M1 immuno 11/12/07 RT : Sauvet gabriella TRANSDUCTION DU SIGNAL DES RECEPTEURS T ET B 1- Stimulation des lymphocytes par l antigène 2- Plusieurs protéines membranaires «aident» le récepteur de l antigène 3- Couplage de récepteurs membranaires aux fonctions effectrices 4- Transmission de l info dans la cellule (de la membrane jusqu au noyau : différentes stratégies) 5- Classe de protéines de signalisation 6- Architecture des protéines de signalisation 7- Plusieurs domaines d interactions conservés 8- Transduction du signal des récepteurs T et B 9- Pathologies : les immunodéficiences héréditaires (quand le signal ne passe plus) Il faut que la cellule reçoive un signal de l extérieur donné par un ligand (protéine extracellulaire) qui se fixe sur son récepteur pour qu il y ait mise en marche d un circuit intracellulaire. Ce circuit doit interpréter et intégrer les signaux de l extérieur pour que la cellule mette en place la réponse adéquate. Stimulation des lymphocytes par l antigène L antigène, en se fixant au récepteur (TCR, BCR) à la surface de la cellule T, initie une série de réponse que le lymphocyte T met en place : modifications de : adhésion, morphologie, polarisation, migration, cytotoxicité qui ne requièrent pas l activation d un programme transcriptionnel mais par contre les autres réponses : différenciation et prolifération de la cellule T immature, apoptose ont une transcription spécifique. 1- Plusieurs protéines membranaires «aident» le récepteur de l antigène Le TCR reconnaît l antigène lié aux protéines du CMH et donne le signal de départ d activation que d autres molécules modifieront : a) Corécepteurs : la protéine CD4 recrute les protéines de signalisation TCR/ CMH b) Protéines d adhésion : favorisent l interaction des cellules T avec les cellules présentatrices de l antigène (CPA) ou des cellules cibles (dans le cadre de la cytotoxicité) c) Protéines de co-stimulation : les protéines CD2 et CD28 modifient quantitativement et qualitativement le signal donné par TCR 1
2- Couplage de récepteurs membranaires aux fonctions effectrices a) Récepteurs tyrosine kinase : récepteur transmembranaire avec une partie extracellulaire (R) qui reconnaît le ligand et directement couplée à une fonction effectrice d activité enzymatique (E) Ex : EGF, PDGF, récepteurs aux cytokines b) Récepteurs couplés à une GTPase (à 7 domaines transmembranaires) : toujours une partie extracellulaire qui reconnaît le ligand mais la partie effectrice se situe dans une autre sous-unité couplée au récepteur Ex : récepteur de chimiokines c) Immuno-récepteurs : une chaine du récepteur reconnaît le ligand mais n est pas capable de transmettre directement le signal à l intérieur de la cellule. Elle est donc couplée à l activité enzymatique soit par une chaine accessoire, soit par une protéine adaptatrice intracytoplasmique. Ex : cas des récepteurs immunitaires (TCR, BCR, FcR ) 3- Transmission de l info dans la cellule (de la membrane jusqu au noyau : différentes stratégies) a) Modification de l activité enzymatique : modifications post-traductionnelles (phosphorylation, méthylation ), interactions avec d autres protéines régulatrices (interaction protéine-protéine) b) Modification de la localisation intracellulaire d une protéine : la protéine peut être recrutée à la membrane plasmique ou transportée du cytosol au noyau c) Production de 2 nd messagers : solubles et qui diffusent dans la cellule (calcium, lipides, inositol phosphate ) 4- Classe de protéines de signalisation a) Protéines avec activité enzymatique Protéines kinase/phosphatase : transfert/hydrolyse de phosphate (Tyr, Ser/Thr, double spécificité) Lipides kinases/phosphatase : transfert groupe phosphate sur un lipide, génération de 2 nd messagers Phospholipases : contrôlent le métabolisme lipidique en hydrolysant la partie polaire du lipide qui devient 2 nd messager GTPases : elles hydrolysent le GTP, localisation/activation d enzymes 2
