SVT 2

I. 1. 1. 1. Définition 1 I. 1. 1. 2. Les types de plaques dentaires I. 1. 1. 3. Formation de la plaque dentaire I. 1. 1. 3. 1. La Pellicule Exogène Acquise I. 1. 1. 3. 2. Fixation des bactéries pionnières I. 1. 1. 3. 3. Maturation de la plaque dentaire 3 3 2 1 2 I. 1. 2. L adhésion bactérienne 4 I. 1. 2. 1. Mécanismes biologiques de l adhésion bactérienne 5 I. 1. 2. 1. 1. Le transport 5 I. 1. 2. 1. 2. L adhésion initiale, non spécifique 5 I. 1. 2. 1. 3. L attachement 7 I. 1. 2. 1. 4. La colonisation 8 I. 1. 2. 2. Les propriétés de surface des bactéries dans l adhésion aux surfaces 10 I. 1. 2. 2. 1. L Energie Libre de Surface 10 I. 1. 2. 2. 2. L hydrophobicité 11 I. 1. 2. 2. 3. Les interactions électrostatiques 13 I. 1. 2. 2. 4. La rugosité 14 I. 1. 3. La carie dentaire 15 EPHE Banque de Monographies SVT 3

I. 1. 3. 1. Etiologie de la carie dentaire I. 1. 3. 2. La salive 15 16 I. 1. 3. 3. Les streptocoques mutans I. 1. 3. 3. 1. Les streptocoques oraux 17 I. 1. 3. 3. 2. L acquisition des streptocoques mutans 18 I. 1. 3. 3. 3. Les facteurs de virulence des streptocoques mutans 19 17 I. 2. Métaux et alliages métalliques utilisés en orthodontie 20 I. 2. 1. Généralités 20 I. 2. 2. Le titane et ses alliages 21 I. 2. 3. Le NiTi, un alliage à mémoire de forme I. 2. 3. 1. Propriétés du NiTi (Jordan et coll., 1997) I. 2. 3. 2. Les utilisations du NiTi 22 22 25 I. 2. 4. la biocompatibilité des métaux 26 I. 3. Etudes bibliographiques : Traitements ODF et écosystème buccal 27 EPHE Banque de Monographies SVT 4

I. 3. 1 Les études in vivo 27 I. 3. 2. Les études in vitro 28 LISTE DES ABREVIATIONS C degré celsius Af austenite finish ANOVA analyse of variance As austenite start CCD charged coupled device CFU/ml colony forming unit par millilitre Diiodo. diiodométhane DO densité optique ELS / DGadh / γ Energie libre de surface Forma. formamide GBP glycan binding - protein GPS glycoprotéine salivaire Gram + gram positif GTF glycosyltransférase Gy Gray MATS method of adhesion to solvent MEB microscope électronique à balayage Mf martensite finish min minute mj.m² millijoule par mètre carré Mm² millimètre carré Ms martensite start NiTi nickel - titane ODF orthopédie dento-faciale PBS phosphate buffer saline PEA pellicule exogène acquise ph potentiel hydrogène PLSD protected least significant difference PRP protéine riche en proline PSEC polysaccharide extracellulaire Ra rugosity average théorie DLVO théorie Derjaguin Landau Verwey et Overbeek Ti titane Ti6A14V titane 6% aluminium 4%valladium Ticp titane commercialement pur TiMo titane - molybdène EPHE Banque de Monographies SVT 5

γ bl énergie libre bactérie / liquide γ bs énergie libre bactérie / solide γ ls énergie libre liquide / solide γ- énergie libre de surface basique γ+ énergie libre de surface acide γab / γp composante polaire γlv énergie libre liquide / vapeur γlw / γd composante dispersive γsv énergie libre solide / vapeur γtot énergie libre de surface totale θ a angle à l air θ o angle à l octane I. 1. Biologie et Microbiologie de la cavité buccale I. 1. 1. La plaque dentaire I. 1. 1. 1. Définition Selon Mouton et Robert (1994), la plaque dentaire se définit comme «une accumulation hétérogène, adhérente à la surface des dents ou située dans l espace gingivo-dentaire, composée d une communauté microbienne riche en bactéries aérobies et anaérobies, enrobées dans une matrice intercellulaire de polymères d origine microbienne et salivaire». Cette plaque bactérienne, présente chez tous les individus dès l apparition des dents, varie d un sujet à l autre. Elle se forme en quelques heures et se dépose plus facilement encore, dans les zones inaccessibles au brossage. Un individu ayant une bonne hygiène possède 5 à 20 mg de plaque dentaire, sans hygiène, les proportions peuvent être multipliées par dix. La plaque dentaire est composée à 80% d eau et à 20% d éléments solides (protéines, glucides, lipides et nombreuses bactéries) (Mouton et al., 1999). I. 1. 1. 2. Les types de plaques dentaires Malgré la diversité des bactéries et des composés salivaires formant la plaque dentaire, Loesche (1982), distingue trois types de ce biofilm en fonction de leur pouvoir pathogène : - Une plaque non pathogène compatible avec un état de santé dentaire et parodontale. Contrôlée mécaniquement, cette plaque n entraîne aucune pathologie dentaire ou parodontale. Elle comprend surtout des bactéries à Gram positif appartenant aux genres Streptococcus et Actinomyces. - Une plaque cariogène. Elle se développe lors d une consommation importante de saccharose et se caractérise par une forte proportion de Streptococcus mutans, propice à la déminéralisation de l émail et à la formation de la carie dentaire. - Une plaque parodontopathique. Elle se développe dans l espace gingivo-dentaire sous EPHE Banque de Monographies SVT 6

