UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS

UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences, Technologie INSERM U618 THÈSE présentée par : Agnès MAILLET soutenue le : 27 novembre 2008 pour obtenir le grade de : Docteur de l Université François - Rabelais Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé EFFET THÉRAPEUTIQUE DU CETUXIMAB ADMINISTRÉ PAR AÉROSOL DANS UN MODÈLE ANIMAL DE TUMEUR BRONCHO-PULMONAIRE Importance du récepteur FcRn dans la réponse anti-tumorale à cet anticorps THÈSE dirigée par : M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours Co-encadrement par : Mme HEUZÉ-VOURC H Nathalie Chargée de Recherche 2 ème classe - INSERM, Tours RAPPORTEURS : M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes JURY : M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes M. BERHENS Christian Chef de projet, LFB Biotechnologies, Les Ulis M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI M. DIOT Patrice Professeur, Université François - Rabelais, Tours M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours M. OHRESSER Marc Ingénieur de Recherche - CNRS, Université François - Rabelais, Tours

UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences, Technologie INSERM U618 THÈSE présentée par : Agnès MAILLET soutenue le : 27 novembre 2008 pour obtenir le grade de : Docteur de l Université François - Rabelais Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé EFFET THÉRAPEUTIQUE DU CETUXIMAB ADMINISTRÉ PAR AÉROSOL DANS UN MODÈLE ANIMAL DE TUMEUR BRONCHO-PULMONAIRE Importance du récepteur FcRn dans la réponse anti-tumorale à cet anticorps THÈSE dirigée par : M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours Co-encadrement par : Mme HEUZÉ-VOURC H Nathalie RAPPORTEURS : Chargée de Recherche 2 ème classe - INSERM, Tours M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes JURY : M. BARBET Jacques Directeur de Recherche - CNRS, Université de Nantes M. BERHENS Christian Chef de projet, LFB Biotechnologies, Les Ulis M. CADRANEL Jacques Professeur, Université Paris VI M. DIOT Patrice Professeur, Université François - Rabelais, Tours M. LEMARIÉ Etienne Professeur, Université François - Rabelais, Tours M. OHRESSER Marc Ingénieur de Recherche - CNRS, Université François - Rabelais, Tours

REMERCIEMENTS Cette thèse a été réalisée au sein de l unité INSERM U618, dans l équipe «Aérosols et Cancer broncho-pulmonaire», à la Faculté de Médecine de l Université François-Rabelais de Tours, sous la direction du Professeur Etienne LEMARIÉ et du Docteur Nathalie HEUZÉ- VOURC H. Je tiens particulièrement à remercier Nathalie HEUZÉ-VOURC H, ma co-encadrante de thèse, avec qui j ai beaucoup appris pendant ces trois années de thèse aussi bien sur le plan scientifique que sur le plan humain. Nathalie, merci pour ta gentillesse, ta bonne humeur, ta présence et ton soutien permanent. Je suis très heureuse d avoir été «cobaye» pour ta première thèse et espère que tu auras aimé autant que moi l équipe que nous avons formée pendant ces trois années! Je remercie également le Professeur Etienne LEMARIÉ, mon directeur de thèse, pour l approche clinique qu il a apportée à nos nombreuses réflexions et pour sa bienveillance. J adresse mes plus sincères remerciements aux membres du jury, le Docteur Jacques BARBET et le Professeur Jacques CADRANEL qui me font l honneur d être les rapporteurs de ma thèse, le Docteur Christian BEHRENS, le Professeur Patrice DIOT et le Docteur Marc OHRESSER qui ont accepté de juger cette thèse. Je remercie les différents organismes qui ont financé cette thèse et qui ont permis qu elle existe. La SPLF, Pneumologie et Développement et l ARAIR pour le soutien financier de la thèse mais également l INSERM, le Ministère de la Recherche, l IFR 135, le Cancéropôle Grand Ouest et la Ligue Contre le Cancer.

Je tiens également à remercier toutes les personnes avec qui nous avons collaboré pendant ces trois années. Ça a été un réel plaisir pour moi de partager leur expérience et leur savoir faire : - Laurent GUILLEMINAULT qui a mis de côté sa blouse de médecin pour venir travailler à nos côtés pendant un an. J ai beaucoup aimé travailler avec toi pendant ces quelques mois où tu es venu agrandir la petite famille «cetuximab» et ton regard de clinicien a été de précieux conseils! - l équipe du CIPA d Orléans avec qui nous avons fait une grande majorité des expérimentations animales : Alain LE PAPE, Stéphanie LERONDEL, Maryline LEMÉE, Stéphanie RÉTIF, Sabrina PESNEL et Julien SOBILO. Merci d avoir chouchouté nos animaux! - les équipes 6 et 7 de l UMR CNRS 6239-GICC de Tours avec qui nous avons étroitement collaboré et qui nous ont approvisionné en cetuximab (vue notre consommation, ce n était pas négligeable!) : Nicolas CONGY-JOLIVET et Gilles THIBAULT pour nous avoir gentiment aidés sur les études de cytométrie en flux, Gilles PAINTAUD et Nicolas AZZOPARDI pour leur précieuse aide sur la pharmacocinétique, Marc OHRESSER pour les différentes constructions plasmidiques FcRn α et β2m et Hervé WATIER, Marie-Cécile ROUSSANNE et Charlotte MAGDELAINE pour leurs conseils avisés tout au long de ce projet. - les collègues du bâtiment M : Sandrine LEGUELLEC et Laurent VECELLIO pour leur gentillesse, leur grande disponibilité et leurs conseils sur les aérosols, Jérome MONTHARU et Georges ROSEAU (du PPF animalerie) pour la bonne humeur qu ils ont apportée aux expérimentations animales et Michèle DE MONTE pour ses conseils sur les études statistiques. - Serge GUYETANT, Claire BLÉCHET, Sandra REGINA et Catherine COCO pour la collecte des prélèvements pulmonaires et des données anatomo-pathologiques et cliniques. Merci d avoir pris le temps pour les études immunohistochimiques et pour l analyse des données clinico-pathologiques des patients.