b) Protéines adaptatrice ou d échafaudage Pas d activité enzymatique Rôle : créer un lien entre 2 protéines qui ne pourraient pas s attacher cad un couplage entre protéines différentes (Ex : Grb2, Gads, Shc, Nck ) Assemblage de plusieurs protéines, donc plusieurs concepts : adaptation concentration : toute une série de protéines pouvant être mises ensemble coopérativité des interactions, ajout de ponts de régulation localisation 2 types de protéines : transmembranaire (LAT, Cbp/PAG ) et cytosolique, recrutée à la membrane (SLP-76, BLNK, Gab ) 5- Architecture des protéines de signalisation basée essentiellement sur l utilisation de modules «prêts à l emploi» que l on retrouve dans plusieurs protéines ayant un avantage sélectif permettant d augmenter le nombre de combinaisons possibles Ex : domaines SH3 retrouvés dans plusieurs protéines de signalisation 6- Plusieurs domaines d interactions conservés a) Domaines d interaction inductibles : détectent les modifications posttraductionnelles des protéines et contrôlent les interactions qui se font quand la cellule est stimulée (qu au moment de l activation) Ex : SH2 reconnaît les tyrosines phosphorylées b) Domaines d interaction constitutive : même dans les cellules désactivées, reconnaissent des séquences et motifs spécifiques d une protéine Ex : SH3 (ou WW) reconnaît les séquences riches en proline, reconnaissance entre domaine PDZ et le C-term de certaines protéines Domaines SH (Src-Homology) : d homologie avec la kinase Src SH1 presque dans toutes les kinases, se lie au domaine catalytique SH2 se lie avec séquences phosphorylées sur 2 résidus Tyr SH3 se lie avec des prolines, domaines N-term (permet ancrage membranaire) c) Domaines liant les phosphoinositides dans la membrane bio : PI(3)P se lie aux domaines FYVE et aux domaines PX PI(3,4)P2 et PI(3,4,5)P3 se lie aux domaines PH et aux domaines PX Domaines PH (Pleckstrin Homology) Présents dans de nombreuses molécules ayant des fonctions différentes (transduction, cytosquelette) Ils reconnaissent des sous-unités βγ des protéines G trimériques, des PKCs, des phosphoinositides Ils permettraient de localiser une protéine au niveau de la membrane. 3
7- Transduction du signal des récepteurs T et B (cf diapos du cours) a) Récepteurs de l antigène des LB Ig : une partie variable qui reconnaît l antigène, une partie constante, et transmembranaire (TM) En soi : ne peut pas transmettre le signal donc il faut un couplage avec les Ig α et β (chaines invariantes) qui ont un domaine cytoplasmique + important o pour la signalisation (car contenant les domaines ITAM de phosphorylation (sur tyrosine) qui seront reconnus par la protéine ayant un double domaine SH2) o et pour le transport à la membrane et l assemblage b) Récepteurs de l antigène des LT Hétérodimère : TCR α :β (TCD4 et TCD8) avec sites de reconnaissance de l antigène Chaines invariantes importantes pour l assemblage et la signalisation (motifs ITAM) liées à o un complexe CD3 : 2 copies de la chaine ε s associant à δ (CD3δε) ou γ (CD3γε) o 1 homodimère : chaine ξ contenant des motifs ITAM permettant le recrutement de protéines de signalisation c) Activation des lymphocytes T : les phases précoces Le récepteur reconnaît son ligand puis il y a interaction entre TCRα/TCRβ maintenue par CD4 ou CD8 souvent associé à une kinase de la famille Src qui peut phosphoryler ITAM. 1- Lck phosphoryle les motifs ITAM 2- ZAP-70 est recruté sur les ITAM 3- ZAP-70 est phosphorylé et activé 4- ZAP-70 induit la formation du complexe LAT-Gads-SLP76 permettant le déclenchement de la voie de signalisation en aval. d) Régulation des kinases de la famille Src par des interactions intramoléculaires 1- forme inactive : après le domaine catalytique, la queue C-term (tyr) sera phosphorylée pour interagir avec le domaine SH2, qui lui interagit avec SH3 2- forme active : l activation entraine la déphosphorylation de la tyrosine C-term qui ouvre alors la protéine et rend le site catalytique accessible aux substrats la phosphorylation d autres résidus stabilise la conformation ouverte (activée) de la protéine. 4
