Analyse d échantillons alimentaires pour la présence d organismes génétiquement modifiés

Analyse d échantillons alimentaires pour la présence d organismes génétiquement modifiés Module 6 La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) M. Somma, M. Querci WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 2 Table des matières Module 6 La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) INTRODUCTION 3 CONSTITUANTS, STRUCTURE ET REPLICATION DE L ADN 3 PRINCIPES DE LA PCR 8 INSTRUMENTATION ET COMPOSANTS POUR LA PCR 12 CONCEPTION DES AMORCES POUR LA PCR 17 PCR SPECIALISEE 22 LA PCR DANS LA PRATIQUE 23 REFERENCES 30 BIBLIOGRAPHIE COMPLEMENTAIRE 32

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 3 Introduction La mise au point de la technique de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) par K. Mullis et ses collaborateurs en 1985 a révolutionné la biologie moléculaire et la médecine moléculaire (Saiki et al., 1985). La réaction de polymérisation en chaîne est une technique in vitro utilisée pour amplifier à l aide d enzymes une région déterminée de l ADN qui se trouve entre deux régions de séquence ADN connue. Alors qu autrefois seules de très petites quantités d un gène spécifique pouvaient être obtenues, la PCR permet maintenant d amplifier même une seule copie de gène à un million d exemplaires en quelques heures. Les techniques PCR sont devenues essentielles pour beaucoup de procédures communes, telles que le clonage de fragments d ADN spécifiques, la détection et l identification de gènes à des fins de diagnostic et en médecine légale ainsi que dans la recherche sur les modes d expression génique. Plus récemment, la PCR a permis l exploration de nouveaux domaines, tels que le contrôle de l authenticité de denrées alimentaires, la présence d ADN génétiquement modifié et la contamination microbiologique. Pour comprendre les principes de la PCR et de ses applications, il faut examiner d abord la nature de la molécule d ADN. C est pourquoi la structure et la réplication de l ADN sont décrites dans la section suivante. Constituants, structure et réplication de l ADN Constituants. Une molécule d ADN est constituée de deux brins complémentaires enroulés sous forme d hélice et composés alternativement d acide phosphorique et de désoxyribose, reliés transversalement par des bases (purines et pyrimidines), prenant la forme d une structure hélicoïdale droite qui porte des informations génétiques encodées dans la séquence des bases. Dans les cellules eucaryotes, la majeure partie de l ADN est contenue dans le noyau et est appelée ADN chromosomique. Il est séparé du reste de la cellule (cytoplasme) par une double membrane (l enveloppe nucléaire). D autre part, les mitochondries et les chloroplastes contiennent de l ADN extrachromosomique. Les éléments constitutifs de l ADN, appelés nucléotides, sont les suivants: datp, désoxyadénosine triphosphate; dgtp, désoxyguanosine triphosphate; dttp, désoxythymidine triphosphate; dctp, désoxycytidine triphosphate.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 4 Par commodité, ces quatre nucléotides sont appelés dntp (désoxynucléoside triphosphates). Un nucléotide comporte essentiellement les trois parties suivantes: une base purine (adénine, A, et/ou guanine, G) ou une base de pyrimidine (cytosine, C, et/ou thymine, T), une molécule de sucre pentose (désoxyribose) et un groupe triphosphate. Comme le montre la Figure 1, une base purine ou pyrimidine est liée à un cycle pentose par une liaison N-glucosidique et un groupe phosphate est lié à l atome de carbone 5 du sucre par une liaison diester. Dans l acide ribonucléique, ARN, la thymine est remplacée par l uracile (U) et la molécule de désoxyribose est remplacée par le ribose. Figure 1. Les composants des nucléotides (image: Andy Vierstraete, 1999) Structure. La Figure 2 montre comment les nucléotides forment une chaîne d ADN. L ADN se forme par le couplage des nucléotides entre le groupe phosphate d un nucléotide (qui est situé sur le cinquième atome C de la molécule de sucre) avec l hydroxyle sur le troisième atome C de la molécule de sucre du nucléotide précédent. À cet effet, un groupe diphosphate se détache (avec libération d énergie). Cela signifie que de nouveaux nucléotides sont toujours ajoutés du côté 3' de la chaîne. La Figure 3 montre que l ADN est bicaténaire (sauf dans certains virus) et que les deux brins s apparient de manière très précise. Chaque base dans un brin

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 5 s appariera avec un seul type de base dans le brin opposé pour former une paire de bases (pb): A est toujours apparié à T par deux liaisons hydrogène; C est toujours apparié à G par trois liaisons hydrogène. De cette façon, les deux chaînes sont complémentaires entre elles et une chaîne peut servir de modèle pour la production de l autre. Figure 2. Formation d une chaîne d ADN à partir des nucléotides (image: Andy Vierstraete, 1999) Les bases forment un noyau hydrophobe à l intérieur de la double hélice. Les sucres et les groupes phosphate (sous leur forme anionique) constituent la couche hydrophile externe de la molécule. Dans les conditions physiologiques, l hélice d ADN bicaténaire est plus stable qu une hélice d ADN monocaténaire. Réplication. L ADN contient l information génétique complète qui définit la structure et la fonction d un organisme. Trois processus différents sont responsables de la transmission de l information génétique: la réplication; la transcription; la traduction.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 6 Figure 3. Structure de l ADN dans une cellule (image: Andy Vierstraete, 1999) Au cours de la réplication, un acide nucléique bicaténaire est dupliqué pour donner des copies identiques. Ce processus perpétue l information génétique. Lors de la transcription, un segment d ADN constituant un gène est lu et transcrit en une