- le laboratoire Novaxia dirigée par Brigitte LEGRAIN et le docteur Dominique-Henri DOUVIN pour les analyses anatomo-pathologiques des prélèvements de souris. - José HUREAUX du CHU d Angers pour m avoir formée pour les premières aérosolisations chez la souris et Isabelle Valo pour les études anatomopathologiques. - Serge BERNARD et Hervé LEROUX de l INRA de Nouzilly qui nous ont gentiment accueillis dans leur laboratoire pour l étude de tolérance. - Jacques BARBET et Alain FAIVRE-CHAUVET de l INSERM U892 de Nantes pour le marquage du cetuximab à l iode 125. - le laboratoire du LFB Biotechnologies pour la purification de l anticorps anti-fcrn α. - Anthony COURTOIS du laboratoire de Biotechnologie et Molécules Marines de Brest pour le marquage du cetuximab au FITC. - le Professeur ANTHONIOZ et Claudine PROUIN du laboratoire de cytologie du CHU Bretonneau pour leur gentillesse. - Patrick VOURC H pour nous avoir fait partager son expérience sur les études épigénétiques. - Yves COURTY pour ses conseils avisés en biologie moléculaire, Pascale REVERDIAU et Sophie IOCHMANN pour leur expérience sur les modèles animaux et la méthylation. - Sophie HAMARD, Jérôme JAILLET, Christelle PARENT et Nathalie RICHE, pour leur bonne humeur, leur gentillesse et leur aide technique et diverse

de côtoyer : Ainsi que toutes les personnes du bâtiment 47C et de l équipe 3A que j ai eu la chance Sylvie ATTUCCI, Martine BERTON, Camille BIANCHI, Eric BOISSINOT, Michèle BRILLARD, Jacques CHANDENIER, Sandrine DALLET-CHOISY, Elisabeth DIOT, Patrice DIOT, Annick ESNARD, Frédéric ESNARD, Michèle FERRER, Francis GAUTHIER, Daniel GRIMBERT, Yves GRUEL, Gilles LALMANACH, Valérie LEBLOND, Fabien LECAILLE, Caroline MAJORAL, Sylvain MARCHAND-ADAM, Emmanuelle MERCIER, Thierry MOREAU, Chantal VALAT, Marie-Louise ZANI. Et particulièrement mes co-thésards et collègues ATER avec qui j ai passé de très bons moments au labo, au Ptit Bota, au squash et ailleurs! Kévin BARANGER, Guillaume GAUD, Alexandre GAUTHIER, Florian VEILLARD et aussi Mireille AINCIBURU, Benjamin BRILLET, Sandrine CASTELLA, Gwenhael JEGOT, Timofey KALUPOV, Valentine PANEL, Hélène SERRANO. Ainsi que les nouveaux et les anciens que j oublie sûrement Pour finir un grand merci à mes parents, mes frères, mes grands-parents et toute ma famille, mes amis et bien sûr Nico pour leur présence et leur soutien inconditionnel... Merci à tous!

RÉSUMÉ Le but de cette étude a été d évaluer l intérêt de l aérosolthérapie d anticorps monoclonaux (AcM) dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (CBNPC) à travers l exemple du cetuximab, un AcM anti-egfr. L expression du récepteur FcRn, élément essentiel dans la pharmacocinétique et la biodistribution des IgGs thérapeutiques a également été étudiée dans le CBNPC. Nos résultats démontrent que l AcM peut résister aux contraintes physiques de la nébulisation. Les données de biodistribution et pharmacocinétique, obtenues dans le modèle animal mis en place, indiquent que suite à une administration pulmonaire, l Ac s accumule de façon précoce et prolongée au niveau pulmonaire chez l animal et qu il passe lentement et faiblement dans le compartiment sanguin. De plus, les tumeurs chez la souris paraissent sensibles à l aérosolthérapie avec du cetuximab. L analyse au niveau transcriptionnel et protéique du récepteur FcRn chez des patients atteints d un CBNPC a révélé que le récepteur est moins exprimé, au niveau transcriptionnel, dans le tissu tumoral que dans le tissu sain adjacent à la tumeur. Cette altération de l expression pourrait être consécutive à l hyperméthylation du promoteur de ce gène. Mots-clés : cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules, aérosolthérapie, anticorps thérapeutiques, récepteur FcRn.

ABSTRACT The project aims at determining whether aerosoltherapy is well suited for monoclonal antibodies (Mab), in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC). In addition, exploration of the expression of FcRn, an IgG receptor contributing to increased half-life and biodistribution of Mab, has been studied in NSCLC. Using cetuximab, an anti-egfr Mab as a model, we showed that Mab resist the physical constraints of nebulization. Biodistribution and pharmacokinetic analyses, using a murine model that we established, revealed that cetuximab is highly and durably accumulated within the lungs and is slowly and weakly released into the bloodstream following airways delivery. Moreover, animal tumors seem sensitive to cetuximab aerosoltherapy. Altogether, our findings highlight the interest of Mab aerosoltherapy for NSCLC treatment. Expression analysis of FcRn at both the transcript and protein levels showed that the receptor is downregulated in NSCLC. FcRn alteration of expression in the tumor might be due to hypermethylation of the gene promoter as often found in cancer. Keywords : non small cell lung cancer, aerosoltherapy, therapeutic antibody, FcRn receptor.

