Histology FISH Accessory Kit Code K5799

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1 Histology FISH Accessory Kit Code K5799 4th edition/ 4ème édition/ 4. Auflage For fluorescence in situ hybridization (FISH) on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. The kit contains reagents sufficient for 20 tests. Pour hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur des coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine. Les réactifs contenus dans ce kit permettent d effectuer 20 tests. Zur Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten. Der Kitinhalt ist für 20 Tests ausreichend. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 1/74

2 Table of content/ Table des matières/ Inhalt ENGLISH Intended Use... 5 Introduction... 5 Reagents... 5 Materials provided... 5 Materials required but not provided... 6 Precautions... 7 Storage... 8 Specimen Preparation... 8 Paraffin-embedded sections... 8 INSTRUCTIONS FOR USE... 9 A. Reagent Preparation... 9 A.1 Pre-Treatment Solution... 9 A.2 Stringent Wash Buffer... 9 A.3 Wash Buffer... 9 A.4 Ethanol series... 9 A.5 Pepsin solution... 9 B. Staining Procedure B.1 Procedural notes B.2 Treatment of tissues prior to staining B.3 Staining protocol B.3.a. Staining protocol for FISH probes diluted in ethylene carbonate-based hybridization buffer B.3.b. Staining protocol for FISH probes diluted in formamide-based hybridization buffer Quality Control Interpretation of Results Troubleshooting Appendix Appendix References Explanation of symbols ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 2/74

3 FRANÇAIS Utilisation prévue Introduction Réactifs Matériel fourni Matériel requis mais non fourni Précautions d'emploi Conservation Préparation des échantillons Coupes incluses en paraffine INSTRUCTIONS D'UTILISATION A. Préparation des réactifs A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Série de bains d'éthanol A.5 Solution de pepsine B. Procédure de coloration B.1 Remarques concernant la procédure B.2 Traitement des tissus avant la coloration B.3 Protocole de coloration Protocole de coloration B.3.a. pour sondes FISH diluées dans un tampon d'hybridation à base de carbonate d'éthylène Protocole de coloration B.3.b. pour sondes FISH diluées dans un tampon d'hybridation à base de formamide Contrôle qualité Interprétation des résultats Dépannage Annexe Annexe Bibliographie Explications des symboles ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 3/74

4 DEUTSCH Verwendungszweck Einführung Reagenzien Mitgelieferte Materialien Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Lagerung Probenvorbereitung Paraffineingebettete Schnitte GEBRAUCHSANWEISUNG A. Vorbereitung von Reagenzien A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Stringent Wash Buffer A.3 Wash Buffer A.4 Ethanolreihe A.5 Pepsinlösung B. Färbeverfahren B.1 Verfahrenshinweise B.2 Gewebebehandlung vor der Färbung B.3 Färbeprotokoll B.3.a. Färbeprotokoll für in ethylencarbonatbasiertem Hybridisierungspuffer verdünnte FISH-Sonden B.3.b. Färbeprotokoll für in formamidbasiertem Hybridisierungspuffer verdünnte FISH-Sonden Qualitätskontrolle Auswertung der Ergebnisse Fehlerbehebung Anhang Anhang Literatur Erläuterung der Symbole ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 4/74

5 ENGLISH Intended Use For in vitro diagnostic use. Histology FISH Accessory Kit is intended for use in the fluorescence in situ hybridization (FISH) technique on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue section specimens. Reagents provided in this Histology FISH Accessory Kit can also be used together with HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (Code K5731, Vial 3). If reagents from Dako Histology FISH Accessory Kit, Code K5799, are used together with reagents from Code K5731, the procedure outlined in the package insert for Code K5731 must be followed. Introduction Histology FISH Accessory Kit contains all key reagents, except for the probe, required to complete a FISH procedure for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue section specimens. After deparaffinization and rehydration, specimens are heated in Pre-Treatment Solution followed by proteolytic digestion using Pepsin. After the heating and proteolytic pre-treatment steps, userprovided FISH probes are applied and specimens are sealed with Coverslip Sealant before denaturation and hybridization. Following hybridization a stringent wash is performed, which ensures removal of unbound and unspecifically bound FISH probes before dehydration with ethanol. Finally, the specimens are mounted with Fluorescence Mounting Medium containing a blue fluorescence counterstain. Results are interpreted using a fluorescence microscope equipped with appropriate filters (see Appendix 1). Reagents Materials provided The materials listed below are sufficient for 20 tests (a test is defined as one 22 mm x 22 mm target area). The kit provides materials sufficient for up to 10 individual FISH runs (four separate runs, when using the pepsin immersing method). Histology FISH Accessory Kit is shipped on dry ice. To ensure that kit components have not been exposed to high temperatures during transport, dry ice should still be present upon receipt. Note that some kit components may remain unfrozen, this will not affect the performance of the Histology FISH Accessory Kit. Vial 1 Vial 2A Vial 2B Vial 4 Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, 20x concentrated MES (2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid) buffer. Pepsin 4 x 6.0 ml, ready-to-use Pepsin solution, ph 2.0; contains stabilizer and an antimicrobial agent. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, concentrated 10x Dilution buffer, ph 2.0; contains an antimicrobial agent. Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, 20x concentrated SSC (saline-sodium citrate) buffer with detergent Tween-20. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 5/74

6 Vial 5 Vial 6 Item 7 Fluorescence Mounting Medium 0.4 ml Ready-to-use fluorescence mounting medium with 500 µg/l DAPI (4,6-diamidine-2-phenylindole).. Wash Buffer (20x) 500 ml, 20x concentrated Tris/HCl buffer. Coverslip Sealant 1 tube Ready-to-use solution for removable sealing of coverslip. NOTE: All reagents are interchangeable with the corresponding reagents in Dako HER2 IQFISH pharmdx (Code K5731). If reagents from Dako Histology FISH Accessory Kit, Code K5799, are used together with reagents from Code K5731, the procedure outlined in the package insert for Code K5731 must be followed. Materials required but not provided Laboratory reagents Distilled or deionized water Ethanol, 96% Xylene or xylene substitutes Laboratory equipment Absorbent wipes Adjustable pipettes Calibrated partial immersion thermometer (range C) Coverslips (18 mm x 18 mm or 22 mm x 22 mm and 24 mm x 50 mm or 24 mm x 60 mm) Forceps Fume hood Dako Hybridizer (Code S2450/S2451)* Heating block or hybridization oven* Humid hybridization chamber* Microcentrifuge Slides, Dako Silanized Slides, Code S3003, poly-l-lysine-coated slides, or superfrost Plus slides Staining jars or baths Metal or plastic cradles Timer (capable of 0 60 minute intervals) Water bath with lid (capable of maintaining 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C and from 95 C to 99 C Microwave oven with sensing capability if pre-treatment is performed using microwave oven** (see Step 1 in Section B.3.a or B.3.b. Staining protocol, Method B). Microwave proof container, lid must contain holes with a diameter of e.g. one cm * Heating block for digestion (37 (±2) C), heating block or hybridization oven for denaturation (66 (±2) C (B.3.a.) or 82 (±2) C) (B.3.b.) and humid hybridization chamber for hybridization (45 (±2) C) can be used, but we recommend Dako Hybridizer, Code S2450/S2451. ** Water bath with lid (capable of maintaining C) or a microprocessor-controlled pressure chamber such as Dako Pascal, Code S2800 can be used instead of a microwave oven. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 6/74

7 Microscope equipment and accessories Filters for fluorescence microscope: DAPI filter and suitable filters for the used fluorochrome, e.g. FITC/Texas Red double filter, FITC and Texas Red mono filters for Dako FISH Probes see Appendix 1 for details. Fluorescence microscope with a 100 watt mercury lamp as light source should be used for Dako FISH Probes. Other light sources are not recommended with these filters. Microscope slide folder (cardboard tray for 20 slides with hinged cover or similar). Precautions 1. For professional users. 2. Vial 1, Pre-Treatment Solution (20x), contains 1 <20% 2-morpholinoethanesulphonic acid; Vial 2A, Pepsin, contains 5 10% propan-2-ol; and Vial 6, Wash Buffer (20x), contains 1 <20% trometamol. At product concentrations these substances do not require hazard labelling. Material Safety Data Sheets (MSDSs) are available for professional users on request. 3. Vial 2A, Pepsin, contains pepsin A that may cause an allergic reaction. 4. Vial 2B, Pepsin Diluent (10x) contains 60% propan-2-ol and is labelled: Highly flammable. Irritant. R11 Highly flammable. R36 Irritating to eyes. R67 Vapours may cause drowsiness and dizziness. S9 Keep container in a well-ventilated place. S16 Keep away from sources of ignition No smoking. S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. S60 This material and its container must be disposed of as hazardous waste. 5. Item 7, Coverslip Sealant contains % naphtha (petroleum), hydrotreated light, and is labeled: Extremely flammable. Dangerous for the environment. R11 Highly flammable. R51/53 Toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. S16 Keep away from sources of ignition No smoking. S35 This material and its container must be disposed of in a safe way. S57 Use appropriate container to avoid environmental contamination. S61 Avoid release to the environment. Refer to special instructions/safety data sheets. S9 Keep container in a well-ventilated place. 6. Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information. 7. Tissue fixation methods and thickness of specimen other than those specified may affect tissue morphology and/or signal intensity. 8. Incubation times and temperatures, or methods other than those specified, may give poor results. 9. Reagents have been optimally diluted. Further dilution may result in poor performance. 10. Only clean staining jars should be used for the pepsin immersion method (Step 2. Method C). ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 7/74

8 Storage Store in the dark at 2-8 C. Alternatively, all rea gents may be stored frozen. The Pepsin (Vial 2A) may be adversely affected if exposed to heat. Do not leave this component at room temperature. Fluorescence Mounting Medium (Vial 5) may be adversely affected if exposed to excessive light levels. Do not store this component in light. Do not use the kit after the expiry date stamped on the kit box. If reagents are stored under conditions other than those specified, the user must validate reagent performance (1). There are no obvious signs indicating instability of this product. Therefore, it is important to evaluate normal tissue previously shown to FISH well as control of the assay run. If an unexpected fluorescence pattern is observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures, and a problem with the Histology FISH Accessory Kit is suspected, contact Dako Technical Services. Specimen Preparation Specimens from biopsies, excisions or resections must be handled to preserve the tissue for FISH analysis. Follow the recommended method of tissue processing for immunocytochemical staining described below. For further information see reference (2). The use of tissue exposed to acid decalcification for FISH is not recommended (3-6). EDTA as decalcifier has been reported to preserve the DNA better (6) for (F)ISH (3, 4, 7) techniques. NOTE: Dako Histology FISH Accessory Kit performance has not been validated on decalcified tissue. Paraffin-embedded sections Only tissue preserved in neutral-buffered formalin and paraffin-embedded are suitable for use. Specimens should e.g. be blocked into a thickness of 3 or 4 mm and fixed hours in neutralbuffered formalin. The tissues are then dehydrated in a graded series of ethanol and xylene, followed by infiltration by melted paraffin held at no more than 60 C. Properly fixed and embedded tissues will keep indefinitely prior to sectioning and slide mounting if stored correctly (15-25 C) (2, 8). Other fixatives are not suitable. Extended fixation time might increase the incubation time required in the Pepsin digestion step. Tissue specimens should be cut into sections of 2-6 µm, collected on slides from a water bath and then air-dried. The optimal thickness of tissue sections is 2-3 µm for Dako Split Signal FISH Probes. Sections of 4 6 µm may be used for other FISH applications. The paraffin should be melted at 60 C for minutes. The sections should then be cooled to room temperature (20-25 C) and stored at 2-8 C. It is recommended that tissue sections are mounted on Dako Silanized Slides, Code S3003, or poly-l-lysine-coated or Superfrost Plus slides. In general, specimens should be analyzed within 6 months of sectioning when stored at 2-8 C. If tissue sections are stored under other conditions than those specified, the user must verify the conditions. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 8/74

9 INSTRUCTIONS FOR USE A. Reagent Preparation It is convenient to prepare the following reagents prior to staining: A.1 Pre-Treatment Solution Crystals may occur in Vial 1, but they will dissolve at room temperature. Ensure that no crystals are present before preparation of reagent. Dilute a sufficient quantity of Vial 1 (Pre-Treatment Solution 20x) by diluting the concentrate 1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted solution may be stored at 2-8 C for one month. Discard diluted sol ution if cloudy in appearance. A.2 Stringent Wash Buffer Dilute a sufficient quantity of Vial 4 (Stringent Wash Buffer 20x) by diluting the concentrate 1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted buffer may be stored at 2-8 C for one month. Discard diluted buffer if cloudy in appearance. A.3 Wash Buffer Dilute a sufficient quantity of Vial 6 (Wash Buffer 20x) by diluting the concentrate 1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted buffer may be stored at 2-8 C for one month. Discard diluted buffer if cloudy in appearance. A.4 Ethanol series From a 96% ethanol solution, prepare 3 jars containing 70%, 85%, and 96% ethanol. Store covered jars at room temperature or at 2-8 C, and use for a maximum of 200 slides. Discard solutions if cloudy in appearance. A.5 Pepsin solution A pepsin solution is only needed when using the pepsin immersing method (B.3.a. and B.3.b Step 2 Method C). Prepare pepsin solution as follows; For a six slide capacity container prepare 60 ml pepsin solution: Add 48 ml of room temperature (20-25 C) distilled or deoinized water to the container. Add 6 ml of cold (2-8 C) Pepsin Diluent (10x) (Vial 2B) to the container. Add 6 ml of cold (2-8 C) Pepsin (Vial 2A) to the container. Put lid on the container and equilibrate the pepsin solution to 37 (±2) C in a water bath. For a 24 slide capacity container prepare 240 ml pepsin solution: Add 192 ml of room temperature (20-25 C) distilled or deoinized water to the container. Add 24 ml of cold (2-8 C) Pepsin Diluent (10x) (Vial 2B) to the container. Add 24 ml of cold (2-8 C) Pepsin (Vial 2A) to the container. Put lid on the container and equilibrate the pepsin solution to 37 (±2) C in a water bath. Equilibrated pepsin solution should be used within 5 hours. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 9/74

10 B. Staining Procedure B.1 Procedural notes The user should read these instructions carefully and become familiar with all components prior to use (see Precautions). If kit components are stored frozen, it is recommended to transfer the reagents to 2 8 C the day before performing the analysis to allow proper temperature equilibration. All reagents should be equilibrated to the relevant temperature prior to use. Vial 1: The diluted Pre-Treatment Solution should be equilibrated to C if water bath is used (Section B.3.a or B.3.b Staining protocol, Step 1: Pre-Treatment, Method A). If microwave oven with sensing capability is used for pre-treatment (Section B.3.a. or B.3.b. Staining protocol, Step 1: Pre-Treatment, Method B) the diluted Pre-Treatment Solution should be equilibrated to room temperature C. Vial 2A: Pepsin should be applied at 2-8 C (Section B.3.a. or B.3.b. Staining protocol, Step 2: Method A and B) and kept cold continuously. Vial 2B: Pepsin Diluent (10x) should be applied at 2-8 C (Section B.3.a. or B.3.b. Staining protocol, Step 2: Method C) Vial 4: One jar of the diluted Stringent Wash Buffer should be equilibrated to room temperature and another jar should be equilibrated to 63 (±2) C (Section B.3.a.) or 65 (±2) C (Section B.3.b), prior to use. Vial 5: Vial 6: Item 7: Fluorescence Mounting Medium may be applied at any temperature from 2-25 C. The diluted Wash Buffer should be equilibrated to room temperature (20-25 C). Coverslip Sealant may be applied at room temperature (20-25 C). All steps must be performed at the outlined temperature. The pre-staining procedure includes dehydrations followed by drying of the specimens. Ensure that the specimens are completely dry before proceeding to the next step. Do not allow specimens to dry during the other procedural steps. If the staining procedure has to be interrupted, slides may be kept in Wash Buffer after the deparaffinization step for up to 1 hour at room temperature (20-25 C). B.2 Treatment of tissues prior to staining Deparaffinization and rehydration: Prior to performing the procedure, tissue slides must be deparaffinized to remove paraffin and rehydrated. Avoid incomplete removal of paraffin. Residual paraffin will result in increased non-specific staining. This step should be performed at room temperature (20-25 C). 1. Place slides in a xylene bath and incubate for 5 (±1) minutes. Change bath and repeat once. 2. Tap off excess liquid and place slides in 96% ethanol for 2 (±1) minutes. Change bath and repeat once. 3. Tap off excess liquid and place slides in 70% ethanol for 2 (±1) minutes. Change bath and repeat once. 4. Tap off excess liquid and place slides in diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2) for a minimum of 2 minutes. Commence staining procedure as outlined in Section B.3.a. or B.3.b., Step 1, Pre-Treatment. Fresh xylene and alcohol solutions should be prepared after every 200 slides have been processed. Xylene substitutes may be used. NOTE: The reagents and instructions supplied in this kit have been designed for optimal performance. Further dilution of the reagents or alteration of incubation temperatures may give ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 10/74

11 erroneous or discordant results. Differences in tissue processing and technical procedures in the user s laboratory may invalidate the assay results. Optional maturing of specimens: Before deparaffinization and rehydration, incubate slides at 60 C for e.g. 1 hour on a heating block, a block in a hybridization oven or on the Dako Hybridizer. Alternatively, incubate slides at 37 C for 1-2 days followed by 1 hour at 60 C. Continue with deparaffinization and rehydration. NOTE: This step is optional. Matured specimens may reduce potential background noise. B.3 Staining protocol Follow one of the two staining protocol variants, B.3.a or B3.b. Do not interchange steps between the two procedures: Staining protocol B.3.a describes the half-day procedure that should be applied for FISH probes diluted in an ethylene carbonate-based hybridization buffer. Staining protocol B.3.b describes the two-day procedure that should be applied for FISH probes diluted in a formamide-based hybridization buffer. B.3.a. Staining protocol for FISH probes diluted in ethylene carbonate-based hybridization buffer Step 1: Pre-Treatment (microwave oven, water bath, Pascal) Pre-treatment can be performed either by using water bath as described in method A), by use of microwave oven with sensing capability as described in method B) or by use of Pascal pressure cooker as described in method C). Method A: Pre-treatment using water bath Fill staining jars, e.g. Coplin jars, with the diluted Pre-Treatment Solution (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.1). Place staining jars containing diluted Pre-Treatment Solution in water bath. Heat water bath and the Pre-Treatment Solution to C. Measure temperature inside jar with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. Cover jars with lids in order to stabilize the temperature and avoid evaporation. Immerse the room temperature deparaffinized sections into the preheated Pre-Treatment Solution in the staining jars. Re-check temperature and incubate for 10 (±1) minutes at C. Remove the entire jar with slides from the water bath. Remove lid and allow the slides to cool in the Pre-Treatment Solution for 15 minutes at room temperature. Transfer the slides to a jar with diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.3) for 3 minutes at room temperature (20-25 C). Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. NOTE: The Pre-Treatment Solution is designed for single use application only. Do not re-use. Method B: Pre-treatment using microwave oven with sensing capability (Recommended) Fill a plastic jar with diluted room temperature (20-25 C) Pre-Treatment Solution. Immerse the deparaffinized sections in Pre-Treatment Solution, cover the jar with a punctured lid and place it in the microwave oven. Select the boiling sensor function and a program that runs for 10 minutes after boiling temperature has been reached*. Following the 10 minutes incubation take the jar with slides out of the oven, remove the lid and cool for 15 minutes at room temperature. Transfer the slides to a jar with diluted Wash Buffer and soak for 3 minutes at room temperature (20-25 C). Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. * The use of a microwave oven with a sensing capability means that the oven must include a sensor and programs which initially heat the Pre-Treatment Solution to the boiling point and subsequently maintain the required pre-treatment temperature (above 95 ºC) while counting down the preset time (10 (±1) minutes). Some microwave oven models with sensing capability may not include the possibility to freely set a count-down time. If the model only includes pre-set programs, be sure to select a program which maintain the required pre-treatment temperature (above 95 ºC) for at least 10 (±1) minutes and manually stop the program after 10 (±1) minutes. NOTE: The Pre-Treatment Solution is designed for a single use application only. Do not re-use. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 11/74

