MINISTERE DE L EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE MEMOIRE Présenté par Valérie Guillermin Pour l obtention du diplôme de l Ecole Pratique des Hautes Etudes Rôle des facteurs de transcription : neurogénine 3 et cdx-2 dans l acquisition et le maintien du phénotype endocrine intestinal Soutenu le 10 juillet 2002 devant le jury composé de : Président : Dr. Y. BENYAMIN Rapporteur : Pr. J.M. EXBRAYAT Examinateur : Dr. C. ROCHE Examinateur : Dr. S. DUPRE-AUCOUTURIER LABORATOIRE DE STAGE :INSERM U45 LABORATOIRE EPHE : SYSTÈME NEURO ENDOCRINE ET EPITHÉLIUM INTESTINAL NORMAL ET NÉOPLASIQUE Adresse: Hôpital Edouard Herriot Pavillon H-Bis 69 437 LYON CEDEX 3 RESPONSABLE: M ME C.ROCHE REPRODUCTION ET DEVELOPPEMENT DES VERTÉBRÉS Adresse: Facultés Catholiques de Lyon 25, rue du Plat 69 002 LYON RESPONSABLE: M R J.M EXBRAYAT ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE Rôle des facteurs de transcription : neurogénine 3 et cdx-2 dans EPHE Banque de Monographies SVT 1
l acquisition et le maintien du phénotype endocrine intestinal Valérie Guillermin Le système endocrine digestif représente, par la diversité de ses produits de sécrétion, le premier système endocrine de l organisme. Dans sa composante intestinale, il se caractérise par la sectorisation des sous-populations endocrines le long de l axe antéro-postérieur. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la mise en place du lignage endocrine à partir d une cellule souche intestinale sont encore assez mal connus. Notre étude porte sur le rôle de deux facteurs de transcription, neurogénine 3 et cdx-2, dans l acquisition et le maintien du phénotype endocrine intestinal. La première partie de notre travail, réalisée en collaboration avec l U381 Inserm de Strasbourg, permet d attribuer à neurogénine 3 un rôle précoce dans la mise en place du lignage endocrine intestinal : l analyse par immunohistologie des souris invalidées pour le gène ngn3 démontre l absence totale de cellule endocrine, à tous les niveaux de l intestin. La deuxième partie de notre travail consiste à analyser le rôle de cdx-2, facteur de transcription impliqué dans la régulation du gène du glucagon, dans la régulation du gène de la cholécystokinine, hormone sécrétée par les cellules I du duodéno-jéjunum. Cdx-2 s avère être un régulateur négatif de l expression du gène de la CCK, selon un mécanisme de régulation transcriptionnelle impliquant une séquence de la région du promoteur, qui reste cependant à identifier. En conclusion, nos résultats identifient et positionnent le facteur de transcription neurogénine 3 dans la cascade d évènements moléculaires gouvernant la mise en place du lignage endocrine intestinal. D autre part, un aspect nouveau et original est apporté par le rôle de cdx-2 dans la régulation de l expression du gène de la cholécystokinine. L ensemble de ces résultats souligne la complexité du rôle des facteurs de transcription dans l homéostasie du système endocrine digestif : acteurs précoces de l aquisition du phénotype endocrine à partir d une cellule souche, mais également régulateurs des phénotypes endocrines différenciés. Mots clefs : différenciation, cellule endocrine intestinale, cholécystokinine, facteurs de transcription, neurogénine 3, cdx-2. INTRODUCTION. P.1 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES. P.2 I/ STRUCTURE DE L INTESTIN. P.2 1/ Les différentes couches de la paroi intestinale. P.2 2/ L axe antéro-postérieur. P.2 EPHE Banque de Monographies SVT 2
II/ DEVELOPPEMENT ET ORGANISATION DE L INTESTIN. P.3 1/ Le développement morphologique P.3 2/ L axe cryto-villositaire. P.3 a/ L épithélium P.3 b/ Le compartiment sous-épithélial P.6 3/ Facteurs impliqués dans le développement de l intestin... P.6 a/ Le mésenchyme.. P.6 b/ Les facteurs de transcription.. P.8 b.1/ Cluster Hox.. P.9 b.2/ Les gènes cdx... P.10 III/ LE SYSTEME ENDOCRINE INTESTINAL. P.13 1/ Description P.13 a/ Le système neuro-endocrine et le système APUD.. P.13 b/ Distribution des cellules endocrines.. P.14 c/ Classification des cellules endocrines P.14 2/ Facteurs impliqués dans le lignage endocrine intestinal... P.15 a/ Le mésenchyme.. P.15 b/ Les facteurs de transcription.. P.17 b.1/ Au niveau du pancréas P.17 b.2/ Au niveau de l intestin P.19 MATERIEL ET METHODES P.22 I/ LES LIGNEES CELLULAIRES P.22 1/ Les lignées endocrines. P.22 2/ Les autres lignées. P.22 II/ LES MODELES ANIMAUX. P.23 1/ Recombinaison homologue. P.23 2/ Les greffes P.23 III/ BIOLOGIE CELLULAIRE. P.23 EPHE Banque de Monographies SVT 3
1/ Culture des lignées cellulaires. P.23 2/ Transfection. P.25 a/ Transfection transitoire. P.25 b/ Transfection stable P.27 3/ Dosage de la luciférase P.30 4/ Dosage des protéines P.31 5/ Expression des résultats P.31 IV/ BIOLOGIE MOLECULAIRE... P.32 1/ Immuno-empreinte ou Western Blot... P.32 2/ Extraction d ARN totaux: technique du TRIZOL. P.36 3/ La RT-PCR P.39 4/ Réplication de vecteurs recombinants.. P.42 a/ Transformation des bactéries. P.42 b/ Amplification des plasmides. P.43 b.1/ Préparation de plasmides en grande quantité : «MAXIPREP». P.43 b.2/ Préparation de plasmides en petite quantité : «MINIPREP» P.45 5/ Mutagenèse dirigée.. P.47 6/ Criblage des colonies : technique du Grünstein... P.51 7/ Séquençage : méthode enzymatique de Sanger.. P.54 V/ TECHNIQUES HISTOLOGIQUES P.58 1/ Préparation des tissus.. P.58 2/ Techniques d immuno-histochimie P.59 RESULTATS.. P.62 I/ RÔLE DE LA NEUROGENINE 3 DANS LE LIGNAGE ENDOCRINE INTESTINAL. P.62 1/ Analyse histologique des animaux invalidés. P.62 a/ L intestin. P.62 b/ L estomac P.63 c/ Les greffes... P.63 II/ SUR-EXPRESSION DU GENE NEUROGENINE 3 DANS UN MODELE CELLULAIRE INTESTINAL : IEC-6 P.64 EPHE Banque de Monographies SVT 4
1/ Transfection stable. P.64 2/ Analyse des clones par RT-PCR P.65 III/ RÔLE DE CDX-2 SUR L EXPRESSION DU GENE DE LA CHOLECYSTOKININE P.66 1/ Etude dans les lignées cellulaires P.66 a/ Niveau d expression de la protéine CDX-2 dans les lignées cellulaires utilisées. P.66 b/ Activité transcriptionnelle du fragment de 800 pb du promoteur du gène de la CCK dans les lignées cellulaires.. P.66 c/ Activité transcriptionnelle des délétions en 5 du promoteur CCK : p654, p420, p144 P.67 2/ Analyse de la région 546 à 536 pb du promoteur CCK.. P.67 a/ Obtention des mutants.. P.67 b/ Vérification des mutants.. P.68 c/ Analyse fonctionnelle des mutants.. P.68 3/ Etude de l effet d un variant cdx-2. P.69 DISCUSSION.. P.70 CONCLUSION ET PERSPECTIVES.. P.74 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES. P.76 LISTE DES TRAVAUX ANNEXES A : adénine ADN : Acide Désoxyribonucléïque ADNc : Acide Désoxyribonucléïque complémentaire APS : ammonium persulfate ARN : Acide Ribonucléïque ARNm : Acide Ribonucléïque messager BET : Bromure d Ethidium BSA : Bovine Serum Albumin C : cytosine CGA : Chromogranine A EPHE Banque de Monographies SVT 5