ABRÉVIATIONS Ac : anticorps ADN : acide désoxynucléique ADNg : ADN génomique AMM : autorisation de mise sur le marché ARN : acide désoxyribonucléique ARNm : ARN messager ASC : aire sous la courbe BSA : bovine serum albumin β2m : β2-microglobuline CBNPC : cancer bronchique non à petites cellules CBPC : cancer bronchique à petites cellules CMH : complexe majeur d histocompatibilité CV : coefficient de variation Ct : threshold cycle DAB : diaminobenzydine DAMM : diamètre aérodynamique médian en masse dntp : désoxyribonucléoside triphosphate DPI : dry powder inhaler EDTA : acide éthylène-diamine-tétraacétique EGF : epidermal growth factor EGFR : epidermal growth factor receptor ELISA : enzyme linked immunosorbent assay FcRn : neonatal Fc receptor FITC : fluoresceine isothiocyanate HRP : horseradish peroxydase i.p. : intrapéritonéale i.v. : intraveineuse Ig : immunoglobuline

kb : kilobase kda : kilodalton MDI : metered dose inhaler PBS : tampon phosphate de sodium PCR : polymerase chain reaction PVDF : polyvinylidene fluoride Q-PCR : PCR quantitative RT : transcription reverse rpm : révolutions par minute SDS : sodium dodécyl sulfate SDS-PAGE : sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Tc 99m : Technetium 99m TKI : tyrosine kinase inhibitor TMA : tissue micro-arrays TNM : tumor node metastasis Tris : tri-(hydroxylméthyl)-amino-méthane U : unité VEGF : vascular endothelial growth factor

TABLE DES MATIÈRES Liste des Figures...12 Liste des Tableaux...14 Listes des Annexes...15 AVANT-PROPOS...16 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE...19 Chapitre I : le cancer broncho-pulmonaire...20 I - Rappel : anatomie des voies respiratoires...20 I.1 - Anatomie du poumon normal...20 I.2 - Les voies respiratoires...20 II - Epidémiologie et étiologie du cancer broncho-pulmonaire...24 III - Le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules...26 IV- Carcinogenèse bronchique...27 V- Traitements actuels du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules...31 V.1 - Thérapies conventionnelles...31 V.2 - Thérapie ciblée...32 Chapitre II : l aérosolthérapie...34 I - Principe de l aérosolthérapie...34 II - Avantages de l aérosolthérapie...35 III - Problématiques de l aérosolthérapie...35 III.1 - Stabilité du médicament...35 III.2 - Dépôt du médicament...36 III.3 - Tolérance et efficacité du médicament...37 IV- Aérosolthérapie et pathologies pulmonaires...38 IV.1 - Généralités...38 IV.2 - Aérosolthérapie et cancer...39 Chapitre III : les anticorps thérapeutiques...42 I - Généralités...42 I.1 - Structure des anticorps...42 I.1a - Les anticorps «naturels»...42 I.1b - Les anticorps à visée thérapeutique...43 I.2 - Pharmacologie des Ac thérapeutiques et de leurs dérivés...47 I.2a - Pharmacodynamie des anticorps thérapeutiques...47 I.2a α - Mécanisme Fab dépendant : Fixation directe et neutralisation...47 I.2a β - Mécanisme Fc dépendant...48 I.2a γ - Pharmacodynamie des anticorps conjugués...49 I.2b - Pharmacocinétique des anticorps thérapeutiques...49 II - Les anticorps thérapeutiques anticancéreux...53 II.1 - Les anticorps approuvés aujourd hui en oncologie...53

II.2 - Les anticorps ciblant l EGFR...54 III - Le cetuximab (C225 ou Erbitux )...56 III.1 Rappel : la voie de signalisation de l EGFR...56 III.1a - Structure du récepteur...56 III.1b - Voies de signalisation de l EGFR...57 III.1c - EGFR et cancer...57 III.2 - Liaison du cetuximab à l EGFR...58 III.3 - Mode d action du cetuximab...60 III.3a - Arrêt du cycle cellulaire...60 III.3b - Effet anti-angiogénique, effet anti-métastatique...60 III.3c - Effet anti-apoptotique...60 III.4 - Indications du cetuximab et études cliniques...61 III.4a - Indications du cetuximab...61 III.4b - Toxicité et effets secondaires...61 III.4c - Facteurs prédictifs de réponse au cetuximab...61 III.4d - Etudes cliniques...62 Chapitre IV : le récepteur FcRn...64 I - Structure et présentation générale...64 I.1 - Structure du récepteur FcRn...64 I.2 - Localisation chromosomique et organisation génique des gènes FCGRT et β2m...65 I.3 - Liaison au domaine Fc des IgGs...67 I.4 - Homologie de séquence inter-espèces...67 II - Expression tissulaire et fonctions...67 II.1- Profil d expression du récepteur FcRn...67 II.2 - Rôles du récepteur FcRn...68 PARTIE I : PROPRIETES AERODYNAMIQUES, IMMUNOLOGIQUES ET PHARMACOLOGIQUES DU CETUXIMAB APRES AEROSOLISATION...70 I -Etude des propriétés aérodynamiques du cetuximab nébulisé...73 II -Etude in vitro des propriétés immunologiques et pharmacologiques du cetuximab nébulisé...74 III -Résultats et discussion...75 PARTIE II : BIODISTRIBUTION, PHARMACOCINETIQUE ET EFFICACITE DU CETUXIMAB ADMINISTRE PAR AEROSOL DANS UN MODELE ANIMAL DE TUMEUR BRONCHO-PULMONAIRE...86 Matériels et Méthodes...88 I - Etudes in vitro - Validation de l aérosolisation du cetuximab...90 I.1 - Préparation du cetuximab...90 I.1a - Concentration du cetuximab...90 I.1b - Nébulisation du cetuximab...90 I.2 - Culture cellulaire...91 I.3 - Cytométrie en flux...91 I.4 - Prolifération cellulaire...91 I.5 - Western-blot...91 II - Etudes in vivo...92 II.1- Protocoles...92 II.1a - Ethique...92 II.1b - Souris...92