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 7 séquence monocaténaire d ARN. L ARN se déplace du noyau vers le cytoplasme. Enfin, pendant la traduction, la séquence d ARN est traduite en séquence d acides aminés lors de la formation de la protéine (Alberts et al., 1983). La réplication de l ADN est le processus sur lequel la PCR est basée, et est décrite en détail ci-après. Pendant la réplication, la molécule d ADN se déroule, chaque brin devenant un modèle (matrice) pour la synthèse d un nouveau brin complémentaire. Chaque molécule fille, consistant en un ancien et un nouveau brin d ADN, est une copie exacte de la molécule parent. Figure 4. La fourche de réplication Plusieurs enzymes sont nécessaires pour dérouler la double hélice et pour synthétiser un nouveau brin d ADN. La topoisomérase et l hélicase sont responsables du déroulement de l ADN par rupture de la structure superenroulée et coupure d un seul brin de l ADN. Ensuite, la primase (une partie d un agrégat de protéines appelé primosome) fixe une petite amorce d ARN sur l ADN monocaténaire, pour servir d extrémité 3 OH à partir de laquelle l ADN polymérase commence la synthèse. Cette amorce d ARN est finalement enlevée par la RNase H et la brèche est comblée par l ADN polymérase I. À ce stade, l ADN polymérase progresse le long d une molécule monocaténaire d ADN, incorporant des dntp libres pour les lier par liaison hydrogène à leur dntp complémentaire approprié sur le brin solitaire (A avec T et G avec C), formant une liaison phosphodiester covalente avec le nucléotide précédent du même brin. L énergie stockée dans le triphosphate est utilisée pour lier de manière covalente chaque

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 8 nouveau nucléotide au deuxième brin en cours de formation. Il y a différentes formes d ADN polymérase, mais c est l ADN polymérase III qui est responsable de la synthèse progressive de nouveaux brins d ADN. L ADN polymérase n agit que de 5' vers 3'. Comme un brin de la double hélice est de sens 5'-3' et l autre de sens 3'-5', l ADN polymérase synthétise une deuxième copie du brin 5'-3' (brin retardé) par petits fragments (fragments d Okazaki) (Ogawa et Okazaki, 1980). La synthèse des nouvelles copies du brin 5'-3' est montrée à la Figure 4. L autre brin (brin avancé) peut procéder à la synthèse directement, de 5' vers 3', à mesure que l hélice se déroule. L ADN polymérase ne peut pas commencer à synthétiser ex novo sur un brin unique nu, mais a besoin d une amorce avec un groupe 3 OH libre sur lequel il peut fixer un dntp. Une ligase catalyse la formation d une liaison phosphodiester entre l hydroxyle en 3 et le phosphate en 5. Le trou qui se forme lorsque l amorce d ARN est éliminée peut ainsi être comblé. Il convient de noter que les protéines de liaison monocaténaires sont importantes pour maintenir la stabilité de la fourche de réplication. Comme l ADN monocaténaire est très labile, c est-à-dire instable, ces protéines s y fixent alors qu il reste monocaténaire, le protégeant ainsi contre la dégradation. Principes de la PCR La PCR est basée sur le mécanisme de la réplication de l ADN in vivo: l ADN bicaténaire est déroulé en ADN monocaténaire, puis dupliqué et «réenroulé». Cette technique comprend les cycles répétitifs suivants: dénaturation de l ADN par fusion à haute température pour convertir l ADN bicaténaire en ADN monocaténaire; hybridation à l ADN cible de deux oligonucléotides utilisés comme amorces; extension de la chaîne d ADN par addition de nucléotides à partir des amorces en utilisant l ADN polymérase comme catalyseur en présence d ions Mg 2+.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 9 Les oligonucléotides consistent généralement en séquences relativement courtes qui sont différentes les unes des autres et complémentaires des sites de reconnaissance flanquant le segment d ADN cible à amplifier. Les étapes de dénaturation de la matrice, d hybridation des amorces et d extension des amorces constituent un «cycle» dans la méthode de réaction de polymérisation en chaîne. La Figure 5 illustre les trois étapes principales du processus d amplification PCR. Figure 5. Les étapes de l amplification PCR (image: Andy Vierstraete, 1999) Après chaque cycle, les brins d ADN nouvellement synthétisés peuvent servir de matrices dans le cycle suivant. Comme le montre la Figure 6, le principal produit de cette réaction exponentielle est un segment d ADN bicaténaire dont les extrémités sont définies par les extrémités 5' des amorces d oligonucléotides et dont la longueur est définie par la distance entre les amorces. Les produits d un premier cycle d amplification réussi sont des molécules d ADN de taille hétérogène dont la longueur peut dépasser la distance entre les sites de fixation des deux amorces. Dans le deuxième cycle, ces molécules produisent des brins d ADN de longueur définie qui s accumuleront de façon exponentielle lors de cycles d amplification ultérieurs et formeront les produits dominants de la réaction. Ainsi, l amplification, en tant que nombre final de copies de la séquence cible, est exprimée par l équation suivante: (2 n -2n)x (1)

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 10 où n est le nombre de cycles, 2n est le premier produit obtenu après le premier cycle et le deuxième produit obtenu après le deuxième cycle avec une longueur indéfinie, et x est le nombre de copies de la matrice originelle. Potentiellement, après 20 cycles de PCR, il y aura une amplification d un facteur de 2 20, en supposant une efficacité de 100 % pendant chaque cycle. L efficacité d une PCR variera d une matrice à l autre et selon le degré d optimisation atteint. Une description détaillée des trois étapes de l amplification PCR (dénaturation de la matrice, hybridation des amorces et extension) est donnée dans les paragraphes ciaprès (Sambrook et al., 1989). Figure 6. L amplification exponentielle de l ADN dans la PCR Dénaturation de la matrice Au cours de la dénaturation, le double brin s ouvre pour donner de l ADN monocaténaire, et toutes les réactions enzymatiques s arrêtent (c est-à-dire l extension d un cycle précédent). Les deux chaînes complémentaires sont séparées par une augmentation de température. C est ce qu on appelle la dénaturation. Pour obtenir la dénaturation de l ADN, on augmente généralement la température à environ 93 96 C. De cette façon, les fortes liaisons H sont rompues et le nombre de bases non appariées augmente. La réaction est complète lorsque tout l ADN bicaténaire est devenu de l ADN monocaténaire. La température à laquelle la moitié de l ADN bicaténaire devient monocatenaire est appelée température de fusion, T f. Le type de solvant, la concentration de sel et le ph utilisés influencent le processus