certaines conditions. Son contenu bactérien évolue progressivement d une flore aéro-anaérobie facultative, composée de cocci à Gram positif, vers une flore anaérobie stricte à Gram positif. Elle est à l origine de nombreuses maladies parodontales (gingivites, parodontites ) I. 1. 1. 3. Formation de la plaque dentaire Le développement de la plaque dentaire dépend de la colonisation des surfaces dentaires et, par conséquent, de la capacité des bactéries à pouvoir se fixer. Cette fixation n est rendue possible qu après l apparition sur l émail des dents, d un film conditionnant. Celui-ci, indispensable à la formation de tout biofilm, est appelé Pellicule Exogène Acquise (PEA). Il entraîne la succession des trois étapes nécessaires à l acquisition de la plaque dentaire : l adhésion des bactéries pionnières, la prolifération des bactéries buccales et la formation des colonies (Bernimoulin, 2003). Dans les années 70, Hillman et al. montrent déjà que la couche salivaire présente sur les surfaces à coloniser, influence significativement de manière positive ou négative, le taux d adhérence bactérienne. I. 1. 1. 3. 1. La Pellicule Exogène Acquise La PEA est un film organique qui se forme naturellement à la surface de l émail dentaire, et qui ne s élimine que difficilement une fois établi. D une épaisseur de l ordre du micron (Liljemark et Bloomquist, 1996), elle apparaît spontanément dans les minutes qui suivent le brossage et est essentiellement d origine salivaire. 98% de sa composition sont des glycoprotéines salivaires (GPS), qui jouent le rôle de récepteurs à adhésines bactériennes (Mouton et al., 1999 ). Elle comprend en grande quantité de PRP (Protéines Riches en Proline), des siga (secretory Immunoglobulin A), des stathérines, des cystatines, des histidines, du lysozyme, des glycosyltransférases d origine bactérienne et l alpha-amylase qui contribue fortement à l adhésion des streptocoques oraux (Scannapieco et al., 1993 ; Lamont et al., 2000). Cette pellicule permet l adhérence des bactéries pionnières, S. gordonii et A. naeslundii adhèrent aux PRP et les autres espèces de streptocoques oraux adhèrent aux SAG (Salivary Agglutinin Glycoprotein) (Lamont et al., 2000). Son rôle est à la fois bénéfique à la santé dentaire, assurant une protection contre la décalcification lors de l ingestion d aliments et boissons acides ; et destructeur, maintenant les acides en contact avec l émail et favorisant la colonisation bactérienne et la formation de la plaque dentaire. EPHE Banque de Monographies SVT 7

I. 1. 1. 3. 2. Fixation des bactéries pionnières Les premières bactéries capables de se fixer sur cette PEA, les espèces pionnières, sont à 67% des coques à Gram positif. Parmi elles, figurent en majorité des streptocoques oraux (S. oralis, S. mitis, S. salivarius, S. sanguinis) et des actinomyces. Ces espèces bactériennes ont la particularité de posséder à leur surface, des adhésines reconnaissant spécifiquement des récepteurs de cette pellicule. Ces bactéries pionnières ne peuvent à elles seules assurer la diversité de la plaque dentaire mature, mais leur présence est indispensable pour la fixation ultérieure de nombreuses autres bactéries qui contribueront à la diversité du biofilm. En effet, une fois cette communauté pionnière installée, d autres espèces ou genres bactériens peuvent se fixer, grâce aux nouvelles adhésines apportées par ces premières bactéries et grâce au micro-environnement qu elles ont créé par leur métabolisme (environnement anaérobie, consommation d oxygène, présence d acides, transformation des glucides) (Marsh, 2000). I. 1. 1. 3. 3. Maturation de la plaque dentaire Après plusieurs heures, de nouvelles espèces se fixent sur les bactéries pionnières et se diversifient avec l apparition de Fusobacterium, de Haemophilus, de Porphyromonas, de Lactobacillus, de Veillonella, de Treponema (Kolenbrander et al., 2002). Cette maturation est la conséquence des phénomènes de co-agrégation inter-bactérienne et de co-adhésion, respectivement une adhésion entre deux bactéries libres ou une adhésion d une bactérie libre sur une autre déjà fixée (Xie et al., 2000 ; Sbordone and Bortolaia, 2003). La plaque dentaire mature correspond principalement à une augmentation de l épaisseur du biofilm. Ce biofilm comprend 10 9 bactéries par mg et environ 500 taxons (références) (Whitaker et al., 1996). Le développement de la plaque dentaire ne se trouve donc limité que par les forces d attrition et une bonne hygiène bucco-dentaire. I. 1. 2. L adhésion bactérienne La formation de la plaque dentaire résulte des phénomènes d adhésion et d adhérence des bactéries. En microbiologie les deux termes se distinguent l un de l autre par leur signification. L adhérence est un état, elle se définit par la capacité de la bactérie à se fixer sur une surface. C est l ensemble des phénomènes qui s opposent à la séparation de deux corps en contact. Sans cette propriété, aucune bactérie ne pourrait se multiplier ou être à l origine de phénomènes pathologiques (Mouton et Robert, 1994). EPHE Banque de Monographies SVT 8

