Réunion d information ADRIANOR 26 septembre 2013 Comment valider vos procédures de nettoyage et désinfection? Faille C., Clarisse M., Zundel S., Villain M., Derache E. INRA, UR 638 PIHM 369 rue Jules Guesde, 59651 Villeneuve d Ascq +33 (0)3 20 43 54 24
Qu est-ce qu un biofilm?.2
Qu est-ce qu un biofilm? Communauté de micro-organismes fixés à une surface, enchâssés dans une matrice d exopolymères Processus naturel Structure vivante, dynamique, en perpétuel remaniement Dominant en milieu hostile Structure et physiologie du biofilm => conditions d organisation sociale proches de celles qu établissent entre elles les cellules eucaryotes au sein des tissus.3
Qu est-ce qu un biofilm? Mode de vie ubiquitaire Observé sur tous types de surfaces tissus animaux & végétaux matériaux chimiquement inertes Observé pour tout milieu de suspension air liquide aliment.4
Les biofilms en IAA.5
Les biofilms en environnements agro-alimentaires Chaînes de transformation des aliments : rôle majeur dans la contamination des produits 1996-1998: 40% des TIAC = conséquence d une contamination des équipements (Haeghebaert, 2001) + récemment: ~ 25% des infections par les aliments dues à une contamination durant le procédé de transformation Japon 2000: > 14 000 personnes malades par consommation de lait contaminé (vanne encrassée) Problème domestique Surfaces des cuisines à l origine de nombreuses contaminations 30% des salmonelloses nombreuses épidémies à Campylobacter, E. coli O157.6
Où trouve-t-on les biofilms en IAA Ateliers (viandes, poissons, fromages, etc.) Équipements Murs, sols Aération, air conditionné, écoulement des eaux usées, siphons Équipements fermés (produits laitiers, etc.) Circuit de fabrication Conditionnement Circuit de nettoyage Cuisines collectives ou non Surfaces en contact direct ou non avec les aliments +/- Éponges, torchons.7
Les biofilms en environnements agro-alimentaires Aliments / ingrédients Feuille de salade.8
Les biofilms en environnements agro-alimentaires Surfaces d équipements Industrie de la viande => Surface de réfrigérateur ex: Listeria monocytogenes Pisciculture => Surface de bassin ex: Yersinia ruckeri.9
Les biofilms en environnements agro-alimentaires Domestique, restauration Planche de découpe Eponge.10
Les biofilms en environnements agro-alimentaires Domestique, restauration Torchons.11
Spécificités de ces biofilms.12
Bactéries capables de se développer dans les conditions difficiles rencontrées en environnement d ateliers (dessiccation, présence de sel, ph acides, T basses, ) Surface de réfrigérateur dans l industrie de la viande Fromagerie [ NaCl] + ph acide.13
Bactéries capables de résister aux procédures de nettoyage et de désinfection Rôle de la bactérie Propriétés de surface Structure du biofilm (3D, exopolymères) Rôle du matériau physico-chimie de surface topographie.14
Exemples de micro-organismes pathogènes en biofilms d environnement agroalimentaire L. monocytogenes (biofilms mixtes, adaptation au froid) acier, polymères (tapis convoyeurs, bacs saumurage), bois (maturation fromage), siphons filière lait, viande, poissons, légumes Salmonella spp. acier, ciment, polymères, verre filières volaille, viande (abattoirs), eau E. coli acier (couteaux), polymères (tapis convoyeurs) filière viande Bacillus cereus (cellules végétatives et spores) acier (conduites, tanks, remplisseuses), polymères (joints), papier filière lait, légumes.15
Exemples de micro-organismes d altération en biofilms en environnement d IAA Pseudomonas spp. (biofilms hébergeant Listeria, Salmonella) sols, aliments (viande), siphons, eau filière lait (bas ph), viande, légumes, fruits Bactéries lactiques Lactobacillus sake (viande) Carnobacterium spp. (lait, viande, poisson) Bactéries thermorésistantes.16
Détection de souillures.17