CCK : Cholécystokinine cpm : coups par minute DMEM : Dulbecco s Modified Eagle s Medium dntp : désoxyribonucléotide DMSO : Diméthyl Sulfoxyde DO : Densité Optique EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid G : guanidine GLP : Glucagon Like Peptide GIP : Gastric Inhibitor Peptide ngn3: neurogénine 3 pb : paires de bases PBS : Phosphate Buffer Saline ph : potentiel Hydrogène PYY : Peptide YY Rnase : Ribonucléase rpm : rotations par minute SDS : Dodécyl Sulfate de Sodium SDS-PAGE : Dodécyl Sulfate de Sodium- Polyacrylamide Gel Electrophoresis Ser : Sérotonine Sec : Sécrétine SVF : Sérum de Veau Fœtal SMS : Somatostatine TEMED : Tétraméthylène Diamine T : thymidine UV : Ultra Violet INTRODUCTION Le système endocrine digestif représente, par la diversité de ses produits de sécrétion, le premier système endocrine de l organisme des mammifères qui se caractérise par : L originalité de sa structure, puisque les cellules qui le composent sont disséminées dans l épithélium gastro-intestinal. Seul le système endocrine pancréatique est regroupé en structures propres : les îlots de Langerhans, eux mêmes dispersés dans le tissu exocrine. La diversité des produits de sécrétion, chacune des hormones sécrétées possédant un rôle particulier dans le contrôle des fonctions digestives. La répartition des sous-populations par secteur le long de l axe antéro-postérieur. Les cellules endocrines intestinales dérivent comme les trois autres types cellulaires de l épithélium d une même cellule souche. Les données disponibles sur les mécanismes de différenciation propre aux cellules endocrines digestives se résument à une série de résultats obtenus par invalidation génique de facteurs de transcription, ciblant en premier lieu le pancréas. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à deux aspects du rôle potentiel des facteurs de transcription dans la différenciation des cellules endocrines intestinales : EPHE Banque de Monographies SVT 6
Un rôle précoce dans la mise en place du système endocrine. Dans ce but nous avons étudié le rôle de la neurogénine 3 Un rôle dans le maintien du phénotype endocrine intestinal. Pour ceci nous avons étudié le rôle de l homéoprotéine CDX-2 sur l expression du gène d une hormone spécifique de l intestin grêle proximal, la cholécystokinine. I/ STRUCTURE DE L INTESTIN 1/ Les différentes couches de la paroi intestinale A tous les niveaux, la paroi du tube digestif est constituée de cinq couches concentriques, de la lumière à la périphérie, qui sont: La muqueuse divisée en deux sous-couches: le revêtement épithélial, le chorion ou tissu conjonctif de soutien (lamina propria). Le chorion est vascularisé et innervé, il contient parfois des glandes exocrines appelées glandes muqueuses en raison de leur position (et non de leur type de sécrétion) ; il est infiltré d éléments lymphoïdes (cellules isolées, follicules etc ) La muscularis mucosae, couche mince formée de fibres musculaires lisses organisées en deux plans, un plan interne de fibres circulaires «encerclant la lumière» et un plan externe de fibres longitudinales orientées parallèlement à la paroi. La sous-muqueuse constituée de tissu conjonctif lâche vascularisé et innervé, où se trouvent des glandes exocrines qui déversent leur produit de sécrétion par des canaux excréteurs traversant la muscularis mucosae et la muqueuse. Ces glandes sont appelées glandes sous-muqueuses. Comme la lamina propria de la muqueuse, la sous-muqueuse contient des éléments lymphoïdes. La musculeuse, couche fonctionnelle constituée de muscle lisse qui se subdivise en une couche circulaire interne et une couche longitudinale externe. L adventice ou séreuse, couche externe de tissu conjonctif lâche qui sert de soutien aux gros vaisseaux et aux nerfs qui vont pénétrer dans les couches plus internes de la paroi. 2/ Axe antéro-postérieur Le tractus intestinal se présente comme un tube déterminant une régionalisation proximodistale caractérisée par des spécificités morphologiques et fonctionnelles à chaque niveau. En effet, l intestin se divise en deux parties selon un axe antéro-postérieur : l intestin grêle et le côlon. Les fonctions de digestion et d absorption des nutriments sont l apanage de l intestin grêle avec certaines spécificités le long de l axe proximo-distal. Il possède également une fonction immunitaire puisqu il contient les plaques de Peyer et les lymphocytes intra-épithéliaux. Il se divise en trois régions définies suivant l axe antéro-postérieur : le duodénum régulant le ph du bol alimentaire provenant de l estomac et où les sécrétions pancréatiques sont déversées. le jéjunum, lieu d importante production enzymatique digestive et de localisation de EPHE Banque de Monographies SVT 7
nombreux transporteurs d ions. Ce compartiment est le site principal de l hydrolyse terminale et de l absorption des nutriments. l iléon, lieu de réabsorption des sels biliaires et qui participe également à l hydrolyse et l absorption des nutriments. le côlon subdivisé en quatre segments (ascendant, transverse, descendant et anse sigmoïde), participe au transport actif des ions, à la réabsorption de l eau et à l élimination des déchets. II/ DEVELOPPEMENT ET ORGANISATION DE L INTESTIN 1/ Le développement morphologique La morphogenèse a été essentiellement étudiée chez les rongeurs. Chez le rat, les principaux évènements morphogénétiques ont lieu pendant la dernière semaine de gestation. Au 14è jour de vie fœtale, l intestin est constitué d un tube formé de deux couches concentriques : une couche externe, le mésenchyme qui se différenciera en tissu conjonctif et en cellules musculaires. une couche interne de cellules pluristratifiées indifférenciées, l endoderme qui formera la bordure épithéliale du tractus digestif et les glandes associées. Les premiers signes de différenciation du mésenchyme