Spectrométrie de masse Introduction Intérêts de la Spectrométrie de masse :

Spectrométrie de masse Introduction Intérêts de la Spectrométrie de masse : Sensibilité, limite de détection faible ( fento mole dans certaines conditions ) Variétés des applications : analyses chimiques quantitative et qualitative réaction ions molécule, cinétique des réactions. Progrès technologique rapide 1

Spectrométrie de masse Introduction -Principes - Un spectromètre comprend : - Système d introduction ( GC, LC, sas d intro direct, ) - Source d ionisation - Analyseur ( un ou plusieurs ) - Détecteur pour compter les ions - Système de traitement de donnée Introduction, GC, LC Ionisation, EI, CI ESI, APCI FAB, Analyseur SQ D,TQD, EB, TOF Détecteur Logiciel 2

Spectrométrie de masse Introduction -Principes Principes de la MS : 1er étape : Produire des ions La quantité de fragments produit dépend de la «force» de l ionisation Les ions sont ensuite séparés d après leur masse et leur charge dans le système dispersif Ils sont ensuite détectés. Introduction, GC, LC Ionisation, EI, CI ESI, APCI FAB, Analyseur SQ D,TQD, EB, TOF Détecteur Logiciel 3

Spectrométrie de masse Analyse de Biomolécules - Electrospray (ESI) 4

Ion moléculaire ou pseudo-moléculaire Electrospray Ion pseudo-moléculaire : En mode positif : ajout d un proton sur M : (M+H) + (masse : M+1, charge+1) En mode négatif : perte d un proton : (M-H) - (masse : M-1, charge -1)

1. Massifs isotopiques Isotopes : atomes d un même élément qui contiennent un nombre identique de protons mais un nombre différent de neutrons Abondance isotopique = pourcentage des isotopes d un élément dans la nature Masse moyenne pondérée (MM) = Masse atomique apparaissant sur le tableau périodique et qui tient compte des isotopes et de leur abondance Exemple : nbre de nbre de protons : nucléons : nbre nbre de nbre masse abondance abondance atomique masse neutrons isotopique en % (1) relative (2) Chlore-35 17 35 35-17 = 18 34,97 75,8% 100 Chlore-37 17 37 37-17 = 20 36,97 24,2% 32,5 Masse moyenne pondérée du chlore = (0,758 * 34,97 uma) + (0,242 * 36,97 uma) = 35,454 uma (1) = nombre moyen d isotope cité pour 100 atomes de l élément (2) = nombre moyen d isotope cité pour 100 isotopes majoritaires 6

Principaux isotopes en chimie organique Elément isotope % Masse isotopique isotope % Masse isotopique isotope % Masse isotopique Masse moyenne C 12 C 100 12.0000 13 C 1.1 13.0033 12.011 H 1 H 100 1.0078 2 H 0.015 2.0140 1.0079 N 14 N 100 14.0031 15 N 0.37 15.0001 14.0067 O 16 O 100 15.9949 17 O 0.04 16.9991 18 O 0.20 17.9992 15.9994 S 32 S 100 31.9721 33 S 0.789 32.9715 34 S 4.44 33.9679 32.066 F 19 F 100 18.9984 Cl 35 Cl 100 34.9688 37 Cl 31.98 36.9659 35.453 Br 79 Br 100 78.9183 81 Br 97.28 80.9163 79.904

Calcul de masses exactes Soit la molécule d eicosane C 20 H 42 : nbre masse masse A isotopique moyenne Hydrogène-1 1 1.0078 1.0079 Hydrogène-2 2 2.0140 Carbone-12 12 12.0000 12.011 Carbone-13 13 13.0034 282 Masse exacte M : ( 12 C 1 20 H 42 ) (20 * 12.000) + (42 * 1.0078) = 282,33 Masse exacte M+1 avec un 13 C : (19 * 12.000) + (1 * 13.0034) + (42 * 1.0078) = 283,33 Masse exacte M+1 avec un 2 H : (20 * 12.000) + (41 * 1.0078) + (1 * 2.0140) = 283,33 Masse moyenne : (20 * 12.011) + (42 * 1.0079) = 282,55 La différence entre masse exacte M et masse moyenne MM augmente avec la taille de la molécule : entre MM et M = ± 1 Da / 1500 Da