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 11 de dénaturation. Par exemple, à faible concentration de sel, à ph élevé et en présence de solvants organiques tels que le formaldéhyde, la température de fusion T f diminue. La concentration de G/C et T/A peut également influencer la valeur de la T f. La T f de la structure de l ADN contenant une quantité élevée de G/C est supérieure à celle de l ADN riche en T/A. Par exemple, Serratia marecescens a une concentration de G/C approximativement d environ 60 % et une T f d environ 94 C, tandis que Pneumococcus a approximativement 40 % de G/C et une T f d environ 85 C. Hybridation des amorces L hybridation, ou réhybridation, des brins d ADN a lieu à une température plus basse (généralement 55 65 C). Une fois que la température est abaissée, les deux chaînes complémentaires d ADN monocaténaire se reformeront en une molécule d ADN bicaténaire. Au cours de cette phase, les amorces se déplacent librement et des liaisons ioniques sont constamment formées et rompues entre l amorce monocaténaire et la matrice monocaténaire. Les liaisons plus stables durent un peu plus longtemps (amorces qui correspondent exactement à l ADN matrice) et sur ce petit morceau d ADN bicaténaire (matrice et amorce), la polymérase peut se fixer et commencer à copier la matrice. Une fois que quelques bases sont incorporées, la liaison ionique est si forte entre la matrice et l amorce qu elle ne se rompra pas. Extension des amorces Au cours de cette étape, les amorces sont étendues sur la séquence cible en utilisant une ADN polymérase thermostable (souvent l ADN polymérase Taq) en présence de dntp, ce qui aboutit à une duplication du matériel cible de départ. La température de travail idéale pour l ADN polymérase Taq est 72 C. Lorsque les amorces ont été étendues de quelques bases, elles possèdent une plus forte attraction ionique pour la matrice, ce qui réduit la probabilité de survenue du processus inverse. Les amorces qui ne correspondent pas exactement se détachent de nouveau (en raison de la température plus élevée) et n entraînent pas une extension du fragment. Les bases (complémentaires de la matrice) sont couplées à l amorce du côté 3 (la polymérase ajoute des dntp de 5 vers 3 en lisant la matrice de 3 vers 5 ). La durée des étapes d extension des amorces peut être augmentée si la région de l ADN à amplifier est longue; cependant, pour la majorité des réactions PCR, une durée d extension de 1 minute est suffisante pour obtenir une extension complète.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 12 Instrumentation et composants pour la PCR Instruments Deux progrès majeurs ont permis d automatiser le processus de la PCR: a. L utilisation d ADN polymérases thermostables, qui résistent à l inactivation aux hautes températures. Ainsi, une partie aliquote initiale de polymérase peut durer pendant un grand nombre de cycles du protocole. b. Le développement des bains de température, qui peuvent augmenter et abaisser rapidement leur température de manière automatisée et programmée. On les appelle des thermocycleurs ou machines PCR. Plusieurs types de dispositifs de variation de la température sont utilisés. Par exemple: chauffage et refroidissement par des fluides, chauffage par résistance électrique et refroidissement par un fluide, chauffage par résistance électrique et refroidissement par semi-conducteurs. La Figure 7 montre un profil typique de cycles de température pour un protocole en trois étapes. Figure 7. Profil de cycles de température PCR Les paramètres des cycles de température, comme la dénaturation, l hybridation des amorces et l extension des amorces, déjà mentionnés, ainsi que les composants utilisés et le nombre de cycles, décrits dans les paragraphes ci-dessous, sont essentiels pour le succès de la PCR.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 13 ADN cible En principe, la PCR peut être effectuée si au moins une copie intacte du gène cible est présente. Un plus grand nombre de copies cibles améliore la probabilité de succès l amplification de l ADN. Tout dommage, tel qu une entaille dans l ADN cible, bloquera la PCR. La taille de la séquence cible peut se situer entre moins de 0,1 et quelques kilobases. La quantité totale d ADN généralement utilisée pour la PCR est de 0,05 à 1,0 µg, ce qui permet la détection de copies uniques de la séquence cible. Même si un échantillon ne doit pas être hautement purifié, certains contaminants, tels que l héparine, des hèmes, le formol, des chélateurs Mg 2+, ainsi que des détergents, doivent être éliminés pour éviter l inhibition du processus d amplification. Amorces D une façon générale, les amorces utilisées ont une longueur de 16 30 nucléotides, ce qui autorise une température d hybridation raisonnablement élevée. Les amorces doivent être exemptes de suites de séquences de polybases (poly-dg, par exemple) ou de motifs répétitifs, ceux-ci pouvant s hybrider de manière inadéquate avec la matrice. Il convient d éviter les séquences répétées inversées afin d empêcher la formation de structures secondaires dans l amorce, ce qui empêcherait l hybridation avec la matrice. Les séquences complémentaires d autres amorces utilisées dans la PCR devraient également être évitées afin d empêcher l hybridation entre amorces ou la formation de dimères d amorce (particulièrement important pour l extrémité 3 de l amorce). Si possible, l extrémité 3 de l amorce devrait être riche en bases de G et C pour une meilleure hybridation de l extrémité qui sera étendue. La distance entre les amorces devrait être inférieure à 10 Kb. En général, on observe une réduction substantielle du rendement lorsque les amorces sont distantes de plus de 3 Kb environ. Des oligonucléotides sont généralement utilisés à la concentration de 1 µm dans la PCR, ce qui est suffisant pour au moins 30 cycles d amplification. Une concentration plus élevée d oligonucléotides peut entraîner l amplification de séquences non cibles indésirables. Inversement, la PCR est inefficace lorsque la concentration d amorce est trop faible. ADN polymérase La méthode PCR originelle utilisait le fragment Klenow de l ADN polymérase d E. coli (Saiki et al., 1985). Toutefois, cette enzyme se dénature à des températures plus