1. Lck inactive e) Etapes de la régulation de Lck lors de la stimulation du TCR induite par Csk sur tyrosine C-term de Lck. (Lck associée au CD4 à la membrane) Csk recrutée à la membrane par son interaction avec Cbp (PAG) Csk phosphoryle la tyrosine C-term de Lck (Y505) SH2 de Lck interagit avec py505 Lck est en conformation «fermée» donc inactive 2. Lck active Cbp est déphosphorylé et Csk est largué dans le cytoplasme CD45 déphosphoryle Y505 de Lck Lck est en conformation «ouverte» Phosphorylation du domaine catalytique de Lck (Y394) ce qui active la protéine Lck qui phosphoryle ITAM et donc active la cellule 3. recrutement de ZAP-70 par son interaction avec les motifs ITAM recrutement au niveau du récepteur T 2 domaines SH2 se lient aux motifs ITAM phosphorylés par Lck 4. régulation de ZAP-70 par phosphorylation de résidus tyrosines La phosphorylation de plusieurs tyrosines régule cette kinase : (1) le domaine catalytique, une fois phosphorylé, stabilise la forme active de l enzyme (2) d autres résidus modulent l activité de l enzyme (Ex : protéines Cbl, Vav, ou Lck) (3) régulation allostérique de l interaction SH2-pITAM 5. la plate-forme de signalisation LAT-SLP76 le recrutement d autres récepteurs en aval 1. la transcription des gènes de la cytokine (IL2) 2. modification du cytosquelette d actine 3. modification des propriétés d adhésion cellulaire 6. les multiples connections de SLP76 : Contenant plusieurs motifs d interaction : SH2 pour recruter les adaptateurs pour l adhésion (intégrines) domaine riche en proline (au centre) se lie au Gads interaction SLP76- LAT plusieurs motifs de phosphorylation de tyrosine (partie terminale) qui régulent le cytosquelette et active PLCγ 5
f) Signalisation en aval du BCR la phosphorylation des ITAM des chaines α et β, par les protéines Lyn et Fyn, des Src-kinases (Lck pour la cellule T), permet le recrutement de Syk (ZAP-70 pour la cellule T) qui active la voie en aval l adaptateur cytoplasmique = BLNK (SLP-65) interagit directement avec les chaines α et β (mais avec différents mécanismes de recrutement par rapport à SLP76) le recrutement de PLCγ1 et PLCγ2 entraine la production de 2 nd messager important pour augmenter le calcium dans la cellule Contrôle par BTK (ITK pour la cellule T) g) Production de 2 nd messagers par la phospholipase C PLCγ : phosphoryle des lipides transmembranaires (phosphoinositides) par hydrolyse de la liaison inositol avec la chaine lipidique IP3 qui relargue le calcium dans la cellule + DAG (membranaire) qui active la PKC (Ser/Thr kinase) h) Calcium intracellulaire et régulation de NFAT IP3 agit sur le réticulum endoplasmique (réservoir de calcium intracellulaire) qui relarguera le calcium dans la cellule ce calcium libre signal à la membrane plasmique contenant les canaux qui s ouvrent augmentation du calcium dans la cellule qui se fixe à la calmoduline pour activer la calcineurine qui active le facteur de transcription NFAT transcription IL2 i) Fonctions de la phosphatidyl-inositol 3-kinase (PI3K) PI3K = kinase activée par le TCR et des corécepteurs (CD28, CD19) avec 2 sous-unités dont une régulatrice avec 2 domaines SH2 (qui se lie au motif phosphorylé dans CD19), et un domaine SH3. PI3K phosphoryle la partie inositol des sous-résidus en position3 donnant PIP3 PIP3 active : 1. la kinase Akt (nbs activités différentes) qui joue sur le métabolisme, la croissance cellulaire, la survie, la prolifération cellulaire 2. PTK qui peut modifier le calcium et la transcription 3. les GTPases qui modifient l actine GTPases 1) trimérique : enzyme associé à la membrane 2) petite GTPases (ex : Ras) : interrupteur qui permet l interaction ou le recrutement d autres protéines ayant 2 formes : une liée au GTP (= forme active) / l autre liée au GDP (=forme inactive) 6