12 Method C: Pre-treatment using Pascal pressure chamber Place 500 ml of deionized water inside the Pascal pan. Fill a plastic jar with 250 ml Pre- Treatment Solution. Immerse the deparaffinized sections in Pre-Treatment Solution and place the jar inside the Pascal pan. Incubate at 121 C for 1 minute. Release pressure after cooling to 90 C. Carefully read the Pascal Handbook for information on proper handling of the Pascal pressure chamber. Remove the container after the pressure is released. Remove lids and allow the slides to cool in the Pre-Treatment Solution for another 15 minutes at room temperature. Transfer the slides to a jar containing diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2). Soak sections for 3 minutes at room temperature. Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to Step 2. NOTE: The Pre-Treatment Solution is designed for a single use only. Do not re-use. Do not use a sealed, airtight container when performing pre-treatment in a microwave oven as the pressure inside the container will increase and may explode or cause injury when opening. It is possible to use a metal slide holder in the microwave oven if the metal holder is submerged in pre-treatment solution during the whole microwave treatment. Do not otherwise use metal in a microwave oven. Follow the microwave manufacturer s instructions. Avoid continuous boiling of the Pre-Treatment Solution during the 10 minutes incubation. Perform regular temperature control using a calibrated thermometer to verify correct temperature conditions. Step 2: Pepsin, ready-to-use (RTU) or pepsin solution Pepsin incubation can be performed by direct application of RTU pepsin drops to the slides either at room temperature (20-25 C) (Method A) or at 37 C (Method B). Alternatively, slides can be immersed into a pepsin solution and incubated at 37 (±2) C (Method C). Method A and Method B: Tap off excess buffer. Using lintless tissue (such as an absorbent wipe or gauze pad), carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep reagents within the prescribed area. Apply 5-8 drops (250 µl) of cold (2-8 C) Pepsin (Vial 2A) to cover specimen. Always store Pepsin at 2-8 C. Method A: Pepsin, RTU - Incubation at C Incubate for 5-15 minutes at room temperature (20-25 C). An incubation time of 5-15 minutes will be adequate for most specimens, but the optimal incubation time may depend on tissue fixation and/or thickness of specimen and should be determined by the user. Tap off excess Pepsin and soak sections in the diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.3) for 3 minutes at room temperature (20-25 C). Replace diluted Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to dehydration. Method B: Pepsin, RTU - Incubation at 37 C Place specimen with Pepsin on a heating block at 37 C e.g. Dako Hybridizer and incubate for 3-5 minutes. An incubation time of 3-5 minutes will be adequate for most specimens, but the optimal incubation time may depend on tissue fixation and/or thickness of specimen and should be determined by the user. Tap off excess Pepsin and soak sections in diluted Wash Buffer for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to dehydration. Dehydrate tissue sections through a graded series of ethanol: 2 minutes in 70% ethanol, 2 minutes in 85% ethanol, and 2 minutes in 96% ethanol. Allow tissue sections to air dry completely. Method C: Pepsin solution - Immersion of slides into 37 C pepsin solution The kit contains reagents sufficient for four separate runs (60 ml pepsin solution, small container for six slides) or a single run (240 ml pepsin solution, large container for 24 slides). Prepare the pepsin solution as described in section A.5. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 12/74

13 Put lid on the container and equilibrate the pepsin solution to 37 (±2) C in a water bath. Ensure that the temperature has stabilized. Measure temperature inside the container with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. Tap of excess wash buffer. Immerse slides into the 37 (±2) C pepsin solution and incubate for minutes. An incubation time of minutes will be adequate for most specimens, but the optimal incubation time may depend on tissue fixation and/or thickness of specimen and should be determined by the user. Tap off exces pepsin solution and soak sections in diluted Wash Buffer for 3 minutes at room temperature (20-25 C). Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to dehydration. Dehydrate tissue sections through a graded series of ethanol: 2 minutes in 70% ethanol, 2 minutes in 85% ethanol, and 2 minutes in 96% ethanol. Allow tissue sections to air dry completely. Step: 3 FISH probe diluted in ethylene carbonate-based hybridization buffer (provided by the user) NOTE: FISH probe mixes diluted in ethylene carbonate-based hybridization buffer must be stored at -18 C between uses. Storage at -18 C results i n separation of the buffer into two phases. Prior to use ensure that only one phase is present by equilibrating the probe mix to room temperature (20-25 C) followed by mixing. Thaw the FISH probe mix at room temperature (20-25 C) for a maximum of 30 minutes (protect from strong light), then thoroughly whirl the vial for 15 seconds at 2500 rpm using a vortex mixer. Apply an appropriate amount of probe mix, e.g. 10 µl, to the center of the tissue section. Immediately place a 22 mm x 22 mm glass coverslip over the probe mix and allow it to spread evenly under the coverslip. Avoid air bubbles. If air bubbles are observed, gently tap them away from the tissue using forceps. Seal coverslip with Coverslip Sealant by ejecting the Sealant around the periphery of the coverslip. Allow the Coverslip Sealant to overlap the coverslip and the slide, thereby forming a seal around the coverslip. Make sure that the Coverslip Sealant covers the entire edge of the coverslip. Prepare Dako Hybridizer* (Code S2450 or S2451) for a hybridization run. Make sure that Humidity Control Strips (Code S2452) are saturated and optimal for use. Start the Hybridizer and choose a program that will: Denature at 66 C for 10 minutes followed by hybridization at 45 C for minutes. Place slides in the Hybridizer, make sure the lid is properly closed and start program. Please refer to Dako Hybridizer Instruction Manual for details. * Instrumentation that allows for conditions identical to the ones described above may be used for denaturation and hybridization: Place slides on a flat metal or stone surface (heating block or on a block in a hybridization oven) preheated to 66 (±1) C. Denature for exactly 10 minutes. Place slides in a preheated humidified hybridization chamber. Cover the chamber with a lid and incubate at 45 (±2) C for minutes. Step 4: Stringent Wash Fill two staining jars, e.g. Coplin jars, with the diluted Stringent Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2). A minimum volume of 100 ml or 15 ml per slide in each jar is recommended. Place one of the staining jars containing diluted Stringent Wash Buffer at room temperature in a fume hood and the other in a water bath. Heat water bath and the diluted Stringent Wash Buffer to 63 (±2) C. Ensure that the temperature has stabilized. Cover jar with lid in order to stabilize the temperature and avoid evaporation. Measure temperature inside the water bath jar with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. The Stringent Wash Buffer contains detergent and may become turbid at 63 C; this will not affect performance. Using forceps or gloves take slides from the hybridization chamber and gently remove Coverslip Sealant as well as coverslip and place slides in the room temperature pre-wash jar, one at a time. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 13/74

14 As soon as all coverslips have been removed, transfer slides from the room temperature, pre-wash jar to the 63 (±2) C jar in the water bath. Immediately after transferring the slides into the 63 (±2) C diluted Stringent Wash Buffer in the water bath, the timer should be started. Perform stringent wash for exactly 10 minutes. Remove slides from the diluted Stringent Wash Buffer, and soak sections in diluted Wash Buffer for 3 minutes at room temperature (20-25 C). Change diluted Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Dehydrate tissue sections through a graded series of ethanol: 2 minutes in 70% ethanol, 2 minutes in 85% ethanol, and 2 minutes in 96% ethanol. Allow tissue sections to dry completely. Step 5: Mounting Apply 15 µl of Fluorescence Mounting Medium containing DAPI (Vial 5) to the target area of the slide and apply a glass coverslip. NOTE: Slides may be read after 15 minutes or within 7 days after mounting. However, fading occurs if slides are exposed to light or high temperatures. To minimize fading, store slides in the dark at C. B.3.b. Staining protocol for FISH probes diluted in formamide-based hybridization buffer DAY 1 Step 1: Pre-Treatment (microwave oven, water bath, Pascal) Pre-treatment can be performed either by using water bath as described in method A), by use of microwave oven with sensing capability as described in method B) or by use of Pascal pressure chamber as described in method C). Method A: Pre-treatment using water bath Fill staining jars with diluted Pre-Treatment Solution (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.1). Place staining jars containing diluted Pre-Treatment Solution in water bath. Heat water bath and the Pre-Treatment Solution to C. Measure temperature inside jar with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. Cover jars with lids (no holes) in order to stabilize the temperature and avoid evaporation. Immerse the deparaffinized sections into the preheated Pre-Treatment Solution. Re-check temperature, close the water bath s lid and incubate for 10 (±1) minutes at C. Remove the entire jar with slides from the water bath. Remove lid (do not remove slides). Allow the slides to cool in the Pre-Treatment Solution for 15 minutes at room temperature. Transfer the slides to a jar containing diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2) for 3 minutes at room temperature. Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to Step 2. Method B: Pre-treatment using microwave oven with sensing capability (Recommended) Fill a container with diluted room temperature (20-25 C) Pre-Treatment Solution. Immerse the deparaffinized sections into the solution and close the lid. The lid must contain holes allowing pressure to escape. Place the container with slides into the microwave oven and heat. Before heating, make sure the outside of the container and microwave oven cavity are dry. Incubate just below the boiling point (not less than 95 C) for 10 minutes. After incubation remove lid (do not remove slides). Allow the slides to cool in the Pre-Treatment Solution for 15 minutes at room temperature (20-25 C). The slides must be covered with buffer during the whole pre-treatment procedure. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 14/74

15 Transfer the slides to a jar containing diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2) for 3 minutes at room temperature. Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to Step 2. Method C: Pre-treatment using Pascal pressure chamber Place 500 ml of deionized water inside the Pascal pan. Fill a plastic jar with 250 ml Pre- Treatment Solution. Immerse the deparaffinized sections in Pre-Treatment Solution and place the jar inside the Pascal pan. Incubate at 121 C for 1 minute. Release pressure after cooling to 90 C. Carefully read the Pascal Handbook for information on proper handling of the Pascal pressure chamber. Remove the container after the pressure is released. Remove lids and allow the slides to cool in the Pre-Treatment Solution for another 15 minutes at room temperature. Transfer the slides to a jar containing diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2). Soak sections for 3 minutes at room temperature. Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to Step 2. NOTE: The Pre-Treatment Solution is designed for a single use only. Do not re-use. Do not use a sealed, airtight container when performing pre-treatment in a microwave oven as the pressure inside the container will increase and may explode or cause injury when opening. It is possible to use a metal slide holder in the microwave oven if the metal holder is submerged in pre-treatment solution during the whole microwave treatment. Do not otherwise use metal in a microwave oven. Follow the microwave manufacturer s instructions. Avoid continuous boiling of the Pre-Treatment Solution during the 10 minutes incubation. Perform regular temperature control using a calibrated thermometer to verify correct temperature conditions. Step 2: Pepsin, ready-to-use (RTU) or pepsin solution Pepsin incubation can be performed by direct application of RTU pepsin drops to the slides either at room temperature (20-25 C) (Method A) or at 37 C (Method B). Alternatively, slides can be immersed into a pepsin solution and incubated at 37 (±2) C (Method C) Method A and method B: Tap off excess buffer. Using lintless tissue (such as an absorbent wipe or gauze pad), carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep reagents within the required area. Apply 5 8 drops (250 µl) of cold (2 8 C) Pepsin (Vial 2A) ensuring that the specimen is covered. Always store Pepsin at 2-8 C. Method A: Pepsin, RTU Incubation at C Incubate for 5-50 minutes at room temperature (20-25 C). An incubation time of minutes at room temperature will be adequate for most specimens, but optimal incubation time should be determined by the user. Tap off excess Pepsin and soak sections in the diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.3) for 3 minutes at room temperature (20-25 C). Replace diluted Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to Step 3, FISH Probe or see Appendix 2 for optimization of digestion time (optional). Method B: Pepsin, RTU Incubation at 37 C Place specimens with pepsin at 37 C on the Dako Hybridizer or on a preheated heating block. Incubate for 2 6 minutes at 37 C. This will be adequate for most specimens prepared as described in the Specimen Preparation section. The optimal incubation time depends on tissue type, tissue fixation, thickness of specimen, specimen maturation and should be determined by the user. These factors may increase the required digestion time to 7 15 min or even higher. First time users should identify the optimal digestion time by testing a representative tissue for 1, 3, 6, 12 and 18 minutes. Tap off Pepsin and soak sections in the diluted Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.3) for 3 minutes at room temperature (20-25 C). Replace diluted Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to Step 3, FISH Probe or see Appendix 2 for optimizing of digestion time (optional). Method C: Pepsin solution - Immersion of slides into 37 C pepsin solution ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 15/74

16 The kit contains reagents sufficient for four seperate runs (60 ml pepsin solution, small container for six slides) or a single run (240 ml pepsin solution, large container for 24 slides). Prepare the pepsin solution as described in section A.5. Put lid on the container and equilibrate the pepsin solution to 37 (±2) C in a water bath. Ensure that the temperature has stabilized. Measure temperature inside the container with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. Tap of excess wash buffer. Immerse slides into the 37 (±2) C pepsin solution and incubate for minutes. An incubation time of minutes will be adequate for most specimens, but the optimal incubation time may depend on tissue fixation and/or thickness of specimen and should be determined by the user. Tap off excess pepsin solution and soak sections in diluted Wash Buffer for 3 minutes at room temperature (20-25 C). Replace Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Continue to Step 3, FISH Probe or see Appendix 2 for optimizing of digestion time (optional). NOTE: It is recommended that the procedure in Specimen Preparation section is followed. Underdigested tissue might result in no signals or only dizzy signals often with a high level of green cytosolic background. Step 3: FISH Probe (provided by the user) NOTE: If reagents from Dako Histology FISH Accessory Kit, Code K5799, are used together with reagents from Code K5731, the procedure outlined in the package insert for Code K5731 must be followed. The following step should be performed in a fume hood. Fluorochrome-labeled probes may be affected adversely if exposed to excessive light levels. Do not perform the remainder of this procedure in strong light, such as direct sunlight. Dehydrate tissue sections through a graded series of ethanol: 2 minutes in 70% ethanol, 2 minutes in 85% ethanol, and 2 minutes in 96% ethanol (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.4). Allow tissue sections to air dry completely. Apply an appropriate amount of fluorochrome-labeled probe, e.g. 10 µl of a Dako FISH probe to the centre of the tissue section. Immediately place an 18 mm x 18 mm (or e.g. 22 mm x 22 mm) glass coverslip over the probe and allow it to spread evenly under the coverslip. Avoid air bubbles. If air bubbles are observed, gently tap them away using forceps. Seal coverslip by applying the Coverslip Sealant around the periphery of the coverslip. Allow the Coverslip Sealant to overlap the coverslip and the slide, thereby forming a seal around the coverslip. Make sure that the Coverslip Sealant seals the entire edge of the coverslip. Place slides in Dako Hybridizer (Code S2450/S2451) and set the denaturation to 82 C for 5 min and hybridization to 45 C overnight (14 20 h) when using Dako FISH probes. Continue to Day 2, Step 4, Stringent Wash. See the Hybridizer Handbook for further instructions. NOTE: A heating block, hybridization oven and hybridization chamber can alternatively be used, see below. Place slide on a flat metal or stone surface (heating block or on a block in a hybridization oven) preheated to 82 (±2) C. Denature for 5 minutes ensuring that the temperature of the block does not drop below 80 C. Place slides in a preheated humidified hybridization chamber. Cover the chamber with a lid and incubate overnight (14 20 hours) at 45 (±2) C when using Dako FISH probes. DAY 2 Step 4: Stringent Wash Fill two staining jars with diluted Stringent Wash Buffer (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2). A minimum volume of 100 ml diluted Stringent Wash Buffer is required for 1 6 slides in a jar. For more than 6 slides use at least 15 ml buffer per slide. Place one of the staining jars containing diluted Stringent Wash Buffer at room temperature in a fume hood and the other in a water bath. Heat water bath and the diluted Stringent Wash Buffer to ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 16/74

17 65 (±2) C. Ensure that the temperature has stabilized. Cover jar with lid in order to stabilize the temperature and avoid evaporation. Measure temperature inside the jar with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. Take slides from the hybridization chamber. Using forceps, gently remove the Coverslip Sealant as well as the coverslip and transfer the slide to the room temperature pre-wash jar. As soon as all coverslips have been removed, transfer slides from the room temperature, pre-wash jar to the 65 (±2) C jar in the water bath. Close jar lid and then water bath lid. Perform stringent wash for exactly 10 minutes at 65 (±2) C. Remove slides from the diluted Stringent Wash Buffer and soak sections in diluted Wash Buffer for 3 minutes at room temperature (20 25 C). Change diluted Wash Buffer and soak sections for another 3 minutes. Dehydrate tissue sections through a graded series of ethanol: 2 minutes in 70% ethanol, 2 minutes in 85% ethanol, and 2 minutes in 96% ethanol (see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.4). Allow slides to completely air-dry. Step 5: Mounting Apply 15 µl of Fluorescence Mounting Medium (Vial 5), containing blue fluorescence counterstain, to the target area of the slide and apply a glass coverslip (e.g. 24 mm x 50 mm or 24 mm x 60 mm). Allow the medium to spread evenly over the specimen. NOTE: Slides may be read after 15 minutes or within 7 days after mounting. Fading occurs if slides are exposed to light or high temperatures. Slides should be stored in the dark at C. Quality Control 1. Signals must be bright, distinct and easy to evaluate. 2. Normal tissue previously shown to FISH well should be used for control of the assay run. 3. Normal tissue cells should have clearly visible fluorescence signals, indicating that the FISH probes have successfully hybridized to the target regions. 4. Failure to detect signals in normal tissue cells indicates assay failure, and results should be considered invalid. 5. Due to tissue sectioning, some normal cells will have less than the expected number of signals. 6. Nuclear morphology must be intact and homogenously stained when evaluated using a DAPI filter. Numerous ghost-like cells, donut cells and a general poor nuclear morphology indicate over-digestion or over-denaturation of the specimen, which can result in loss or fragmentation of signals. Peripheral staining, holes in cells (DAPI filter) and/or strong green cytosolic background staining when observed with a Texas Red/FITC double filter might indicate underdigestion, which can result in loss of signal. Such specimens should be considered invalid. 7. Differences in tissue fixation, processing, and embedding in the user s laboratory may produce variability in results, necessitating regular evaluation of in-house controls. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 17/74

18 Interpretation of Results Scan several areas of cells to account for possible heterogeneity. Select an area having good nuclei distribution. Begin analysis in the upper left quadrant of the selected area and, scanning from left to right, count the number of signals within the nuclear boundary of each evaluated nucleus, according to the guidelines below. Focus up and down to find all of the signals in the individual nucleus. Do not score nuclei with no signals. Do not include nuclei that require subjective judgement. Skip nuclei with weak signal intensity and non-specific or high background. The user must determine the number of nuclei that should be counted for each probe. Avoid areas where the nuclear borders are ambiguous. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 18/74