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 14 basses que celle requise pour la dénaturation de la plupart des matrices bicaténaires. Ainsi, dans les premières expériences, de l enzyme fraîche devait être ajoutée à la réaction après chaque cycle. En outre, les échantillons devaient être déplacés d un bain de température à un autre pour permettre les différentes étapes de dénaturation, d hybridation et de polymérisation. Il est évident que l utilisation d ADN polymérase thermorésistante a facilité le processus, car l ajout d enzymes après chaque étape de dénaturation n est plus nécessaire. En général, les ADN polymérases ne peuvent incorporer que des nucléotides de l extrémité 3 d un polynucléotide. La première ADN polymérase thermostable utilisée était l ADN polymérase Taq, isolée dans la bactérie Thermus aquaticus (Saiki et al., 1988). Bien que cette enzyme soit probablement celle qui est la plus largement utilisée dans les applications de la PCR, plusieurs autres ADN polymérases sont commercialisées. Le Tableau 1 indique les propriétés de certains ADN polymérases thermostables actuellement utilisées pour la PCR (Newton et Graham, 1994). Tableau 1. Caractéristiques de certaines ADN polymérases utilisées pour la PCR Source Application Taq/ AmpliTaq Thermus aquaticus Taq: AmpliTaq naturelle: pour génie génétique Vent Thermococcus litoralis Pour génie génétique Deep- Vent Pyrococcus GB-D Pour génie génétique Pfu Tth UITma Pyrococcus Furiosus Naturelle Thermus thermophilus Pour génie génétique Thermotoga maritima Pour génie génétique T ½ d activité à 95 ºC (mn) 40 1380 400 >120 20 >50 a Activité exonucléase 5 3 Oui Non Non Non Oui Non Activité exonucléase 3 5 Non Oui Oui Oui Non Oui Processivité 50-60? 7? 30-40? Vitesse d extension (nt/s) Extrémités d ADN résultantes 75? >80 60 >33? 3 A >95 % franches >95 % franches? 3'A franches PM en kda 94?? 92 94 70

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 15 ADN polymérase Taq/AmpliTaq. Comme indiqué plus haut, cette enzyme a été isolée chez la bactérie Thermus aquaticus, qui vit dans une source thermale dans le parc national Yellowstone aux États-Unis, à des températures proches de 85 C. La température de travail optimale de cette enzyme est de 70 80 C. À cette température, la bactérie synthétise l ADN à une vitesse de 35 100 nucléotides/seconde. Le nombre moyen de nucléotides qu une enzyme incorpore dans l ADN avant de se détacher de la matrice est appelé processivité. L ADN polymérase AmpliTaq est une enzyme génétiquement modifiée exprimée par E. coli. Comme AmpliTaq est recombinante, la pureté et la reproductibilité de cette enzyme sont plus élevées que celles du type sauvage. Toutefois, une contamination potentielle peut se produire pendant l amplification de l ADN avec certaines séquences homologues d E. coli. Dans ce cas, il est recommandé d utiliser une ADN polymérase qui n a pas été exprimée, avec E. coli comme organisme hôte. Les ADN polymérases tant Taq qu AmpliTaq possèdent une activité exonucléase 5 3, qui élimine les nucléotides en avant de la chaîne en progression. ADN polymérases Vent, DeepVent, Pfu et UITma. Ces enzymes ont une activité exonucléase 3 5 qui permet l élimination des résidus mésappariés jusqu à ce qu il se forme un terminus à bases correctement appariées. Cependant, l activité exonucléase 3 5 peut causer une dégradation des amorces. Par conséquent, il convient de n ajouter l enzyme qu après que la réaction a commencé ou d utiliser des amorces chimiquement modifiées. ADN polymérase AmpliTaqGold. Cette enzyme consiste en une ADN polymérase AmpliTaq inactive à la température ambiante et ne peut être activée qu au cours d une période d incubation à 94 C. Dans ce cas, le programme du thermocycleur devrait comprendre une période de pré-incubation à une température de 92 95 C. Pour la PCR «à libération contrôlée», la pré-incubation peut être éliminée, mais au moins 10 cycles de plus que dans la PCR classique doivent être exécutés. Tampons de réaction et MgCl 2 dans les réactions PCR Outre les réactifs qui interviennent directement dans la réaction, la PCR requiert un tampon approprié. La composition du tampon dépend du type et des caractéristiques

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 16 de l enzyme utilisée et la plupart des fournisseurs fournissent généralement un tampon 10x pour utilisation avec l enzyme respective. Le tampon de réaction le plus couramment utilisé avec l ADN polymérase Taq/AmpliTaq contient: 10 mm de Tris, ph 8,3 50 mm de KCl 1,5-2,5 mm de MgCl 2 La présence de cations bivalents dans la PCR est essentielle. La concentration de MgCl 2 dans le mélange de réaction final est généralement de 0,5 à 5,0 mm, et la concentration optimale est déterminée empiriquement (Innis et Gelfand, 1990). Les ions Mg 2+ : forment un complexe soluble avec les dntp, ce qui est essentiel pour l incorporation des dntp, stimulent l activité polymérase, augmentent la T f de l interaction amorce/matrice (et stabilisent par conséquent l interaction entre les deux chaînes). En général, une faible concentration de Mg 2+ conduit à un faible rendement (ou à une production nulle), alors qu une concentration de Mg 2+ élevée entraîne une accumulation de produits non spécifiques («mésamorçage»). Il est important d éviter la présence, dans la solution d ADN matrice, d une concentration élevée de chélateurs tels que l EDTA ou de groupes ioniques à charge négative tels que le phosphate. On trouve dans la littérature actuelle des discussions sur différents tampons et suppléments PCR, tels que le DMSO, le PEG 6000, le formamide, le glycérol, la spermidine et des détergents non ioniques, utilisés pour accroître la spécificité ou l efficacité de la réaction (Roux, 1995). Certaines ADN polymérases atteindront en effet leur niveau d activité optimal (Rolfs et al., 1992) seulement en présence de ces suppléments. Désoxyribonucléoside triphosphates Des désoxyribonucléoside triphosphates libres (dntp) sont nécessaires pour la synthèse de l ADN. Les concentrations de dntp pour la PCR devraient être de 20 à 200 µm pour chaque dntp et les quatre dntp devraient être utilisés à des concentrations équivalentes pour réduire au minimum les erreurs de mésincorporation (Innis et al., 1988). Des dntp de grande pureté sont fournis par plusieurs fabricants sous forme soit de quatre stocks individuels, soit de mélange des