apparaissent au 15 ème jour de vie fœtale, avec ségrégation des cellules en deux zones : une zone située juste au dessous de l épithélium où les cellules mésenchymateuses se différencient en cellules de la lamina propria, et une zone plus périphérique où les cellules mésenchymateuses se différencient en cellules musculaires. Cette différenciation des cellules mésenchymateuses se manifeste également par une synthèse d actine du muscle lisse dans les assises cellulaires périphériques. Parallèlement à la formation des villosités à partir du 17 ème jour de vie fœtale (10 ème semaine chez l homme), l endoderme se réduit progressivement à une mono-couche cellulaire. Cette conversion de l épithélium s accompagne, dans la période périnatale, de la mise en place des cryptes à la base des villosités. Chez la souris, la formation des villosités a lieu entre le 15 ème et le 18 ème jour de vie fœtale. Les cryptes n apparaissent que pendant les deux premières semaines de la vie post-natale et leur nombre augmente pendant la 2 ème et la 3 ème semaine (1). Il a également été montré qu une membrane basale continue est présente à l interface de l endoderme et du mésenchyme à des stades très précoces du développement. Lors des évènements morphologiques les plus importants tels que la formation des villosités, cette lame basale sousépithéliale devient discontinue, permettant le contact entre les cellules épithéliales et les cellules mésenchymateuses sous-jacentes (2). EPHE Banque de Monographies SVT 8
Chez le rat adulte le tractus digestif présente quatre couches fonctionnelles distinctes : la muqueuse, la sous muqueuse, la musculeuse, l adventice. 2/ Axe crypto-villositaire a/ L épithélium La muqueuse intestinale est bordée d un épithélium monostratifié qui possède une capacité de prolifération et de différenciation cellulaire importante. Son renouvellement s effectue en 2-3 jours chez le rat et en 4-5 jours chez l homme. L épithélium peut être subdivisé en deux compartiments morphologiquement et fonctionnellement distincts : les cryptes, invaginations de l épithélium, contiennent les cellules souches, les cellules en prolifération et les cellules de Paneth. les villosités, évaginations de l épithélium, constituées de cellules différenciées. En effet, les cellules des cryptes qui étaient en prolifération (à l exception des cellules de Paneth qui sont différenciées et restent au niveau des cryptes) cessent de se diviser et se différencient au niveau de la jonction crypto-villositaire. Les cellules migrent au sommet des villosités pour être exfoliées. L épithélium colique présente des cryptes plus profondes et les villosités de l intestin grêle sont remplacées par des coiffes épithéliales. Cependant on retrouve la même organisation cellulaire. Le renouvellement de l épithélium se fait à partir de cellules souches (3). Ces cellules souches pluripotentes n ont pas encore été identifiées. Elles se divisent soit de façon symétrique (10% des cas) qui génère deux cellules souches, soit de façon asymétrique (90% des cas). La division asymétrique donne naissance à une nouvelle cellule souche et à une cellule qui entre en phase active de prolifération puis de différenciation. Les contrôles mis en jeu dans la régulation de la division sont encore inconnus (4). La division cellulaire est suivie d une migration et d une différenciation des cellules le long de l axe crypto-villositaire. Les travaux de Cheng et Leblond (5) ont montré que les cellules souches sont à l origine des quatre types cellulaires présents dans l épithélium digestif. La mise en place de ces quatre types cellulaires se déroule au cours du développement embryonnaire de façon asynchrone. Ces types cellulaires assurent les différentes fonctions du tractus digestif : les entérocytes spécialisés dans la fonction d absorption. Ils sont caractérisés par la présence de microvillosités, constituant la bordure en brosse, à leur pôle apical. La membrane des villosités est le siège des enzymes digestives et des transporteurs de macromolécules présentes dans la lumière intestinale. Les entérocytes représentent 90% de la population cellulaire totale. les cellules caliciformes (à mucus) caractérisées par la présence de nombreux grains de EPHE Banque de Monographies SVT 9
sécrétion dans leur cytoplasme apical. Le mucus agirait comme barrière protégeant l épithélium de substances luminales potentiellement nocives. Elles représentent environ 5% de la population totale ; leur proportion augmente au niveau du côlon. les cellules de Paneth présentes au fond des cryptes. Leur nombre augmente du duodénum vers l iléon et leur présence est rare dans le côlon. Elles possèdent des grains de sécrétion apicaux à forte activité lysosomiale suggérant l intervention des cellules de Paneth dans le contrôle de la flore bactérienne. les cellules endocrines élaborant des amines et/ ou des peptides biologiquement actifs contenus dans les granules sécrétoires présents à leur pôle basal. Elles assurent un rôle physiologique important dans l intestin et représentent seulement 1% de la population totale. L épithélium colique diffère de l épithélium de l intestin grêle, il ne possède pas de cellules de Paneth et il est essentiellement composé de colonocytes. Les colonocytes sont morphologiquement et fonctionnellement différents des entérocytes ; ils présentent un important système tubulo-vacuolaire, ainsi que de grandes vacuoles supra-nucléaires. De plus, ils ne produisent pas les hydrolases digestives qui caractérisent les entérocytes. La durée du renouvellement cellulaire varie selon l axe céphalo-caudal et selon le type cellulaire (5), (6). b/ Le compartiment sous-épithélial. L épithélium du tractus digestif repose sur une lame basale qui est en contact étroit avec un réseau de fibroblastes sous-épithéliaux et d éléments du tissu conjonctif extracellulaire. Ces fibroblastes sous-épithéliaux sont présents au contact de l épithélium au niveau des cryptes et des villosités, aussi bien dans l intestin grêle que dans le côlon (7). Cependant leur organisation diffère selon leur localisation au niveau du tractus digestif (8), (9). Les constituants de la matrice extracellulaire s organisent en une structure dense au niveau de la lame basale. Cette lame basale est constituée de laminine, de collagène IV, de nidogène et de perlecan ou protéoglycane héparane sulfate. Le collagène IV et le nidogène sont produits par le compartiment mésenchymateux alors que le perlecan est synthétisé par le compartiment épithélial. Quant à la laminine, elle est produite par les deux compartiments (10). 3/ Facteurs impliqués dans le développement de l intestin a/ Le mésenchyme Les interactions épithélio-mésenchymateuses sont nécessaires pour la maturation de l intestin pendant l organogenèse, mais également pour la différenciation des cellules cryptiques en cellules des EPHE Banque de Monographies SVT 10