19 Troubleshooting Problem Probable Cause Suggested Action 1. No signals or weak signals 1a. Inappropriate digestion time. 1a. Ensure that formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are used. A prolonged digestion time of e.g minutes or even higher at 37 C might help. See Section B.3.a or B.3.b Step 2, Troubleshooting point 4d, 4e and Appendix 2. 1b. Kit has been exposed to high temperatures during transport or storage. 1c. Pre-treatment conditions incorrect. 1d. Denaturation conditions incorrect. 1e. Hybridization temperature incorrect. 1f. Evaporation of probe buffer during hybridization. 1b. Check storage conditions. Ensure that dry ice was present when the consignment was received. Ensure that vials 2A and 5 have been stored at 2 8 C, and that vial 5 has been stored in the dark. 1c. Ensure that the recommended pre-treatment temperature and time are used. Furthermore that the digestion incubation time has been optimized if required, see Section B.3.a or B.3.b Step 2. The closer the pre-treatment temperature is to the boiling point the stronger signals. Ensure that the Pepsin is handled at the correct temperature. See Section B.1. 1d. Ensure that the recommended denaturation temperature and time are used. 1e. Hybridize at 45 (±2) C when using Dako FISH probes. 1f. Ensure sufficient humidity in the hybridization chamber. Use Dako Hybridizer (Code S2450/S2451) and Hybridizer Humidity Control Strips (Code S2452). Use Coverslip Sealant. See Troubleshooting point 5a and 5b. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 19/74

20 1g. Stringency wash conditions incorrect. 1h. Microscope not functioning properly - Inappropriate filter set - Unsuitable lamp - Mercury lamp too old - Burnout filters - Dirty and/or cracked collector lenses - Unsuitable immersion oil 1g. Ensure that the recommended stringency wash volume, temperature and time are used, and that coverslips are removed before performing stringent wash. 1h. Check the microscope and ensure that the used filters are suitable for use with the fluorochromes, that they are not worn out and that the mercury lamp is suitable and has not been used beyond expected lifetime (See Appendix 1). Use suitable immersion oil for fluorescence. In case of doubt, please contact your local microscope vendor. 1i. Faded signals. 1i. Avoid extended microscopic examination and minimize exposure to strong light sources. 2. Areas without signal 2a. Probe volume too small. 2a. Ensure that the probe volume is large enough to cover the area under the coverslip. 2b. Air bubbles caught during probe application or mounting. 2b. Avoid air bubbles. If observed, gently tap them away using forceps. 2c. Poor deparaffinization. 2c. Ensure that the paraffin has been complete removed from sections. See section B Excessive background staining 3a. Inappropriate digestion time. Strong green cytosolic background might indicate under-digestion. 3a. Ensure that formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are used. A prolonged digestion time of e.g minutes at 37 C might help. See Section B.3.a or B.3.b. Step 2, Troubleshooting point 4e and Appendix 2. 3b. Sections have dried in B.3. 3b. Follow the instructions and avoid drying of slides unless specified. 3c. Paraffin incompletely removed. 3c. Follow the deparaffinization and rehydration procedures outlined in Section B.2 ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 20/74

21 4. Poor nuclei morphology or weak nuclei staining 3d. Stringency wash temperature too low. 3e. Prolonged exposure of hybridized section to strong light. 3f. Expired glass slides or nonsuitable slides may cause an excessive red star sky staining. 3g. Non-fluorescing Immersion oil mixed with the Fluorescence Mounting Medium. 4a. Incorrect pre-treatment conditions may result in unclear or cloudy appearance. 4b. Boiling during the pre-treatment may result in morphology damage and lack of signals. 3d. Ensure that the recommended stringency wash temperature is used. 3e. Avoid extended microscopic examination and minimize exposure to strong light. 3f. Use the recommended slide types and secure that they are not expired. See Paraffin-embedded sections section. 3g. Use large glass coverslips when mounting as recommended. See Section B.3.a or B.3.b, Step 5. This prevents immersion oil from mixing with mounting medium, avoiding auto fluorescence and accidental removal of coverslips by the microscopes objective. 4a. Ensure that the recommended pre-treatment temperature and time are used. See also Troubleshooting point 4b-e. 4b. Avoid boiling. See Section B.3, Step 1. See also Troubleshooting point 4d. 4c. Incorrect Pepsin treatment. 4c. Adhere to recommended Pepsin incubation times. See Section B.3, Step 2 and Appendix 2. See also Troubleshooting point 1a, 1c 3a, 4d and 4e. 4d. Too long Pepsin treatment will dissolve the tissue and result in lack of signals. Over-digestion may cause ghost cells or donut nuclei and nuclei with a general poor nuclear morphology to appear. 4d. Shorten the Pepsin incubation time. See Section B.3.a or B.3.b, Step 2 and Appendix 2. Ensure that the section thickness is 2 6 µm. See also Troubleshooting point 1a, 1c, 4b and 4e. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 21/74

22 5. Coverslip adhere strongly to glass slide after hybridization and thereby hard to remove. 6. High level of green autofluorescence on slide including areas without FFPE tissue 4e. Too short Pepsin treatment may result in lack of signals. Underdigested tissue may cause peripheral nuclei stain and holes in nuclei (DAPI filter); high green background in cytosol (Texas Red/FITC double filter). Notice that nuclei in underdigested tissue have nice morphology in contrast to overdigested tissue. 4f. Denaturation temperature too high. 4g. Incorrect hybridizations conditions. 5a. Coverslip inappropriately sealed to glass slide. 5b. Incorrect hybridizations conditions. Might cause reduced or no signals, tissue damage and background staining. 6. Use of expired or unrecommended glass slides 4e. Prolong the Pepsin incubation time to e.g. 2 3 times the used digestion time. See also Troubleshooting point 1a, 1c, 3a, 4a and 4d. 4f. Ensure that the recommended denaturation temperature is used. 4g. See Troubleshooting point 1f and 5b. 5a. Do not force off the coverslip if the coverslip adhere strongly to glass slide. Immerse slide in the jar containing diluted Stringent Wash Buffer at room temperature for five minutes and then remove coverslip. Follow recommendations for coverslip sealing in Section B.3a or B.3.b, Step 3. See also Troubleshooting point 1f and 5b. 5b. Ensure sufficient humidity in the hybridization chamber. Use Dako Hybridizer (Code S2450/S2451) and Hybridizer Humidity Control Strips (Code S2452). Follow instructions given in Package Insert for Hybridizer Humidity Control Strips. See recommended hybridization conditions in Section B.3.a or B.3.b, Step 3. See also Troubleshooting point 1f and 5a. 6. Ensure that the coated glass slide (Dako Silanized Slides, Code S3003, or poly-llysine-coated slides) have not passed expiry date. NOTE: If the problem cannot be attributed to any of the above causes, or if the suggested corrective action fails to resolve the problem, please call Dako Technical Services for further assistance. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 22/74

23 Appendix 1 Histology FISH Accessory Kit, Code K5799 Fluorescence Microscope Specifications Dako recommends the following equipment for use with the Histology FISH Accessory Kit when using Dako FISH probes: 1. Microscope type Epifluorescence microscope. 2. Lamp 100 watt mercury lamp (should generally be replaced every 200 hours). 3. Objectives For screening of the tissue, fluorescence dry 10x or fluorescence oil immersion 16x objectives are applicable. For high power magnification and scoring of signals, only fluorescence oil immersion objectives, e.g. 63x or 100x are recommended. 4. Filters Filters are individually designed for specific fluorochromes and must be chosen accordingly. Dako recommends the use of a specific DAPI filter in combination with a high quality Texas Red/FITC double filter when using Dako FISH probes. DAPI filter, e.g. Omega Optical filter #XF06 or Chroma filter # Texas Red/FITC double filter, e.g. Omega Optical filter # XF53 or Chroma filter # Texas Red and FITC single filters can be used for confirmation, e.g. Omega Optical filter # XF102-2 and XF202, respectively. Fluorochrome Excitation Wavelength Emission Wavelength FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filters are specific to each microscope type and the use of appropriate filters is crucial for the interpretation. Further detailed information, can be provided by your microscope manufacturer or your Dako representative or Dako Web site. 5. Oil Non-fluorescing immersion oil. Precautions Specific fluorochromes require different equipment. For Dako FISH probes a 50 watt mercury lamp is not recommended, rhodamine filters cannot be used, and triple filters are in general not recommended. A non-optimized microscope may cause problems when reading the fluorescent signals. It is important that the light source has not expired and that it is properly aligned and focused. Customers should monitor and follow the manufacturer s recommendations for the mercury lamp and the microscope should be maintained. An effort should be made to expose the sample to as little of the excitation light as possible in order to minimize fading of the fluorescence. We recommend that you discuss the set-up of your particular microscope with the manufacturer before starting the fluorescence in situ hybridization, or refer to relevant literature. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 23/74

24 Appendix 2 Optional step for optimizing Pepsin digestion time This optional step can be used to evaluate the effect of the pepsin digestion and to help optimizing the digestion time used in Step 2, Pepsin. To control whether the used pepsin digestion time is sufficient, stain the washed pepsin-digested tissue section with user provided 10 µl propidium iodide (400 ng/ml). Place a 22 mm x 22 mm glass coverslip over the propidium iodide and allow it to spread evenly under the coverslip. Incubate for 1 minute. Use a fluorescence microscope with Texas Red/FITC double filter (see Appendix 1) to evaluate the red staining of nuclei with propidium iodide. If the tissue digestion is acceptable there should be red nuclei with well-defined perimeters. Remove propidium iodide by soaking sections in diluted Wash Buffer twice for 3 minutes at room temperature (20-25 C) and continue to Section B3, Staining protocol, Step 3, FISH Probe. If the nuclei are still green by autofluorescence and not stained red by propidium iodide it is necessary to repeat the digest cycle: Soak sections in diluted Wash Buffer twice for 3 minutes at room temperature (20-25 C) to remove propidium iodide. Apply 5 8 drops (250 µl) of cold (2-8 C) Pepsin (Vial 2) to cover specimen. Always store the Pepsin vial at 2 8 C. Place slides at 37 C on a preheated heating block or on the Dako Hybridizer. Incubate for 10 minutes if no or little digestion has occurred. The 10 minutes is only a guideline; the user should determine the optimal time. Soak again in diluted Wash Buffer twice for 3 minutes at room temperature (20-25 C) to remove Pepsin. Apply once more 10 µl propidium iodide (400 ng/ml) for 1 minute. Evaluate staining and soak sections in diluted Wash Buffer twice for 3 minutes at room temperature (20-25 C). Repeat cycle if necessary or continue to Section B.3.a or B.3.b, Staining protocol, Step 3, FISH Probe. NOTE: The kit contains reagents sufficient for 20 tests. The use of Wash Buffer and Pepsin in this optional step will reduce the total number of possible tests with the kit. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 24/74

25 FRANÇAIS Utilisation prévue Pour utilisation diagnostique in vitro. Le kit Histology FISH Accessory Kit est destiné à être utilisé avec la technique d'hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur des échantillons de coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine. Les réactifs fournis avec le kit Histology FISH Accessory Kit peuvent également être utilisés avec le mélange de sondes HER2/CEN-17 IQISH (réf. K5731, flacon 3). Si des réactifs provenant du Dako Histology FISH Accessory Kit, réf. K5799, sont utilisés en association avec les réactifs du kit portant la référence K5731, la procédure indiquée dans la notice de ce dernier doit être respectée. Introduction Le kit Histology FISH Accessory Kit contient tous les principaux réactifs, à l'exception de la sonde, nécessaires pour réaliser une procédure FISH sur des échantillons de coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine. Après déparaffinage et réhydratation, les échantillons sont chauffés dans une Pre-Treatment Solution, puis soumis à une digestion protéolytique utilisant de la Pepsin. Après les étapes de chauffage et de prétraitement protéolytique, les sondes FISH fournies par l'utilisateur sont appliquées et les échantillons sont scellés avec du Coverslip Sealant, avant que ne soient effectuées la dénaturation et l'hybridation. Après l'hybridation, un lavage stringent assurant l'élimination des sondes FISH non liées et de celles liées de manière non spécifique est réalisé avant de passer à l'étape de déshydratation à l'éthanol. Pour terminer, les échantillons sont montés avec un Fluorescence Mounting Medium contenant un contre-colorant de fluorescence bleu. Les résultats sont interprétés à l'aide d'un microscope à fluorescence équipé des filtres appropriés (voir l'annexe 1). Réactifs Matériel fourni Le matériel répertorié ci-dessous est suffisant pour effectuer 20 tests (un test est défini comme une zone cible de 22 mm x 22 mm). Le matériel contenu dans ce kit permet d'effectuer jusqu'à 10 cycles FISH distincts (quatre cycles distincts en cas d'utilisation de la méthode d'immersion dans la Pepsin). Le kit Histology FISH Accessory Kit est expédié avec de la carboglace. Pour être sûr que les éléments du kit n'ont pas été exposés à des températures élevées pendant le transport, on doit trouver de la carboglace à sa réception. Il est à noter que certains éléments du kit peuvent rester décongelés, mais cela n'affecte pas les performances du kit Histology FISH Accessory Kit. Flacon 1 Flacon 2A Flacon 2B Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, concentrée 20x Tampon MES (acide 2-[N-morpholino]éthanesulphonique). Pepsin 4 x 6,0 ml, prête à l'emploi Solution de pepsine, ph 2,0 ; contient un stabilisateur et un agent antimicrobien. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, concentré 10x Tampon de dilution, ph 2,0 ; contient un agent antimicrobien. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 25/74

26 Flacon 4 Flacon 5 Flacon 6 Article 7 Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, concentré 20x Tampon SSC (solution saline/citrate de sodium) avec un détergent (Tween-20). Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Fluorescence Mounting Medium prêt à l'emploi avec 500 µg/l de DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole). Wash Buffer (20x) 500 ml, concentré 20x Tampon Tris/HC. Coverslip Sealant 1 tube Solution prête à l'emploi pour un vernissage supprimable de la lamelle de protection. REMARQUE : Tous les réactifs sont interchangeables avec les réactifs correspondants du kit Dako HER2 IQFISH pharmdx (réf. K5731). Si des réactifs provenant du Dako Histology FISH Accessory Kit, réf. K5799, sont utilisés en association avec les réactifs du kit portant la référence K5731, la procédure indiquée dans la notice de ce dernier doit être respectée. Matériel requis mais non fourni Réactifs de laboratoire Eau distillée ou déionisée Éthanol à 96 % Xylène ou substituts du xylène Matériel de laboratoire Lingettes absorbantes Pipettes réglables Thermomètre à immersion partielle étalonné (plage de température de 37 à 100 Χ) Lamelles de protection (18 mm x 18 mm ou 22 mm x 22 mm et 24 mm x 50 mm ou 24 mm x 60 mm) Pince Hotte de laboratoire Dako Hybridizer (réf. S2450/S2451)* Bloc chauffant ou étuve à hybridation* Chambre d'hybridation humide* Microcentrifugeuse Lames silanisées Dako Silanized Slides, réf. S3003, lames revêtues de poly-l-lysine ou lames Superfrost Plus Cuves ou bains de coloration Paniers porte-lames métalliques ou en plastique Minuteur (pouvant accepter des intervalles de 0 à 60 minutes) Bain-marie avec couvercle (pouvant maintenir une température de 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C et de 95 C à 99 C ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 26/74

27 Four à micro-ondes avec fonction de détection si le prétraitement est réalisé à l'aide d'un four à micro-ondes (voir l'étape 1, Section B.3.a ou B.3.b. Protocole de coloration, Méthode B). Récipient pouvant aller au four à micro-ondes et dont le couvercle doit contenir des trous avec un diamètre d'un centimètre par exemple *Un bloc chauffant pour la digestion (37 (±2) C), un bloc chauffant ou une étuve à hybridation pour la dénaturation (66 (±2) C (B.3.a.) ou 82 (±2) C) (B.3.b.) et une chambre d'hybridation humide pour l'hybridation (45 (±2) C) peuvent être utilisés, mais nous recommandons le Dako Hybridizer, réf. S2450/S2451. ** Un bain-marie avec couvercle (capable de maintenir une température comprise entre 95 et 99 C) ou un autocuiseur commandé par microprocesseur comme le Dako Pascal, réf. S2800, peuvent être utilisés à la place d'un four à micro-ondes. Microscope et accessoires Filtres pour microscope à fluorescence : Filtre DAPI et filtres appropriés pour le fluorochrome utilisé, par ex. double filtre FITC/Texas Red, filtres simples FITC et Texas Red pour les sondes FISH de Dako - voir l'annexe 1 pour plus de détails. Microscope à fluorescence avec une lampe à mercure de 100 watts, une source de lumière devant être utilisée pour les sondes FISH de Dako. D'autres sources de lumière sont déconseillées avec ces filtres. Boîte de rangement des lames de microscope (plateau en carton pour 20 lames avec couvercle à charnières ou similaire). Précautions d'emploi 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Le flacon 1, Pre-Treatment Solution (20x), contient 1 à < 20% d'acide 2-morpholinoéthanesulphonique ; le flacon 2A, Pepsin, contient 5 à 10% de propane-2-ol et le flacon 6, Wash Buffer (20x), contient 1 à < 20% de trométamol. Aux concentrations du produit, ces substances ne nécessitent pas d'étiquetage de sécurité. Les fiches de données de sécurité (FDS) destinées aux utilisateurs professionnels sont disponibles sur demande. 3. Le flacon 2A, Pepsin, contient de la pepsine A qui peut provoquer une réaction allergique. 4. Le flacon 2B, Pepsin Diluent (10x), contient 60% de propane-2-ol et comporte les mentions suivantes : Facilement inflammable. Irritant. R11 Facilement inflammable. R36 Irritant pour les yeux. R67 L'inhalation de vapeurs peut provoquer somnolence et vertiges. S9 Conserver le récipient dans un endroit bien ventilé. S16 Conserver à l'écart de toute flamme ou source d'étincelles - Ne pas fumer. S26 En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l'eau et consulter un spécialiste. S60 Éliminer le produit et son récipient comme un déchet dangereux. 5. Article 7, le Coverslip Sealant contient 60 à 100% de naphta léger (pétrole), hydrotraité, et comporte les mentions suivantes : Extrêmement inflammable. Dangereux pour l'environnement. R11 Facilement inflammable. R51/53 Toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner des effets néfastes à long terme pour l'environnement aquatique. S16 Conserver à l'écart de toute flamme ou source d'étincelles - Ne pas fumer. S35 Ne se débarrasser de ce produit et de son récipient qu'en prenant toutes précautions d'usage. S57 Utiliser un récipient approprié pour éviter toute contamination du milieu ambiant. S61 Éviter le rejet dans l'environnement. Consulter les instructions spéciales/la fiche de données de sécurité. S9 Conserver le récipient dans un endroit bien ventilé. 6. Consulter la fiche de données de sécurité (FDS) pour plus d'informations. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 27/74