L adhésion est une action qui se caractérise par l ensemble des phénomènes physico-chimiques, mécaniques et biologiques permettant à une bactérie de s unir à une surface de façon durable (Quirynen et Bollen, 1995). Elle dépend donc de(s)/du : - L environnement (température, ph ) - L aspect et la rugosité de la surface - L énergie libre de surface du système bactérie substratum - Caractère hydrophile ou hydrophobe des bactéries et du substratum - Charges de surface des bactéries et du substratum - La force ionique du milieu - La présence de structures spécifiques à la surface des bactéries et du substratum Il n y a pas d adhérence sans adhésion préalable. L adhésion peut se résumer en quatre étapes dynamiques successives (Van Loosdrecht et al., 1990 ; Bos et al., 1999 ; Grivet et al., 2000) : - Le transport - L adhésion initiale non spécifique - L attachement - La colonisation I. 1. 2. 1. Mécanismes biologiques de l adhésion bactérienne I. 1. 2. 1. 1. Le transport Dans la cavité buccale, les bactéries de la plaque proviennent de la flore salivaire et linguale, elles se rapprochent de la pellicule exogène acquise (PEA) selon trois mécanismes (Mouton et Robert, 1994 ; Quirynen et Bollen, 1995). - La diffusion passive : il s agit du mouvement Brownien qui anime toutes les bactéries et leur permet un déplacement aléatoire à la vitesse moyenne de 40µm par heure. - La motilité : elle se définit par les mouvements propres de la bactérie, grâce à la présence, sur sa surface, de flagelles. Ce mécanisme peut être associé au chimiotactisme, qui permet aux bactéries de se rapprocher des surfaces. - La convection : elle résulte des mouvements de la langue et des flux salivaires. EPHE Banque de Monographies SVT 9

I. 1. 2. 1. 2. L adhésion initiale, non spécifique L ensemble des bactéries et la surface commencent à interagir l un avec l autre lorsque la distance qui les sépare est de 50nm ; s en suit une succession d interactions de longue puis de courte distance, qui sont partiellement de nature physico-chimique. Cette phase d adhésion est tout d abord réversible puis devient irréversible. q Les interactions de longue distance Dans de nombreux milieux biologiques, deux types d interactions de longue distance sont décrits. Les bactéries sont tout d abord attirées dans un minimum énergétique secondaire par des forces d attraction : les forces de Van der Waals. Lorsque la distance des 20nm est franchie, il apparaît des forces de répulsion électrostatiques, bactéries et surfaces étant chargées négativement. Ces forces sont répulsives. o Les forces de van der Waals Ce sont des forces retenant ensemble les molécules et les atomes de deux corps et qui dépendent des attractions reliant les atomes et les molécules lorsqu ils se rapprochent. Les forces de van der Waals sont en général de faible intensité, elles diminuent rapidement avec la distance et il en existe de trois natures : - Interaction d orientation (interaction dipôle permanent / dipôle permanent) : force de Keesom - Interaction d induction (interaction dipôle permanent / dipôle induit) : force de Debye - Interaction de dispersion (interaction dipôle induit / dipôle induit) : force de London Ces forces résultent de l interaction entre les électrons d une molécule et les charges d une autre. Ces différentes interactions sont des forces d attraction. Pour éviter l interpénétration des nuages électriques des deux molécules, des forces de répulsion entrent en jeu, les forces électrostatiques. o Les forces électrostatiques de répulsion Ces interactions interviennent en général lorsque la bactérie est à une distance inférieure à 20nm du substratum (Rutter et Vincent, 1984). Elles sont essentiellement dues à la présence de charges électriques autour des surfaces (bactéries et substratum). Lorsque la surface de la bactérie, chargée négativement arrive en contact avec la surface du substratum, chargée également négativement, il se produit des interactions électrostatiques répulsives dues au chevauchement des deux couches superficielles chargées. D après la théorie DLVO développée par Derjaguin, Landau, Verwey et Overbeek (Derjaguin et Landau, 1941 ; Verwey et Overbeek, 1948), la résultante des interactions de van der Waals (G A ) et des interactions électrostatiques (G E ), appelée énergie de Gibbs (G TOT ), gouverne l adhésion EPHE Banque de Monographies SVT 10