villosités (11), (12). Le compartiment épithélial est séparé du compartiment mésenchymateux par la membrane basale, qui est une différenciation de la matrice extracellulaire. L épithélium est donc en contact étroit avec la membrane basale et la matrice extracellulaire qui jouent un rôle essentiel dans les interactions épithélio-mésenchymateuses. Pendant l organogenèse de l intestin, les différents constituants de la matrice extracellaire subissent une redistribution pendant les principaux évènements morphogénétiques (13). La distribution des molécules de la membrane basale et leurs liaisons spécifiques à des intégrines suggèrent leur implication dans différents évènements cellulaires tels que la prolifération, la migration et la différenciation. Le rôle des composants de la matrice extracellulaire dans les interactions épithélio-mésenchymateuses a été plus particulièrement étudié par l équipe de M. Kédinger. Ces études ont permis de mettre en évidence une corrélation entre la production des composants de la matrice extracellulaire et la différenciation entérocytaire (14). En fait, la formation de la lame basale dépend du contact entre les cellules épithéliales et les cellules mésenchymateuses (15). L importance des interactions épithélio-mésenchymateuses repose sur un contact morphologique très étroit entre les cellules épithéliales et celles d origine mésenchymateuse pendant la phase de morphogenèse intense au cours du développement et dans les cryptes de l intestin adulte. Il a été mis en évidence que les cellules endodermiques ou épithéliales séparées du compartiment mésenchymateux ne survivent et ne se différencient pas. Pour ceci des modèles expérimentaux de dissociations d ébauches endodermiques et mésenchymateuses embryonnaires et de réassociations diverses en cocultures et en greffes ont permis de définir les principales caractéristiques de ces interactions (16). Des contacts entre cellules épithéliales et mésenchymateuses sont donc indispensables à la morphogenèse et à la cyto-différenciation. Cependant, l intégrité morphologique des ébauches d endoderme et de mésenchyme n est pas nécessaire pour permettre cette action permissive réciproque. En effet, des cultures primaires de cellules mésenchymateuses (issues d intestin fœtal ou de fibroblastes de la lamina propria) associées à un endoderme en coculture ou en greffe miment parfaitement l action de support du mésenchyme intact. En revanche, le mésenchyme permet le développement de tous les types de cellules épithéliales (cellules absorbantes, à mucus, endocrines et de Paneth) à partir de cellules endodermiques en culture ou d une lignée épithéliale indifférenciée des cryptes. Ces modèles de dissociation et d association d ébauches des différents segments du tractus digestif a permis également de montrer l influence du mésenchyme de l intestin grêle sur le développement de l endoderme colique et gastrique qui sont alors «intestinalisés». Ces modèles de greffes d associations comprenant le mésenchyme de l intestin grêle et l endoderme de côlon ou d estomac permettent le développement de structures intestinales dont l épithélium, de type villositaire et non plus glandulaire, est composé de cellules absorbantes dans lesquelles une expression ectopique d enzymes digestives a pu être démontrée. Ces dernières années, les évènements moléculaires régulant les interactions cellulaires qui sont EPHE Banque de Monographies SVT 11
à l origine du développement de l intestin, de la mise en place de l axe proximo-distal et de l axe crypto-villositaire sont particulièrement étudiés. b/ Les facteurs de transcription Les gènes homéotiques ont été identifiés vers les années 1980 (17) chez la drosophile et depuis dans tout le règne animal (18) et dans les plantes. Ces gènes codent pour des facteurs de transcription nucléaires. Bien que la structure fine et la fonction précise de ces gènes puissent varier d un organisme à l autre, leur rôle général comme facteur de régulation de l expression génique est conservé. Organisation des gènes homéotiques Les gènes homéotiques codent pour des protéines qui possèdent des caractéristiques structurales communes : l homéodomaine qui présente une structure en hélice-boucle-hélice, est capable de se lier à l ADN (19). de courtes séquences nucléotidiques sont conservées entre certains gènes homéotiques. Les séquences peptidiques correspondantes, situées en amont de l homéodomaine, pourraient être impliquées dans les interactions entre les protéines homéotiques et d autres éléments de la machinerie transcriptionnelle (20). Fonction des gènes homéotiques Les gènes homéotiques ont fait l objet d études qui ont montré leur importance dans le développement précoce et la morphogenèse chez la drosophile mais également chez les mammifères. Leur rôle crucial dans le développement des mammifères a particulièrement été étudié chez la souris pendant les grandes phases de développement. Cette famille de gènes fait également l objet de travaux visant à montrer leur importance dans la mise en place ou le maintien de l identité cellulaire, donc au niveau de la détermination de l information de position et de l identité des cellules de l organe en développement. Chez la drosophile, les gènes contrôlant ce processus peuvent être classés en trois catégories (21): les gènes caudal et bicoïd, à effet maternel, participant à la détermination de la polarité de l embryon les gènes de segmentation définissant le nombre et la polarité des segments les gènes des complexes ANT-C et BX-C définissant l identité des segments. Conformément à leur rôle essentiel au cours du développement précoce, la plupart des gènes homéotiques s expriment principalement chez l embryon et le fœtus. Chez l adulte, une expression importante de certains gènes homéotiques n est maintenue que dans un nombre limité d organes ou EPHE Banque de Monographies SVT 12
