Guide d Interprétation Petrifilm Série 2000 Test pour la numération rapide des Coliformes Ce document est destiné à vous apporter une aide pour l'interprétation des résultats obtenus à partir des tests 3M TM Série 2000 Numération rapide des coliformes (ou RCC : Rapid Coliform Count). Il prend en compte les trois méthodes de dénombrement des coliformes les plus largement reconnues. L AOAC International et la FDA (Food and Drug Administration) / BAM (Bacteriological Analytical Manual) définissent les coliformes comme des bâtonnets Gram négatif produisant de l acide et du gaz par fermentation métabolique du lactose. Grâce à cette production d acide, l indicateur de ph inclus dans le milieu passe de l orange au jaune. Ceci correspond à la présence d un coliforme présumé. La présence de bulles de gaz autour des colonies indique un coliforme confirmé. L ISO définit les coliformes par leur capacité à se développer sur un milieu spécifique. La méthode ISO 4832, numération des coliformes par comptage des colonies, définit les coliformes par la taille de la colonie et la production d acide sur milieu VRBL (Violet Red Bile Lactose). Sur les tests 3M Petrifilm RCC, les coliformes sont caractérisés par des zones jaunes d acidification ou des colonies rouges associées ou non à des bulles de gaz. La méthode ISO 4831, numération des coliformes par la technique du Nombre le Plus Probable (NPP), définit les coliformes par leur capacité à se développer et à produire du gaz par fermentation du lactose dans un bouillon sélectif. Sur le test 3M Petrifilm RCC, les colonies de coliformes sont rouges et associées à des bulles de gaz. L AFNOR a validé le test 3M Petrifilm RCC par comparaison aux méthodes ISO 4831 et 4832. 1 2 (après 6 heures d incubation) Dénombrement des coliformes par comptage des zones acides (6-14h) Les zones jaunes d acidification peuvent commencer à apparaître dès 6h d incubation. Si des coliformes sont présents, ces zones apparaîtront et vont diffuser tout au long de l incubation. Interprétation par comparaison à la méthode AOAC/BAM : Dénombrer les zones jaunes d acidification, avec ou sans colonies rouges visibles, pour obtenir le nombre de coliformes présumés. Interprétation par comparaison à la méthode ISO 4832 (VRBL) : Compter les zones jaunes d acidification avec ou sans colonies rouges visibles comme coliformes. Les résultats définitifs sont obtenus après 14h ± 30 min. d incubation (méthode validée par l AFNOR). (après 14 heures d incubation) Dénombrement des colonies de coliformes (8-24h) Des colonies rouges avec ou sans gaz peuvent commencer à apparaître à partir de 8h et continuer à se développer pendant toute la durée de l incubation. Interprétation par comparaison à la méthode AOAC / BAM : Compter les colonies rouges associées à des bulles de gaz, quel que soit le moment où elles apparaissent, comme coliformes confirmés. Interprétation par comparaison à la méthode ISO 4831 (NPP) : Dénombrer les colonies rouges associées à des bulles de gaz. Les résultats définitifs sont obtenus après 24h ± 2h (méthode validée par l AFNOR, sauf pour les produits de charcuterie). Interprétation par comparaison à la méthode ISO 4832 (VRBL) : Dénombrer toutes les colonies rouges associées ou non à des bulles de gaz. Les résultats définitifs sont obtenus après 24h ± 2h d incubation (méthode validée par l AFNOR).
Les résultats d une lecture précoce de la Petrifilm RCC (estimée par la production bactéries, de leur état métabolique et de Nombre de coliformes = 0 3 Dénombrement des zones jaunes d acidification (6-14h) : Notez l évolution de la couleur de la gélose entre les photos 3 et 10. Au fur et à mesure que les bactéries produisent de l acide, le gel d abord rouge-orange devient orange-jaune. Une forte concentration de coliformes (>1000 CFU/test 3M Petrifilm RCC) peut provoquer un jaunissement de toute la gélose après 4h d incubation. Voir photo 4. Dans ce cas, des résultats précis seront obtenus en poursuivant les dilutions de l échantillon. Certaines souches de coliformes produisent beaucoup d acide. Dans ce cas, la fusion des zones jaunes d acidification peut intervenir à partir de 20 colonies présentes sur le test 3M Petrifilm RCC. Une estimation peut être faite si plus de 50 zones jaunes d acidification distinctes sont présentes sur le test 3M Petrifilm RCC : la surface de la gélose du test 3M Petrifilm RCC est d environ 20 cm 2. Une estimation peut être réalisée en comptant les colonies présentes sur un ou plusieurs carrés représentatifs, en calculant la moyenne, puis en la multipliant par 20. Il y a 6 zones jaunes d acidification dans le carré mis en évidence sur la photo 5. Les colonies rouges deviendront visibles au sein des zones jaunes d acidification au fur et à mesure que les coliformes se développent. Voir photo 6. Nombre de coliformes : incomptable (nombre réel > 10 5 ) 4 Nombre estimé de coliformes = 120 5 Nombre estimé de coliformes = 280 6