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 17 quatre dntp. Les solutions de stock de dntp (généralement 100 mm) devraient être ajustés à un ph de 7,0 7,5 avec 1 M de NaOH pour que le ph de la réaction finale ne tombe pas au-dessous de 7,1 (Sambrook et al., 1989); cependant, beaucoup de solutions de stock de dntp sont maintenant fournies avec un ph déjà ajusté. Nombre de cycles et effet plateau Le nombre de cycles d amplification nécessaires pour produire une bande visible sur un gel dépend en grande partie de la concentration initiale d ADN cible. Pour amplifier 50 molécules cibles, 40 45 cycles sont recommandés, tandis que 25 30 cycles sont suffisants pour amplifier 3x10 5 molécules de la même concentration (Innis et Gelfand, 1990). Cette non-proportionnalité est due à l effet plateau, qui est l atténuation du taux exponentiel d accumulation de produit dans les dernières étapes d une PCR, lorsque le produit atteint 0,3 1,0 nm. Cela peut être dû à la dégradation des réactifs (dntp, enzyme), à l épuisement de réactifs (amorces problème avec les produits courts, dntp problème avec les produits longs), à l inhibition du produit final (formation de pyrophosphate), à la compétition pour les réactifs par les produits non spécifiques, compétition pour la liaison avec les amorces par réhybridation du produit concentré (10 nm) (Innis et Gelfand, 1990). Si le produit désiré n est pas obtenu en 30 cycles, un petit échantillon (1 µl) du produit amplifié devra être prélevé, mélangé et ré-amplifié en 20 30 cycles dans un nouveau mélange réactif, plutôt que d augmenter le nombre de cycles. Dans certains cas où la concentration de matrice est faible, cette ré-amplification peut produire un bon produit, contrairement à la prolongation à 40 cycles ou plus. Conception des amorces pour la PCR La conception des amorces est sans doute le paramètre le plus important pour le succès de la PCR. Toutes choses égales par ailleurs, une amorce mal conçue peut empêcher le fonctionnement de la réaction PCR. La séquence d amorce détermine plusieurs choses, telles que la position et la longueur du produit, sa température de fusion et finalement le rendement (Innis et Gelfand, 1994). Une amorce mal conçue peut conduire à une production faible, voire nulle, en raison d une amplification non spécifique et/ou à la formation de dimères d amorce, qui peuvent devenir suffisamment compétitifs pour inhiber la formation de produit. Cette note d application a pour but d établir des règles dont il convient de tenir compte lors de la

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 18 conception d amorces pour la PCR. Ce sujet est traité plus en détail dans d autres publications (Dieffenbach et al., 1995). Sélection des amorces Plusieurs variables doivent être prises en considération lors de la conception des amorces pour la PCR. En voici quelques-unes des plus importantes: longueur de l amorce, température de fusion (T f ), spécificité, séquences d amorce complémentaires teneur en G/C et suites polypyrimidine (T, C) ou polypurine (A, G), séquence à l extrémité 3. Chacun de ces éléments essentiels est examiné dans les sections suivantes. Longueur de l amorce Comme la spécificité, la température et le temps d hybridation dépendent en partie de la longueur de l amorce, ce paramètre est essentiel pour le succès de la PCR. En général, les oligonucléotides entre 18 et 24 bases sont extrêmement spécifiques de la séquence, à condition que la température d hybridation soit optimale. La longueur de l amorce est également proportionnelle à l efficacité de l hybridation. En général, plus l amorce est longue, moins l hybridation est efficace. Le nombre de matrices amorcées diminuant à chaque étape, cela peut aboutir à une diminution sensible de produit amplifié. Les amorces ne devraient toutefois pas être trop courtes, à moins que l application l exige spécifiquement. Comme indiqué ci-dessous, l objectif est de concevoir une amorce dont la température d hybridation est d au moins 50 C. La relation entre la température d hybridation et la température de fusion est l une des «boîtes noires» de la PCR. Une règle générale est d utiliser une température d hybridation qui est 5 C plus basse que la température de fusion. Souvent, la température d hybridation déterminée de cette façon ne sera pas optimale et il faudra procéder empiriquement pour déterminer la température optimale. À cet effet, le plus facile est d utiliser un thermocycleur à gradient.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 19 Température de fusion (T f ) Il est important de se rappeler que deux amorces sont ajoutées à une PCR dirigée sur un site ou une cible. Les deux amorces d oligonucléotides doivent être conçues de sorte qu elles aient des températures de fusion semblables. Si les amorces ne concordent pas en termes de T f, l amplification sera moins efficace ou peut ne pas fonctionner du tout, car l amorce avec la T f la plus élevée haut va mésamorcer aux basses températures et l amorce avec la T f plus basse peut ne pas fonctionner aux hautes températures. Les températures de fusion des oligonucléotides sont déterminées le plus exactement à l aide de calculs thermodynamiques du type «plus proches voisins» avec la formule suivante: T f amorce = H [ S+ R ln (c/4)] -273.15 C + 16.6 log 10 [K + ] (2) où H est l enthalpie et S est l entropie pour la formation de l hélice, R est la constante molaire des gaz et c est la concentration d amorces. Le plus simple est d utiliser les logiciels de conception d amorces déjà disponibles sur le marché (Sharrocks, 1994). Heureusement, une bonne approximation de cette valeur (généralement valide pour les oligonucléotides de 18 24 bases) peut être obtenue à l aide de la formule suivante: T f = 2(A+T) + 4(G+C) (3) où A, T, G et C sont les bases purine et pyrimidine. Au Tableau 2 figurent des valeurs calculées pour des amorces de différentes longueurs à l aide de cette équation (appelée formule de Wallace) et en supposant une teneur en GC de 50 % (Suggs et al., 1981).