de tissus, à savoir ceux qui se caractérisent par un renouvellement cellulaire permanent comme le tissu hématopoïétique ou l épithélium digestif. La régulation des gènes homéotiques est un phénomène complexe qui reste encore à élucider. L expression de ces gènes est régulée de façon directe et indirecte par plusieurs types de facteurs dont les facteurs de transcription parmi lesquels les protéines codées par les gènes homéotiques euxmêmes, les acides rétinoïques et les facteurs de croissance. Les facteurs de transcription jouent un rôle important dans la mise en place et le maintien de l axe proximo-distal et/ou dans les interactions épithélio-mésenchymateuses intestinales. b.1/ Cluster Hox La famille des gènes homéotiques Hox, la plus connue, est organisée en quatre «cluster de gènes» qui sont activés séquentiellement le long de l axe céphalo-caudal. Plusieurs gènes Hox (cluster HoxD, HoxA4) principalement mésenchymateux, sont exprimés au cours du développement mais aussi dans le système gastro-intestinal chez l adulte. Des expériences de sur-expression par transgenèse ou transfert de gènes par des vecteurs viraux, ainsi que l invalidation de ces gènes ont permis de montrer leur importance dans la différenciation musculaire et leur rôle dans la formation des sphincters iléo-caecal et anal. Dans l intestin de souris, la présence de neuf gènes homéotiques a été démontrée à l aide de la technique de PCR (22). Ces travaux ont permis de dresser le profil d expression de certains de ces homéogènes le long de l axe antéro-postérieur. b.2/ Les gènes Cdx Les gènes homéotiques cdx sont des homologues du gène caudal de la drosophile qui participe à l établissement du gradient céphalo-caudal dans l embryogenèse précoce. Ces gènes ont un profil d expression biphasique : expression très précoce dans l aire extra-embryonnaire et embryonnaire, et expression tardive restreinte aux organes d origine endodermique (23). Ainsi cdx-1 et cdx-2, chez les rongeurs et l homme, et cdxa chez le poulet, sont exprimés dans l endoderme intestinal au cours du développement et dans l épithélium de l organe mature selon un gradient croissant le long de l axe proximo-distal (22); il existe une nette frontière au niveau du sphincter pylorique en amont duquel ces gènes ne sont pas exprimés. De plus, dans l intestin de souris, les protéines CDX-1 et CDX-2 montrent une intéressante complémentarité puisque la première est exprimée dans les cellules des cryptes et la seconde principalement par les cellules des villosités. Enfin, l intérêt de ces gènes est également lié au fait qu ils sont dérégulés dans les cancers gastrointestinaux : dans l ensemble, leur expression est diminuée dans les cancers coliques, mais elle est induite dans des métaplasies intestinales de l estomac. Dans le contexte des interactions épithélio-mésenchymateuses, les observations suivantes sont intéressantes : d une part l expression de cdx-2 est augmentée par la laminine-1 (molécule de la EPHE Banque de Monographies SVT 13
matrice extracellulaire), d autre part l induction d une sur-expression de cdx-2 dans les cellules intestinales stimule leur différenciation. Dans ces conditions, les cibles de cdx-2 sont : des marqueurs de différenciation, à titre d exemple cdx-2 stimule l activité transcriptionnelle du promoteur du gène de la saccharase-isomaltase. des molécules d adhésion cellule-matrice extracellulaire et des molécules de la matrice extracellulaire. Par ailleurs, la sur-expression de cdx-2 dans les cellules cancéreuses coliques humaines diminue leur potentiel de prolifération et tumorigène (24). Gène cdx-2 et axe antéro-postérieur Le profil de cdx-2 le long de l axe antéro-postérieur de l intestin fait penser au gradient d expression céphalo-caudal montré chez la drosophile embryonnaire. Ce gradient constitue un composant majeur de l information intrinsèque utilisé par tous les noyaux pour déterminer leur position longitudinale. Une question se pose alors sur l implication de cdx-2 au niveau de l information de position le long de l intestin chez les mammifères. Une première indication d une telle implication vient de xénogreffes dans lesquelles l endoderme indifférencié peut être modifié en fonction de l origine du mésenchyme. Des travaux réalisés par l équipe de M.Kedinger (25) ont permis de montrer que l association d un endoderme et d un mésenchyme de côlon suit un développement typique, alors qu une hétéro-différenciation structurale et fonctionnelle de l endoderme vers un phénotype d intestin grêle se produit sous l influence du mésenchyme de l intestin grêle. En corrélation avec cette hétéro-différenciation, Plateroti et col (26), ont montré une diminution des taux d ARNm de cdx-1 et cdx-2 dans les cellules épithéliales de côlon, qui est conforme avec la faible expression de ces gènes dans l intestin grêle. L évidence définitive de l implication des gènes cdx dans le profilement longitudinal des mammifères est montré par les phénotypes des souris knock out réalisées par l équipe de P.Gruss (27). Bien que le phénotype intestinal des souris homozygotes cdx-1-/- ne soit pas décrit en détail, ces souris montrent des anomalies squelettiques compatibles avec un rôle de ce gène dans l information déterminant la position pendant le développement précoce. Les souris homozygotes cdx-2-/- meurent au cours de l embryogenèse précoce. En revanche les souris hétérozygotes cdx-2 +/- survivent mais elles présentent des anomalies identiques à celles des souris cdx-1-/-. En effet, des travaux ont montré une faible expression de ce gène au cours du développement intestinal normal. Cependant des aires de métaplasie, dans lesquelles la copie du gène sauvage est stoppée, apparaissent principalement au niveau du côlon (28). En effet, l épithélium de côlon montre des propriétés typiques du tractus digestif supérieur, de l estomac et de l œsophage qui n expriment pas cdx-2. De plus, un épithélium de transition montrant des caractéristiques typiques, de l intestin grêle antérieur au postérieur, se développe entre les surfaces de l estomac et les régions entourant le phénotype normal du côlon, restaurant ainsi la continuité normale des tissus intestinaux types. EPHE Banque de Monographies SVT 14