II.1c - Sacrifices / euthanasie...92 II.2- Technique d aérosolisation...93 II.3 - Toxicité du cetuximab administré par aérosol chez la souris...93 II.3a - Traitement des souris...93 II.3b - Suivi des souris, analyses hématologique et histologiques post-mortem...94 II.4 - Mise en place d un modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire ectopique sensible au cetuximab.96 II.4a - Préparations cellulaires...96 II.4b - Administrations intrabronchiques...96 II.4c - Suivi de la croissance tumorale...97 II.4c α - Tomodensitométrie thoracique...97 II.4c β - Analyse histologique...97 II.4d - Sensibilité du modèle vis-à-vis du cetuximab...97 II.5 - Biodistribution du cetuximab administré par aérosol...98 II.5a - Marquage du cetuximab avec le Xenofluor-750...98 II.5b - Analyse de l affinité du cetuximab-xenofluor-750 pour l EGFR...98 II.5c - Etude de la biodistribution du cetuximab par imagerie infrarouge...99 II.5c α - Principe de l imagerie infrarouge...99 II.5c β - Capacité du cetuximab-xenofluor750 à fixer les cellules A431 in vivo 100 II.5c γ - Biodistribution du cetuximab administré par différentes voie.....100 II.6 - Pharmacocinétique du cetuximab administré par aérosol.....101 II.6a - Administration du cetuximab-xenofluor750...101 II.6b - Prélèvements sanguins.101 II.6c - Dosage du cetuximab...102 II.6c α - Principe et procédure..102 II.6c β - Validation du dosage.. 102 II.6d - Analyse pharmacocinétique.103 II.7- Efficacité du cetuximab administré par aérosol.....103 III Statistiques...103 Résultats...105 I - Validation de l aérosolisation du cetuximab par le Microsprayer TM... 107 I.1 - Validation de l aérosolisation du cetuximab par le Microsprayer TM in vitro...108 I.1a - Effet de la nébulisation par le Microsprayer TM et de la concentration sur la solution de cetuximab...108 I.1b - Reconnaissance et affinité pour l EGFR du cetuximab concentré ou aérosolisé par le Microsprayer TM...109 I.1c - Inhibition de la prolifération cellulaire par le cetuximab concentré ou aérosolisé par le Microsprayer TM...110 I.1d - Inhibition de la phosphorylation de l EGFR par le cetuximab aérosolisé par le Microsprayer TM..111 I.2 - Validation de l aérosolisation du cetuximab par le Microsprayer TM in vivo : efficacité du dépôt pulmonaire de cetuximab et étude de sa toxicité par administration pulmonaire chez la souris...112 I.2a - Décès des animaux...113 I.2a α Hémorragies liées au geste.113 I.2a β Décès sans explication après analyse histologique...113 I.2b - Dépôts pulmonaires...114 II.2c - Suivi des animaux et analyse histologique post-mortem...115 II - Etablissement d un modèle animal de tumeur broncho-pulmonaire ectopique sensible au cetuximab... 118 II.1 - Mise en place du modèle animal...119 II.2 - Homogénéisation des lots de souris en fonction de la taille des tumeurs...122 II.3 - Sensibilité des tumeurs au cetuximab...124 III - Biodistribution du cetuximab administré par aérosol... 125 III.1 - Validation du marquage du cetuximab avec le Xenofluor750 TM...125

III.2 - Etude de la biodistribution du cetuximab par imagerie infrarouge...127 III.2a Administration par voie intraveineuse...127 III.2b Administration par voie inhalée...129 III.2c Administration par voie intrapéritonéale...131 IV - Pharmacocinétique du cetuximab administré par aérosol... 134 V- Efficacité du cetuximab administré par aérosol... 137 Discussion... 140 PARTIE III : EXPRESSION DU RECEPTEUR FCRN DANS LE CANCER BRONCHO-PULMONAIRE NON A PETITES CELLULES... 147 Matériels et Méthodes... 150 I - Matériel biologique... 152 I.1 - Prélèvements tissulaires...152 I.2 - Lignées cellulaires...153 II - Analyse des transcrits de la chaîne α du récepteur FcRn et de la β2-microglobuline... 153 II.1 - Préparation des ARN...153 II.2 - Transcription inverse...154 II.3 - Réactions de PCR quantitatives en temps réel...156 II.3 a - Principe...156 II.3 b - Mode opératoire...158 II.3 c - Etablissement des courbes d étalonnage...158 II.3 d - Contrôles de la spécificité de l amplification...160 III - Analyse de l expression protéique de la chaîne α du récepteur FcRn... 161 III.1 - Préparation des échantillons...161 III.2 - Localisation de l expression de la protéine FcRn α par immunohistochimie...161 IV - Etude de la méthylation du gène FCGRT... 162 IV.1 - Détermination des sites CpG...162 IV.2 - Préparation des ADN génomiques...162 IV.3 - Traitement des ADNg au bisulfite de sodium...163 IV.4 - Methylated Specific PCR ou MSP...165 V - Analyse statistiques... 166 V.1 - Analyses non paramétriques...166 V.2 - Analyse de la survie globale des patients...166 Résultats... 167 I - Analyse des transcrits de la chaîne α du récepteur FcRn et de la β2-microglobuline... 168 I.1 - Validation de la méthode...168 I.1 a - Normalisation des résultats...168 I.1 b - Spécificité des dosages...169 I.1 c - Linéarités des dosages...170 I.1 d - Reproductibilité des dosages...172 I.2 - Analyse quantitative de l expression de FcRn α et de la β2-microglobuline...175 I.2 a - Analyse comparative des expressions dans les tissus tumoraux et non tumoraux...175 I.2a α - Analyse statistique des différences d expression...175 I.2a β - Analyse des différences d expression en fonction des paramètres physiopathologiques...177 I.2a γ - Analyse de la survie globale des patients...177 I.2b - Analyse comparative des expressions dans les lignées cellulaires...178 II - Analyse de l expression protéique de la chaîne α du récepteur FcRn dans les tissus tumoraux et non tumoraux... 179 II.1 - Validation de la méthode...180