28 7. Toute modification des méthodes de fixation des tissus et de l'épaisseur des échantillons spécifiées peut affecter la morphologie tissulaire et/ou l'intensité du signal. 8. Toute modification des durées et des températures d'incubation ou des méthodes spécifiées est susceptible d'entraîner des résultats médiocres. 9. Les réactifs ont été dilués de manière optimale. Une dilution supplémentaire peut entraîner des performances médiocres. 10. Seules des cuves de coloration propres doivent être utilisées pour la méthode d'immersion dans la Pepsin (Étape 2. Méthode C). Conservation Conserver à l'abri de la lumière, entre 2 et 8 C. Autrement, tous les réactifs tolèrent une conservation au congélateur. La Pepsin (flacon 2A) peut s'altérer si elle est exposée à la chaleur. Ne pas laisser ce composant à température ambiante. Le Fluorescence Mounting Medium (flacon 5) peut s'altérer s'il est exposé à une luminosité intense. Ne pas conserver ce composant à la lumière. Ne pas utiliser le kit après la date de péremption indiquée sur la boîte. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles spécifiées, les performances des réactifs doivent être validées par l'utilisateur (1). Aucun signe évident n'indique l'instabilité de ce produit. Par conséquent, il est important d'évaluer un tissu sain ayant précédemment présenté de bons résultats de FISH en tant que contrôle du cycle. Si l'on observe un profil de fluorescence inattendu qui ne peut pas être expliqué par un changement des procédures du laboratoire et que l'on soupçonne un problème avec le kit Histology FISH Accessory Kit, contacter l'assistance technique de Dako. Préparation des échantillons Les échantillons provenant de biopsies, d'excisions ou de résections doivent être manipulés de manière à préserver le tissu pour l'analyse FISH. Suivre la méthode recommandée pour le traitement des tissus pour la coloration immunocytochimique décrite ci-dessous. Pour plus d'informations, consulter la référence (2). L'utilisation de tissus exposés à une décalcification acide pour FISH est déconseillée (3 à 6). En tant qu'agent décalcifiant, l'edta a été reconnu comme étant mieux à même de préserver l'adn (6) pour les techniques (F)ISH (3, 4, 7). REMARQUE : Les performances du kit Histology FISH Accessory Kit de Dako n'ont pas été validées sur des tissus décalcifiés. Coupes incluses en paraffine Seuls les tissus préservés dans du formol neutre tamponné et inclus en paraffine peuvent être utilisés. Les échantillons doivent, par exemple, être inclus dans des blocs d'une épaisseur de 3 à 4 mm et être fixés pendant 18 à 24 heures dans du formol neutre tamponné. Les tissus sont ensuite déshydratés dans une série de bains d'éthanol à des concentrations de plus en plus élevées et dans du xylène, pour être ensuite infiltrés avec de la paraffine liquide maintenue à une température ne dépassant pas 60 C. Les tissus, fixés et inclus correctement, se conservent indéfiniment avant la coupe et le montage sur lame s'ils sont conservés de manière adéquate (15 à 25 C) (2, 8). Les autres fixateurs ne conviennent pas. Une durée de fixation prolongée peut augmenter la durée d'incubation nécessaire lors de l'étape de digestion par la Pepsin. Les échantillons de tissus doivent être coupés en sections de 2 à 6 m, recueillis sur des lames depuis un bain-marie, puis séchés à l'air libre. L'épaisseur optimale des coupes de tissus est de 2 à 3 µm pour les sondes FISH encadrantes ou de «split» de Dako. Des coupes de 4 à 6 µm peuvent être utilisées pour d'autres applications FISH. La paraffine doit être fondue à 60 C pendant 30 à 60 minutes. Les coupes doivent ensuite être refroidies à température ambiante (20 à 25 C) et conservées entre 2 et 8 C. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 28/74

29 Il est recommandé de monter les coupes de tissus sur des lames silanisées Dako Silanized Slides, réf. S3003, des lames revêtues de poly-l-lysine ou des lames Superfrost Plus. En général, les échantillons doivent être analysés dans les 6 mois suivant la coupe lorsqu'ils sont conservés entre 2 et 8 C. Si les coupes de tissus sont conservées dans des conditions autres que celles spécifiées, celles-ci doivent être vérifiées par l'utilisateur. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 29/74

30 INSTRUCTIONS D'UTILISATION A. Préparation des réactifs Il est pratique de préparer les réactifs suivants avant de procéder à la coloration : A.1 Pre-Treatment Solution Des cristaux peuvent se former dans le flacon 1, mais ils se dissolvent à température ambiante. Vérifier l'absence de cristaux avant de préparer le réactif. Préparer une quantité suffisante à partir du flacon 1 (Pre-Treatment Solution 20x) en diluant le concentré au 1/20ème dans de l'eau distillée ou déionisée. La solution diluée inutilisée peut être conservée entre 2 et 8 C pendant un mois. Jeter la solution diluée si elle a un aspect trouble. A.2 Stringent Wash Buffer Préparer une quantité suffisante à partir du flacon 4 (Stringent Wash Buffer 20x) en diluant le concentré au 1/20ème dans de l'eau distillée ou déionisée. Le tampon dilué inutilisé peut être conservé entre 2 et 8 C pendant un mois. Jeter le tampon dilué s'il a un aspect trouble. A.3 Wash Buffer Préparer une quantité suffisante à partir du flacon 6 (Wash Buffer 20x) en diluant le concentré au 1/20ème dans de l'eau distillée ou déionisée. Le tampon dilué inutilisé peut être conservé entre 2 et 8 C pendant un mois. Jeter le tampon dilué s' il a un aspect trouble. A.4 Série de bains d'éthanol À partir d'une solution d'éthanol à 96%, préparer 3 cuves contenant de l'éthanol à 70%, 85% et 96%. Conserver les cuves couvertes à température ambiante ou entre 2 et 8 C, et les utiliser pour un maximum de 200 lames. Jeter les solutions si elles ont un aspect trouble. A.5 Solution de pepsine Une solution de pepsine n'est nécessaire qu'en cas d'utilisation de la méthode d'immersion dans la Pepsin (Sections B.3.a. et B.3.b, Étape 2, Méthode C). Préparer la solution de pepsine comme suit : Pour un récipient pouvant contenir six lames, préparer 60 ml de solution de pepsine : Ajouter 48 ml d'eau distillée ou déionisée à température ambiante (20 à 25 C) dans le récipient. Ajouter 6 ml de Pepsin Diluent (10x) froid (2 à 8 C) (flacon 2B) dans le récipient. Ajouter 6 ml de Pepsin froide (2 à 8 C) (flacon 2A) dans le récipient. Poser le couvercle sur le récipient et ramener la solution de pepsine à 37 (±2) C dans un bainmarie. Pour un récipient pouvant contenir 24 lames, préparer 240 ml de solution de pepsine : Ajouter 192 ml d'eau distillée ou déionisée à température ambiante (20 à 25 C) dans le récipient. Ajouter 24 ml de Pepsin Diluent (10x) froid (2 à 8 C) (flacon 2B) dans le récipient. Ajouter 24 ml de Pepsin froide (2 à 8 C) (flacon 2A) dans le récipient. Poser le couvercle sur le récipient et ramener la solution de pepsine à 37 (±2) C dans un bainmarie. La solution de pepsine ramenée à la bonne température doit être utilisée dans les 5 heures. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 30/74

31 B. Procédure de coloration B.1 Remarques concernant la procédure L'utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec tous les composants avant utilisation (voir la section Précautions d'emploi). Si les composants du kit sont conservés au congélateur, il est recommandé de transférer les réactifs entre 2 et 8 C le jour précédant l'analyse afin de pouvoir ramener les composants à la bonne température. Tous les réactifs doivent être ramenés à la bonne température avant utilisation. Flacon 1 : La Pre-Treatment Solution diluée doit être ramenée à une température comprise entre 95 et 99 C si un bain-marie est utilisé (Section B.3.a ou B.3.b Protocole de coloration, Étape1 : Prétraitement, Méthode A). Si un four à micro-ondes avec fonction de détection est utilisé pour le prétraitement (Section B.3.a. ou B.3.b. Protocole de coloration, Étape 1 : Prétraitement, Méthode B), la Pre-Treatment Solution diluée doit être ramenée à température ambiante, entre 20 et 25 C. Flacon 2A : La Pepsin doit être appliquée entre 2 et 8 C (Section B.3.a. ou B.3.b. Protocole de coloration, Étape 2 : Méthodes A et B) et elle doit rester constamment froide. Flacon 2B : Le Pepsin Diluent (10x) doit être appliqué entre 2 et 8 C (Section B.3.a. ou B.3.b. Protocole de coloration, Étape 2 : Méthode C). Flacon 4 : Une cuve de Stringent Wash Buffer dilué doit être ramenée à température ambiante et une autre à une température de 63 (±2) C (Section B.3.a.) ou 65 (±2) C (Section B.3.b), avant utilisation. Flacon 5 : Le Fluorescence Mounting Medium peut être appliqué à n'importe quelle température comprise entre 2 et 25 C. Flacon 6 : Article 7 : Le Wash Buffer dilué doit être ramené à température ambiante (20 à 25 C). Le Coverslip Sealant peut être appliqué à température ambiante (20 à 25 C). Toutes les étapes doivent être réalisées à la température indiquée. La procédure précédant la coloration comprend plusieurs déshydratations suivies d'un séchage des échantillons. S'assurer que les échantillons sont complètement secs avant de passer à l'étape suivante. Ne pas laisser les échantillons se dessécher pendant les autres étapes de la procédure. Si la procédure de coloration doit être interrompue, les lames peuvent être conservées dans le Wash Buffer après l'étape de déparaffinage pendant une (1) heure maximum à température ambiante (20 à 25 C). B.2 Traitement des tissus avant la coloration Déparaffinage et réhydratation : Avant de réaliser la procédure, les lames de tissus doivent être déparaffinées afin d'éliminer la paraffine, puis réhydratées. Éviter toute élimination incomplète de la paraffine. Tout résidu de paraffine provoque une augmentation de la coloration non spécifique. Cette étape doit être réalisée à température ambiante (20 à 25 C). 1. Placer les lames dans un bain de xylène et laisser incuber pendant 5 minutes (±1 minute). Renouveler le bain et recommencer l'opération une fois. 2. Éliminer l'excès de liquide en tapotant et placer les lames dans de l'éthanol à 96% pendant 2 minutes (±1 minute). Renouveler le bain et recommencer l'opération une fois. 3. Éliminer l'excès de liquide en tapotant et placer les lames dans de l'éthanol à 70% pendant 2 minutes (±1 minute). Renouveler le bain et recommencer l'opération une fois. 4. Éliminer l'excès de liquide en tapotant et placer les lames dans le Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, section A.2) pendant au moins 2 minutes. Commencer la procédure de coloration comme indiqué à la section B.3.a. ou B.3.b., Étape 1, Prétraitement. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 31/74

32 De nouvelles solutions de xylène et d'alcool doivent être préparées lorsque 200 lames ont été traitées. Des substituts du xylène peuvent être utilisés. REMARQUE : Les réactifs et les instructions fournis dans ce kit ont été conçus pour des performances optimales. Une dilution supplémentaire des réactifs ou une modification des températures d'incubation peuvent entraîner des résultats erronés ou discordants. Toute différence dans le traitement des tissus ou dans les procédures techniques dans le laboratoire de l'utilisateur peut invalider les résultats du test. Vieillissement facultatif des échantillons : Avant le déparaffinage et la réhydratation, incuber les lames à 60 C pendant 1 heure, par exemple sur un bloc chauffant, un bloc dans une étuve à hybridation ou sur le Dako Hybridizer. Le cas échéant, incuber les lames à 37 C pendant 1 à 2 jours, puis pendant 1 heure à 60 C. Procéder au déparaffinage et à la réhydratation. REMARQUE : Cette étape est facultative. Les échantillons vieillis peuvent réduire le bruit de fond potentiel. B.3 Protocole de coloration Choisissez l'un des deux protocoles de coloration possibles : B.3.a ou B3.b. Ne pas interchanger les étapes entre les deux procédures. Le protocole de coloration B.3.a décrit la procédure d'une demi-journée à appliquer pour les sondes FISH diluées dans un tampon d'hybridation à base de carbonate d'éthylène. Le protocole de coloration B.3.b décrit la procédure de deux jours à appliquer pour les sondes FISH diluées dans un tampon d'hybridation traditionnel à base de formamide. Protocole de coloration B.3.a. pour sondes FISH diluées dans un tampon d'hybridation à base de carbonate d'éthylène Étape 1 : Prétraitement (four à micro-ondes, bain-marie, autocuiseur Pascal) Le prétraitement peut être réalisé soit en utilisant un bain-marie, comme décrit dans la méthode A), en utilisant un four à micro-ondes avec fonction de détection, comme décrit dans la méthode B) ou en utilisant un autocuiseur Pascal, comme décrit dans la méthode C). Méthode A : Prétraitement à l'aide d'un bain-marie Remplir les cuves, par ex. jarres de Coplin, de Pre-Treatment Solution diluée (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, section A.1). Placer les cuves de coloration contenant la Pre- Treatment Solution diluée dans un bain-marie. Chauffer le bain-marie et la Pre-Treatment Solution entre 95 et 99 C. Mesurer la température à l'intérieur de la cuve à l'aide d'un thermomètre étalonné afin de s'assurer que la température est correcte. Recouvrir les cuves avec des couvercles afin de stabiliser la température et d'éviter toute évaporation. Immerger les coupes déparaffinées à température ambiante dans les cuves de coloration contenant la Pre-Treatment Solution préchauffée. Vérifier à nouveau la température et laisser incuber pendant 10 (±1) minutes à C. Retirer la cuve contenant les lames du bain-marie. Retirer le couvercle et laisser les lames refroidir dans la Pre-Treatment Solution pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer les lames dans une cuve contenant du Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, Section A.3) pendant 3 minutes à température ambiante (20-25 C). Remplacer le Wash Buffer et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. REMARQUE : La Pre-Treatment Solution est conçue pour une seule application. Ne pas réutiliser. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 32/74

33 Méthode B : Prétraitement en utilisant un four à micro-ondes avec fonction de détection (recommandée) Remplir une cuve en plastique de Pre-Treatment Solution diluée à température ambiante (20-25 C). Immerger les coupes déparaffinées dans la Pre-Treatment Solution, recouvrir la cuve d'un couvercle percé et la placer dans le four à micro-ondes. Sélectionner la fonction de détection de l'ébullition ainsi qu'un programme qui s'exécute pendant 10 minutes après avoir atteint la température d'ébullition*. Après les 10 minutes d'incubation, sortir la cuve contenant les lames du four. Retirer le couvercle et laisser refroidir pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer les lames dans une cuve contenant du Wash Buffer dilué et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes à température ambiante (20-25 C). Remplacer le Wash Buffer et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. * L'utilisation d'un four à micro-ondes doté d'une fonction de détection de l'ébullition signifie que le four doit être doté d'un capteur et de programmes qui chauffent d'abord la Pre-Treatment Solution jusqu'à ébullition puis maintiennent la température de prétraitement requise (plus de 95 ºC) tout en décomptant le temps prédéterminé (10 minutes (±1 minute)). Il est possible que certains modèles de fours à micro-ondes avec fonction de détection ne permettent pas de choisir le temps de chauffage. Si le modèle comprend uniquement des programmes préréglés, s'assurer de sélectionner un programme qui maintient la température de prétraitement requise (plus de 95 ºC) pendant au moins 10 minutes (±1 minute) et arrêter manuellement le programme après 10 minutes (±1 minute). REMARQUE : La Pre-Treatment Solution est conçue pour une seule application. Ne pas réutiliser. Méthode C : Prétraitement en utilisant un autocuiseur Pascal Verser 500 ml d'eau déionisée dans l'autocuiseur Pascal. Remplir une cuve en plastique avec 250 ml de Pre-Treatment Solution Immerger les coupes déparaffinées dans la Pre-Treatment Solution et placer la cuve dans l'autocuiseur Pascal. Incuber à 121 C pendant 1 minute. La pression est évacuée une fois la température descendue à 90 C. Lire attentivement le Manuel de l'autocuiseur Pascal pour obtenir des informations sur comment manipuler correctement ce dernier. Retirer le récipient après la libération de la pression. Retirer les couvercles et laisser les lames refroidir dans la Pre-Treatment Solution pendant 15 minutes supplémentaires à température ambiante. Transférer les lames dans une cuve contenant du Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, section A.2). Laisser tremper les coupes pendant 3 minutes à température ambiante. Remplacer le Wash Buffer et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à l'étape 2. REMARQUE : La Pre-Treatment Solution est conçue pour une seule utilisation. Ne pas réutiliser. Ne pas utiliser de récipient fermé et étanche en cas de prétraitement au four à micro-ondes. La pression à l'intérieur du récipient augmente et peut provoquer des dommages au moment de l'ouverture ou exploser. Il est possible d'utiliser un support de lame en métal dans le four à microondes si celui-ci est immergé dans la solution de prétraitement tout au long du traitement par micro-ondes. Dans tous les autres cas, ne pas utiliser de métal dans un four à micro-ondes. Suivez les instructions fournies par le fabricant du four à micro-ondes. Éviter l'ébullition continue de la Pre-Treatment Solution pendant les 10 minutes d'incubation. Effectuer une vérification régulière de la température à l'aide d'un thermomètre étalonné afin de contrôler les bonnes conditions de température. Étape 2 : Pepsin, prête à l'emploi ou solution de pepsine L'incubation de la Pepsin peut être réalisée en déposant directement sur les lames des gouttes de pepsine prête à l'emploi, soit à température ambiante (20-25 C) (Méthode A), soit à 37 C (Méthode B). La seconde option consiste à immerger les lames dans une solution de pepsine et à les laisser incuber à 37 (±2) C (Méthode C). Méthode A et méthode B : Éliminer l'excès de tampon en tapotant. Avec un tissu non pelucheux (tissu absorbant ou tampon de gaze par exemple), essuyer soigneusement le pourtour de l'échantillon pour éliminer tout liquide restant et pour garder les réactifs dans la zone prescrite. Déposer 5 à 8 gouttes (250 µl) de Pepsin froide (2 à 8 C) (flacon 2A) pour couvrir l'échantillon. La Pepsin doit toujours être stockée entre 2 et 8 C. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 33/74

34 Méthode A : Pepsin prête à l'emploi - incubation à C Incuber à température ambiante (20-25 C) pendant 5 à 15 minutes. Une durée d'incubation de 5 à 15 minutes convient pour la plupart des échantillons, mais la durée d'incubation optimale peut dépendre de la fixation des tissus et/ou de l'épaisseur de l'échantillon et doit être déterminée par l'utilisateur. Éliminer l'excès de Pepsin en tapotant et faire tremper les coupes dans le Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, section A.3) pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C). Remplacer le tampon de lavage dilué et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à la déshydratation. Méthode B : Pepsin prête à l'emploi - incubation à 37 C Placer l'échantillon avec la Pepsin sur un bloc chauffant à 37 C (par ex. Dako Hybridizer) et incuber pendant 3 à 5 minutes. Une durée d'incubation de 3 à 5 minutes convient pour la plupart des échantillons, mais la durée d'incubation optimale peut dépendre de la fixation des tissus et/ou de l'épaisseur de l'échantillon et doit être déterminée par l'utilisateur. Éliminer l'excès de Pepsin en tapotant et faire tremper les coupes dans le Wash Buffer dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20 25 C). Remplacer le Wash Buffer et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à la déshydratation. Déshydrater les coupes de tissu dans une série de bains d'éthanol à des concentrations de plus en plus élevées : 2 minutes dans de l'éthanol à 70%, 2 minutes dans de l'éthanol à 85% et 2 minutes dans de l'éthanol à 96%. Laisser les coupes de tissus sécher complètement à l'air libre. Méthode C : Solution de pepsine - immersion des lames dans une solution de pepsine à 37 C Les réactifs contenus dans ce kit permettent d'effectuer quatre cycles distincts (60 ml de solution de pepsine, petit récipient pour six lames) ou un seul cycle (240 ml de solution de pepsine, grand récipient pour 24 lames). Préparer la solution de pepsine comme indiqué à la section A.5. Poser le couvercle sur le récipient et ramener la solution de pepsine à 37 (±2) C dans un bainmarie. S'assurer que la température s'est stabilisée. Mesurer la température à l'intérieur du récipient à l'aide d'un thermomètre étalonné afin de s'assurer que la température est correcte. Éliminer l'excès de Wash Buffer en tapotant. Immerger les lames dans la solution de pepsine à 37 (±2) C et laisser incuber pendant 20 à 30 minutes. Une durée d'incubation de 20 à 30 minutes convient à la plupart des échantillons, mais la durée d'incubation optimale peut dépendre de la fixation du tissu et/ou de l'épaisseur de l'échantillon et elle doit être déterminée par l'utilisateur. Éliminer l'excès de solution de pepsine en tapotant et faire tremper les coupes dans le Wash Buffer dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20-25 C). Remplacer le Wash Buffer et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à la déshydratation. Déshydrater les coupes de tissu dans une série de bains d'éthanol à des concentrations de plus en plus élevées : 2 minutes dans de l'éthanol à 70%, 2 minutes dans de l'éthanol à 85% et 2 minutes dans de l'éthanol à 96%. Laisser les coupes de tissus sécher complètement à l'air libre. Étape 3 : Sonde FISH diluée dans un tampon d'hybridation à base de carbonate d'éthylène (fournie par l'utilisateur) REMARQUE : Les sondes FISH diluées dans un tampon d'hybridation à base de carbonate d'éthylène doivent être conservées à -18 C entre l es utilisations. La conservation à -18 C sépare le tampon en deux phases. Avant utilisation, s'assurer que le tampon ne présente qu'une seule phase en équilibrant le mélange de sondes à température ambiante (20-25 C) suite au mélange. Décongeler le mélange de sondes FISH à température ambiante (20-25 C) pendant 30 minutes maximum (à l'abri de toute lumière vive), puis agiter soigneusement le flacon pendant 15 secondes à rpm en utilisant un mélangeur Vortex. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 34/74