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 20 Tableau 2. Calcul de la température de fusion des amorces avec l équation de Wallace Longueur de l amorce T f = 2 (A+T) + 4(G+C) Longueur de l amorce T f = 2 (A+T) + 4(G+C) 4 12 C 22 66 C 6 18 C 24 72 C 8 24 C 26 78 C 10 30 C 28 84 C 12 36 C 30 90 C 14 42 C 32 96 C 16 48 C 34 102 C 18 54 C 36 108 C 20 66 C 38 114 C Les températures calculées à l aide de la règle de Wallace sont imprécises pour les valeurs extrêmes de ce Tableau. Lors du calcul des températures de fusion des amorces, il convient de veiller à ce que la température de fusion du produit est suffisamment basse pour obtenir une fusion de 100 % à 92 C. Bien que ce paramètre contribue à assurer une PCR plus efficace, il n est pas toujours nécessaire pour le succès de la PCR. En général, les produits entre 100 et 600 paires de base sont efficacement amplifiés dans de nombreuses réactions PCR. En cas de doute, la T f du produit peut être calculée à l aide de la formule suivante: T f =81.5 + 16.6 (log 10 [K+] + 0.41 (%G+C)-675/longueur (4) Spécificité Comme mentionné plus haut, la spécificité de l amorce dépend au moins partiellement de la longueur de l amorce. Il est évident qu il y a beaucoup plus d oligonucléotides uniques à 24 paires de bases qu à 15 paires de bases. Ceci dit, les amorces doivent être choisies de telle sorte qu elles aient une séquence unique dans l ADN matrice qui doit être amplifié. Une amorce conçue avec une séquence hautement répétitive conduira à une traînée lors de l amplification d ADN génomique.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 21 Toutefois, la même amorce peut donner une bande unique si un clone unique d une bibliothèque génomique est amplifié. Comme l ADN polymérase Taq est active dans une large gamme de températures, l extension de l amorce se produira aux basses températures d hybridation. Si la température est trop basse, un amorçage non spécifique peut se produire, qui peut être étendu par la polymérase s il y a une homologie courte à l extrémité 3. En général, une température de fusion de 55 72 C donne les meilleurs résultats (à noter que cela correspond à une longueur d amorce de 18 24 bases avec la règle de Wallace). Séquences d amorce complémentaires Les amorces doivent être conçues absolument sans aucune homologie intra-amorce au-delà de 3 paires de bases. Si une amorce possède une telle région d autohomologie, des structures partiellement doubles brin en «épingles à cheveux» peuvent se former, qui perturberont l hybridation avec la matrice. Un autre risque connexe est l homologie inter-amorce. L homologie partielle dans les régions centrales de deux amorces peut interférer avec l hybridation. Si l homologie se situe à l extrémité 3 de l une ou de l autre amorce, la formation de dimères d amorce se produira, ce qui, par compétition, empêchera le plus souvent la formation du produit désiré. Teneur en G/C et suites polypyrimidine (T, C) ou polypurine (A, G) Les amorces devraient être composées à 45-55 % de GC. La séquence d amorce doit être choisie de telle sorte qu il n y ait aucune suite poly-g ou poly-c pouvant promouvoir une hybridation non spécifique. Les suites poly-a and poly-t doivent également être évitées, car elles «respireront» et ouvriront des parties du complexe amorce-matrice. Cela peut réduire l efficacité de l amplification. Les suites polypyrimidine (T, C) et polypurine (A, G) devraient également être évitées. Idéalement, l amorce présentera un mélange presque aléatoire de nucléotides, une teneur de 50 % en GC et une longueur d environ 20 bases. La T f se situera alors entre 56 et 62 C (Dieffenbach et al., 1995).

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 22 Séquence à l extrémité 3 Il est établi que la position terminale 3 dans les amorces PCR est essentielle pour empêcher le mésamorçage. Le problème des homologies d amorce se produisant dans ces régions a déjà été examiné. Une autre variable à considérer est l inclusion d un résidu G ou C à l extrémité 3 des amorces. Ce «crampon GC» contribue à la fixation correcte à l extrémité 3 en raison de la liaison hydrogène plus forte des résidus G/C. Cela contribue également à une plus grande efficacité de la réaction en réduisant au minimum la «respiration» qui pourrait se produire. PCR spécialisée Outre l amplification d une séquence d ADN cible par les procédures PCR habituelles déjà décrites, plusieurs types spécialisés de PCR ont été mis au point pour des applications spécifiques. PCR nichée Des séries d amorces successives peuvent être utilisées pour améliorer le rendement PCR de la séquence d ADN cible (Newton et Graham, 1994). La PCR nichée est effectuée en 15 à 30 cycles avec une série d amorces, puis en 15 à 30 cycles supplémentaires avec une deuxième série d amorces, pour une région interne du premier produit ADN amplifié. Ainsi, le plus grand fragment produit lors des premiers cycles de la PCR est utilisé comme matrice pour la seconde PCR. La PCR nichée peut augmenter considérablement la sensibilité et la spécificité de l amplification de l ADN. La spécificité est particulièrement améliorée parce que cette technique élimine presque toujours tout faux produit d amplification non spécifique. Cela est dû au fait qu après la première PCR il est peu probable que les produits non spécifiques soient suffisamment complémentaires des amorces successives pour pouvoir servir de matrice pour une amplification supplémentaire, la séquence cible désirée étant dès lors amplifiée préférentiellement. Toutefois, le risque accru de contamination est un inconvénient de cette sensibilité extrême et l exécution de ces PCR doit avoir lieu avec le plus grand soin, particulièrement en laboratoire diagnostique.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 23 PCR multiplex Alors que la PCR standard utilise généralement une paire d amorces pour amplifier une séquence spécifique, la PCR multiplex utilise des paires multiples d amorces pour amplifier simultanément un grand nombre de séquences. La présence de nombreuses amorces PCR dans un seul tube pourrait poser beaucoup de problèmes, tels que la formation accrue de produits PCR mésamorcés, de dimères d amorce et la discrimination d amplification de fragments d ADN plus longs (Atlas et Bey, 1994). Pour ce type d amplification PCR, on choisit des amorces ayant des températures d hybridation semblables. Les longueurs des produits amplifiés devraient être semblables; de grandes différences de longueur des ADN cibles favoriseront l amplification de la cible courte par rapport à la cible longue, ce qui aboutit à des différences de rendement de produits amplifiés. En outre, les tampons utilisés pour la PCR multiplex contiennent la polymérase Taq, qui diminue la compétition entre les amplicons et la discrimination de fragments d ADN plus longs pendant la PCR multiplex. Les produits de la PCR multiplex peuvent subir une hybridation supplémentaire avec une sonde spécifique du gène pour vérification. La PCR dans la pratique Comme déjà indiqué dans les sections précédentes, la PCR est une puissante technique analytique et préparatoire qui est largement utilisée. Cependant, en raison de la nature de cette procédure, des traces de contaminants de l ADN pourraient servir de matrices, ce qui conduirait à l amplification du mauvais acide nucléique cible (faux positifs). Par conséquent, il est essentiel d effectuer l amplification PCR dans un environnement exempt d ADN. Les zones de travail physiquement séparées et dotées d équipements spécialisés réduisent le risque de contamination. Le respect strict des exigences en matière de décontamination (décontamination des acides nucléiques, prévention des aérosols, etc.) est la condition préalable la plus importante pour réduire au maximum le taux de faux positifs. La contamination PCR peut provenir de plusieurs sources: paillasses de laboratoire, équipements et dispositifs de pipetage, qui peuvent être contaminés par des préparations ADN précédentes ou par des fragments de restriction épurés,