II.2 - Expression dans les tissus tumoraux et non tumoraux...182 III- Etude de la méthylation du gène FCGRT... 185 III.1 - Détermination de la présence d ilots CpG dans la séquence génique FCGRT...185 III.2 - Méthylation des ilots CpG...186 Discussion... 190 DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES... 193 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES... 196 ANNEXE... 212 TRAVAUX PERSONNELS... 214

FIGURES Figure 1 : Division des voies aériennes inférieures, selon le modèle de poumon de Weibel (Patton et al. 2007)... 21 Figure 2 : Représentation schématique du revêtement épithélial tapissant les voies respiratoires intrapulmonaires, d après Huchon, 2001... 22 Figure 3 : Eléments constitutifs de la muqueuse et de la sous-muqueuse bronchiques d après A. Godwin (Cornell University Medical College)... 23 Figure 4 : Carcinogénèse bronchique, d après Hirsch et al., 2001... 27 Figure 5 : Voie de signalisation de l EGFR et facteurs impliqués dans la carcinogenèse bronchique, d après Uramoto et al., 2007... 28 Figure 6 : Différents mécanismes de régulation épigénétique, d après Sawan et al., 2008... 29 Figure 7 : Répression d un gène par des mécanismes épigénétiques au cours de la carcinogénèse, d après Vaissière et al., 2008... 30 Figure 8 : Dépôt des particules dans le tractus pulmonaire selon leur DAMM, d après Dautzenberg et al., 2006... 36 Figure 9 : Structure de base d une immunoglobuline (Ig) : deux chaînes légères identiques et deux chaînes lourdes identiques reliées par des ponts disulfures (en rouge).... 41 Figure 10 : Structure des anticorps thérapeutiques d après Carter, 2001... 44 Figure 11 : Les différents formats d anticorps, d après Baty et al. 2006... 45 Figure 12 : Mécanismes d action des anticorps thérapeutiques, d après Congy-Jolivet et al, 2007... 48 Figure 13 : Les récepteurs à tyrosines kinases de la famille HER et leurs principales voies de signalisation, d après Ciardiello et al., 2008... 55 Figure 14 : Transduction du signal après activation de l EGFR d après Nyati et al., 2006... 55 Figure 15 : Modélisation de la fixation du ligand sur le récepteur à l EGF, d après Li, 2005... 58 Figure 16 : Propriétés anti-tumorales du cetuximab, d après www.merck.de... 59 Figure 17 : Structure schématique et cristallographique du récepteur FcRn, d après Raghavan et al. 1996... 65 Figure 18 : Représentation schématique de la structure du gène FCGRT codant la chaîne α du récepteur FcRn, selon Simister et al., 1996 ; Zhu et al., 2001 ; Sachs et al., 2006 (A) et Mikulska et al., 2000 (B)... 66 Figure 19 : Représentation schématique de la structure du gène codant la β2 microglobuline... 66 Figure 20 : Le récepteur FcRn permet le transfert périnatal des IgGs d après Roopenian et al., 2007 68 Figure 21 : Rôle du FcRn dans le transport et le recyclage des IgGs à travers les cellules endothéliales, d après Ternant et al., 2005... 69 Figure 22 : Principe de fonctionnement d un impacteur en cascade, d après Dautzenberg et al., 2006... 72 Figure 23 : Exemple de montage utilisant un impinger... 74 Figure 24 : Photographie du Microsprayer TM IA-1Clong et de son utilisation pour une administration endotrachéale chez la souris... 89 Figure 25 : Image radiologique du positionnement du cathéter avant injection intrabronchique de cellules A431 chez une souris BALB/c Nude... 95 Figure 26 : Image scintigraphique du dépôt des cellules A431 additionnées de Tc 99m chez une souris BALB/c Nude... 95 Figure 27 : Différentes méthodes pour administrer un aérosol chez le petit rongeur, d après Sakagami 2006... 106 Figure 28 : Reconnaissance de l EGFR par le cetuximab après nébulisation... 109 Figure 29 : Effet du cetuximab nébulisé sur la croissance des cellules A431... 110 Figure 30 : Inhibition de la phosphorylation de l EGFR par le cetuximab après nébulisation... 111