Calcul de l abondance relative des satellites isotopiques M+1, M+2 pour des petites molécules Type d élément Caractéristiques Exemple Abondance relative du 2 ème isotope* 1! Isotope ou F - Q plusieurs isotopes I - dont un est majoritaire P - (A > 99,9%) H 0,015 Q+1 Isotope M+1 C 1,08 non négligeable N 0,37 * Abondance de l isotope majoritaire = 100 O 0,2 Q+2 Isotope M+2 S 4,43 non négligeable Cl 31,98 Br 97,28 Satellite M+1 : M+1 (1,08. Nombre de C) + ( 0,37. Nombre de N ) M 100 Satellite M+2 : M+2 (31,98. Nombre de Cl) + ( 4,43. Nombre de S ) + M 100 analyse de spectres de masse 9

Massifs isotopiques complexes Exemple : Allure du massif isotopique de molécules contenant 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl

En Conclusion : Chaque formule brute est associée à un massif isotopique qui lui est propre Pour des molécules de masse < 500 Da : L abondance des pics «M+1» renseigne sur le nombre d éléments Q+1 : M+1/M (1,08. Nombre de C) + ( 0,37. Nombre de N ) /100 L abondance des pics «M+2» et suivants renseigne sur la présence d éléments Q+2 (S, Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes : analyse de spectres de masse 11

! Le nombre de formules brutes dont la masse est comprise entre deux valeurs données augmente avec la masse de l entité Formules brutes* contenant 12 C, 1 H, H, 14 14 N et 16 16 O entre 28.000 et 28.200 : Formules brutes* contenant Oentre 12 C, 1 H, 14 N et 16 180.000 et 180.200 : CO : 28.000 N 2 : 28.006 CH 2 N : 28.019* C 2 H 4 : 28.031 La capacité d un spectromètre à distinguer une masse x d une masse y dépend de la résolution

Résolution = m / m m = différence de masse correspondant à deux pics adjacents tout juste séparés m = masse du premier pic (ou moyenne des masses des deux pics) Dès lors, un spectromètre dont la résolution est de 2000 peut séparer des pics situés à des valeurs m/z de 2000 et 2001 (ou de 200 et 200,1 ou de 20,00 et 20,01) Si la résolution est suffisante, on peut alors associer une masse donnée à une seule formule brute Deux pics sont séparés si la profondeur de la vallée qui les sépare ne dépasse pas une fraction donnée de la hauteur du pic le moins intense (généralement 10% pour la haute résolution et 50% pour la basse résolution) Autre définition (pour un pic isolé) = résolution FWHM : m = largeur à mi-hauteur. Définition plus flatteuse : résolution FWHM / résolution à 10% = 2,2 Remarque : Un autre paramètre important de l analyseur est l exactitude en masse càd la précision, ou plus exactement la justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de la stabilité et du pouvoir de résolution de l analyseur. analyse de spectres de masse 13

Résolution = m / m Remarque : Un autre paramètre important de l analyseur est l exactitude en masse càd la précision, ou plus exactement la justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de la stabilité et du pouvoir de résolution de l analyseur. analyse de spectres de masse 14

Basse Résolution et Haute Résolution Entités identiques dont l une contient un 13 C Formule Brute : Masse exacte M m R = m/ m 12 C 1 H 4 16,0313 13 C 1,0033 16 1 H 4 17,0346 12 C 2571 H 14 383 N 16 65 O 32 * 77 S 6 5 803,6377 1,0033 6 000 13 C 12 C 2561 H 14 383 N 16 65 O 32 * 77 S 6 5 804,6401 Spectromètre HR ou BR? BR HR 14 N 2 28,00615 12 C 1 2 H 4 28,0312 0,025 1 100 BR Entités mais de masses très proches 12 C 14 9 N 16 4 O 180,0073 12 C 1 11 H 14 2 N 16 O 2 180,0085 0,0013 140 000 HR 12 C 2571 H 14 383 N 16 65 O 32 * 77 S 6 5 803,6377 12 C 2591 H 14 385 N 16 62 O 32 78 S 6 5 803,6390 0,0013 4 500 000 Impossible à séparer Les spectromètres commerciaux actuels peuvent avoir une résolution allant jusque 500 000 HR = haute résolution : R de l ordre de 10 4-10 5 - BR = Basse résolution : R de l ordre de 10 3 * Insuline analyse de spectres de masse 15

En Conclusion : La résolution détermine la capacité d un spectromètre de masse à différencier deux masses : R = m / m Pour des molécules de masse < 1000 Da : Les spectromètres à haute résolution permettent d associer une masse donnée à une formule brute Pour des molécules de masse > 1000 Da Ce n est plus le cas. A haute résolution et selon la taille de la molécule, on peut parfois distinguer les satellites isotopiques ( m = 1) NB : N oubliez pas que l analyse des massifs isotopiques est une aide précieuse dans l attribution d une formule brute