Choix du protocole Choix des méthodes de détection de l hygiène des surfaces Surveillance et vérification des procédures de nettoyage et désinfection (CCP essentiel à sécurité alimentaire) Surveillance au minimum quotidienne Établissement de la validité des méthodes de surveillance pour établir si pas de dérive corrélation entre réponse du test et qualité hygiénique de surface : Périodicité moindre (1-2 fois/semaine).18
Caractéristiques du test à prendre en compte? Vitesse Tests biochimiques. Sensibilité, exactitude Surveillance et vérification des procédures de nettoyage et désinfection. Tests microbiologiques, PCR, visualisation directe des surfaces Établissement de la validité des méthodes de surveillance Simplicité Facilité de mise en œuvre ou automatisation complète Reproductibilité Influence du manipulateur Coût Méthodes par contact Technique reconnue Publiée ou testée par organismes reconnus.19
Caractéristiques de la souillure à prendre en compte? Constituants du biofilm Microorganismes / matière organique / matière minérale Etat des microorganismes Vivants et cultivables VNC Morts Où se situe le biofilm? Accessibilité ou non Surface place lisse / recoin / surface rugueuse Pop. totale Pop. Viable (CTC+) Pop. cultivable Prélèvement de surfaces en ateliers de la filière fromage (Alliot, 1999).20
Cadre de l étude Contrat en partenariat avec l ADRIANOR et l ADRIANORMANDIE, et des PME agroalimentaires Projet DIAMS (DRAF) : Diagnostic Autocontrôle Mesure des Souillures. Objectif Diagnostic de la pertinence des produits et procédures d autocontrôle sur la détermination du niveau d encrassement par des souillures complexes à l issue des opérations de nettoyage et désinfection.21
Outils de contrôle de l hygiène des surfaces Evaluation de l hygiène des surfaces Souillure Microbiologique (viable cultivable) Non microbiologique Tests par frottis Tests par empreintes Visuel Bioluminescence Cytométrie Protéines Sucres Lipides EPS NADPH Allergènes Ecouvillons Eponges Chiffonnettes Boîtes contact Lames contact Films Microscopique Non microscopique.22
Approche expérimentale.23
Méthodes d étude Biofilms 3 souches bactériennes (IAA) Pseudomonas fluorescens D3-276 (produits laitiers) Escherichia coli CECT 434 (légumes) Bacillus cereus CUETM 98/4 (produits laitiers) Matériaux Très répandus dans les IAA Acier inoxydable 304 2B (1) Acier inoxydable 304 2R (2) Polyéthylène (3) Polypropylène (4) Téflon (5) Verre (6) 1 6 2 4 3 5.24
Propriétés des matériaux Verre Acier inoxydable 2R Acier inoxydable 2B Polypropylène Téflon Polyéthylène Rugosité moyenne Ra (µm) Angle de contact à l eau Verre Acier inoxydable 2R Acier inoxydable 2B Polypropylène Téflon Polyéthylène <0,01 0,02 0,13 0,14 0,45 11,61.25 25,5 43,0 50,3 97,1 113,0 89,0
Mode opératoire Production de biofilms Immersion horizontale Incubation 24 h à 25 C Méthodes test Coloration Tests microbiologiques par frottis Tests microbiologiques par empreintes Tests biochimiques Observation incubation 48 h à 30 C Dénombrement.26
Décrochement par frottis.27
Outils de décrochement Ecouvillons (différentes «tiges», différents matériaux de prélèvements ) Coton (Copan) Rayonne (Copan) Fibre de Polyester (Texwipe) Nylon floqué (Quantiswab, Copan).28
Outils de décrochement Mousse Polyester biseautée (Enviro-Swab, 3M) Eponge (Sponge Stick, 3M) Chiffonnette (Grosseron).29
Efficacité des outils de prélèvements, rôle du matériau Coton Rayonne Polyester Quantiswab Enviroswab Eponge Chiffonnette Verre Inox 2R Inox 2B Polyéthylène Polypropylène Téflon Outils les plus performants: Résultats les plus élevés sur P. fluorescens et E. coli Outils les moins performants: Résultats les plus faibles sur P. fluorescens et E. coli Eponge : test parmi les plus performants quelque soit le matériau Quantiswab, Enviroswab, chiffonnette performants sur verre et aciers +/- polypropylène Ecouvillons en rayonne et polyester, voire coton : peu performants même sur acier inoxydable.30