Figure 31 : Imagerie scintigraphique d un dépôt d aérosol dans les voies respiratoires d une souris BALB/c après administration avec le Microsprayer TM de cetuximab en présence d un traceur radioactif (Tc 99m )... 114 Figure 32 : Histologie de différents organes d une souris BALB/c traitée avec 2 mg de cetuximab par aérosol une fois par semaine pendant 5 semaines... 115 Figure 33 : Variation de poids et hémogramme des souris après cinq semaines de traitement au cetuximab par voie pulmonaire... 117 Figure 34 : Histologie des tumeurs pulmonaires ou trachéales retrouvées chez les souris après une induction intrabronchique de cellules A431... 120 Figure 35 : Tomodensitométrie thoracique d une souris BALB/c Nude porteuse de tumeur bronchopulmonaire de cellules A431... 122 Figure 36 : Tomodensitométrie thoracique (avant et après traitement au cetuximab) et analyse histologique post-mortem des poumons d une souris porteuse de tumeur broncho-pulmonaire avant le traitement... 123 Figure 37 : Etude de l affinité du cetuximab-xenofluor750 TM et du cetuximab natif pour l EGFR par cytométrie en flux avec des cellules A431... 126 Figure 38 : Fixation du cetuximab-xenofluor750 TM sur une tumeur de cellules A431 implantées en sous-cutanée chez la souris BALB/c Nude... 127 Figure 39 : Biodistribution du cetuximab-xenofluor750 TM administré par différentes voies chez la souris BALB/c Nude porteuse de tumeur broncho-pulmonaire... 128 Figure 40 : Immunodétection du cetuximab dans des extraits protéiques pulmonaires de souris ayant reçu l anticorps par différentes voies... 130 Figure 41 : Imagerie infrarouge ex vivo des poumons d une souris BALB/c Nude porteuse de tumeur broncho-pulmonaire 48 heures après avoir reçu du cetuximab-xenofluor750 TM par voie aérosol... 131 Figure 42 : Concentrations sériques moyennes et biodistribution par imagerie optique proche infrarouge de cetuximab-xénofluor750 TM durant les 336 heures suivant l administration par différentes voies chez la souris BALB/c Nude porteuse de tumeur pulmonaires A431... 133 Figure 43 : Effet du cetuximab administré par aérosol sur des tumeurs A431 implantées en intrabronchique chez la souris BALB/c Nude... 138 Figure 44: Principe de la PCR en temps réel utilisant le SYBR Green... 155 Figure.45: Représentation schématique des constructions plasmidiques pcr2.1-fcrn α et pgem-t Easy - β2m, d après M. Ohresser... 157 Figure 46 : Principe de conversion d un résidu cytosine non méthylé en un résidu uracile après traitement au bisulfite de sodium, d après Clark et al., 1994... 164 Figure 47 : Courbe de fusion obtenue lors de la quantification de transcrits FcRn α par PCR en temps réel... 170 Figure 48 : Courbes étalons établies lors de la quantification de transcrits FcRn α par PCR en temps réel... 171 Figure 49 : Droite d étalonnage établie lors de la quantification de transcrits FcRn α par PCR en temps réel... 171 Figure. 50: Quantification des transcrits FcRn α et β2-microglobuline dans les tissus pulmonaires non tumoraux et tumoraux... 174 Figure 51 : Comparaison des courbes de survie des patients présentant un cancer broncho-pulmonaire et une expression de FcRn α dans les tissus non tumoraux et tumoraux inférieure ou supérieure à la médiane, selon la méthode de Kaplan-Meier... 178 Figure 52 : Immunodétection de la protéine FcRn α dans les cellules MDCKII et MDCKII clone 33... 180 Figure 53 : Immunodétection de FcRn α sur des tissus broncho-pulmonaires normaux... 181 Figure 54 : Immunohistochimie de FcRn α dans des tissus pulmonaires non tumoraux et tumoraux de type carcinome épidermoide ou adénocarcinome... 183 Figure 55 : Immunohistochimie sur tissu micro-arrays de tumeur broncho-pulmonaire... 184 Figure 56 Représentation graphique de la séquence génomique de 19.9 kb du gène FCGRT... 185 Figure 57 : Mise au point de la MSP avec des amorces spécifiques des îlots CpG 1, 2 et 4 détectés dans la séquence FCGRT... 187 Figure 58 : Analyse de la méthylation du promoteur du gène FCGRT de patients atteints de CBNPC par la méthode de la MSP... 188

TABLEAUX Tableau 1 : Classification TNM d après Spira et al., 2004.... 25 Tableau 2 : Traitements du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules en fonction du stade d extension tumorale, d après Lemarié et al., 2008.... 31 Tableau 3 : Mode de dépôt des particules dans l arbre respiratoire selon leur taille... 37 Tableau 4 : Caractéristiques des isotypes d immunoglobulines humaines, d après Lobo et al. 2004.. 41 Tableau 5 : Anticorps anticancéreux actuellement disponibles sur le marché, modifié d après Magdelaine-Beuzelin et al., 2007... 52 Tableau 6 : Les anticorps anti-egfr approuvés ou en développement, d après Roberts et al, 2007.. 54 Tableau 7 : Essais cliniques pour le traitement du CBNPC, association du cetuximab à une chimiothérapie, d après Morgensztern, 2007... 62 Tableau 8 : Répartition des dépôts d aérosol dans les voies respiratoires des souris BALB/c après administration par le MicrosprayerTM de PBS ou cetuximab en présence de Tc99m... 114 Tableau 9 : Formation de foyers tumoraux pulmonaires 6 ou 8 semaines après l implantation intrabronchique de cellules A431 seules ou avec des adjuvants chez la souris BALB/c Nude... 119 Tableau 10 : Formation de foyers tumoraux pulmonaires 6 ou 8 semaines après l implantation intrabronchique de cellules A431 additionnées d EDTA à 10 mm chez la souris BALB/c Nude... 120 Tableau 11 : Comparaison des paramètres pharmacocinétiques du cetuximab-xénofluor750 TM administré par aérosol et par voie intraveineuse chez la souris BALB/c Nude porteuse de tumeur A431 broncho-pulmonaire... 135 Tableau 12 Description des caractéristiques physiopathologiques de la cohorte de patients atteints de cancer broncho-pulmonaire... 151 Tableau 13: Séquences des différentes amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes codant pour FcRn α, β2-microglobuline ou la sous unité ribosomale 18S utilisées dans les réactions de PCR conventionnelles et de PCR en temps réel... 159 Tableau 14: Conditions des réactions de PCR quantitatives en temps réel pour l amplification des gènes codant pour FcRn α, β2-microglobuline ou la sous unité ribosomale 18S... 159 Tableau 15: Séquences et températures d hybridation des différentes amorces oligonucléotidiques spécifiques des îlots CpG de la séquence FCGRT utilisées dans les réactions de PCR conventionnelles... 165 Tableau 16 : Contrôle de la reproductibilité inter-essai sur les valeurs standards de la gamme d étalonnage FcRn α... 172 Tableau 17. : Reproductibilité inter-essai sur les standards des gammes d étalonnage β2m et 18S.. 173 Tableau 18: Relation entre l expression du gène codant FcRn α dans les tissus broncho-pulmonaires non tumoraux et tumoraux et différentes variables physiopathologiques... 176 Tableau 19 : Quantification des transcrits de FcRn α dans les lignées cancéreuses pulmonaires et les lignées de cellules épithéliales bronchiques immortalisées par PCR en temps réel... 179