35 Appliquer une quantité appropriée de mélange de sondes, par ex. 10 µl, au centre de la coupe de tissu. Placer immédiatement une lamelle de protection de 22 mm x 22 mm sur le mélange de sondes et le laisser s'étaler de manière homogène sous la lamelle. Éviter la formation de bulles d'air. En cas de formation de bulles d'air, les éliminer du tissu en tapotant doucement à l'aide de pinces. Sceller la lamelle de protection avec du Coverslip Sealant en éjectant l'étanchéisant sur le pourtour de la lame. Laisser l'étanchéisant dépasser de la lamelle de protection et de la lame pour former un joint autour de la lamelle. S'assurer que le Coverslip Sealant recouvre bien tout le bord de la lamelle de protection. Préparer le Dako Hybridizer* (réf. S2450 ou S2451) pour un cycle d'hybridation. S'assurer que les bandelettes de contrôle de l'humidité Humidity Control Strips (réf. S2452) sont saturées et optimales pour utilisation. Allumer l'hybridizer et choisir un programme qui va : Dénaturer à 66 C pendant 10 minutes, puis hybrider à 45 C pendant 60 à 120 minutes. Placer les lames dans l'hybridizer, s'assurer que le couvercle est correctement fermé puis lancer le programme. Consulter le manuel du Dako Hybridizer pour de plus amples instructions. * Tout appareillage permettant d'assurer des conditions identiques à celles décrites ci-dessus peut être utilisé pour la dénaturation et l'hybridation. Placer les lames sur une surface métallique ou en pierre plate (bloc chauffant ou bloc dans un four d'hybridation) préchauffée à 66 (±1) C. Dénaturer pendant exactement 10 minutes. Placer les lames dans une chambre d'hybridation humide préchauffée. Couvrir la chambre d'un couvercle et incuber à 45 (±2) C pendant 60 à 120 minutes. Étape 4 : Lavage stringent Remplir deux cuves de coloration, par ex. jarres de Coplin, de Stringent Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, Section A.2). Un volume minimum de 100 ml ou 15 ml par lame dans chaque cuve est recommandé. Placer l'une des cuves de coloration contenant du Stringent Wash Buffer dilué à température ambiante dans une hotte de laboratoire et l'autre dans un bain-marie. Faire chauffer le bain-marie et le Stringent Wash Buffer dilué à 63 (±2) C. S'assurer que la température s'est stabilisée. Recouvrir la cuve avec un couvercle pour stabiliser la température et éviter toute évaporation. Vérifier la température à l'intérieur de la cuve se trouvant au bain-marie à l'aide d'un thermomètre étalonné pour s'assurer que la température est correcte. Le Stringent Wash Buffer contient un détergent et peut se troubler à 63 C ; ceci n'affe cte pas les performances. A l'aide de pinces ou de gants, sortir les lames de la chambre d'hybridation et retirer avec précaution le Coverslip Sealant ainsi que la lamelle de protection et placer les lames l'une après l'autre dans la cuve de prélavage à température ambiante. Dès que toutes les lamelles de protection ont été retirées, transférer les lames de la cuve de prélavage à température ambiante dans la cuve à 63 (±2) C dans le bain-marie. Le chronomètre doit être lancé immédiatement après le transfert des lames dans le Stringent Wash Buffer dilué à 63 (±2) C dans le bain-marie. Exécuter un lavage stringent pendant exactement 10 minutes. Retirer les lames du Stringent Wash Buffer dilué et faire tremper les coupes dans du Wash Buffer dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20-25 C). Renouveler le Wash Buffer dilué et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Déshydrater les coupes de tissu dans une série de bains d'éthanol à des concentrations de plus en plus élevées : 2 minutes dans de l'éthanol à 70%, 2 minutes dans de l'éthanol à 85% et 2 minutes dans de l'éthanol à 96%. Laisser sécher complètement les coupes de tissus. Étape 5 : Montage Appliquer 15 µl de Fluorescence Mounting Medium contenant du DAPI (flacon 5) sur la zone cible de la lame et poser une lamelle de protection en verre. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 35/74

36 REMARQUE : Les lames peuvent être lues après 15 minutes ou dans les 7 jours suivant le montage. Toutefois, une décoloration se produit si les lames sont exposées à la lumière ou à des températures élevées. Pour minimiser la décoloration, stocker les lames dans l'obscurité entre C. Protocole de coloration B.3.b. pour sondes FISH diluées dans un tampon d'hybridation à base de formamide 1er JOUR Étape 1 : Prétraitement (four à micro-ondes, bain-marie, autocuiseur Pascal) Le prétraitement peut être réalisé soit en utilisant un bain-marie, comme décrit dans la méthode A), en utilisant un four à micro-ondes avec fonction de détection, comme décrit dans la méthode B) ou en utilisant un autocuiseur Pascal, comme décrit dans la méthode C). Méthode A : Prétraitement à l'aide d'un bain-marie Remplir les cuves de coloration de Pre-Treatment Solution diluée (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, section A.1). Placer les cuves de coloration contenant la Pre-Treatment Solution diluée dans un bain-marie. Chauffer le bain-marie et la Pre-Treatment Solution entre 95 et 99 C. Mesurer la température à l'intérieur de la cuve à l'aide d'un thermomètre étalonné afin de s'assurer que la température est correcte. Recouvrir les cuves avec des couvercles (sans trous) afin de stabiliser la température et d'éviter toute évaporation. Immerger les coupes déparaffinées dans la Pre-Treatment Solution préchauffée. Vérifier à nouveau la température, fermer le couvercle du bain-marie et laisser incuber pendant 10 minutes (±1 minute) entre 95 et 99 C. Retirer la cuve contenant les lames du bain-marie. Retirer le couvercle (ne pas retirer les lames). Laisser les lames refroidir dans la Pre-Treatment Solution pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer les lames dans une cuve contenant du Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, section A.2) pendant 3 minutes à température ambiante. Remplacer le Wash Buffer et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à l'étape 2. Méthode B : Prétraitement en utilisant un four à micro-ondes avec fonction de détection (recommandée) Remplir un récipient de Pre-Treatment Solution diluée à température ambiante (20 à 25 C). Immerger les coupes déparaffinées dans la solution et fermer le couvercle. Le couvercle doit contenir des trous pour que la pression s'échappe. Placer le récipient contenant les lames dans le four à micro-ondes et chauffer. Avant de chauffer, s'assurer que l'extérieur du récipient et la cavité du four à micro-ondes sont secs. Laisser incuber juste en dessous du point d'ébullition (non inférieur à 95 C) pendant 10 minutes. Retirer le couvercle après l'incubation (ne pas retirer les lames). Laisser les lames refroidir dans la Pre-Treatment Solution pendant 15 minutes à température ambiante (20 à 25 C). Les lames doivent être recouvertes de tampon tout au long de la procédure de prétraitement. Transférer les lames dans une cuve contenant du Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, section A.2) pendant 3 minutes à température ambiante. Remplacer le Wash Buffer et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à l'étape 2. Méthode C : Prétraitement en utilisant un autocuiseur Pascal Verser 500 ml d'eau déionisée dans l'autocuiseur Pascal. Remplir une cuve en plastique avec 250 ml de Pre-Treatment Solution Immerger les coupes déparaffinées dans la Pre-Treatment Solution et placer la cuve dans l'autocuiseur Pascal. Incuber à 121 C pendant 1 minute. La pression est évacuée une fois la température descendue à 90 C. Lire attentivement le Manuel de l'autocuiseur Pascal pour obtenir des informations sur comment manipuler correctement ce dernier. Retirer le récipient après la libération de la pression. Retirer les couvercles et laisser les lames refroidir dans la Pre-Treatment Solution pendant 15 minutes supplémentaires à température ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 36/74

37 ambiante. Transférer les lames dans une cuve contenant du Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, section A.2). Laisser tremper les coupes pendant 3 minutes à température ambiante. Remplacer le Wash Buffer et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à l'étape 2. REMARQUE : La Pre-Treatment Solution est conçue pour une seule utilisation. Ne pas réutiliser. Ne pas utiliser de récipient fermé et étanche en cas de prétraitement au four à micro-ondes. La pression à l'intérieur du récipient augmente et peut provoquer des dommages au moment de l'ouverture ou exploser. Il est possible d'utiliser un support de lame en métal dans le four à microondes si celui-ci est immergé dans la solution de prétraitement tout au long du traitement par micro-ondes. Dans tous les autres cas, ne pas utiliser de métal dans un four à micro-ondes. Suivez les instructions fournies par le fabricant du four à micro-ondes. Éviter l'ébullition continue de la Pre-Treatment Solution pendant les 10 minutes d'incubation. Effectuer une vérification régulière de la température à l'aide d'un thermomètre étalonné afin de contrôler les bonnes conditions de température. Étape 2 : Pepsin, prête à l'emploi ou solution de pepsine L'incubation de la Pepsin peut être réalisée en déposant directement sur les lames des gouttes de pepsine prête à l'emploi, soit à température ambiante (20 à 25 C) (Méthode A), soit à 37 C (Méthode B). La seconde option consiste à immerger les lames dans une solution de pepsine et à les laisser incuber à 37 (±2) C (Méthode C). Méthode A et méthode B : Éliminer l'excès de tampon en tapotant. Avec un tissu non pelucheux (tissu absorbant ou tampon de gaze par exemple), essuyer soigneusement le pourtour de l'échantillon pour éliminer tout liquide restant et pour garder les réactifs dans la zone requise. Déposer 5 à 8 gouttes (250 µl) de pepsine froide (2 à 8 C) (flacon 2A) en s'assurant de recouvrir l'échantillon. La Pepsin doit toujours être stockée entre 2 et 8 C. Méthode A : Pepsin prête à l'emploi - incubation entre 20 et 25 C Laisser incuber à température ambiante (20 à 25 C) pendant 5 à 50 minutes. Une durée d'incubation de 10 à 20 minutes à température ambiante convient à la plupart des échantillons, mais la durée d'incubation optimale doit être déterminée par l'utilisateur. Éliminer l'excès de Pepsin en tapotant et faire tremper les coupes dans le Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, section A.3) pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C). Remplacer le tampon de lavage dilué et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à l'étape 3, Sonde FISH ou consulter l'annexe 2 pour l'optimisation de la durée de digestion (facultatif). Méthode B : Pepsin prête à l'emploi - incubation à 37 C Placer les échantillons avec la Pepsin à 37 C sur le Dako Hybridizer ou sur un bloc chauffant préchauffé. Incuber pendant 2 à 6 minutes à 37 C. Cette durée convient à la plupart des échantillons préparés suivant les instructions décrites à la section Préparation des échantillons.. La durée d'incubation optimale dépend du type de tissu, de la fixation du tissu, de l'épaisseur de l'échantillon, du vieillissement de l'échantillon et elle doit être déterminée par l'utilisateur. Ces facteurs peuvent accroître la durée de digestion requise jusqu'à 7 à 15 minutes ou plus. Les utilisateurs qui réalisent cette procédure pour la première fois doivent identifier la durée de digestion optimale en testant un tissu représentatif pendant 1, 3, 6, 12 et 18 minutes. Éliminer la Pepsin en tapotant et faire tremper les coupes dans le Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D'UTILISATION, section A.3) pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C). Remplacer le tampon de lavage dilué et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à l'étape 3, Sonde FISH ou consulter l'annexe 2 pour l'optimisation de la durée de digestion (facultatif). Méthode C : Solution de pepsine - immersion des lames dans une solution de pepsine à 37 C ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 37/74

38 Les réactifs contenus dans ce kit permettent d'effectuer quatre cycles distincts (60 ml de solution de pepsine, petit récipient pour six lames) ou un seul cycle (240 ml de solution de pepsine, grand récipient pour 24 lames). Préparer la solution de pepsine comme indiqué à la section A.5. Poser le couvercle sur le récipient et ramener la solution de pepsine à 37 (±2) C dans un bainmarie. S'assurer que la température s'est stabilisée. Mesurer la température à l'intérieur du récipient à l'aide d'un thermomètre étalonné afin de s'assurer que la température est correcte. Éliminer l'excès de Wash Buffer en tapotant. Immerger les lames dans la solution de pepsine à 37 (±2) C et laisser incuber pendant 20 à 30 minutes. Une durée d incubation de 20 à 30 minutes convient à la plupart des échantillons, mais la durée d incubation optimale peut dépendre de la fixation du tissu et/ou de l épaisseur de l échantillon et elle doit être déterminée par l utilisateur. Éliminer l excès de solution de pepsine en tapotant et faire tremper les coupes dans le Wash Buffer dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20 25 C). Remplacer le Wash Buffer et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Procéder à l étape 3, Sonde FISH ou consulter l annexe 2 pour l optimisation de la durée de digestion (facultatif). REMARQUE : Il est recommandé de suivre la procédure décrite dans la section Préparation des échantillons. Des tissus pas assez digérés peuvent se traduire par une absence de signaux ou seulement par des signaux atténués présentant souvent un fond cytosolique vert élevé. Étape 3 : Sonde FISH (fournie par l utilisateur) REMARQUE : Si des réactifs provenant du Dako Histology FISH Accessory Kit, réf. K5799, sont utilisés en association avec les réactifs du kit portant la référence K5731, la procédure indiquée dans la notice de ce dernier doit être respectée. L étape suivante doit être réalisée sous une hotte de laboratoire. Les sondes marquées avec un fluorochrome peuvent s altérer si elles sont exposées à une luminosité intense. Ne pas réaliser les étapes restantes de cette procédure sous une lumière trop vive, telle que la lumière du soleil. Déshydrater les coupes de tissu dans une série de bains d éthanol à des concentrations de plus en plus élevées : 2 minutes dans de l éthanol à 70%, 2 minutes dans de l éthanol à 85% et 2 minutes dans de l éthanol à 96% (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, Section A.4). Laisser les coupes de tissus sécher complètement à l air libre. Appliquer une quantité appropriée de sonde marquée avec un fluorochrome, par ex. 10 µl d une sonde FISH de Dako, au centre de la coupe de tissu. Placer immédiatement une lamelle de protection en verre de 18 mm x 18 mm (ou de 22 mm x 22 mm) sur la sonde et laisser celle-ci s étaler de manière homogène sous la lamelle. Éviter la formation de bulles d air. Si des bulles d air sont observées, les éliminer en tapotant doucement à l aide d une pince. Sceller la lamelle avec du Coverslip Sealant en appliquant de l étanchéisant sur tout le pourtour de la lamelle. Laisser l étanchéisant dépasser de la lamelle de protection et de la lame pour former un joint autour de la lamelle. S assurer que l étanchéisant recouvre bien tout le bord de la lamelle de protection. Placer les lames dans le Dako Hybridizer (réf. S2450/S2451) et régler la dénaturation à 82 C pendant 5 minutes et l hybridation à 45 C sur la nuit (14 à 20 h) en cas d utilisation des sondes FISH de Dako. Passer au 2 ème Jour, Étape 4, Lavage stringent. Consulter le manuel de l Hybridizer pour de plus amples instructions. REMARQUE : Un bloc chauffant, une étuve à hybridation et une chambre d hybridation peuvent être utilisés tour à tour, voir ci-dessous. Placer la lame sur une surface métallique ou une pierre plate (bloc chauffant ou sur un bloc dans une étuve à hybridation) préchauffée à 82 (±2) C. Dénaturer pendant 5 minutes en veillant à ce que la température du bloc ne descende pas en dessous de 80 C. Placer les lames dans une chambre d hybridation humide préchauffée. Recouvrir la chambre d un couvercle et laisser incuber pendant la nuit (14 à 20 heures) à 45 (±2) C en cas d utilisation des sondes FISH de Dako. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 38/74

39 2 ème JOUR Étape 4 : Lavage stringent Remplir deux cuves de coloration de Stringent Wash Buffer dilué (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, section A.2). Un volume minimal de 100 ml de Stringent Wash Buffer dilué est nécessaire pour une cuve contenant de 1 à 6 lames. Utiliser au moins 15 ml de tampon par lame s il y a plus de 6 lames. Placer l une des cuves de coloration contenant du Stringent Wash Buffer dilué à température ambiante dans une hotte de laboratoire et l autre dans un bain-marie. Faire chauffer le bain-marie et le Stringent Wash Buffer dilué à 65 (±2) C. S assurer que la température s est stabilisée. Recouvrir la cuve avec un couvercle pour stabiliser la température et éviter toute évaporation. Mesurer la température à l intérieur de la cuve à l aide d un thermomètre étalonné pour s assurer que la température est correcte. Sortir les lames de la chambre d hybridation. À l aide d une pince, retirer avec précaution l étanchéisant ainsi que les lamelles de protection, puis placer les lames dans la cuve de prélavage ramenée à température ambiante. Une fois toutes les lamelles de protection retirées, transférer les lames de la cuve de prélavage à température ambiante dans la cuve à 65 (±2) C se trouvant dans le bain-marie. Fermer le couvercle de la cuve, puis celui du bain-marie. Effectuer un lavage stringent pendant exactement 10 minutes, à 65 (±2) C. Retirer les lames du Stringent Wash Buffer dilué et faire tremper les coupes dans le Wash Buffer dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C). Renouveler le Wash Buffer dilué et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires. Déshydrater les coupes de tissu dans une série de bains d éthanol à des concentrations de plus en plus élevées : 2 minutes dans de l éthanol à 70%, 2 minutes dans de l éthanol à 85% et 2 minutes dans de l éthanol à 96% (voir INSTRUCTIONS D UTILISATION, Section A.4). Laisser les lames sécher complètement à l air libre. Étape 5 : Montage Déposer 15 µl de Fluorescence Mounting Medium (flacon 5) contenant un contre-colorant de fluorescence bleu sur la zone cible de la lame et appliquer une lamelle de protection en verre (par ex. 24 mm x 50 mm ou 24 mm x 60 mm). Faire en sorte que le milieu se répartisse de manière homogène sur l échantillon. REMARQUE : Les lames peuvent être lues après 15 minutes ou dans les 7 jours suivant le montage. Une atténuation de la coloration se produit si les lames sont exposées à la lumière ou à des températures élevées. Les lames doivent être conservées à l abri de la lumière, entre -18 et 8 C. Contrôle qualité 1. Les signaux doivent être de couleur vive, bien distincts et faciles à évaluer. 2. Les tissus sains ayant précédemment présenté de bons résultats de FISH doivent être utilisés en tant que contrôle du cycle. 3. Les cellules de tissus sains doivent présenter des signaux fluorescents clairement visibles indiquant que les sondes FISH se sont bien hybridées sur les régions cibles. 4. L absence de détection de signaux dans les cellules de tissus sains indique que le test a échoué et les résultats doivent être considérés comme non valides. 5. À cause de la coupe du tissu, certaines cellules saines présenteront un nombre de signaux inférieur à celui attendu. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 39/74