bactérienne initiale. G TOT est fonction de la distance bactérie-substratum (H), ainsi que de la force ionique du milieu. A force ionique faible, les interactions électrostatiques sont très importantes et les conditions sont très défavorables à l adhésion bactérienne (G TOT > 0). Par contre, à force ionique élevée, les interactions électrostatiques sont masquées par les nombreuses charges du milieu, ce qui crée des conditions très favorables à l adhésion bactérienne (G TOT < 0). Dans les milieux naturels, telle que la salive, la force ionique est moyenne (Quirynen et Bollen, 1995), l énergie d adhésion nécessaire à la bactérie va donc varier en fonction de la distance bactérie substratum. - Lorsque la bactérie est à une distance comprise entre 50 et 20nm du substratum, elle est uniquement soumise aux interactions attractives de Van der Waals. - En dessous de 20nm, les forces électrostatiques entrent en jeu. L énergie potentielle passe alors par un minimum jusqu auquel l adhésion de la bactérie est réversible. A ce niveau, se crée une barrière énergétique répulsive. Lorsque la bactérie franchit cette barrière, elle se trouve à une distance de l ordre du nanomètre, où apparaissent les interactions de courte distance. q Les interactions de courte distance Lorsque la distance bactérie substrat est proche du nanomètre, les bactéries franchissent la barrière énergétique (maximum énergétique) et sont soumises à des interactions de courte distance, qui sont irréversibles : - Les interactions acide base (accepteur / donneur d électrons), qui permettent la formation de liaisons hydrogènes (interactions de Lewis). Ce sont des interactions électrostatiques fortes, de courte distance, possibles lorsqu un atome d hydrogène est en contact avec un atome chargé négativement. - Les interactions électrostatiques, qui se caractérisent par la formation de ponts entre une charge négative de la bactérie et une charge négative du substratum, grâce à des cations divalents (Ca 2+, Mg 2+ ). - Les interactions hydrophobes. Elles entrent en jeu lors d une adhésion en milieu aqueux. Les molécules d eau se disposent en structure ordonnée, assimilées à des molécules apolaires, pouvant ainsi former des liaisons avec d autres molécules apolaires. - Les interactions de van der Waals sont toujours présentes et des interactions répulsives d hydratation (phospholipides surfaces solides) et des liaisons covalentes peuvent également être observées. I. 1. 2. 1. 3. L attachement Pour se maintenir sur les surfaces dentaires durant une longue période, les bactéries forment des EPHE Banque de Monographies SVT 11

liaisons de haute affinité, en utilisant des molécules de surface spécifiques. Les interactions sont de deux ordres : - Les interactions de type Adhésine Récepteur. Les adhésines sont des protéines qui se fixent stéréochimiquement à des récepteurs de la PEA, essentiellement saccharidiques, en formant des ponts entre les deux surfaces (Jenkinson et Lamont, 1997 ; Mouton et al., 1999). Celles que l on retrouve le plus fréquemment chez les streptocoques mutans sont les lectines, mais il y a également les antigènes I/II, les Lra I (Lipoprotein receptor antigen I), les adhésines de la matrice extracellulaire et les adhésines fimbriales (Moreillon et al., 2002). - Les interactions de type Enzyme Substrat : par exemple S. mutans produit des complexes enzymatiques : les Glycosyltransférases (GTF). Celles-ci permettent la formation de glycanes en présence du saccharose de l alimentation. Ces glycanes, très collants, se fixent de manière spécifique aux GTF, enzymes présentes sur les surfaces des autres streptocoques, ou bien sur des récepteurs présents sur la PEA, les Glucan Binding Protein (GBP). En ce qui concerne les récepteurs de la pellicule exogène acquise, au niveau des surfaces dentaires, autres que les GBP, on retrouve surtout des protéines riches en histidine et en proline(prp), le lyzozyme et l alpha-amylase (Jenkinson et Lamont, 1997 ; Brown et al., 1999). I. 1. 2. 1. 4. La colonisation Lorsque les micro-organismes sont fermement fixés, la croissance peut commencer et les bactéries se multiplier. Quelques minutes après leur fixation sur les surfaces dentaires, les bactéries pionnières sont capables d appréhender la présence d autres bactéries et synthétisent de nombreux exopolysaccharides de surface, afin de permettre à ces nouvelles espèces de coadhérer et de former des micro-colonies au niveau des surfaces dentaires. Ces micro-colonies sont à l origine du biofilm dentaire et se retrouvent prisonnières dans des couches de glycanes et de glycoprotéines salivaires. Elles sont constituées de 10 à 25 % de cellules et de 75 à 90 % d exopolymères. Les récepteurs de la PEA sont alors tous saturés et la colonisation entre dans une phase de multiplication bactérienne lente. Lorsque la densité d une même espèce est suffisamment importante, des facteurs responsables de la division cellulaires entrent en jeu et la croissance bactérienne devient exponentielle. Il s agit d un phénomène de quorum sensing, qui fait intervenir la notion de densité bactérienne et celle de déclenchement de l expression de gènes à partir d un certain seuil de densité. Il permet une communication inter-bactérienne par le biais de signaux moléculaires spécifiques et une coordination dans la croissance bactérienne. Ce EPHE Banque de Monographies SVT 12