Intérêts/inconvénients des prélèvements par frottis Autorisent des analyses ultérieures variées Facilité de mise en œuvre Consommables bon marché Analyse de zones +/- accessibles Récupération +/- bonne de la souillure (- 1 log / microscopie) Influence du manipulateur.31
Méthodes par contact.32
Outils de détection des souillures microbiologiques par contact Géloses contact: Pétrifilms (Coliformes et Flore Totale, 3M) Lames bifaces gélosées (Coliformes et Flore Totale, LiofilChem) Boîtes contact (Flore Totale, ATL) Résultats proches pour les 3 méthodes.33
Outils de détection des souillures microbiologiques par contact Boites contact (RODAC, ATL) Gélose présentant ménisque convexe Reproductibilité de pression et durée => applicateurs Applicateur (500 g, 10 s).34
Outils de détection des souillures microbiologiques par contact Pétrifilm TM 3M Double film partie inférieure contenant un milieu déshydraté (réhydratation de 30 min à 1-2 h) film supérieur quadrillé pour le dénombrement Reproductibilité de pression et durée => applicateur Lecteurs automatiques disponibles commercialement.35
Outils de détection des souillures microbiologiques par contact Lames gélosées (LiofilChem) Lames biface (milieux différents) Application manuelle Incubateur.36
Outils de détection des souillures microbiologiques par contact Intérêts / inconvénients Facilité d utilisation Empreinte d une surface => localisation précise d une contamination Consommables bon marché (1-2 ) +/- mini-étuves, applicateurs et portoirs commercialement disponibles Accessibilité nécessaire Géométrie Surfaces plates et lisses [boîtes contact] Récupération partielle des souillures Bonne sur surface mouillée, moins bonne parfois sur surface sèche +/- reproductible [ex : lames gélosées, pas d applicateur] Incubation longue (24 h à 72 h) Problème des cellules mortes et VNC, de résidus bactéricides.37
Méthodes biochimiques.38
Outils biochimiques Méthodes par frottement + analyse (Kit) Principe Prélèvement par écouvillon et dosage direct (colorimétrique ) des protéines +/- sucres réducteurs des sucres de l ATP, NADP de résidus alimentaires.39
Outils biochimiques Protéines : Clean-Trace Plus (3M) Clean-Trace Instant (3M) Pro-Clean (Hygiena) Rida et Path-Check (R-Biopharm / Microgen) Flash (Biocontrol).40
Outils biochimiques Protéines, sucres et lipides : Clean Test (LiofilChem) Glucose/lactose : Spotcheck Plus (Hygiena) NAD(P)/NAD(P)H : Speed Check (Ecolab) Résidus alimentaires : Vericleen (Charm) EPS sur surfaces d acier : Biofilm Detector Kit (REALCO).41
Outils biochimiques Bilan efficacité Spotcheck Plus (lactose /glucose) pas adapté aux biofilms Vericleen et Flash : les moins performants surtout sur le Polyéthylène 1 2 3 1: Témoin (pas de biofilm) 2: Résultat positif orangé 3: Résultat positif violet - + Tests positifs demandant une certaine expertise Clean Trace Instant (3M) : lecture très rapide parfois nécessaire Biofilm Detector Kit sur acier (REALCO) : étape de «nettoyage» de la surface ProClean (Hygiena) : tige très souple, prélèvement parfois inférieur à celui des autres kits.42
Outils biochimiques Bilan efficacité Tests positifs, lecture facile : Speed Check (Ecolab) : changement de couleur très net Ridacheck, Pathcheck (R-Biopharm / Microgen) Clean trace Plus (3M), Clean Test (LiofilChem).43
Outils biochimiques Intérêts / inconvénients Meilleure accessibilité que méthodes par contact Très rapides (qq secondes à qq minutes) Très faciles à mettre en œuvre (avec gabarit usage unique [~1 ] ou acier [~25 ]) Sensibilité faible: qq µg qq 10 aines µg (selon auteurs) Influence du manipulateur (pression appliquée, schéma de prélèvement)
Conclusion.45
Méthodes biochimiques : méthodes rapides, relativement sensibles, bon complément aux méthodes microbiologiques pour détecter des biofilms sur des surfaces