40 6. La morphologie nucléaire doit être intacte et colorée de manière homogène lors d une évaluation à l aide d un filtre DAPI. La présence de nombreuses cellules fantômes, de cellules convexes et une mauvaise morphologie nucléaire générale indiquent une digestion ou une dénaturation trop fortes de l échantillon, qui peut avoir pour effet une perte ou une fragmentation des signaux. Une coloration périphérique, des trous dans les cellules (filtre DAPI) et/ou une forte coloration de fond cytosolique verte observés avec un double filtre Texas Red/FITC peuvent indiquer une digestion trop faible susceptible de se traduire par une perte de signal. De tels échantillons doivent être considérés comme non valides. 7. Des différences dans la fixation, le traitement ou l inclusion du tissu dans le laboratoire de l utilisateur peuvent produire des variations dans les résultats, ce qui exige une évaluation régulière de contrôles internes. Interprétation des résultats Scanner plusieurs zones contenant des cellules pour prendre en compte toute hétérogénéité possible. Sélectionner une zone présentant une bonne répartition des noyaux. Commencer l analyse dans le coin supérieur gauche de la zone sélectionnée puis, en scannant de gauche à droite, compter le nombre de signaux dans les limites nucléaires de chaque noyau évalué conformément aux recommandations ci-dessous. Faire la mise au point afin de trouver tous les signaux dans chaque noyau. Ne pas compter les noyaux ne présentant aucun signal. Ne pas inclure les noyaux réclamant un jugement subjectif. Ne pas inclure les noyaux présentant des signaux de faible intensité et une coloration de fond non spécifique ou importante. L utilisateur doit déterminer le nombre de noyaux devant être comptés pour chaque sonde. Éviter les zones où les limites nucléaires sont ambiguës. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 40/74

41 Dépannage Problème Cause probable Mesure suggérée 1. Aucun signal ou signaux de faible intensité 1a. Mauvaise durée de digestion. 1a. S assurer que des coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine sont utilisées. Une durée de digestion prolongée, par exemple, 7 à 15 minutes ou plus, à 37 C, peut s avérer utile. Voir la Section B.3.a ou B.3.b, Étape 2, Dépannage, points 4d, 4 e et l annexe 2. 1b. Le kit a été exposé à des températures élevées pendant le transport ou la conservation. 1c. Mauvaises conditions de prétraitement 1d. Mauvaises conditions de dénaturation. 1e. Mauvaise température d hybridation. 1b. Vérifier les conditions de conservation. S assurer qu il y avait de la carboglace à la réception des colis. S assurer que les flacons 2A et 5 ont été conservés entre 2 et 8 C, et que le flacon 5 a été conservé à l abri de la lumière. 1c. S assurer que la température et la durée recommandées pour le prétraitement sont bien respectées. De plus, s assurer que la durée d incubation de la digestion a été optimisée si nécessaire, voir la Section B.3.a ou B.3.b Étape 2. Plus la température de prétraitement se rapproche du point d ébullition, plus les signaux sont forts. S assurer que la Pepsin est manipulée à la bonne température. Voir la section B.1. 1d. S assurer que la température et la durée de dénaturation recommandées sont bien respectées. 1e. Hybrider à 45 (±2) C en cas d utilisation des sondes FISH de Dako. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 41/74

42 2. Zones sans aucun signal 1f. Évaporation du tampon de la sonde pendant l'hybridation. 1g. Mauvaises conditions du lavage stringent. 1h. Le microscope ne fonctionne pas correctement - Mauvais jeu de filtres - Lampe inadaptée - Lampe à mercure trop vieille - Filtres épuisés - Lentilles du collecteur sales et/ou fissurées - Huile à immersion inadaptée 1f. S'assurer que la chambre d'hybridation a une humidité suffisante. Utiliser le Dako Hybridizer (réf. S2450/ S2451) et les bandelettes de contrôle de l'humidité Humidity Control Strips (réf. S2452). Utiliser le Coverslip Sealant. Voir la section Dépannage, points 5a et 5b. 1g. S'assurer que le volume, la température et la durée recommandés pour le lavage stringent sont bien respectés et que les lamelles de protection sont retirées avant d'effectuer le lavage stringent. 1h. Vérifier le microscope et s'assurer que les filtres utilisés sont adaptés aux fluorochromes, qu'ils ne sont pas usés, que la lampe à mercure est adaptée et qu'elle n'a pas été utilisée au-delà de sa durée de vie prévue (voir l'annexe 1). Utiliser une huile à immersion adaptée à la fluorescence. En cas de doute, contacter le distributeur local du microscope. 1i. Signaux atténués. 1i. Éviter les examens au microscope prolongés et minimiser l'exposition aux sources de lumière intense. 2a. Volume de sondes insuffisant. 2a. Veiller à ce que le volume de sondes soit suffisant pour recouvrir la zone sous la lamelle de protection. 2b. Formation de bulles d'air pendant l'application du mélange de sondes ou pendant le montage. 2b. Éviter la formation de bulles d'air. Si des bulles sont observées, les éliminer en tapotant doucement à l'aide d'une pince. 2c. Mauvais déparaffinage. 2c. S'assurer que la paraffine a été complètement éliminée des coupes. Voir la section B.2. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 42/74

43 3. Coloration de fond excessive 4. Mauvaise morphologie ou faible coloration des noyaux 3a. Mauvaise durée de digestion. Un fond cytosolique vert fort peut indiquer une digestion trop faible. 3b. Les coupes ont séché lors de l'étape B.3. 3c. Élimination incomplète de la paraffine. 3d. Température du lavage stringent trop basse. 3e. Exposition prolongée de la coupe hybridée à une lumière intense. 3f. Des lames de verre périmées ou des lames inadaptées peuvent provoquer une coloration rouge excessive à «ciel étoilé». 3g. Huile à immersion non fluorescente mélangée avec le Fluorescence Mounting Medium. 4a. De mauvaises conditions de prétraitement peuvent provoquer un aspect trouble ou laiteux. 3a. S'assurer que des coupes de tissus fixées au formol et incluses en paraffine sont utilisées. Une durée de digestion prolongée, par exemple, 7 à 15 minutes à 37 C, peut s'avérer utile. Voir la Section B.3.a ou B.3.b. Étape 2, Dépannage, point 4e et l'annexe 2. 3b. Suivre les instructions et, sauf mention contraire, éviter de sécher les lames. 3c. Suivre les procédures de déparaffinage et de réhydratation décrites dans la section B.2. 3d. S'assurer que la température de lavage stringent recommandée est bien respectée. 3e. Éviter les examens au microscope prolongés et minimiser l'exposition à une lumière intense. 3f. Utiliser les types de lames recommandés et s'assurer qu'elles ne sont pas périmées. Voir la section «Coupes incluses en paraffine». 3g. Utiliser de grandes lamelles de protection en verre lors du montage selon les recommandations. Voir la Section B.3.a ou B.3.b, Étape 5. Ceci empêche que l'huile à immersion ne se mélange avec le milieu de montage, évitant ainsi l'autofluorescence et le retrait accidentel des lamelles de protection par l'objectif du microscope. 4a. S'assurer que la température et la durée recommandées pour le prétraitement sont bien respectées. Voir également la section Dépannage, point 4b-e. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 43/74

44 4b. L'ébullition au cours du prétraitement peut endommager la morphologie et provoquer une absence de signaux. 4c. Mauvais traitement à la Pepsin. 4d. Un traitement à la pepsine trop long va dissoudre le tissu et se traduire par une absence de signaux. Une digestion trop forte peut faire apparaître des cellules fantômes ou des noyaux convexes et des noyaux présentant une mauvaise morphologie nucléaire générale. 4e. Un traitement à la Pepsin trop court peut se traduire par une absence de signaux. Un tissu faiblement digéré peut provoquer une coloration périphérique des noyaux et des trous dans les noyaux (filtre DAPI) ; fond cytosolique vert fort (double filtre Texas Red/FITC). Il est à noter que les noyaux dans un tissu faiblement digéré présentent une belle morphologie par rapport à celle d'un tissu fortement digéré. 4f. Température de dénaturation trop élevée. 4g. Mauvaises conditions d'hybridation. 4b. Éviter l'ébullition. Voir la section B.3, Étape 1. Voir également la section Dépannage, point 4d. 4c. Respecter les durées d'incubation recommandées pour la Pepsin. Voir la section B.3, Étape 2 et l'annexe 2. Voir également la section Dépannage, points 1a, 1c, 3a, 4d et 4e. 4d. Raccourcir la durée d'incubation dans la Pepsin. Voir la section B.3.a ou B.3.b, Étape 2 et l'annexe 2. S'assurer que l'épaisseur des coupes est de 2 à 6 µm. Voir également la section Dépannage, points 1a, 1c, 4b et 4e. 4e. Prolonger la durée d'incubation dans la Pepsin, par exemple, de 2 à 3 fois la durée de digestion utilisée. Voir également la section Dépannage, points 1a, 1c, 3a, 4a et 4d. 4f. S'assurer que la température de dénaturation recommandée est bien respectée. 4g. Voir la section Dépannage, points 1f et 5b. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 44/74

45 5. La lamelle de protection colle trop à la lame de verre après l'hybridation, ce qui rend son retrait difficile. 6. Niveau élevé d'autofluores-cence verte sur la lame, y compris dans les zones sans tissu fixé au formol et inclus en paraffine 5a. Mauvaise étanchéisation de la lamelle de protection sur la lame de verre. 5b. Mauvaises conditions d'hybridation. Peut se traduire par une réduction des signaux ou bien leur absence, une détérioration du tissu et l'apparition d'une coloration de fond. 6. Utilisation de lames de verre périmées ou non recommandées 5a. Ne pas forcer le retrait de la lamelle de protection si elle colle trop à la lame de verre. Immerger la lame dans la cuve contenant le Stringent Wash Bufferdilué à température ambiante pendant cinq minutes et retirer ensuite la lamelle de protection. Suivre les recommandations pour l'étanchéisation de la lamelle de protection à la section B.3.a ou B.3.b, Étape 3. Voir également la section Dépannage, points 1f et 5b. 5b. S'assurer que la chambre d'hybridation a une humidité suffisante. Utiliser le Dako Hybridizer (réf. S2450/S2451) et les bandelettes de contrôle de l'humidité Humidity Control Strips (réf. S2452). Suivre les instructions de la notice des bandelettes de contrôle de l'humidité Hybridizer Humidity Control Strips. Voir les conditions d'hybridation recommandées à la section B.3.a ou B.3.b, Étape 3. Voir également la section Dépannage, points 1f et 5a. 6. S'assurer que la date de péremption des lames de verre revêtues (lames silanisées Dako Silanized Slides, réf. S3003 ou lames revêtues de poly-l-lysine) n'a pas été dépassée. REMARQUE : Si le problème ne peut être attribué à l'une des causes mentionnées ci-dessus, ou si l'action corrective suggérée échoue, appeler l'assistance technique de Dako pour obtenir de l'aide. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 45/74

46 Annexe 1 Histology FISH Accessory Kit, réf. K5799 Spécifications du microscope à fluorescence Dako recommande le matériel suivant pour une utilisation avec le kit Histology FISH Accessory Kit en cas d'utilisation des sondes FISH de Dako : 1. Type de microscope Microscope à épifluorescence. 2. Lampe Lampe à mercure de 100 watts (doit être en général remplacée toutes les 200 heures). 3. Objectifs Pour le passage en revue rapide du tissu, des objectifs de fluorescence secs 10x ou à immersion d'huile 16x conviennent. Pour un fort grossissement et l'évaluation des signaux, seuls des objectifs de fluorescence à immersion d'huile, par ex. 63x ou 100x, sont recommandés. 4. Filtres Les filtres sont conçus individuellement pour des fluorochromes spécifiques et doivent être choisis en conséquence. Dako recommande l'utilisation d'un filtre DAPI spécifique combiné à un double filtre Texas Red/FITC de haute qualité en cas d'utilisation des sondes FISH de Dako. Filtre DAPI, par ex. filtre Omega Optical réf. XF06 ou filtre Chroma réf Double filtre Texas Red/FITC, par ex. filtre Omega Optical réf. XF53 ou filtre Chroma réf Les filtres Texas Red et FITC simples peuvent être utilisés pour la confirmation, par ex. filtres Omega Optical réf. XF102-2 et XF202 respectivement. Fluorochrome Longueur d'onde d'excitation Longueur d'onde d'émission FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Les filtres sont spécifiques à chaque type de microscope et l'utilisation des filtres appropriés est cruciale pour l'interprétation. Pour obtenir des informations détaillées, contacter votre fabricant de microscope ou votre représentant Dako ou consulter le site de Dako. 5. Huile Huile à immersion non fluorescente. Précautions d'emploi Des fluorochromes spécifiques nécessitent un matériel différent. Une lampe à mercure de 50 watts est déconseillée pour les sondes FISH de Dako. Les filtres de la rhodamine ne peuvent pas être utilisés et les filtres triple bande sont en général déconseillés. Un microscope non optimisé peut causer des problèmes pour la lecture des signaux fluorescents. Il est important que la source de lumière n'ait pas dépassé la date de péremption et qu'elle soit correctement alignée et centrée. Les clients doivent contrôler et suivre les recommandations du fabricant concernant la lampe à mercure et le microscope doit être entretenu. Tous les efforts doivent être faits pour exposer l'échantillon le moins possible à la lumière d'excitation afin de minimiser l'atténuation de la fluorescence. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 46/74

47 Nous vous recommandons de discuter de la mise au point de votre microscope avec le fabricant avant de commencer l'hybridation in situ en fluorescence ou de vous rapporter à la documentation correspondante. Annexe 2 Étape facultative pour l'optimisation de la durée de digestion par la Pepsin Cette étape facultative peut être utilisée pour évaluer l'effet de la digestion par la Pepsin et pour faciliter l'optimisation de la durée de digestion utilisée à l'étape 2, Pepsin. Pour contrôler si la durée de digestion par la Pepsin utilisée est suffisante, colorer la coupe de tissu lavé et digéré par la Pepsin avec 10 µl d'iodure de propidium fourni par l'utilisateur (400 ng/ml). Placer une lamelle de protection en verre de 22 mm x 22 mm sur l'iodure de propidium et laisser celui-ci s'étaler de manière homogène sous la lamelle. Laisser incuber pendant 1 minute. Utiliser un microscope à fluorescence avec un double filtre Texas Red/FITC (voir l'annexe 1) afin d'évaluer la coloration rouge des noyaux avec l'iodure de propidium. Si la digestion du tissu est acceptable, il devrait y avoir des noyaux rouges aux périmètres bien définis. Éliminer l'iodure de propidium en faisant tremper deux fois les coupes dans le Wash Buffer dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C) et passer à la section B3, Protocole de coloration, Étape 3, Sonde FISH. Si les noyaux sont toujours verts par autofluorescence et ne sont pas colorés en rouge avec l'iodure de propidium, il est nécessaire de répéter le cycle de digestion : Faire tremper les coupes deux fois dans le Wash Buffer dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C) pour éliminer l'iodure de propidium. Déposer 5 à 8 gouttes (250 µl) de Pepsin froide (2 à 8 C) (flacon 2) pour couvrir l'échantillon. Le flacon de Pepsin doit toujours être conservé entre 2 et 8 C. Placer les lames à 37 C sur un bloc chauffant préchauffé ou sur le Dako Hybridizer. Incuber pendant 10 minutes si aucune digestion ou une faible digestion a eu lieu. Les 10 minutes sont données à titre indicatif ; l'utilisateur doit déterminer la durée optimale. Faire tremper à nouveau les lames dans le Wash Buffer dilué deux fois pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C) pour éliminer la Pepsin. Appliquer à nouveau 10 µl d'iodure de propidium (400 ng/ml) pendant 1 minute. Évaluer la coloration et faire tremper deux fois les coupes dans le Wash Buffer dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20 à 25 C). Répéter le cycle si nécessaire ou passer à la section B.3.a ou B.3.b, Protocole de coloration, Étape 3, Sonde FISH. REMARQUE : Les réactifs contenus dans ce kit permettent d'effectuer 20 tests. L'utilisation du Wash Buffer et de la Pepsin dans cette étape facultative réduira le nombre total de tests possibles avec ce kit. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 47/74

48 DEUTSCH Verwendungszweck Zur In-vitro-Diagnostik. Das Histology FISH Accessory Kit wird beim Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-(FISH-)Verfahren auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten angewendet. Die mit diesem Histology FISH Accessory Kit mitgelieferten Reagenzien können auch in Verbindung mit dem HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (Code-Nr. K5731, Behälter 3) verwendet werden. Wenn Reagenzien aus dem Dako Histology FISH Accessory Kit, Code-Nr. K5799, zusammen mit Reagenzien aus Code-Nr. K5731 verwendet werden, muss das in der Packungsbeilage für Code-Nr. K5731 beschriebene Verfahren befolgt werden. Einführung Das Histology FISH Accessory Kit enthält alle für die Durchführung eines FISH-Verfahrens auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten erforderlichen Hauptreagenzien mit Ausnahme der Sonde. Nach Entparaffinierung und Rehydrierung werden Proben in der Pre- Treatment-Lösung erwärmt, anschließend erfolgt die proteolytische Andauung mit Pepsin. Nach der Erwärmung und Andauung und vor der Denaturierung und Hybridisierung werden vom Anwender bereitgestellte FISH-Sonden aufgebracht und die Proben mit Coverslip Sealant versiegelt. Nach der Hybridisierung erfolgt ein Stringenz-Waschschritt, um vor der Dehydrierung mit Ethanol alle ungebundenen bzw. unspezifisch gebundenen FISH-Sonden zu entfernen. Schließlich werden die Proben mit dem eine blaue Fluoreszenz-Gegenfärbung enthaltenden Fluorescence Mounting Medium fixiert. Die Ergebnisse werden mit einem mit den entsprechenden Filtern ausgestatteten Fluoreszenzmikroskop ausgewertet (siehe Anhang 1). Reagenzien Mitgelieferte Materialien Die unten angeführten Kitmaterialien reichen für 20 Tests aus (Definition eines Tests: Zielbereich von 22 mm x 22 mm). Das Kit enthält Materialien, die für bis zu 10 einzelne FISH-Durchläufe ausreichen (vier separate Läufe bei Anwendung der Pepsin-Eintauchmethode). Der Versand des Histology FISH Accessory Kit erfolgt auf Trockeneis. Um sicher zu sein, dass Kitkomponenten während des Transports keinen hohen Temperaturen ausgesetzt wurden, muss bei Entgegennahme des Kits immer noch Trockeneis vorhanden sein. Bitte beachten, dass einige der Kitkomponenten in ungefrorenem Zustand verbleiben; die Leistung des Histology FISH Accessory Kit wird dadurch jedoch nicht beeinträchtigt. Behälter 1 Behälter 2A Behälter 2B Pre-Treatment Solution (20x) 150 ml, 20-fach konzentriert MES-(2-[N-Morpholin]ethansulfonsäure-) Puffer. Pepsin 4 x 6,0 ml, gebrauchsfertig Pepsinlösung, ph 2,0, mit Stabilisierungsmittel und antimikrobiellem Wirkstoff. Pepsin Diluent (10x) 24 ml, 10-fach konzentriert Verdünnungspuffer, ph 2,0, mit antimikrobiellem Wirkstoff. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 48/74