phénomène englobe trois composants (Cvitkovitch et al., 2003) : - un signal peptidique - deux systèmes de régulation : une membrane histidine kinase une réponse régulatrice intracellulaire II régule de nombreuses activités physiologiques chez les bactéries : - les mécanismes de développement et de croissance (S. gordonii, S. pneumoniae, S. mutans). - La sporulation - La synthèse d antibiotiques (Lactococcus lactis) - La mise en place des facteurs de virulence (Staphylococcus aureus) Parmi les nombreux facteurs entrant en jeu dans le phénomène de quorum sensing chez S. mutans, le gène ComX a été reconnu comme un facteur agissant sur le développement de la compétence génétique lors du contact entre deux cellules et récemment le gène LuxS a également été découvert. Il est nécessaire pour le développement de la biosynthèse d autres molécules (AI-2), sa mutation entraîne une chute de la formation du biofilm (Cvitkovitch et al., 2003 ; Chopp et al., 2003) La complexité de l écosystème de la plaque dentaire s explique par l existence de phénomènes de coadhésion et de coagrégation. Ce sont les interactions entre chaque bactérie qui vont permettre la régulation du biofilm mature, l apparition de réseaux de canaux et la circulation des éléments nutritifs. Cette structure complexe permet le développement d une résistance aux agents extérieurs tels que les antibiotiques ou les produits de désinfection. I. 1. 2. 2. Les propriétés de surface des bactéries dans l adhésion aux surfaces La phase irréversible de l adhésion se caractérise par des interactions de courte distance, qui font intervenir les propriétés physico-chimiques des bactéries. Les interactions acide base de Lewis sont les principales, elles englobent les interactions hydrophiles et hydrophobes. Pour que la bactérie puisse établir des liaisons de type ligand - récepteur avec le substratum, elle doit pouvoir éliminer le film d eau qui la sépare de celui-ci, on évalue alors l énergie libre de surface de la bactérie. D autre part, les liaisons électrostatiques mettent en évidence le potentiel zêta qui est le résultat des forces induites par la bactérie lors de ce genre d interactions. I. 1. 2. 2. 1. L Energie Libre de Surface L Energie Libre de Surface (ELS) est une grandeur physique qui englobe les interactions de Van der Waals, les interactions électrostatiques et les interactions polaires. Lorsque la bactérie se trouve au minimum énergétique primaire, un film d eau est maintenu entre cette dernière et le substratum. D après la théorie de la thermodynamique (Weerkamp et al., 1985 ; Bos et al., 1999), EPHE Banque de Monographies SVT 13

l énergie (ΔG adh ) exercée par la bactérie pour supprimer cette couche d eau, et donc, passer d un système de deux interfaces (bactérie / liquide (γ bl ), liquide / substratum (γ ls )) à un système à une interface (bactérie / substratum (γbs)), correspond à la variation d énergie libre du système (Weerkamp et al., 1985 ;Quirynen et Bollen, 1995 ; Bos et al., 1999). ΔG adh = γ bs - (γ ls + γ bl ) Lorsque ΔG adh est négative, l adhésion bactérienne est favorisée. En effet, l ELS à laquelle est confrontée la bactérie quand elle se trouve dans un système à une interface est inférieure à l ELS présente dans un système à deux interfaces. L ELS tient compte de l ensemble des interactions de Van der Waals et des interactions acide base rencontrées par la bactérie. Cela montre l importance de cette énergie dans l adhésion bactérienne et l intérêt pour de nombreux auteurs de l étudier (Weerkamp et al., 1985 ; van Oss et al., 1986 ; Bos et al., 1999.). Owens et Wendt (1969), en se basant sur les travaux de Fowkes (1963), ont fondé le calcul de l ELS sur la séparation de l énergie libre en composantes, correspondant aux interactions apolaires (dites dispersives) (γ D ) et aux interactions polaires (γ P ) : forces de Van der Waals (interactions dipôle permanent (Keesom), dipôle induit (Debye)) et forces acide base de Lewis (liaisons hydrogènes). 1 + cos θ= 2(γ D ) 1/2 x ((γ D ) 1/2 / γ) + 2(γ P ) 1/2 x ((γ P ) 1/2 / γ) Pour ce calcul, il a été mis en place la technique de mesure d angle de contact (θ) de gouttes de liquides différent, dont les composantes dispersives et polaires sont connues. Il en ressort l équation de Young : γ lv cos θ = γ sv - γ sl En 1986, Van Oss critique ce système et propose une nouvelle approche : la composante polaire (γ AB ) est uniquement représentée par les interactions acide / base qui incluent les interactions basiques, donneuses d électrons (γ - ) et les interactions acides, accepteuses d électrons (γ + ). Parallèlement, la composante dispersive devient γ LW pour des interactions dites de «Lifshitz Van der Waals». Il en ressort une équation à trois inconnues, nécessitant donc l étude sur trois liquides : l eau, le diiodométhane et le formamide. (1 + cos θ) γ = 2[(γ LW.γ LW ) 1/2 + (γ +.γ - ) 1/2 (γ -.γ + ) 1/2 ] où γ AB = (γ -.γ + ) 1/2 I. 1. 2. 2. 2. L hydrophobicité Pour Van Oss (1996), l ensemble des interactions polaires (interaction hydrophobes) est la composante majoritaire de l ELS. En effet, lors de ses travaux en 1996, il démontre que les interactions hydrophobes peuvent être jusqu à 100 fois supérieures aux interactions de Van der EPHE Banque de Monographies SVT 14