la forme active (chargée en GTP) recrute/active les effecteurs (ex : Raf1) à la membrane entrainant : le passage GDP/GTP : GEF/GRP pousse l équilibre vers la forme GTP alors que GAP favorise la catalyse du GTP la régulation de la voie MAP kinases, du cytosquelette d actine, l adhésion cellulaire, le transport vésiculaire Activation de Ras voie ubiquitaire : par activation de la protéine Sos (facteur d échange) qui entraine l activation de Ras voie dépendante de la production de calcium et DAG par PLC : DAG qui active Ras-GRP et permet le passage de la forme liée au GDP à celle liée au GTP j) Régulation de la voie des MAP kinases et activation du facteur AP1 structure à 3 étages : MKKK, MKK, MAPK les MAP kinases : ERK1, ERK2, P38, JNK prolifération, différenciation, inflammation, mort cellulaire la fonction des petites protéines G dans ERK et JNK: l activation d AP-1 (famille Fos et Jun) (ERK induit la transcription de Fos / JNK peut activer Jun) transcription IL-2 k) Activation de NF-κB par le TCR NFκB activé par une cascade dépendant du calcium dans les cellules T : PKCθ a besoin de DAG et calcium recrutement PLCγ à la membrane PKCθ recrute le complexe IKK qui une fois activé phosphoryle la protéine NFκB NFκB phosphorylé se fixera sur le promoteur de gène pour permettre la transcription d IL2 Activation de la PKCθ et recrutement à la membrane Phosphorylation de Carma1 et Bcl10 Assemblage du complexe Carma1-Bcl10-Malt1 Recrutement du complexe NEMO-IKKα/β Phosphorylation et dégradation de la sous-unité inhibitrice IκB Translocation de NF-κB dans le noyau transcription IL-2 7
9- Pathologies : les immunodéficiences héréditaires (quand le signal ne passe plus) Des mutations de protéines de signalisation sont à la base de certaines immunodéficiences héréditaires. Exemple : 1. touchant les LB mutation de la kinase BTK important dans les cellules B pour activer PLCγ problème de maturation des cellules B (Bruton s linked agammaglobulinemia) 2. touchant les LT 1- mutation de la protéine WASP : important pour la régulation du cytosquelette d actine dans les cellules T altérations du cytosquelette, de l activation, de la prolifération ( syndrome de Wiskott-Aldrich) 2- mutation CD3γ et CD3ε 3- mutation ZAP-70 pour la phase précoce d activation des lymphocytes T déficience sélective des LT (STD) pas de protéine CD8 (pas de dvp des LT CD8+) mais CD4 arrive quand même à maturer sans s activer (les LT CD4+ ne s activent pas) Radeau lipidique dans la membrane cellulaire Il existe des régions enrichies en cholestérol et sphingolipides (= Raft) où se concentrent des protéines de signalisation. Ces domaines sont des plate-formes où les kinases de la famille Src se concentrent et sont pré associées pour l activation, par fusion, pour déclencher les réponses. La synapse immunologique Les récepteurs ne sont pas dispersés aléatoirement mais ont une répartition caractéristique. L activation entraine le récepteur T et la protéine de signalisation dans la région centrale entre la cellule T et la cellule présentatrice de l antigène = synapse immunologique entourée de grandes protéines d adhésion ou de régions inhibitrices (NF1 protéine d adhésion, intégrines, CD45 exclue au moment de l activation) extinction du signal. Les activations commencent dans de petits agrégats (contenant TCR, Zap70) qui convergeront vers la synapse et se retrouveront avec des molécules inhibitrices. Avec les diapos c est plus facile de comprendre!! 8
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