croissance bactérienne sur le test 3M d acide et de gaz) dépendent du type de leur concentration. Dénombrement des colonies (8-24h) : Les photos 7 et 8 montrent les résultats obtenus à partir de 2 microorganismes différents inoculés à des concentrations équivalentes et incubés pendant une même durée. Des colonies rouges distinctes avec des zones jaunes d acidification apparaissent sur les deux tests 3M Petrifilm RCC. Les microorganismes sur la photo 8 ont produit du gaz plus rapidement que ceux de la photo 7. Le dénombrement des colonies avec ou sans gaz sera ou non effectué en fonction de la méthode choisie comme référence. Une bulle de gaz est associée à une colonie lorsqu elle est distante de la colonie d au maximum un diamètre de cette dernière ou quand plusieurs petites bulles forment un cercle autour de la colonie. Voir cercles 1 et 2 sur la photo 7. *La photo 9 est un autre exemple de dénombrement des colonies avec ou sans gaz. Celui-ci dépend de la méthode de référence choisie : Par comparaison à la méthode AOAC / BAM, les colonies de coliformes confirmés, c est-à-dire gazogènes, sont au nombre de 72. Par comparaison à la méthode ISO 4831 (NPP), les colonies de coliformes gazogènes sont au nombre de 72. Par comparaison à la méthode ISO 4832 (VRBL), les colonies de coliformes, gazogènes ou non, sont au nombre de 128. Lorsque le nombre de colonies par test 3M Petrifilm RCC est supérieur à 150, il est possible de l estimer. Ne pas compter les colonies se développant sur la mousse car elles ne sont pas en contact avec les agents sélectifs du milieu. Voir photos 7 à 10. Estimation du nombre de coliformes = 240 10 (voir texte pour la numération des coliformes)* 9 1 2 Nombre de coliformes gazogènes = 64 7 Nombre de coliformes gazogènes = 164 8
Tests 3M Petrifilm RCC incomptables (>1000 colonies / Test) Coliformes incomptables (nombre réel > 10 4 ) 11 Coliformes incomptables (nombre réel > 10 3 ) 12 Un test 3M Petrifilm RCC incomptable peut être identifié par une ou plusieurs de ces caractéristiques : 1/ Gel rouge-orange devenant rouge-jaune. 2/ Nombreuses petites colonies. 3/ Nombreuses bulles de gaz. Le test 3M Petrifilm RCC est incomptable car : 1/ Le gel a changé de couleur. 2/ Il y a de nombreuses petites colonies. Coliformes incomptables (nombre réel > 10 4 ) Sur la photo 13, le nombre de colonies est si important que celles-ci ne peuvent être visualisées. Un changement de couleur du gel vers le jaune et les nombreuses bulles de gaz indiquent que le test 3M Petrifilm RCC est incomptable. 13 Nombre de coliformes = 0 La photo 14 montre un test 3M Petrifilm RCC avec un nombre important de colonies Gram (-) non coliformes. Lorsqu il y a beaucoup de bactéries ne fermentant pas de lactose, le gel peut virer au rouge sombre. 14
ph : Le ph de croissance optimum de la plupart des bactéries se situe autour de 7.0. L analyse des produits acides ou basiques nécessite l ajustement du ph des dilutions entre 6.5 et 7.5 avant d inoculer le test 3M Petrifilm RCC. Les photos 15 et 16 montrent les résultats obtenus après l analyse de yaourt frais inoculé après ajustement du ph. La présence d inhibiteurs dans le milieu empêche la croissance des cultures de ferments Gram (+), mais l acide produit lors du développement de ces bactéries peut changer la couleur de fond du gel de rouge-orange à l orange-jaune, et prendre l aspect d un test incomptable. Observer les tests 3M Petrifilm RCC contenant une culture de yaourt frais au cours de l incubation pour obtenir plus d indications sur une éventuelle croissance des coliformes. Nombre de coliformes = 0 15 Nombre de coliformes = 4 Comparer le test 3M Petrifilm RCC ci-dessus ne contenant pas de colonies avec le test incomptable de la page précédente (photo 11). Sur la photo 15, noter l absence de colonies ou de bulles de gaz qui indiqueraient, si elle étaient présentes, un résultat incomptable. Malgré le changement de couleur du gel, l acide produit par les coliformes est facilement visible, comme le montre la photo 16. Produit : Les débris d aliments ont souvent une forme irrégulière et ne sont pas associés à des bulles de gaz 16 1 2 Nombre de coliformes confirmés = 11 17 Nombre de coliformes = 10 18 La photo 17 représente un test 3M Petrifilm RCC inoculé avec une dilution de paprika et lu quelques heures après incubation. Le cercle 1 montre une zone acide autour d un débris d aliment rouge. Certains aliments peuvent contenir des débris acides de forme irrégulière qui réagissent avec l indicateur de ph. Le cercle 2 montre une bulle proche d un débris d aliment de forme irrégulière, mais pas de zone acide. Il ne s agit dans aucun des deux cas de colonie de coliformes. La photo 18 montre une dilution de chocolat. Quelquefois, le gaz produit par la colonie fait éclater celle-ci qui se retrouve disséminée autour de la bulle de gaz, comme il est montré dans le cercle. La production d acide autour de la bulle est un autre indicateur de la présence d une colonie de coliformes.