Waals et aux interactions électrostatiques. Il est donc possible d établir une corrélation entre l ELS et l hydrophobicité. Lorsque l ELS diminue, l hydrophobicité augmente, et inversement (Weerkamp et al., 1988). Une fois établie, cela a suscité beaucoup d intérêt pour de nombreux auteurs, pour prédire l adhésion bactérienne (van Loosdrecht et al., 1987 ; Satou et al., 1988 ; Yoshida et al., 1998 ; Radford et al., 1999). L hydrophobicité d une bactérie est due en grande partie à la présence des composés de surface de la bactérie, utiles à l adhésion (Rosenberg et al., 1990). Il est alors aisé de comprendre qu une bactérie hydrophobe aura plus de facilité pour enlever le film d eau la séparant de la surface à coloniser et qu elle établira plus facilement contact avec cette surface, qu une bactérie hydrophile. Pour évaluer l hydrophobicité d une surface, deux techniques ont été développées : la mesure d angle de contact et la mesure d adhésion aux solvants. - La mesure de l angle de contact entre une goutte d eau et la surface à étudier permet une évaluation directe des propriétés hydrophobes / hydrophiles de la surface (Rosenberg et al., 1990). La surface est dite hydrophobe quand l angle est supérieur à 50 et hydrophile quand l angle est inférieur à 50. - La méthode d adhésion aux solvants (MATS) dérive d une première méthode mise au point par Rosenberg et al. (1980) qui utilisait l adhésion à l hexadécane uniquement. Bellon- Fontaine et al. (1996) et Lee et Yii (1996) ont développé cette technique avec l étude de trois solvants (hexadécane (solvant apolaire), éther (solvant polaire basique, donneur d électrons) et chloroforme (solvant polaire acide, accepteur d électrons)). La méthode MATS consiste à mettre en contact une suspension bactérienne de densité optique (DO) connue avec un solvant. Après une brusque agitation, des micro-gouttelettes de solvants se forment sur lesquelles les bactéries adhèrent, ou non, selon l hydrophobicité. Il suffit de mesurer la DO de la phase aqueuse et de déterminer le pourcentage d adhésion au solvant, à l aide de ce rapport : DO (phase aqueuse de départ) DO (phase aqueuse après mélange) DO (phase aqueuse de départ) D après les études de Lee et Yii (1996), il est permis de dire qu une bactérie est hydrophobe quand ce pourcentage est supérieur à 50%, hydrophile quand ce pourcentage est inférieur à 20% et moyennement hydrophobe quand le pourcentage est entre ces deux valeurs. Les solvants utilisés ayant pratiquement la même composante Lifshitz van der Waals, et en absence d interactions électrostatiques, les différences d adhésion bactérienne observées entre les solvants monopolaires et le solvant apolaire peuvent être attribuées aux interactions acide base. En effet, l utilisation d un tampon PBS de forte molarité (0,15M) permet de négliger les EPHE Banque de Monographies SVT 15

interactions électrostatiques (Geertsema-Doornusch et al., 1993). Si le pourcentage d adhésion au chloroforme est faible par rapport aux deux autres, la surface bactérienne présente un caractère acide et si le pourcentage d adhésion à l éther est faible par rapport aux deux autres, la surface bactérienne présente un caractère basique. Dans le cadre de l étude des propriétés de surface des solides, l hydrophobicité a également une importance dans la prédiction de l adhérence bactérienne. Il a été établi que cette propriété est en corrélation négative avec l ELS (Weerkamp et al., 1988). C est pourquoi, de nombreux auteurs préfèrent mesurer l hydrophobicité de la surface au calcul de l énergie libre de surface. Dans le cas des biomatériaux, cette mesure se fait uniquement par la technique de l angle de contact de la goutte posée décrite dans le chapitre des propriétés de surface des bactéries. I. 1. 2. 2. 3. Les interactions électrostatiques L adhésion bactérienne dépend également des forces électrostatiques (Bos et al., 1996). La force induite par les interactions électrostatiques d une bactérie et du substratum est directement liée aux structures de surface (protéines) et à la force ionique du milieu, cette force est évaluée par la mesure du potentiel zêta. Dans les milieux biologiques (salive), où le ph est neutre, les charges sont souvent négatives, il en résulte donc des interactions électrostatiques de type répulsif (Groenink et al., 1998). L évaluation du potentiel zêta s effectue classiquement grâce à une mesure de la mobilité électrophorétique des particules en suspension. La mobilité électrophorétique est évaluée soit par électrophorèse classique (Satou et al., 1988 ; Weerkamp et al., 1988), soit par électrophorèse capillaire (Glynn et al., 1998). Cette dernière technique, plus récente, semble beaucoup plus précise, puisqu elle permet notamment de détecter des variations de charges de surface entre les différentes souches d une même espèce bactérienne. En 1988, Satou et al. établissent le rôle déterminant du potentiel zêta dans l adhésion de S. mutans, alors qu il n a aucune influence sur l adhésion de S. sanguis, et Weerkamp et al. étudient l adhérence de différentes espèces bactériennes (S. mutans, S. sanguis, S. salivarius, Actinomyces viscosus et A. odontolyticus) sur l émail et la dentine humaine en fonction des potentiels zêta de chacune des surfaces. Ils concluent que la diminution de la force ionique du milieu induit une augmentation des charges des surfaces en jeu et une diminution de l adhésion bactérienne. En 1997, l étude de Busscher et al. montre que l adhésion bactérienne (Staphylococcus, Streptococcus et Candida) sur des surfaces de silicone recouvertes de salive dépend du potentiel zêta des deux types de surface en jeu et qu elle est plus importante lorsque les potentiels zêta des différentes surfaces sont plus élevés. I. 1. 2. 2. 4. La rugosité De manière générale, l accumulation de plaque dentaire est beaucoup plus importante sur les EPHE Banque de Monographies SVT 16