49 Behälter 4 Behälter 5 Behälter 6 Artikel 7 Stringent Wash Buffer (20x) 150 ml, 20-fach konzentriert SSC-Puffer (saline-sodium citrate; NaCl + Natriumcitrat) mit Detergens Tween-20. Fluorescence Mounting Medium 0,4 ml Gebrauchsfertiges Fluoreszenz Eindeckmedium mit 500 µg/l DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol). Wash Buffer (20x) 500 ml, 20-fach konzentriert Tris/HCl-Puffer. Coverslip Sealant 1 Röhrchen Gebrauchsfertige Lösung zur wieder ablösbaren Deckglasversiegelung. HINWEIS: Alle Reagenzien sind mit den entsprechenden Reagenzien im Dako HER2 IQFISH pharmdx (Code-Nr. K5731) austauschbar. Wenn Reagenzien aus dem Dako Histology FISH Accessory Kit, Code-Nr. K5799, zusammen mit Reagenzien aus Code-Nr. K5731 verwendet werden, muss das in der Packungsbeilage für Code-Nr. K5731 beschriebene Verfahren befolgt werden. Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs) Laborreagenzien Destilliertes oder entionisiertes Wasser Ethanol, 96%ig Xylol oder Xylol-Ersatz Laborausstattung/-geräte Saugfähige Wischtücher Einstellbare Pipetten Kalibriertes Thermometer, teileingetaucht (Bereich C) Deckgläser (18 mm x 18 mm oder 22 mm x 22 mm und 24 mm x 50 mm oder 24 mm x 60 mm) Pinzette Abzugshaube Dako Hybridizer (Code-Nr. S2450/S2451)* Heizblock oder Hybridisierungsofen* Feuchtigkeitskammer für die Hybridisierung* Mikrozentrifuge Objektträger, Dako Silanized Slides, Code-Nr. S3003, mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger oder SuperFrost-Plus-Objektträger Färbeschalen oder -bäder Metall- oder Kunststoffgestelle Kurzzeitwecker (auf Zeitabstände zwischen 0 60 Minuten ausgelegt) Wasserbad mit Deckel (darauf ausgelegt, eine Temperatur von 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C und von 95 C bis 99 C aufrechtzuerhalten) ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 49/74

50 Mikrowellenherd mit Temperatursensor, falls Vorbehandlung mit Mikrowellenherd erfolgt** (siehe Schritt 1 in Abschnitt B.3.a. oder B.3.b. Färbeprotokoll, Methode B) Mikrowellengeeigneter Behälter, Deckel muss Löcher mit einem Durchmesser von z. B. 1 cm aufweisen * Heizblock für Andauung (37 (±2) C), Heizblock oder Hybridisierungsofen für Denaturierung (66 (±2) C (B.3.a.) oder 82 (±2) C) (B.3.b.) und Feuchtigkeitskammer für die Hybridisierung (45 (±2) C) können verwendet werden, aber wir empfehlen Dako Hybridizer, Code-Nr. S2450/S2451. ** Wasserbad mit Deckel (darauf ausgelegt, eine Temperatur von C aufrechtzuerhalten) oder eine mikroprozessorgesteuerte Druckkammer, wie z. B. Dako Pascal, Code-Nr. S2800, können anstelle des Mikrowellenherds verwendet werden. Mikroskopausstattungen und -zubehör Filter für Fluoreszenz-Mikroskop: DAPI-Filter und passende Filter für das verwendete Fluorochrom, z. B. FITC/Texas Red Doppelfilter, FITC- und Texas Red Monofilter für Dako FISH-Sonden Details siehe Anhang 1. Es wird ein Fluoreszenzmikroskop mit einer 100-Watt-Quecksilberdampflampe für Dako FISH- Sonden empfohlen. Andere Lichtquellen werden bei diesen Filtern nicht empfohlen. Mappe für Mikroskop-Objektträger (Halter aus Pappe für 20 Objektträger mit beweglicher Klappe o.ä.) Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur für Fachpersonal bestimmt. 2. Behälter 1, Pre-Treatment Solution (20x), enthält 1 <20%ige 2-Morpholinethansulfonsäure; Behälter 2A, Pepsin, enthält 5 10%iges Propan-2-ol; und Behälter 6, Wash Buffer (20x), enthält 1 <20%iges Trometamol. Bei den in diesem Produkt verwendeten Konzentrationen benötigen diese Substanzen keine Warnhinweise.Von fachlich qualifizierten Anwendern können Material-Sicherheitsdatenblätter (MSDS) angefordert werden. 3. Behälter 2, Pepsin, enthält Pepsin A, das eine allergische Reaktion hervorrufen kann. 4. Behälter 2B, Pepsin Diluent (10x), enthält 60%iges Propan-2-ol und ist wie folgt gekennzeichnet: Leichtentzündlich. Reizend. R11 Leichtentzündlich. R36 Reizt die Augen. R67 Dämpfe können Schläfrigkeit und Benommenheit verursachen. S9 Behälter an einem gut belüfteten Ort aufbewahren S16 Von Zündquellen fernhalten Nicht rauchen. S26 Bei Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. S60 Dieser Stoff und sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. 5. Artikel 7, Coverslip Sealant enthält 60 bis 100%iges Naphtha (Benzin), hydriert, leicht, und ist wie folgt gekennzeichnet: Hochentzündlich. Umweltgefährlich. R11 Leichtentzündlich. R51/53 Giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche Wirkungen haben. S16 Von Zündquellen fernhalten Nicht rauchen. S35 Abfälle und Behälter müssen in gesicherter Weise beseitigt werden. S57 Zur Vermeidung einer Kontamination der Umwelt geeigneten Behälter verwenden. S61 Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Besondere Anweisungen einholen/sicherheitsdatenblatt zu Rate ziehen. S9 Behälter an einem gut gelüfteten Ort aufbewahren. 6. Weitere Informationen bitte dem Sicherheitsdatenblatt (MSDS) entnehmen. 7. Verfahren der Gewebefixierung und Schnittdicken, die von den gemachten Angaben abweichen, können die Gewebemorphologie und/oder die Signalintensität beeinträchtigen. 8. Ebenso können die Ergebnisse durch Inkubationszeiten oder -temperaturen bzw. Verfahren, die hier nicht ausdrücklich beschrieben sind, beeinträchtigt werden. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 50/74

51 9. Die Reagenzien wurden optimal verdünnt. Eine weitergehende Verdünnung kann zu einem Leistungsverlust führen. 10. Nur saubere Färbeschalen für die Pepsin-Eintauchmethode (Schritt 2, Methode C) verwenden. Lagerung Im Dunkeln bei 2-8 C lagern. Alternativ können all e Reagenzien eingefroren werden. Wärme kann sich auf Pepsin (Behälter 2A) nachteilig auswirken. Diese Komponente darf nicht Raumtemperatur ausgesetzt werden. Zu starke Lichteinstrahlung kann für das Fluorescence Mounting Medium (Behälter 5) schädlich sein. Diese Komponente lichtgeschützt aufbewahren. Das Kit nach Ablauf des auf der Kit-Verpackung aufgedruckten Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Werden die Reagenzien nicht unter den genannten Bedingungen aufbewahrt, muss die Reagenzleistung vom Anwender validiert werden (1). Es gibt keine offensichtlichen Anhaltspunkte für die mögliche Instabilität dieses Produkts. Es ist daher wichtig, normales Gewebe, das bekanntermaßen gute FISH-Resultate gezeigt hat, als Kontrolle bei dem Assay mitzuführen. Wenn ein unerwartetes Fluoreszenzmuster beobachtet wird, welches durch Änderungen in den Labormethoden nicht erklärt werden kann, und falls Verdacht auf ein Problem mit dem Histology FISH Accessory Kit besteht, ist bitte Kontakt mit dem technischen Kundendienst von Dako aufzunehmen. Probenvorbereitung Die Handhabung von Biopsie-, Exzisions- oder Resektionsproben muss dergestalt erfolgen, dass die Gewebe für die FISH-Analyse erhalten bleiben. Das unten beschriebene empfohlene Verfahren der Gewebeverarbeitung für die immunzytochemische Färbung einhalten. Weitere Angaben der Quelle (2) entnehmen. Es wird nicht empfohlen, für das FISH-Verfahren Gewebe zu verwenden, die der Dekalzifizierung durch Säure ausgesetzt worden sind (3 6). Es wurde beobachtet, dass sich EDTA als Entkalker besser zur Konservierung der DNA (6) für das (F)ISH-Verfahren (3, 4, 7) eignet. HINWEIS: Die Leistung des Dako Histology FISH Accessory Kit wurde im Zusammenhang mit entkalktem Gewebe nicht validiert. Paraffineingebettete Schnitte Geeignet sind nur in neutral gepuffertem Formalin fixierte und paraffineingebettete Gewebe. Von Proben sollten beispielsweise Präparatblöcke mit einer Dicke von 3 mm oder 4 mm angefertigt werden, gefolgt von Stunden Fixierung in neutralem gepuffertem Formalin. Die Gewebe werden anschließend in einer abgestuften Reihe von Ethanol- und Xylol-Bädern dehydriert, gefolgt von einer Infiltration durch geschmolzenes Paraffin, das auf maximal 60 C gehalten wird. Ordnungsgemäß fixierte und eingebettete Gewebe halten sich bei richtiger Lagerung (15 25 C) (2, 8) vor der Abtrennung und Objektträger-Eindeckung unbegrenzt. Andere Fixiermittel sind nicht geeignet. Eine zu lange Fixierung kann beim Andauungsschritt mit Pepsin eine längere Inkubationszeit erforderlich machen. Gewebeproben auf eine Dicke von 2 6 µm schneiden, aus einem Wasserbad auf den Objektträger aufbringen und an der Luft trocknen. Die optimale Dicke der Gewebeschnitte für Dako Split Signal FISH-Sonden beträgt 2 3 µm. 4 6 µm dicke Gewebsschnitte können mit anderen FISH- Applikationen verwendet werden. Das Paraffin Minuten bei 60 C schmelzen. Anschließend die Schnitte auf Raumtemperatur (20 25 C) abkühlen lassen und bei 2 8 C aufbewahren. Es wird empfohlen, die Gewebeschnitte auf Dako Silanized Slides, Code-Nr. S3003, oder Poly-L- Lysin-beschichteten oder SuperFrost Plus-Objektträgern aufzuziehen. Grundsätzlich sollten die Gewebeproben innerhalb von 6 Monaten ab der Abtrennung bei 2 8 C analysiert werden. Sollten die Gewebeschnitte unter anderen Bedingungen als den beschriebenen aufbewahrt worden sein, so müssen diese vom Anwender verifiziert werden. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 51/74

52 GEBRAUCHSANWEISUNG A. Vorbereitung von Reagenzien Es wird empfohlen, die folgenden Reagenzien vor der Färbung anzusetzen: A.1 Pre-Treatment Solution In Behälter 1 kann Kristallbildung auftreten, Kristalle werden sich jedoch bei Raumtemperatur auflösen. Vor Ansetzen des Reagenz muss gewährleistet werden, dass keine Kristalle vorliegen. Aus Behälter 1 (Pre-Treatment Solution 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen, indem das Konzentrat im Verhältnis von 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnt wird. Nicht verbrauchte angesetzte Lösung kann einen Monat lang bei 2 8 C aufbewahrt werden. Angesetzte Lösungen mit getrübtem Aussehen müssen entsorgt werden. A.2 Stringent Wash Buffer Aus Behälter 4 (Stringent Wash Buffer 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen, indem das Konzentrat im Verhältnis von 1 : 20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnt wird. Nicht verbrauchter angesetzter Puffer kann einen Monat lang bei 2 8 C aufbewahrt werden. Angesetzter Puffer mit getrübtem Aussehen muss entsorgt werden. A.3 Wash Buffer Aus Behälter 6 (Wash Buffer 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen, indem das Konzentrat im Verhältnis von 1 : 20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnt wird. Nicht verbrauchter angesetzter Puffer kann einen Monat lang bei 2 8 C aufbewahrt werden. Angesetzter Puffer mit getrübtem Aussehen muss entsorgt werden. A.4 Ethanolreihe Aus einer 96%igen Ethanol-Lösung 3 Gefäße mit jeweils 70%igem, 85%igem und 96%igem Ethanol ansetzen. Abgedeckte Gefäße bei Raumtemperatur oder 2 8 C aufbewahren und für maximal 200 Objektträger verwenden. Angesetzte Lösungen mit getrübtem Aussehen müssen entsorgt werden. A.5 Pepsinlösung Pepsinlösung wird nur benötigt, wenn die Pepsin-Eintauchmethode (B.3.a. und B.3.b. Schritt 2 Methode C) zur Anwendung kommt. Pepsinlösung folgendermaßen vorbereiten: Bei einem Behälter für sechs Objektträger 60 ml Pepsinlösung zubereiten: 48 ml destilliertes oder entionisiertes Wasser bei Raumtemperatur (20 25 C) in den Behälter geben. 6 ml kalten (2 8 C) Pepsin Diluent (10x) (Behälter 2B) hinzugeben. 6 ml kaltes (2 8 C) Pepsin (Behälter 2A) hinzugeben. Deckel auf den Behälter setzen und die Pepsinlösung im Wasserbad eine Temperatur von 37 (±2) C annehmen lassen. Bei einem Behälter für 24 Objektträger 240 ml Pepsinlösung zubereiten: 192 ml destilliertes oder entionisiertes Wasser bei Raumtemperatur (20 25 C) in den Behälter geben. 24 ml kalten (2 8 C) Pepsin Diluent (10x) (Behälter 2B) hinzugeben. 24 ml kaltes (2 8 C) Pepsin (Behälter 2A) hinzugeben. Deckel auf den Behälter setzen und die Pepsinlösung im Wasserbad eine Temperatur von 37 (±2) C annehmen lassen. Die Pepsinlösung innerhalb von 5 Stunden nach dem Aufwärmen verbrauchen. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 52/74

53 B. Färbeverfahren B.1 Verfahrenshinweise Vor der Verwendung sind alle diese Anleitungen durchzuarbeiten und Benutzer sollten sich mit allen Kitkomponenten vertraut machen (siehe Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen ). Werden Kitkomponenten eingefroren, empfiehlt es sich, die Reagenzien einen Tag vor der Analyse in einen Bereich mit einer Temperatur von 2 8 C zu bringen, damit ein entsprechender Temperaturausgleich erfolgen kann. Vor Beginn der Immunfärbung alle Reagenzien die erforderliche Temperatur annehmen lassen. Behälter 1: Behälter 2A: Behälter 2B: Behälter 4: Behälter 5: Behälter 6: Artikel 7: Die verdünnte Pre-Treatment Solution wird auf C erwärmt, falls die Vorbehandlung in einem Wasserbad erfolgt (B.3.a. oder B.3.b. Färbeprotokoll, Schritt 1: Pre-Treatment, Methode A). Falls ein Mikrowellenherd mit Temperatursensor für die Vorbehandlung verwendet wird (B.3.a. oder B.3.b. Färbeprotokoll, Schritt 1: Pre-Treatment, Methode B), wird die verdünnte Pre- Treatment Solution auf Raumtemperatur (20 25 C) ab geglichen. Pepsin wird bei 2 8 C (B.3.a. oder B.3.b. Färbeprotokoll, Schritt 2: Methode A und B) angewendet und ständig gekühlt gehalten. Pepsin-Verdünnungsmittel (10x) wird bei 2 8 C (B.3.a. oder B.3.b. Färbeprotokoll, Schritt 2: Methode C) angewendet. Ein Gefäß mit dem verdünnten Stringent Wash Buffer wird vor der Verwendung auf Raumtemperatur abgeglichen und ein anderes Gefäß auf 63 (±2) C (B.3.a.) bzw. 65 (±2) C (B.3.b). Das Fluorescence Mounting Medium kann bei jeder beliebigen Temperatur zwischen zwischen 2 25 C aufgebracht werden. Den verdünnten Wash Buffer auf Raumtemperatur (20 25 C) abgleichen. Deckglaskleber bei Raumtemperatur (20 25 C) verw enden. Alle Schritte müssen bei den angegebenen Temperaturbereichen durchgeführt werden. Das Verfahren umfasst Dehydrierungsschritte mit anschließendem Trocknen der Proben. Vor dem folgenden Schritt müssen die Proben vollständig getrocknet sein. Gewebeschnitte dürfen während anderer Verfahrensschritte nicht austrocknen. Muss das Färbeverfahren unterbrochen werden, können die Objektträger nach dem Entparaffinierungsschritt bis zu 1 Stunde bei Raumtemperatur (20 25 C) in Wash Buffer aufbewahrt werden. B.2 Gewebebehandlung vor der Färbung Entparaffinierung und Rehydrierung: Zur Entfernung des Paraffins müssen die Gewebeschnitte vor dem Verfahren entparaffiniert und anschließend rehydriert werden. Das Paraffin muss vollständig entfernt werden. Überreste des Paraffins können eine stärkere unspezifische Färbung zur Folge haben. Diesen Schritt bei Raumtemperatur (20 25 C) durchführen. 1. Die Objektträger in ein Xylolbad stellen und 5 (±1) Minuten inkubieren. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 2. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger 2 (±1) Minuten lang in 96%iges Ethanol geben. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 3. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger 2 (±1) Minuten lang in 70%iges Ethanol geben. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. 4. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger mindestens 2 Minuten lang in verdünnten Wash Buffer geben (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.2). Das Färbeverfahren, wie in Abschnitt B.3.a. oder B.3.b., Schritt 1, Pre-Treatment, erläutert, beginnen. Nach 200 Objektträgern frische Xylol- und Alkohollösungen ansetzen. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 53/74

54 Es kann Xylol-Ersatz verwendet werden. HINWEIS: Die in diesem Kit enthaltenen Reagenzien und Anweisungen wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnungen der Kitreagenzien oder Abänderungen der Inkubationstemperaturen können zu fehlerhaften oder unstimmigen Ergebnissen führen. Unterschiede bei der Gewebeverarbeitung und bei den technischen Verfahren im Labor des Benutzers können die Ergebnisse des Assays hinfällig machen. Optionale Reifung der Gewebeproben: Vor der Entparaffinierung und Rehydrierung die Objektträger z. B. 1 Stunde bei 60 C auf einem Heizblock, einem Block im Hybridisierungsofen oder im Dako Hybridizer inkubieren. Die Objektträger 1 bis 2 Tage bei 37 C und anschließend 1 Stunde bei 60 C inkubieren. Danach mit der Entparaffinierung und Rehydrierung fortfahren. HINWEIS: Dieser Schritt ist optional. Gereifte Proben können potenzielle Hintergrundstörungen vermindern. B.3 Färbeprotokoll Nach einer der beiden Färbeprotokoll-Varianten B.3.a oder B.3.b vorgehen. Die Arbeitsschritte der beiden Verfahren nicht vertauschen. Das Färbeprotokoll B.3.a beschreibt das halbtägige Verfahren, das bei FISH-Sonden anzuwenden ist, die in einem ethylencarbonatbasierten Hybridisierungspuffer verdünnt sind. Das Färbeprotokoll B.3.b beschreibt das zweitägige Verfahren, das bei FISH-Sonden anzuwenden ist, die in einem formamidbasierten Hybridisierungspuffer verdünnt sind. B.3.a. Färbeprotokoll für in ethylencarbonatbasiertem Hybridisierungspuffer verdünnte FISH-Sonden Schritt 1: Vorbehandlung (Mikrowellenherd, Wasserbad, Pascal) Die Vorbehandlung kann entweder in einem Wasserbad erfolgen, wie unter Methode A) beschrieben, oder alternativ durch Verwendung eines Mikrowellenherds mit Temperatursensor, wie unter Methode B) beschrieben, oder durch Verwendung eines Pascal-Dampfdrucktopfs, wie unter Methode C) beschrieben. Methode A: Vorbehandlung im Wasserbad Färbebehältnisse, wie z. B. Coplin-Gefäße, mit verdünnter Pre-Treatment Solution befüllen (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.1). Verdünnte Pre-Treatment Solution enthaltende Färbeschalen in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und Pre-Treatment Solution auf C erwärmen. Temperatur in der Schale mit einem kalibrierten Thermometer kontrollieren. Schalen mit Deckeln versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden. Die auf Raumtemperatur gebrachten entparaffinierten Schnitte in die vorgewärmte Pre-Treatment Solution in die Färbeschalen einlegen. Temperatur erneut messen und 10 (±1) Minuten lang bei C inkubieren. Gesamte Färbeschale samt Objektträger aus dem Wasserbad heben. Deckel abnehmen und die Objektträger 15 Minuten lang in der Pre-Treatment Solution bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Objektträger 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in eine Färbeschale mit verdünntem Wash Buffer transferieren (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.3). Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. HINWEIS: Die Pre-Treatment Solution ist nur für den einmaligen Gebrauch bestimmt. Nicht wiederverwenden. Methode B: Vorbehandlung im Mikrowellenherd mit Temperatursensor (empfohlen) Ein Kunststoffgefäß mit verdünnter Pre-Treatment Solution füllen (Raumtemperatur, C). Die entparaffinierten Schnitte in Pre-Treatment Solution tauchen, das Gefäß mit einem punktierten Deckel abdecken und in den Mikrowellenherd stellen. Kochtemperatursensor und ein Programm auswählen, das nach Erreichen der Kochtemperatur 10 Minuten lang weiterläuft*. Nach der 10-minütigen Inkubation das Gefäß mit den Objektträgern aus dem Herd nehmen, den Deckel entfernen und 15 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Objektträger in ein ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 54/74