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 24 contamination croisée entre échantillons, produits d amplifications PCR précédentes. Cette section contient un certain nombre de recommandations, le but étant de définir les exigences habituelles pour l établissement et l entretien d un environnement propre pour tout système de dosage basé sur la PCR, indépendamment du nombre d échantillons traités (Roth et al., 1997). Méthodes physiques de prévention Équipements de laboratoire. Afin d éviter une contamination, des zones de travail physiquement séparées devront être établies de la manière suivante. 1. Zone de préparation des échantillons Cette pièce consiste en une zone où ont lieu toutes les étapes précédant l amplification de l ADN matrice (par exemple, isolement et purification de l ADN). 2. Zone de préparation de la PCR Cette pièce «propre» est consacrée aux procédures de préparation de la PCR (par exemple, mastermix, dilution des amorces, etc.). 3. Zone post-pcr La zone est consacrée à l amplification de la séquence d ADN cible ainsi qu à la détection et à l analyse des produits PCR. En outre, il convient de respecter les règles générales suivantes. Toutes les pièces doivent contenir des équipements spécialisés (tabliers, gants, réactifs et fournitures). Les réactifs et appareils doivent être étiquetés avec indication du contenu et de la date de préparation. Utiliser un système de flux unidirectionnel, c est-à-dire ne jamais transférer des matières, des échantillons ou des équipements des zones post-pcr vers les zones pré-pcr. Utiliser des tubes PCR jetables qui sont exempts de DNase et de RNase. Utiliser des embouts de pipette spéciaux résistants aux aérosols et un ensemble de pipettes réservé exclusivement à la PCR, de préférence des pipettes à déplacement positif. Si possible, préparer la PCR sous une hotte d aspiration équipée d un éclairage UV. Sous la hotte d aspiration, placer une microcentrifugeuse et des gants jetables utilisés uniquement pour la PCR.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 25 Laver périodiquement les paillasses et les étagères à l eau de Javel à 10 %, puis à l éthanol à 70 %. Manipulation des échantillons Toujours utiliser des techniques stériles et porter des gants neufs lors du travail dans les zones décrites précédemment. Changer les gants fréquemment, particulièrement si on suspecte qu ils ont été contaminés par des solutions contenant l ADN matrice. Toujours utiliser des ustensiles en verre/plastique et des pipettes neufs ou stérilisés pour la préparation des réactifs PCR et de l ADN matrice. Stériliser à l autoclave tous les réactifs et solutions qui peuvent subir ce traitement sans problème pour leur performance. Bien sûr, les amorces, les dntp et l ADN polymérase Taq ne devront pas être stérilisés à l autoclave. Avoir à disposition son propre ensemble de réactifs et de solutions PCR qui ne sont utilisés que pour la PCR, et stocker ces réactifs en petites parties aliquotes. Lors du pipetage d ADN, éviter de créer des aérosols qui peuvent transporter des contaminants. Toujours prévoir des réactions de contrôle, par exemple un contrôle négatif («pas d ADN») qui contient tous les composants de la réaction sauf l ADN matrice, et un contrôle positif qui a été utilisé avec succès dans des PCR antérieures. Méthodes biochimiques de prévention Uracile-ADN glycosylase. La PCR peut amplifier un milliard de fois une seule molécule. Par conséquent, même des quantités infimes d un contaminant peuvent être amplifiées et conduire à un faux positif. Ces contaminants sont souvent des produits d amplifications PCR antérieures (contamination par transfert). C est pourquoi des méthodes permettant d éviter cette contamination ont été mises au point.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 26 Une méthode couramment utilisée consiste à substituer le dutp au dttp pendant l amplification PCR pour produire de l ADN contenant de l uracile (U-ADN) (Longo et al., 1990). Le traitement des mélanges PCR par l uracile-adn glycosylase (UNG) avant l amplification PCR, suivi du clivage des polynucléotides pyrimidine à haute température (95 C) dans des conditions alcalines (pendant l étape de dénaturation initiale) débarrassera l échantillon de l U-ADN contaminant (voir Figure 8). Figure 8. Réaction à l uracile-adn glycosylase Cette méthode exige bien sûr que toutes les PCR dans le laboratoire soient effectuées avec le dutp au lieu du dttp. Remarques concernant l utilisation de produits PCR contenant du dutp dans les applications en aval: les performances des produits PCR contenant du dutp sont aussi bonnes que celles des produits contenant du dttp lorsqu ils sont utilisés comme cibles d hybridation ou comme matrices pour le séquençage didésoxy; les produits PCR contenant du dutp peuvent être clonés directement s ils sont transformés en hôtes bactériens reconnaissant l UNG; un substrat contenant du dutp est aisément digéré par certaines enzymes de restriction courantes (EcoR I et BamH I, par exemple), tandis que d autres présentent une activité réduite (Hpa I, Hind II, Hind III, par exemple) sur ces substrats; l utilisation d ADN contenant du dutp n est pas recommandée pour les études sur la fixation des protéines ou les interactions ADN-protéines.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 27 DNase I, exonucléase III. D autres méthodes biochimiques sont basées sur le traitement de l ADN contaminé par la DNase I, l exonucléase III ou par une enzyme de restriction contenant une séquence de reconnaissance dans l ADN cible. Cependant, en raison des strictes conditions de réaction exigées, ces enzymes présentent l inconvénient de réduire l efficacité de l amplification PCR. Préparation du mélange pour la réaction PCR (mastermix) Les composants réactifs essentiels pour la PCR sont l eau, le tampon de réaction, une ADN polymérase thermostable, des amorces d oligonucléotides, des désoxynucléotides (dntp), de l ADN matrice (cible) et des ions magnésium (Mg 2+ ). En général, tous les réactifs (sauf l ADN matrice) sont mélangés dans un seul tube en quantités suffisantes pour le nombre de réactions à effectuer (mastermix). Le mastermix est ensuite réparti en parties aliquotes dans plusieurs tubes et l ADN matrice est ajouté. L utilisation d une solution mastermix réduit le risque de contamination et améliore la performance de la réaction PCR pour les raisons suivantes: une qualité uniforme de la solution est garantie pour tous les réactifs pour une série d analyses, le risque de contamination du parent et des solutions résultantes est réduit, de plus grands volumes peuvent être prélevés par pipette, les pipetages sont moins nombreux, ce qui fait gagner du temps. Le succès de l amplification de la région d intérêt dépend de la quantité et de la qualité de l ADN matrice. La quantité de matrice nécessaire dépend de la complexité de l échantillon d ADN. Étant donné que la taille du génome nucléaire varie d un organisme à l autre, la concentration en ADN doit être maintenue constante (généralement 10 ng/µl). Au Tableau 3 figure une comparaison de la taille du génome d espèces végétales fréquemment utilisées dans la transformation de plantes et du nombre correspondant de copies du génome dans une quantité définie d ADN. Par exemple, dans un plasmide de 4 kb contenant un insert de 1 kb, 25 % de l ADN de départ constituent la cible d intérêt. Inversement, un gène de 1 kb dans le génome du maïs (5 x 10 9 pb) représente approximativement 0,00002 % de l ADN de départ. Environ 1 000 000 plus d ADN génomique de maïs est nécessaire pour maintenir le même nombre de copies cibles par réaction. Pour des résultats optimisés, plus de