surfaces rugueuses que sur les surfaces lisses, tels que les alliages métalliques (Bollen et al., 1997 ;Capopreso et al., 1999). La plaque dentaire adhère non seulement en plus grande quantité, mais est également plus difficile à enlever quand la surface du matériau est irrégulière (Nassar et al., 1995 ; Quirynen et al., 1995). En effet, les rainures et autres défauts de surface entraînent une augmentation de la surface potentielle à coloniser, et sont des lieux favorables à la création de niches microbiennes. De nombreuses recherches ont donc montré que la rugosité de surface était un facteur important dans la formation et la rétention buccale (Quirynen et Bollen, 1995 ;Bollen et al., 1996 ; Rimondini et al., 1997). Pour se détacher de cette propriété de surface, il est donc préférable d utiliser des surfaces lisses polies miroir (Ra 0,1µm). Pour Bollen et al. (1997) et Zissis et al. (2000), il existe un seuil de 0,20µm en dessous duquel la rugosité n influence pas l adhésion bactérienne. Cependant, pour Bos et al. (1999), l influence de la rugosité sur l accélération de la formation du biofilm, vient essentiellement de la difficulté à nettoyer parfaitement ces surfaces rugueuses. - I. 1. 3. La carie dentaire I. 1. 3. 1. Etiologie de la carie dentaire Parmi les nombreuses maladies affectant l état de santé bucco-dentaire, la carie figure comme l une des affections les plus fréquemment rencontrées, avec les maladies parodontales (Bowen, 2002). La carie dentaire est une maladie infectieuse, transmissible et multifactorielle, où interfèrent trois facteurs : l hôte et ses défenses, l alimentation et la présence de bactéries cariogènes (Barsotti et al., 2000). La présence de chacun est indispensable à l apparition de la carie dentaire. Ce sont les acides produits par la plaque bactérienne (acide lactique et acide acétique), engendrant la dissolution du calcium et du phosphate de l hydroxyapatite, et un pouvoir tampon du milieu environnant insuffisant pour maintenir le ph au dessus de 4-5, qui induisent une déminéralisation progressive de l émail (Barsotti et Morrier.,2002). Celle-ci dépend cependant de nombreux autres facteurs, la concentration en source de carbone, le taux et l activité de la microflore, le flux salivaire et la surface dentaire (Tonger Decker et al, 2003). La rupture de l équilibre de l environnement de la cavité buccale peut s expliquer par : - Une production d acides trop importante - La présence d une salive non protectrice, car en quantité insuffisante ou de mauvaise qualité - Une synthèse peu importante d acides mais de manière fréquente, empêchant toute reminéralisation de l émail Lorsque l émail est totalement détérioré, l attaque peut atteindre la dentine puis les tissus EPHE Banque de Monographies SVT 17

pulpaires, source d atteintes endodontiques et péri-apicales. C est un processus dynamique, alternant périodes de progression et arrêts. La durée et l intensité de la période active varient fréquemment en fonction de l âge et du moment de la journée, au sein d une même population (Hamilton, 2000). Dans la cavité buccale, selon Hamilton (2000), trois types de plaques dentaires sont individualisés selon leur localisation : supra-gingivale, gingivale et sous-gingivale, mais l activité bactérienne et l apparition de caries s effectuent essentiellement au niveau de la plaque supra-gingivale (Hamilton, 2000). I. 1. 3. 2. La salive La salive est un liquide acellulaire avec un ph compris entre 6,75 et 7,25 formée essentiellement de protéines et de glycoprotéines (Marsh, 2000). La salive a très tôt été étudiée en temps que facteur pouvant influencer la minéralisation de l émail (Hicks et al., 2003), par sa composition et les flux qu elle génère (Hai, 1995 ; Lenander Lumikari, 2000). La cavité buccale est donc protégée de la carie dentaire par des constituants d origine salivaire, soit organiques, soit inorganiques. Parmi les facteurs organiques, il faut retenir la présence essentielle de protéines enzymatiques, facteurs non immunitaires, synthétisées au niveau des glandes salivaires. Présente en grande quantité, l α-amylase, par exemple, est une enzyme qui intervient lors de la digestion, et inhibe les bactéries cariogènes. Cependant dans une étude assez récente, Scannapieco et al. (1993), mettent en évidence que l α-amylase aide les bactéries à transformer le glucose en acide lactique et par conséquent, favorise la déminéralisation de l émail. Des glycoprotéines sont également présentes, telles que les mucines, qui ont le pouvoir d agglutiner les bactéries buccales. Il semble que leur capacité d agglutination soit supérieure chez les personnes cario-résistantes. Elles agissent également comme source d énergie et de carbone pour les bactéries. Parmi les constituants organiques de la salive, des lipides, issus des glandes submandibulaires, sont décelés, ils peuvent modifier l adhérence bactérienne à la dent. La salive possède aussi des facteurs inorganiques. Des concentrations importantes de calcium, de phosphate et de fluor associées à un ph élevé protègent l émail de la déminéralisation. Les ions phosphates et bicarbonates exercent un pouvoir tampon. Ils neutralisent les acides d origine bactérienne, responsables de la carie. I. 1. 3. 3. Les streptocoques mutans Le genre Streptococcus est constitué de petits cocci, de forme sphérique ou ovoïde dont le diamètre varie entre 0,5 et 2µm. Ils sont immobiles, asporulés et à Gram positif et se retrouvent en paires (culture en boîte de Pétri) ou en chaînettes (milieu liquide). Ce sont des bactéries anaérobies facultatives qui nécessitent un milieu de croissance enrichi (gélose Columbia), additionné de sang de mouton à 5% et une atmosphère avec 10% de CO 2. Leur métabolisme est EPHE Banque de Monographies SVT 18