Spectrométrie de masse Quantification La sensibilité = recherche de la limite de détection(lod) et Quantification (LOQ). En analyse Qualitative, la LOD est la quantité minimal d échantillon nécessaire à l obtention d un spectre de masse de qualité. En analyse Quantitative la LOD est la quantité minimal détectable d une molécule par rapport au bruit de fond. LOD = 3 S/N LOQ = 10 S/N Plusieurs paramètres conditionnent la LOQ : - Paramètre de source du spectromètre de masse - La technique d ionisation - les solvants et tampon en ESI 17

Spectrométrie de masse Analyse de Biomolécules 18 MRM, des limitations 1. La molécule doit s ioniser, surtout en ESI 2. La molécule doit fragmenter, mais pas trop 3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu à 6 (TQD ) 4. Précision des mesures : 10% 5. LOD, LOQ variable en fonction des molécules, des appareils ( 20 pg pour la carnitine sur TQD Waters de 2000), inférieur sur une Maxis Q-TOF de 2009. 6. Répétabilité des aires : mauvais d un jour à l autre 1. lié à l encrassement 2. Effet matrice en ESI ( pas en EI ). On préfère toujours la solution de l étalon interne à la courbe de calibration externe Idéalement, l étalon interne est la molécule marqué iso topiquement ( Testostérone D3, Carnitine D3.

Spectrométrie de masse Quantification La spectrométrie de masse apporte : - Spécificité - La sensibilité La spécificité est obtenu par : - La préparation de l échantillon pour séparer la molécule cyble des interférences. - Le spectromètre de masse en lui même La sensibilité est obtenu par : - La technologie employée - Les modes du spectromètre de masse 19

Spectrométrie de masse La spécificité est obtenu par : - La purification de l échantillon Quantification - Extraction ( liquide liquide ) - SPE / MIP - La dérivatisation : augmentation du poids de la molécule d intêret et ciblage d ion caractéristique de masse supérieur. - Le spectromètre de masse. - Augmenter la résolution - R= 2000 TQD - R= 20 000 Q-TOF - - mode SRM ( Single Reaction Monitoring ). 20

Quantitatif 1. Etablir une courbe de calibration avec toujours la même quantité d étalon interne. 2. Concentré l échantillon avec la même quantité d étalon interne que pour la calibration 3. Comparer le rapport A Atrazine / A IS pour obtenir la quantité d étalon interne.

Quantitatif Cpd # Formula RT Mass [M+H]+ DEDIA C3H4N5Cl 145.0155 146.0227 DIA C5H8N5Cl 173.0468 174.0540 DEA C6H10N5Cl 187.0625 188.0697 ATRAZINE C8H14N5Cl 5.01 215.0938 216.1010 ATRAZINE-D5 C8H9D5N5Cl 5.02 220.1252 221.1324

Qualitatif 1. Définir les paramètres optimaux de sources. 2. Réaliser la Courbe de calibration 1. Toujours la même quantité d étalon interne dans les 200µl 2. Faire varier la quantité d atrazine de 20ng ( limite haute de la réglementation) 3. 20 ng 4. 10 ng 5. 5 ng 6. 1 ng 7. 0.5 ng 8. 100 pg 9. 10 pg 3. Comparer le rapport de l aire de l atrazine / Aire de l atrazine D5 après extraction en HR-MS

Spectre Produit de l Atrazine à Ce =5, 19,33,47 ev

Spectre Produit de l Atrazine-D5 à Ce =5, 19,33,47 ev

Transition M.R.M pour l ATRAZINE et son étalon interne MRM Compound Name ISTD? Precursor Ion MS1 Res Product Ion MS2 Res Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage Polarity ATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 179.1 Unit 200 120 17 7 Positive ATRAZINE-D5 True 221.1 Unit 69.1 Unit 200 120 41 7 Positive ATRAZINE False 216.1 Unit 174.1 Unit 200 110 13 7 Positive ATRAZINE False 216.1 Unit 104 Unit 200 110 29 7 Positive

HPLC : colonne type C18 2.1 x 100 mm, 2.6µm Debit 300µl/min Temps B% Débit Solvant A H2O 5mM Acétatate d'ammonium 0 3 300 µl/min Solvant B Méthanol 0.5 3 300 µl/min 5 90 300 µl/min 7 90 300 µl/min 7.05 3 300 µl/min 9 3 300 µl/min QQQ. Vcap 3500 V GAS Temp 350 C Drying gaz 12 L/min Nebuliseur 45 psi Fragmenteur 120 V ESI Positif