Petrifilm Test 3M Petrifilm Série 2000 Numération rapide des Coliformes Se reporter à la notice d utilisation pour des informations détaillées concernant les points suivants : mises en garde, garantie, recours, stockage et destruction. Fiche d Utilisation Stockage Petrifilm Petrifilm 1 Mettre au réfrigérateur les poches fermées à une température 8 C ( 46 F). Utiliser les tests 3M Petrifilm RCC avant la date d'expiration indiquée sur la poche. 2 Pour refermer les poches, replier l'extrémité et fermer à l'aide d'un ruban adhésif. 3 Garder les poches entamées à une température 25 C ( 77 F). Ne pas les placer au réfrigérateur. Utiliser les tests 3M Petrifilm RCC dans le mois qui suit l'ouverture de la poche. Préparation 4 Le lait entier et écrémé peut être inoculé directement. Les autres produits alimentaires et laitiers doivent être dilués au 10 ème avant d être inoculés. Peser ou pipeter le produit dans un récipient stérile (sac stomacher, bouteille, sac Whirl-Pack ou autre). 5 Ajouter la quantité nécessaire de l'un des diluants suivants : tampon phosphate Butterfield (tampon phosphate IDF, KH2PO4 à 0,0425 g/l, ajuster le ph à 7,2), eau peptonée à 0,1%, peptone sel (méthode ISO 6887), solution saline (0,85-0,90%) ou eau distillée. 6 Broyer ou homogénéiser l'échantillon en utilisant la procédure habituelle. Ne pas utiliser de tampons contenant du citrate de sodium ou du thiosulfate de sodium. Ajuster le ph de l échantillon entre 6,5 et 7,5. Pour les produits acides, utiliser NaOH 1N. Pour les produits alcalins, utiliser HCI 1N. Ensemencement 7 Placer le test 3M Petrifilm RCC sur une surface plane. Soulever le film supérieur 8 Avec une pipette tenue perpendiculairement au test 3M Petrifilm RCC, déposer 1 ml de l'échantillon, ou de l'échantillon dilué au centre du film inférieur. 9 Recouvrir délicatement avec le film supérieur de manière à éviter l'introduction de bulles d'air. Ne pas laisser le film supérieur retomber brutalement.
10 Placer le diffuseur, face lisse vers le bas, au centre du film supérieur, au niveau de l'inoculum. 11 Etaler l'échantillon en exerçant une légère pression sur le diffuseur. Ne pas tourner ou faire glisser le diffuseur. 12 Retirer le diffuseur. Attendre au minimum 1 minute pour permettre au gel de se solidifier. Incubation Interprétation <70 F 13 Incuber les tests 3M Petrifilm RCC à l'horizontale, le film supérieur vers le haut, sans empiler plus de 20 unités, à 35 C ± 1 C* pendant 24h ± 2h, examiner les tests 3M Petrifilm RCC à intervalles réguliers selon l information désirée (voir notice d utilisation). *Voir notice d utilisation pour les conditions d incubation particulières relatives aux produits de charcuterie (Validation AFNOR). 14 Lire les tests 3M Petrifilm RCC à la lumière du jour pour une détection rapide des zones acides, et avec un stylo compteur de colonies type Quebec ou un autre système permettant une amplification visuelle pour énumérer les colonies rouges, avec bulles de gaz. Se référer au guide d'interprétation pour la lecture des résultats. 15 Pour isoler une colonie en vue d une identification plus poussée, soulever le film supérieur et prélever la colonie. Remarques L interprétation des colonies de coliformes sur le test 3M Petrifilm RCC varie selon les méthodes approuvées : se référer à la notice d utilisation.
3M TM Flore Totale 3M TM - Réf. : 06400 / 100 Unités - Réf. : 06406 / 1000 Unités Pour la numération des Enterobacteriaceae 3M TM Coliformes - Réf. : 06420 / 50 Unités - Réf. : 06421 / 1000 Unités - Réf. : 06410 / 50 Unités - Réf. : 06416 / 1000 Unités 3M TM Levures et Moisissures - Réf. : 06407 / 100 Unités - Réf. : 06417 / 1000 Unités 3M TM Serie 2000 Pour la numération rapide des coliformes - Réf. : 06402 / 50 Unités - Réf. : 06412 / 500 Unités 3M TM Haute sensibilité pour la numération des coliformes - Réf. : 06405 / 50 Unités - Réf. : 06415 / 500 Unités 3M TM Escherichia coli et coliformes - Réf. : 06404 / 50 Unités - Réf. : 06414 / 500 Unités For Europe, please contact Laboratoires 3M Santé Tél. : (33) 1 30 31 85 71 - Fax : (33) 1 30 31 85 78 Département Microbiologie Laboratoires 3M Santé Boulevard de l Oise 95029 Cergy-Pontoise Cedex Tél. : 01 30 31 85 77