de type fermentatif (Schlegel and Bouvet, 2000). Les streptocoques sont classés en quatre grands groupes, les streptocoques du groupe D, les streptocoques pyogènes, généralement pathogènes pour l homme, les streptocoques oraux, peu ou pas pathogènes pour l Homme et les streptocoques non classés (Schlegel et Bouvet, 2000). Les streptocoques mutans appartiennent au groupe des streptocoques oraux. I. 1. 3. 3. 1. Les streptocoques oraux Les streptocoques oraux sont regroupés, par les techniques de biologie moléculaire et de biochimie (hybridation ADN, séquençage ARN), en cinq sous-ensembles (Bouvet et al., 2000) : - S. anginosus - S. mitis - S. mutans - S. salivarius - S. pneumoniae Tous regroupent plusieurs espèces. Les streptocoques oraux sont présents dans la cavité buccale, ainsi que dans le tractus respiratoire de manière naturelle. Certaines espèces jouent un rôle prépondérant dans la formation initiale de la plaque dentaire (S. mitis, S. sanguinis, S. oralis), tandis que d autres sont plus particulièrement impliquées dans les caries dentaires (S. mutans, S. sobrinus). On peut les retrouver également, dans la flore intestinale et génito-urinaire (S. constellatus, S. intermedius, S. anginosus), où ils sont responsables d abcès du foie (S. intermedius) ou d infections génitales (S. anginosus). Quant aux S. pneumoniae, il sont à l origine de nombreuses pathologies graves chez l homme (pneumonie, meningite, otite )( Thierry et al., 2000). En routine, le diagnostic d espèce se fait grâce aux tests biochimiques et enzymatiques des galeries Rapid ID32 STREP (BioMérieux. SA). Parmi les streptocoques oraux, le groupe mutans est le plus impliqué dans l étiologie de la carie dentaire (Burne, 1998 ; Ajdic et al., 2002), particulièrement les espèces S. mutans et S. sobrinus. Elles jouent un rôle prépondérant non seulement dans l initiation de la carie mais aussi dans la progression de l attaque carieuse. Ce groupe comprend par ailleurs cinq autres espèces et se divise en huit sérotypes (a à h, selon la composition de la paroi en hydrate de carbone) et en quatre groupes génétiques par les techniques de biologie moléculaire (Whiley & Beighton, 1998 ; Barsotti & Morrier, 2002). I. 1. 3. 3. 2. L acquisition des streptocoques mutans L habitat des streptocoques mutans est la cavité buccale. Pour Caufield et al. (2000), il existe une période préférentielle de colonisation des surfaces dentaires qu ils ont appelé «fenêtre d infectiosité» : elle est comprise entre le 19 ème et le 33 ème mois et correspond à l éruption des EPHE Banque de Monographies SVT 19

molaires temporaires dont les surfaces sont favorables à l adhésion bactérienne. Cependant, récemment Wan et al. (2001) ont montré la présence fréquente (50% des cas) de streptocoques mutans dans la cavité buccale de nourrissons (<6 mois), non encore dentés. L isolement de ces streptocoques mutans est lié à une consommation importante de glucides fermentescibles, associée à une hygiène bucco-dentaire médiocre, de mauvaises habitudes alimentaires (Wan et al., 2003) et l appartenance à une catégorie socio-professionnelle défavorisée (Tanner et al., 2003). Par ailleurs, pour un même individu, l emplacement de la dent et la face considérée ont une importance lors de la colonisation par les streptocoques mutans ; les faces triturantes des molaires sont l espace le plus colonisé et les incisives centrales sont les moins colonisées (Rudney et al., 2003). L acquisition des streptocoques mutans est de deux ordres, verticale, principalement par contact maternel, la mère transmet son patrimoine microbien (>10 5 CFU/ml) à son enfant (Berkowitz, 2003), et horizontale, par contact avec d autres enfants dans les crèches, les microorganismes sont transmis d un enfant à l autre au sein d une même génération (Mattos-Graner et al., 2001 ; Tedjosasongko et Kozai, 2002). I. 1. 3. 3. 3. Les facteurs de virulence des streptocoques mutans Les streptocoques mutans sont les bactéries prédominantes de la plaque cariogène, car elles sont les mieux armées pour utiliser les glucides fermentescibles, en particulier, le saccharose de l alimentation. Ils possèdent de nombreux facteurs de virulence (Burne, 1998 ; Banas, 2004) : - leur seul habitat naturel est la surface dentaire. - ce sont des bactéries acidogènes, qui produisent des acides et aciduriques, qui survivent en milieu acide. - ils synthétisent des polysaccharides extracellulaires (PSEC), produits à partir du saccharose de l alimentation. Ces PSEC jouent un rôle prépondérent dans la cohésion des bactéries entre elles et dans leur adhérence à la surface de l émail. - ils accumulent des réserves glucidiques intracellulaires, de type glycogène, lorsqu il y a abondance de glucides dans l alimentation et utilisent ces réserves en période de carence alimentaire. - ils possèdent de nombreuses adhésines, permettant une meilleure fixation aux surfaces dentaires et aux autres espèces / genres bactériens. L adhérence des streptocoques mutans aux surfaces dentaires est à la fois saccharose - dépendante et saccharose indépendante. I. 2. Métaux et alliages métalliques utilisés en orthodontie I. 2. 1. Généralités EPHE Banque de Monographies SVT 20