ANNEXE Annexe 1 : Fonctionnements des appareils de nébulisation, selon Dautzenberg et al., 2006......213

Avant-propos

Avant-propos Le cancer du poumon est aujourd hui la première cause de mortalité par cancer en France avec 28 000 morts par an et, représente un réel problème de santé publique. Au niveau mondial, on estime qu il est responsable d environ 900 000 décès annuellement, soit 18% des décès par cancer (Hill et al., 2008). Malgré la découverte de nouvelles molécules thérapeutiques, le gain sur la survie est modeste et les progrès des traitements systémiques restent lents. L aérosolthérapie dans le traitement du cancer broncho-pulmonaire représente une alternative très attractive et reste pourtant à ce jour très peu explorée. La voie pulmonaire pourrait, en effet, renforcer l efficacité thérapeutique du traitement en augmentant la concentration locale du médicament tout en limitant les effets systémiques indésirables et la dégradation au niveau hépatique et/ou rénal de la molécule. Une stratégie de traitement en plein essor dans le traitement des cancers, l immunothérapie passive, passe par l utilisation d anticorps monoclonaux recombinants et montre des résultats très satisfaisants (Glennie et al., 2003). Actuellement, la voie d administration privilégiée pour les anticorps thérapeutiques est la voie systémique. L objectif principal de ma thèse était d évaluer l intérêt de l aérosolthérapie d anticorps monoclonaux recombinants pour le traitement du cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (CBNPC). Dans cette étude, le cetuximab (Erbitux ), une IgG1 chimérique ciblant l EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), a été choisi comme modèle. Plusieurs éléments ont conduit à ce choix : - L EGFR est sur-exprimé dans 40 à 80% des CBNPC (Mao, 2001). - L EGFR est situé à la surface des cellules tumorales et représente donc une cible moléculaire de choix. - Le cetuximab est disponible commercialement puisqu il a reçu une autorisation de mise sur le marché (AMM) dans le traitement du cancer colorectal métastatique et du cancer des voies aéro-digestives supérieures. - Le cetuximab est actuellement en étude de phase III pour le traitement du CBNPC en administration intraveineuse (Hanna et al., 2006). Par ailleurs, le récepteur FcRn exprimé au niveau de l épithélium bronchique et par les macrophages alvéolaires a été décrit comme intervenant spécifiquement dans le transport intracellulaire et la protection des IgGs. De récentes études ont démontré qu il jouait un rôle majeur dans la biodisponibilité de protéines de haut poids moléculaire conjuguées au domaine 17

Avant-propos Fc des immunoglobulines. En effet, en les excluant des voies endocytiques qui mènent à leur catabolisme, il augmente leur demi-vie sérique et joue alors un rôle essentiel dans leur pharmacocinétique (Bitonti et al., 2004 ; Low et al., 2005 ; Dumont et al., 2006). Le récepteur FcRn pourrait donc être un facteur important dans la pharmacocinétique des anticorps thérapeutiques administrés par voie pulmonaire et in fine dans la réponse à ce type de traitement. Le second objectif de mon travail de thèse était d étudier l expression du récepteur FcRn dans le cancer broncho-pulmonaire afin d estimer son rôle dans la biodistribution et la pharmacocinétique des IgGs thérapeutiques anti-tumorales au niveau pulmonaire. 18

Revue bibliographique

Revue bibliographique CHAPITRE I : LE CANCER BRONCHO-PULMONAIRE I- Rappel : anatomie des voies respiratoires. L appareil respiratoire a une situation unique dans l organisme car il est en communication directe et constante avec l environnement extérieur. Il exerce de multiples fonctions : une fonction respiratoire via les échanges gazeux et de nombreuses fonctions non respiratoires (régulation du métabolisme acido-basique, filtration de toxines, etc ). Il possède un ensemble complexe d éléments cellulaires et de terminaisons nerveuses contribuant à le protéger des agressions extérieures par clairance des particules inhalées, sécrétions de mucus et de surfactant, et un système de défenses immunitaires. I.1- Anatomie du poumon normal. Chaque poumon a une face externe convexe plaquée sur la paroi thoracique, une face interne concave faisant face au médiastin, une face basale reposant sur le diaphragme et un sommet ou apex situé à la base du cou. Les poumons sont des organes spongieux ayant une forme pyramidale. Ils sont entourés par la plèvre, sont dissymétriques et se divisent en lobes et en segments. Le poumon droit est formé de trois lobes (supérieur, moyen et inférieur) subdivisés en dix segments et le poumon gauche de deux lobes (supérieur et inférieur) subdivisés en dix segments également. I.2- Les voies respiratoires. L air respiré pénètre par les voies aériennes supérieures c est-à-dire les fosses nasales ou la bouche, puis le pharynx et le larynx avant d atteindre les voies respiratoires inférieures. 20

Revue bibliographique Les voies respiratoires inférieures se divisent en trois compartiments (Figure 1) : - les voies de conduction qui vont de la trachée aux bronchioles terminales, - la zone transitionnelle qui correspond aux bronchioles respiratoires, - une zone respiratoire d échange gazeux qui correspond aux territoires alvéolaires comprenant eux-mêmes les canaux et les sacs alvéolaires. Figure 1 : Division des voies aériennes inférieures, selon le modèle de poumon de Weibel (Patton et al., 2007). L aspect morphologique des voies de conduction respiratoires est similaire de la trachée aux petites bronches intra-lobulaires. Seule la composition de leur paroi varie parallèlement à la diminution du calibre. Les parois bronchiques sont tapissées par un épithélium de revêtement cylindrique. Celui-ci repose, par l intermédiaire d une membrane basale continue, sur un chorion formé de tissu conjonctif, de tissu élastique et de muscle lisse. Le chorion est parcouru par des vaisseaux sanguins, lymphatiques et des structures nerveuses. 21