Bien que les mécanismes moléculaires ne soient pas élucidés, ces observations démontrent clairement que cdx-2 est un composant majeur qui informe les cellules épithéliales qu elles appartiennent à l intestin et leur localisation le long de ce dernier. Les voies par lesquelles les gènes cdx conduisent les cellules endodermales vers un phénotype intestinal, et donnent l information de position le long de l axe longitudinal de l intestin, sont des questions encore sous investigation. Curieusement, le phénotype squelettique résultant de la perte de cdx-1 dans les souris knock out est accompagné par des changements dans le profil du gène Hox (27), (24), et par une sur-expression de cdx-2 dans des cellules de côlon humaines Caco-2. En effet, cette sur-expression mène à une sur-régulation du gène Hox-8 suggérant que la fonction des gènes cdx peut être, au moins en partie, médiée par les gènes Hox. Ainsi les protéines CDX peuvent participer au complexe transcriptionnel qui dicte l expression tissu spécifique de ces gènes dans l intestin, ainsi que leur position en tête de la cascade des gènes régulateurs incluant les gènes Hox. La fonction de ces derniers dans la détermination de l identité des cellules a été démontrée dans d autres tissus. Gènes Cdx et axe crypto-villositaire En plus du rôle attribué aux gènes cdx dans l information de position le long de l axe longitudinal de l intestin, un rôle dans le contrôle de la progression des cellules de l état de prolifération à celui de différenciation le long de l axe crypto-villositaire a été proposé (24), (29). Les travaux réalisés consistent en des transfections de cellules intestinales (Caco-2 et IEC) afin de surexprimer ces gènes ou d inhiber leur expression endogène. Par inhibition de Cdx-1 avec un ARN anti-sens, la croissance des cellules Caco-2 est réduite in vitro, suggérant que ce gène exprimé en majorité dans les cryptes, peut participer au contrôle de la prolifération cellulaire. Contrairement à la situation observée avec cdx-1, la prolifération des cellules Caco-2 et IEC est réduite par surexpression de cdx-2. De plus, cette sur-expression déclenche la polarisation et la différenciation fonctionnelle des cellules IEC, indifférenciées à l état basal. Au niveau des cellules Caco-2, qui se différencient spontanément, cette sur-expression de cdx-2 stimule la différenciation de toutes les cellules. En effet, une augmentation de cdx-2, dans les cellules Caco-2, active les molécules qui sont préférentiellement exprimées dans les cellules épithéliales des villosités par rapport aux cellules des cryptes, comme les enzymes digestives (sucrase, lactase) et les molécules impliquées dans les interactions cellules-cellules ou cellules-matrice. Ainsi, ces données suggèrent que les gènes cdx sont impliqués dans la régulation de l équilibre entre prolifération et différenciation de cellules, qui est crucial pour l homéostasie durant le renouvellement constant de l épithélium intestinal. Les deux gènes semblent jouer des rôles différents, dans ce processus, cohérents avec leur profil respectif le long de l axe crypto-villositaire. Excepté pour les enzymes digestives lactase et sucrase, pour lesquelles on ne sait pas si les gènes cdx-1 et/ou cdx-2 exercent des effets régulateurs directs et/ou indirects sur les cibles situées en aval. EPHE Banque de Monographies SVT 15
III/ LE SYSTÈME ENDOCRINE INTESTINAL 1/ Description a/ Le système neuro-endocrine et le système APUD Des travaux effectués sur les différents tissus endocriniens ont montré que certaines cellules sécrétant des amines ou des peptides avaient des caractères ultrastructuraux communs. Ces cellules sont pauvres en réticulum endoplasmique granuleux, et riches en réticulum endoplasmique lisse et en ribosomes libres. Elles contiennent aussi des petits grains sécrétoires bordés par une membrane. Des investigations histochimiques ultérieures ont montré que beaucoup de ces cellules participaient aux mêmes processus métaboliques de synthèse hormonale. Entre autres, ces processus comprennent une incorporation importante de précurseurs amines et l aptitude à la décarboxylation. Ainsi, le terme descriptif de cellules APUD ( Amine Precursor Uptake and Decarboxylation) a été appliqué. Ces cellules se retrouvent dans tous les tissus endocrines et en particulier dans les cellules endocrines gastro-intestinales. Les cellules endocrines du tube digestif appartiennent au système endocrine diffus (SED), vaste domaine de cellules endocrines éparpillées dans tout l organisme (poumons, testicules, ovaires, reins) par opposition aux glandes endocrines anatomiquement bien individualisées (hypophyse, épiphyse, thyroïde, parathyroïde, surrénales, pancréas). Des travaux ultérieurs ont laissé penser que les cellules APUD constituent un groupe toujours plus diversifié mais dont tous les éléments dérivent embryologiquement de la crête neurale ; on peut ainsi les considérer comme des neurones hautement modifiés. Pour cette raison, le terme de système neuro-endocrinien diffus a été utilisé pour englober tous les types de cellules, et le terme de paraneurone pour décrire ces cellules. Actuellement, la séparation entre les deux grands régulateurs du fonctionnement de l organisme : le système nerveux et le système endocrinien, ne peut être maintenue. En effet, il existe des molécules à double rôle, neuro-transmetteur et hormonal ; des médiateurs chimiques sécrétés par des cellules du tube digestif, tels la gastrine, la cholécystokinine (CCK), le VIP (vasoactive intestinal peptide), la substance P, la bombésine ont été décelés dans le cerveau et inversement, la somatostatine et la sérotonine connues comme neuro-transmetteurs sont retrouvées dans le tube digestif. Cependant toutes les cellules du SED n appartiennent pas au système APUD et ne sont pas des cellules neuro-endocrines ; certaines ont une origine endoblastique ou mésoblastique. Les cellules endocrines du SED peuvent provenir des trois feuillets embryonnaires comme les cellules des glandes endocrines. b/ Distribution des cellules endocrines L épithélium intestinal se caractérise par une régionalisation morphologique et fonctionnelle le long de l axe antéro-postérieur (du duodénum vers le côlon). Cette régionalisation concerne tous les EPHE Banque de Monographies SVT 16