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 28 104 copies de la séquence cible doivent être utilisées comme matrice initiale pour obtenir un signal en 25 30 cycles. Tableau 3. Comparaison de la taille du génome de certaines espèces végétales et copies correspondantes du génome dans une quantité définie d ADN Échantillon Taille du génome Copies du génome dans 1 µg d ADN Copies du génome dans 1 ng d ADN Maïs 5 x 10 9 pb 1,85 x 10 5 185 Soja 1,55 x 10 9 pb 5,98 x 10 5 598 Tabac 3,8 x 10 9 pb 2,43 x 10 5 245 Riz 4 x 10 8 pb 2,31 x 10 6 2 310 Même si, dans la pratique, moins de 10 copies d une séquence cible peuvent être amplifiées, dans ce cas davantage de cycles PCR peuvent être nécessaires pour détecter un signal par électrophorèse sur gel. Les protocoles généraux couramment appliqués considèrent un certain nombre de cycles de 30 à 40. Il convient d être prudent lorsqu on augmente encore le nombre de cycles, car cela peut accroître l amplification non spécifique. Contrôles Comme indiqué dans la section précédente, on trouve des sources potentielles de contamination partout dans le laboratoire. Les échantillons, le personnel du laboratoire, la climatisation, les équipements et les réactifs peuvent tous être une source de contamination. Parmi les agents contaminants, on peut citer les suivants: 1. contamination par transfert d ADN cible amplifié lors de PCR antérieures; 2. contamination croisée entre échantillons, ce qui conduit au transfert d ADN cible d un échantillon à l autre; 3. ADN génomique de préparations d échantillons antérieures; 4. produits de dégradation de réactions de décontamination. Alors que les trois premières formes de contamination produisent des faux positifs, le dernier type conduit à des faux négatifs. Cette forme de contamination, observée pour la première fois par Niederhauser et collaborateurs en 1994, provoque l inhibition des réactions PCR (Niederhauser et al., 1994). En fait, la décontamination selon la méthode UNG favorise la formation de complexes avec les amorces.

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 29 Pour obtenir des résultats fiables, des contrôles tant positifs que négatifs doivent toujours être utilisés pendant une réaction PCR. Le Tableau 4 indique quelques-uns des contrôles les plus couramment utilisés pour assurer la performance des procédures d amplification d acide nucléique. Tableau 4. Contrôles à introduire dans les tests basés sur la PCR Contrôle Contamination des réactifs par l ADN cible Méthode Contrôle négatif sans ADN matrice (seulement mastermix) Spécificité de la réaction Contrôles pour trouver les produits secondaires et non spécifiques Développement et sensibilité de la réaction Intégrité du mélange PCR Contrôles positifs/négatifs pour vérifier que les conditions et les rendements désirés sont obtenus Contrôle positif pour l ADN Contrôles positifs L efficacité de l extraction de l ADN et de son amplification doit être vérifiée au moyen de contrôles positifs. Idéalement, les limites de détection devraient être données en tant qu équivalents génomiques, ce qui permettrait la production de contrôles à sensibilité définie, avec de petits nombres de copies. En règle générale, il faut disposer d une préparation de référence contenant une concentration connue de l ADN cible à l étude. Contrôles négatifs Une contamination (transfert de produits ou acides nucléiques amplifiés) peut se produire pendant l isolement et la purification de l ADN cible, ainsi que pendant la préparation du mélange de la réaction d amplification. Il est donc nécessaire d ajouter un contrôle négatif au mélange de la réaction d amplification.