Revue bibliographique La composition de l épithélium de revêtement reste identique de la trachée aux bronchioles terminales. Cependant son épaisseur et la proportion des différents types cellulaires varient. Cet épithélium comprend cinq types principaux de cellules (Figure 2) : - les cellules ciliées : environ un tiers des cellules épithéliales dans les grosses bronches. Leur rôle prinicpal est la propulsion du film muqueux et des particules inhalées en direction du larynx. - les cellules basales : représentent moins de 10% des cellules épithéliales dans les grosses bronches. Elles contiennent des filaments de kératine et possèdent des desmosomes. Elles feraient partie des cellules souches permettant le renouvellement de l épithélium à l état physiologique ou après différentes agressions. - les cellules à mucus : environ 10% des cellules épithéliales dans les grosses bronches. Elles contiennent des vacuoles de mucus et leur nombre peut augmenter rapidement dans certaines conditions pathologiques. - les cellules neuroendocrines : environ 1% des cellules épithéliales. Leur rôle exact n est pas bien défini, elles pourraient intervenir dans la réponse inflammatoire. - les cellules de Clara : présentes seulement au niveau des bronchioles. Elles interviennent notamment dans la protection des voies respiratoires et le renouvellement des cellules bronchiolaires et alvéolaires. Figure 2 : Représentation schématique du revêtement épithélial tapissant les voies respiratoires intra-pulmonaires, d après Huchon, 2001. CC : cellule ciliée, CM : cellule à mucus, CB, cellule basale, C CI : cellule de Clara, P1 : pneumocyte I, P2 : pneumocyte II. 1 : épithelium, 2 : membrane basale, 3 : sous-muqueuse. 22

Revue bibliographique Il existe d autres types cellulaires, plus rarement rencontrés dans l épithélium respiratoire, comme les cellules intermédiaires ou parabasale, les cellules séreuses ou encore les cellules cylindriques non ciliées. La sous-muqeuse dont l épaisseur diminue parallèlement au calibre de la bronche, est composée d un réseau de tissu conjonctif et élastique. Elle contient des glandes séromuqueuses qui s ouvrent dans la lumière bronchique par l intermédiaire d un canal excréteur tapissé par des cellules muqueuses puis ciliées : elles produisent plus de 90% du mucus bronchique. Plus en profondeur, siège le cartilage (Figure 3). Figure 3 : Eléments constitutifs de la muqueuse et de la sous-muqueuse bronchiques d après A. Godwin (Cornell University Medical College). Les alvéoles, siège des échanges gazeux entre l air et le sang circulant, sont tapissées par un épithélium simple. Celui-ci comporte deux types cellulaires : - les pneumocytes de type I (90% de la surface alvéolaire) indifférenciés, incapables de se diviser et très sensibles aux agressions. - les pneumocytes de type II sécrètent l hypophase du surfactant et sont capables de se diviser assurant ainsi la régénération du revêtement alvéolaire lors de dommages de l alvéole. Ces cellules sont reliées entre elles par des jonctions serrées leur conférant un rôle de barrière. Les capillaires alvéolaires forment le plus vaste réseau de capillaires de l organisme. Ils sont situés dans la paroi alvéolaire et sont de type continu non fenêtré. 23

Revue bibliographique II- Epidémiologie et étiologie du cancer broncho-pulmonaire. Malgré la découverte de nouvelles molécules thérapeutiques, le cancer du poumon reste à ce jour la première cause de mortalité par cancer en France avec 28 000 décès par an. Au niveau mondial, on estime qu il est responsable d environ 900 000 décès annuellement, soit 18% des décès par cancer. Depuis quelques années, une augmentation du nombre de femmes touchées par le cancer du poumon est observée malgré une diminution globale de la mortalité par cancer (Hill et al., 2008). En pratique, on distingue deux catégories de cancers broncho-pulmonaires : les cancers bronchiques à petites cellules (CBPC : 20% des cas) qui représentent la forme la plus agressive et les cancers bronchiques non à petites cellules qui restent les plus fréquents (CBNPC : 80% des cas). Le pronostic vital des cancers bronchiques est très faible avec moins de 15% de survivants à 5 ans et représente le plus bas pour les tumeurs solides. En effet, le diagnostic est souvent posé lorsque la maladie est à un stade avancé et les patients ne peuvent être traités chirurgicalement. L incidence du cancer du poumon est en très grande partie liée à la consommation de tabac et sa réduction passe d abord par une meilleure prévention du tabagisme. Le tabagisme actif, facteur de risque principal du cancer bronchique, est responsable de 90% des cas (Collins et al., 2007). La fumée du tabac contient de nombreux carcinogènes, le principal étant le benzo-a-pyrène. Le rôle du tabagisme passif est également prouvé : il multiplie par trois le risque de cancer du poumon, mais n'est directement responsable que de 100 cancers par an en France. Outre le tabac, il existe des carcinogènes professionnels, environnementaux ou domestiques qui agissent le plus souvent en synergie avec le tabac. On peut citer l amiante, le radon, la silice, le chrome, l arsenic, le cadmium ou encore la pollution atmosphérique et l exposition professionnelle à la fumée de diesel (Lemarié, 2008). 24

Tableau 1 : Classification TNM d après Spira et al., 2004. Définition des catégories TNM (T : Tumor, N : Node, Metastasis) et classification en stades.