types cellulaires de l épithélium et en particulier les cellules endocrines qui présentent une distribution régionale distincte le long de l axe antéro-postérieur. c/ Classification des cellules endocrines Les cellules endocrines du tube digestif constituent le système endocrinien gastrointestinal ; elles ont été repérées depuis longtemps comme «cellules claires» en technique de coloration courante, puis individualisées en cellules argentaffines, argyrophiles, chromaffines par des techniques de fixation-coloration aux sels de métaux (sels d argent, de chrome, de plomb). La microscopie électronique a permis une analyse structurale précise (forme cellulaire, richesse en ergatoplasme et/ou en réticulum endoplasmique, appareil de Golgi volumineux, aspect des grains de sécrétion). Cette analyse structurale constitue une classification en une quinzaine de populations différentes. Cependant c est avec l apparition de l immunohistochimie qu une relation spécifique «cellule- molécule sécrétée» a été mise en place permettant ainsi de distinguer deux souspopulations : les cellules endocrines identifiées par la présence dans leur cytoplasme d un polypeptide connu dont le rôle est clairement défini (cellules G, K, I, S, N, D, L). les cellules endocrines définies morphologiquement mais dont le produit de sécrétion est mal ou pas connu (cellules P/D1, X, EC, ECL) La majorité des cellules endocrines ne contiennent qu un seul peptide, mais une cellule endocrine peut sécréter une famille de peptides apparentés biochimiquement et biologiquement. Par ailleurs, certaines cellules peuvent produire à la fois un peptide et une amine. 2/ Facteurs impliqués dans le lignage endocrine intestinal Il est actuellement admis que les quatre types cellulaires constituant l épithélium intestinal dérivent d une même cellule souche cryptique. Cependant, les mécanismes permettant la mise en place du lignage endocrine au niveau intestinal ne sont pas encore totalement élucidés. En particulier, les mécanismes permettant la localisation géographique spécifique des différentes sous populations endocrines le long de l axe céphalo-caudal restent totalement inconnus à ce jour. a/ Le mésenchyme Parmi les mécanismes pouvant être impliqués, le rôle des interactions épithéliomésenchymateuses a été relativement peu exploré pour ce qui concerne le secteur endocrine. Les informations disponibles proviennent des expériences de Rawdon et Andrew conduites chez EPHE Banque de Monographies SVT 17
différentes espèces d oiseaux, au cours des années 90. Ces travaux reposent sur des modèles d association endoderme/mésenchyme de différentes parties du tube digestif. L endoderme et le mésenchyme sont dissociés enzymatiquement et des recombinaisons hétérotypiques sont réalisées et greffées sur la membrane chorio-allantoïdienne. Ces associations ont été réalisées afin de préciser : le rôle du mésenchyme et de l endoderme dans la différenciation des cellules endocrines intestinales. Un rôle instructif du mésenchyme dans la différenciation des cellules entéro-endocrines a été mis en évidence dans deux expériences associant de l endoderme de gésier à des mésenchymes d origine proventriculaire et intestinale (30), (31). Le gésier ne contient que très peu de cellules endocrines à l éclosion (32, 33). En revanche, lorsque cet endoderme de gésier est associé à du mésenchyme de proventricule, une différenciation de tous les types cellulaires endocrines spécifiques du proventricule est observée, à savoir l apparition de cellules à NT, SMS, glucagon, PP, bombésine- GRP. Cependant, le nombre de cellules observé est plus faible que dans les contrôles endoderme proventricule/ mésenchyme proventricule. Ceci suggère que l endoderme est partiellement compromis dans sa propre différenciation et ne répond pas pleinement aux stimuli du mésenchyme hétérologue. De plus, cette différenciation endocrine peut s expliquer par la levée de l inhibition du mésenchyme de gésier sur l expression des différents types de cellules endocrines (30). La morphogenèse développée par les greffons est de type proventriculaire. Dans l autre expérience, qui associe de l endoderme de gésier à du mésenchyme d intestin, les cellules endocrines qui se différencient sont soit communes au proventricule et à l intestin (NT, SMS, glucagon, PP) soit spécifiques de l intestin (motiline et sécrétine). Une morphogenèse de type intestinale est développée par les greffons expérimentaux. L ensemble de ces résultats confirme la présence de cellules souches tout le long du tractus digestif, déjà mise en évidence par l équipe d Andrew en 1984 (34). Ces cellules souches sont capables de se différencier en plusieurs types de cellules endocrines, en réponse à des stimuli particuliers d origine mésenchymateuse. Dans les associations endoderme gésier/ mésenchyme intestinal, l importance de l âge du donneur a été également étudiée. Lorsque l endoderme est issu de donneurs plus âgés, une morphogenèse de type gésier est observée, ainsi que l absence d expression des cellules endocrines spécifique de l intestin. En revanche, l âge du mésenchyme ne modifie pas la morphogenèse des greffons. L importance de l âge de l endoderme suggère un rôle de ce dernier dans la différenciation des cellules endocrines. En effet, à partir d un certain stade de développement, le mésenchyme n induit plus la morphogenèse et la différenciation des cellules endocrines qui lui sont spécifiques. En fait, la détermination de l endoderme est mise en place à un stade très précoce. Ce point a été étudié dans des associations endoderme proventricule/ mésenchyme d origine non intestinale (flanc). La morphogenèse des greffons expérimentaux s oriente vers celle du proventricule. Les nombres de cellules spécifiques du proventricule (NT, SMS, glucagon, PP) sont identiques dans les greffons expérimentaux et les greffons contrôles, seul le nombre des cellules à GRP est significativement plus EPHE Banque de Monographies SVT 18
faible que dans les greffons contrôles. Ceci suggère, que seule la présence du mésenchyme homologue permet une différenciation complète de ce type cellulaire (35). L incapacité de l endoderme isolé à se différencier permet de conclure que la présence de mésenchyme, bien qu hétérologue, semble nécessaire au développement des greffons, et plus particulièrement à la différenciation endocrine. Ce rôle permissif du mésenchyme a été également observé dans deux autres types d associations (36), (37). Ces travaux montrent que l épithélium endodermique indifférencié est déterminé très précocement, et à ce stade l action du mésenchyme serait une induction permissive, capable de favoriser l expression de potentialités préexistantes. Suite à cette présélection des types cellulaires, par un facteur encore inconnu à ce jour, le mésenchyme, via la sécrétion d un facteur, permettrait une sélection région-spécifique. La maturation des cellules endocrines serait ensuite induite par un autre facteur d origine mésenchymateuse sous l action de facteurs hormonaux circulants (38, 39). Par ailleurs, un rôle paracrine des fibroblastes sous-épithéliaux sur l expression des gènes de certains peptides digestifs a été mis en évidence in vitro par l équipe de C.Roche au laboratoire. La co-culture directe et indirecte de cellules endocrines de la lignée STC-1 avec des fibroblastes sous-épithéliaux entraîne des modifications de l expression des gènes de CCK, SMS, GIP, glucagon et sécrétine (40). Un des facteurs diffusibles d origine fibroblastique a été identifié : FGF2 possède une action stimulante sur l expression du gène de la CCK (41). L ensemble de ces travaux démontre bien l implication des interactions épithéliomésenchymateuses dans le phénotype endocrine intestinal, domaine qui nécessite de plus importantes investigations ; b/ Les facteurs de transcription b.1/ Au niveau du pancréas A l heure actuelle, l aspect le mieux connu de la différenciation endocrine intestinale est le rôle de certains facteurs de transcription. L essentiel des connaissances provient d expériences d invalidation de gène réalisées dans un premier temps pour élucider la mise en place des lignages endocrines au niveau pancréatique. Grâce à ces expériences, l ordre chronologique de l intervention de différents facteurs s est progressivement précisé, aboutissant à un schéma précis proposé par l équipe de A.Grapin-Botton (42), intégrant toutes les données de la littérature. La figure 8 indique que l expression du facteur de transcription p48 est le premier signe de différenciation des cellules exocrines (43). Certains gènes sont nécessaires à la différenciation de l ensemble des cellules endocrines. Ainsi le gène pro-neural neurogénine 3 (ngn3), dont l activation dépend de la voie de signalisation Notch/Delta, induit successivement un autre gène pro-neural Neuro D, puis les gènes paired homeodomain Pax6 et Isl-1 (44), (45). Tous ces gènes sont induits par ngn3 EPHE Banque de Monographies SVT 19
et absents du pancréas lorsque ngn3 est inactivé (46). D autres gènes sont spécifiques de certains lignages. Ainsi l inactivation de Pax4 entraîne une augmentation du nombre de cellules a au dépens des cellules b et d (47). L inactivation de Nkx2.2 empêche la différenciation des cellules b, réduit le nombre de cellules a et PP mais n affecte pas le nombre de cellules d (47). En l absence de ce gène, de nombreux précurseurs partiellement différenciés mais n exprimant pas les hormones s accumulent. Nkx6.1 et Hlxb9 affectent uniquement les cellules b (48). Lorsque Nkx6.1 est inactivé, les quelques cellules b qui apparaissent précocement se forment mais la majorité, qui se différencient vers E13 n apparaissent pas. En l absence de Hlxb9, il apparaît trois fois moins de cellules exprimant l insuline que dans les embryons normaux. En l absence de Pdx-1 (pancreatic and duodenal homeobox gene-1), aucune cellule à insuline n est observée alors que les cellules à glucagon se différencient (49). Les facteurs de transcription à homéodomaine et de type basique hélice- boucle- hélice (b- HLH) cités dans le schéma de synthèse proposé par l équipe de M.German sont des facteurs exprimés à la fois dans le pancréas et le tube neural. Leur expression dans le tube neural, leur fonction dans la différenciation des sous-types de neurones ont été bien caractérisées. C est le cas de la neurogénine, facteur de transcription de la famille des b-hlh. En effet, des travaux ont mis en évidence l implication des trois isoformes de la neurogénine dans la détermination de précurseurs neuraux chez la drosophile (50), (51). Le rôle d un de ces trois isoformes, la neurogénine 3, localisée dans le système nerveux central et également présent dans le pancréas embryonnaire, a été particulièrement étudié. L équipe de G.Gradwohl (46) a dressé le profil d expression de la ngn3 au cours du développement embryonnaire du pancréas. Le taux d expression de la ngn3 augmente au cours de l embryogenèse précoce avant de diminuer jusqu à son extinction à la naissance. Afin de mettre en évidence un rôle précoce de la ngn3 au niveau de la différenciation des cellules endocrines du pancréas, l équipe de G.Gradwohl a également réalisé un modèle de souris dans lequel le gène de la ngn3 est invalidé. L analyse histologique du pancréas des souris ngn3 -/- révèle l absence d îlots de Langerhans, l absence totale de cellules endocrines ainsi que l absence de marqueurs spécifiques des cellules endocrines (Pax4, Pax6, Beta2/neuroD). En revanche on note la présence de marqueurs spécifiques des cellules exocrines (p48 et prox-1). Des travaux effectués par Apelqvist et col. (52) avaient mis en évidence qu une sur-expression de la ngn3 sous contrôle du promoteur Ipf-1/Pdx-1 induisait une différenciation endocrine prématurée au dépens du développement du pancréas exocrine. L équipe de G.Gradwohl, elle, montre un rôle de commutateur génétique de la ngn3 qui spécifie le destin des cellules endocrines dans un pancréas pluripotent. La ngn3 appartiendrait à un second groupe de gènes régulateurs qui auraient une fonction en aval de la cascade et permettraient la prolifération, la différenciation et la survie des précurseurs des quatre lignées cellulaires endocrines. En plus de leur rôle au cours de la mise en place des cellules endocrines au cours du développement, certains facteurs de transcription jouent également un rôle au niveau de la régulation de l activité transcriptionnelle de gènes d hormones. En effet des études récentes impliquent Cdx-2 dans la régulation transcriptionnelle de gènes d hormones. Par exemple le gène du proglucagon possède une région riche en AT, l élément G1, capable d interagir evec l homéoprotéine CDX-2. L équipe de J.Drücker en réalisant une mutation de cet élément G1 a mis en évidence que l efficacité EPHE Banque de Monographies SVT 20