55 Gefäß mit verdünntem Wash Buffer transferieren und 3 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) einweichen lassen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. * Verwendung eines Mikrowellenherds mit Temperatursensor heißt, der Herd muss mit einem Sensor sowie mit einem Programm ausgestattet sein, das die Pre-Treatment Solution zunächst auf den Siedepunkt erhitzt, und danach die erforderliche Vorbehandlungstemperatur (über 95 C) beibehält, bis die voreingestellte Restzeit (10 (±1) Minuten) abgelaufen ist. Einige Mikrowellenherdmodelle mit Temperatursensor bieten unter Umständen nicht die Möglichkeit, eine beliebige Restzeit einzustellen. Falls das Modell lediglich voreingestellte Programme bietet, ist darauf zu achten, ein Programm auszuwählen, das die erforderliche Vorbehandlungstemperatur (über 95 ºC) mindestens 10 (±1) Minuten lang beibehält und das Programm nach 10 (±1) Minuten manuell zu stoppen. HINWEIS: Die Pre-Treatment Solution ist nur für den einmaligen Gebrauch bestimmt. Nicht wiederverwenden. Methode C: Vorbehandlung in der Pascal-Druckkammer 500 ml entionisiertes Wasser in die Pascal-Pfanne geben. Ein Kunststoffgefäß mit 250 ml Pre- Treatment Solution füllen. Die entparaffinierten Schnitte in die Pre-Treatment Solution eintauchen und das Gefäß in der Pascal-Pfanne platzieren. Bei 121 C 1 Minute lang inkubieren. Den Druck nach dem Kühlen auf 90 C ablassen. Die Information en zur ordnungsgemäßen Handhabung der Pascal-Druckkammer im Pascal-Handbuch sorgfältig durchlesen. Den Behälter nach Ablassen des Drucks herausnehmen. Deckel abnehmen und die Objektträger 15 Minuten lang in der Pre- Treatment Solution bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Objektträger in eine Schale mit verdünntem Wash Buffer (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.2) legen. Gewebeschnitte 3 Minuten bei Raumtemperatur einweichen lassen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Weiter mit Schritt 2. HINWEIS: Die Pre-Treatment Solution ist nur für den einmaligen Gebrauch bestimmt. Nicht wiederverwenden. Bei der Vorbehandlung in einem Mikrowellenherd keinen versiegelten, luftdichten Behälter verwenden, da der Druck im Innern des Behälters zunehmen würde und zu einer Explosion oder Verletzungen beim Öffnen führen könnte. Es ist möglich, einen metallenen Objektträgerhalter im Mikrowellenherd zu verwenden, wenn der Metallhalter während der gesamten Mikrowellenbehandlung in Vorbehandlungslösung getaucht ist. Abgesehen davon in einem Mikrowellenherd kein Metall verwenden. Die Anleitungen des Herd-Herstellers beachten. Anhaltendes Kochen von Pre-Treatment Solution während der 10minütigen Inkubation vermeiden. Die Temperatur mithilfe eines kalibrierten Thermometers regelmäßig kontrollieren. Schritt 2: Pepsin, gebrauchsfertig, oder Pepsinlösung Die Pepsin-Inkubation kann durch direktes Aufbringen der gebrauchsfertigen Pepsintropfen auf die Objektträger bei Raumtemperatur (20 25 C) (Methode A) oder bei 37 C (Methode B) erfolgen. Alternativ können die Objektträger in eine Pepsinlösung eingetaucht und bei 37 (±2) C inkubiert werden (Methode C). Methode A und Methode B: Überschüssigen Puffer abklopfen. Mit einem flusenfreien Tuch (wie z. B. einem saugfähigen Wischtuch oder Gazetupfer) vorsichtig rund um die Probe alle verbleibende Flüssigkeit abwischen und dafür sorgen, dass Reagenzien innerhalb des vorgeschriebenen Bereichs verbleiben. 5 8 Tropfen (250 µl) kaltes (2 8 C) Pepsin (Behälter 2A) zum Bedecken der Probe aufbringen. Pepsin immer bei 2 8 C lagern. Methode A: Pepsin, gebrauchsfertig Inkubation bei C 5-15 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) inkubieren. Bei den meisten Proben ist eine Inkubationszeit von 5-15 Minuten angemessen. Die optimale Inkubationszeit schwankt jedoch in Abhängigkeit von der Gewebefixierung und/oder Dicke des histologischen Schnitts und muss vom Anwender ermittelt werden. Überschüssiges Pepsin abklopfen und Schnitte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in verdünntem Wash Buffer einweichen lassen (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.3). Verdünnten Wash Buffer ersetzen und die Schnitte weitere 3 Minuten lang einweichen. Weiter mit Dehydrierung. Methode B: Pepsin, gebrauchsfertig Inkubation bei 37 C ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 55/74

56 Probe mit Pepsin bei 37 C auf einen Heizblock z. B. Dako Hybridizer geben und 3-5 Minuten inkubieren. Bei den meisten Proben ist eine Inkubationszeit von 3-5 Minuten angemessen. Die optimale Inkubationszeit schwankt jedoch in Abhängigkeit von der Gewebefixierung und/oder Dicke des histologischen Schnitts und muss vom Anwender ermittelt werden. Überschüssiges Pepsin durch Abklopfen entfernen und Gewebeschnitte in verdünntem Wash Buffer 3 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) einweichen lassen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Weiter mit Dehydrierung. Die Gewebeschnitte über eine abgestufte Reihe von Ethanol-Bädern dehydrieren: 2 Minuten in 70%igem Ethanol, 2 Minuten in 85%igem Ethanol und 2 Minuten in 96%igem Ethanol. Gewebeschnitte an der Luft vollständig trocknen lassen. Methode C: Pepsinlösung Eintauchen der Objektträger in 37 C warme Pepsinlösung Die in diesem Kit enthaltenen Reagenzien sind ausreichend für vier separate Durchläufe (60 ml Pepsinlösung, kleiner Behälter für sechs Objektträger) oder einen einzelnen Durchlauf (240 ml Pepsinlösung, großer Behälter für 24 Objektträger). Pepsinlösung, wie in Abschnitt A.5 beschrieben, vorbereiten. Deckel auf den Behälter setzen und die Pepsinlösung im Wasserbad eine Temperatur von 37 (±2) C annehmen lassen. Die Temperatur muss stabil bleiben. Temperatur im Behälter mit einem kalibrierten Thermometer messen, um die korrekte Temperatur zu gewährleisten. Überschüssigen Wash Buffer abklopfen. Objektträger in die 37 (±2) C warme Pepsinlösung eintauchen und Minuten lang inkubieren Bei den meisten Proben ist eine Inkubationszeit von Minuten angemessen. Bei den meisten Proben ist eine Inkubationszeit von Minuten angemessen. Die optimale Inkubationszeit schwankt jedoch in Abhängigkeit von der Gewebefixierung und/oder Dicke des histologischen Schnitts und muss vom Anwender ermittelt werden. Überschüssige Pepsinlösung durch Abklopfen entfernen und Gewebeschnitte in verdünntem Waschpuffer 3 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) einweichen lassen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Weiter mit Dehydrierung. Die Gewebeschnitte über eine abgestufte Reihe von Ethanol-Bädern dehydrieren: 2 Minuten in 70%igem Ethanol, 2 Minuten in 85%igem Ethanol und 2 Minuten in 96%igem Ethanol. Gewebeschnitte an der Luft vollständig trocknen lassen. Schritt 3: In ethylencarbonatbasiertem Hybridisierungspuffer verdünnte FISH-Sonde (vom Anwender bereitgestellt) HINWEIS: In ethylencarbonatbasiertem Hybridisierungspuffer verdünnte FISH-Sondenmixes müssen zwischen den Anwendungen bei -18 C gelagert werden. Die Lagerung bei -18 C führt zur Trennung des ethylencarbonatbasierten Puffers in zwei Phasen. Vor Gebrauch vergewissern, dass nur eine Phase vorhanden ist, indem der Sondenmix auf Raumtemperatur (20-25 C) abgeglichen und anschließend gemischt wird. Den FISH-Sondenmix bei Raumtemperatur (20 25 C) max. 30 Minuten lang auftauen (vor stark er Lichteinwirkung schützen), dann den Behälter 15 Sekunden lang bei 2500 U/min mit einem Vortex-Mischer gründlich vortexen. Eine angemessene Menge Sondenmix, z. B. 10 µl, auf die Mitte des Gewebeschnitts auftragen. Sofort über dem Sondenmix ein Deckglas von 22 mm x 22 mm Größe auflegen und den Sondenmix sich gleichmäßig unter dem Deckglas ausbreiten lassen. Einschluss von Luftblasen vermeiden. Sollten Luftblasen festgestellt werden, werden sie mit der Pinzette vorsichtig aus dem Gewebe herausgeklopft. Deckglas mit Coverslip Sealant absiegeln, indem das Abdichtmittel rund um die Peripherie des Deckglases aufgetragen wird. Das Coverslip Sealant das Deckglas und den Objektträger so überlappen lassen, dass es eine Abdichtung rund um das Deckglas bildet. Das Coverslip Sealant muss den gesamten Rand des Deckglases abdecken. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 56/74

57 Dako Hybridizer* (Code-Nr. S2450 oder S2451) für einen Hybridisierungslauf vorbereiten. Humidity Control Strips (Code-Nr. S2452) müssen gesättigt und optimal für den Gebrauch sein. Den Hybridizer starten und ein Programm mit folgenden Parametern wählen: Denaturierung bei 66 C für 10 Minuten, gefolgt von Hybridisierung bei 45 C für Minuten. Objektträger in den Hybridizer legen, dabei muss der Deckel richtig geschlossen sein, und das Programm starten. Weitere Einzelheiten siehe Gebrauchsanweisung des Dako Hybridizer. * Für Denaturierung und Hybridisierung können Geräte eingesetzt werden, die die gleichen Bedingungen wie oben beschrieben bieten: Die Objektträger auf eine auf 66 (±1) C vorgewärmte flache Oberfläche aus Metall oder Stein legen (Heizblock oder Block in einem Hybridisierungsofen). Genau 10 Minuten lang denaturieren. Objektträger in eine vorgeheizte befeuchtete Hybridisierungskammer legen. Kammer mit Deckel versehen und Minuten lang bei 45 (±2) C inkubieren. Schritt 4: Stringenz-Waschung Zwei Färbebehältnisse, wie z. B. Coplin-Gefäße, mit verdünntem Stringent Wash Buffer befüllen (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.2). Für jede Schale wird ein Mindestvolumen von 100 ml oder von 15 ml pro Objektträger empfohlen. Eine Färbeschale mit verdünntem Stringent Wash Buffer bei Raumtemperatur unter eine Abzugshaube und die andere Färbeschale in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und den verdünnten Stringent Wash Buffer auf 63 (±2) C erwärmen. Sicherstellen, dass sich die Temperatur stabilisiert hat. Schale mit Deckel versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden. Temperatur innerhalb der Schale im Wasserbad mit einem kalibrierten Thermometer messen, um die korrekte Temperatur zu gewährleisten. Der Stringent Wash Buffer enthält ein Detergenz und kann bei 63 C ein getrübtes Aussehen annehmen. Die Leistung wird hierdurch nicht beeinträchtigt. Mit einer Pinzette oder mit durch Handschuhe geschützten Händen die Objektträger aus der Hybridisierungskammer nehmen. Vorsichtig Coverslip Sealant sowie Deckglas entfernen und die Objektträger einen nach dem anderen in die Raumtemperatur aufweisende Schale für den Vorwaschschritt geben. Sobald alle Deckgläser entfernt wurden, die Objektträger wieder aus der Vorwasch-Schale mit der raumwarmen Lösung herausnehmen und in die 63 (±2) C warme Schale im Wasserbad legen. Unmittelbar nach der Überführung der Objektträger in den 63 (±2) C warmen verdünnten Stringent Wash Buffer im Wasserbad muss der Timer gestartet werden. Genau 10 Minuten lang mit Stringent Wash Buffer waschen. Objektträger aus dem verdünnten Stringent Wash Buffer herausheben und Schnitte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in verdünntem Wash Buffer einweichen. Verdünnten Wash Buffer ersetzen und Schnitte 3 weitere Minuten lang einweichen. Die Gewebeschnitte über eine abgestufte Reihe von Ethanol-Bädern dehydrieren. 2 Minuten in 70%igem Ethanol, 2 Minuten in 85%igem Ethanol und 2 Minuten in 96%igem Ethanol. Gewebeschnitte vollständig trocknen lassen. Schritt 5: Eindeckung Im Targetbereich des Objektträgers 15 µl Fluorescence Mounting Medium mit DAPI (Behälter 5) aufbringen und mit einem Deckglas eindecken. HINWEIS: Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger kann nach 15 Minuten oder innerhalb von 7 Tagen nach dem Eindecken erfolgen. Es kommt allerdings zu Verblassen, falls die Objektträger Licht oder hohen Temperaturen ausgesetzt werden. Um ein Verblassen auf dem Minimum zu halten, sind die Objektträger bei C im Dunkeln aufzubewahren. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 57/74

58 B.3.b. Färbeprotokoll für in formamidbasiertem Hybridisierungspuffer verdünnte FISH- Sonden TAG 1 Schritt 1: Vorbehandlung (Mikrowellenherd, Wasserbad, Pascal) Die Vorbehandlung kann entweder in einem Wasserbad erfolgen, wie unter Methode A) beschrieben, oder alternativ durch Verwendung eines Mikrowellenherds mit Temperatursensor, wie unter Methode B) beschrieben, oder durch Verwendung einer Pascal-Druckkammer, wie unter Methode C) beschrieben. Methode A: Vorbehandlung im Wasserbad Die Färbeschalen mit der verdünnten Pre-Treatment Solution füllen (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.1). Verdünnte Pre-Treatment Solution enthaltende Färbeschalen in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und Pre-Treatment Solution auf C erwärmen. Temperatur in der Schale mit einem kalibrierten Thermometer kontrollieren. Schalen mit Deckeln (ohne Löcher) versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden. Die entparaffinierten Schnitte in die erwärmte Pre-Treatment Solution eintauchen. Temperatur erneut prüfen, den Deckel des Wasserbads schließen und 10 (±1) Minuten lang bei C inkubieren. Gesamte Färbeschale samt Objektträger aus dem Wasserbad heben. Deckel abnehmen (Objektträger nicht entnehmen). Die Objektträger in der Pre-Treatment Solution 15 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Objektträger 3 Minuten in eine Schale mit verdünntem Wash Buffer (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.2) von Raumtemperatur legen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Weiter mit Schritt 2. Methode B: Vorbehandlung im Mikrowellenherd mit Temperatursensor (empfohlen) Einen Behälter mit verdünnter Pre-Treatment Solution von Raumtemperatur (20 25 C) füllen. Die entparaffinierten Schnitte in die Lösung eintauchen und den Deckel schließen. Der Deckel muss für den Druckausgleich Löcher aufweisen. Den Behälter mit Objektträgern in den Mikrowellenherd stellen und erwärmen. Vor der Erwärmung überprüfen, ob das Äußere des Behälters und das Innere des Mikrowellenherds trocken sind. Direkt unterhalb des Siedepunkts (nicht weniger als 95 C) 10 Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation Deckel abnehmen (Objektträger nicht entnehmen). Die Objektträger in der Pre-Treatment Solution 15 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) abkühlen lassen. Während der gesamten Vorbehandlungsphase müssen die Objektträger mit Pufferlösung bedeckt sein. Objektträger 3 Minuten in eine Schale mit verdünntem Wash Buffer (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.2) von Raumtemperatur legen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Weiter mit Schritt 2. Methode C: Vorbehandlung in der Pascal-Druckkammer 500 ml entionisiertes Wasser in die Pascal-Pfanne geben. Ein Kunststoffgefäß mit 250 ml Pre- Treatment Solution füllen. Die entparaffinierten Schnitte in die Pre-Treatment Solution eintauchen und das Gefäß in der Pascal-Pfanne platzieren. Bei 121 C 1 Minute lang inkubieren. Den Druck nach dem Kühlen auf 90 C ablassen. Die Information en zur ordnungsgemäßen Handhabung der Pascal-Druckkammer im Pascal-Handbuch sorgfältig durchlesen. Den Behälter nach Ablassen des Drucks herausnehmen. Deckel abnehmen und die Objektträger 15 Minuten lang in der Pre- Treatment Solution bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Objektträger in eine Schale mit verdünntem Wash Buffer (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.2) legen. Gewebeschnitte 3 Minuten bei Raumtemperatur einweichen lassen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Weiter mit Schritt 2. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 58/74

59 HINWEIS: Die Pre-Treatment Solution ist nur für den einmaligen Gebrauch bestimmt. Nicht wiederverwenden. Bei der Vorbehandlung in einem Mikrowellenherd keinen versiegelten, luftdichten Behälter verwenden, da der Druck im Innern des Behälters zunehmen würde und zu einer Explosion oder Verletzungen beim Öffnen führen könnte. Es ist möglich, einen metallenen Objektträgerhalter im Mikrowellenherd zu verwenden, wenn der Metallhalter während der gesamten Mikrowellenbehandlung in Vorbehandlungslösung getaucht ist. Abgesehen davon in einem Mikrowellenherd kein Metall verwenden. Die Anleitungen des Herd-Herstellers beachten. Anhaltendes Kochen von Pre-Treatment Solution während der 10minütigen Inkubation vermeiden. Die Temperatur mithilfe eines kalibrierten Thermometers regelmäßig kontrollieren. Schritt 2: Pepsin, gebrauchsfertig, oder Pepsinlösung Die Pepsin-Inkubation kann durch direktes Aufbringen der gebrauchsfertigen Pepsintropfen auf die Objektträger bei Raumtemperatur (20 25 C) (Methode A) oder bei 37 C (Methode B) erfolgen. Alternativ können die Objektträger in eine Pepsinlösung eingetaucht und bei 37 (±2) C inkubiert werden (Methode C). Methode A und Methode B: Überschüssigen Puffer abklopfen. Mit einem flusenfreien Tuch (wie z. B. einem saugfähigen Wischtuch oder Gazetupfer) vorsichtig rund um die Probe alle verbleibende Flüssigkeit abwischen und dafür sorgen, dass Reagenzien innerhalb des erforderlichen Bereichs verbleiben. 5 8 Tropfen (250 µl) kaltes (2 8 C) Pepsin (Behälter 2A) auftropfen, um die Probe zu bedecken. Pepsin immer bei 2 8 C lagern. Methode A: Pepsin, gebrauchsfertig Inkubation bei C 5 50 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) inkubieren. Für die meisten Proben ist eine Inkubationszeit von Minuten bei Raumtemperatur ausreichend, doch die optimale Inkubation sollte vom Anwender festgelegt werden. Überschüssiges Pepsin abklopfen und Schnitte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in verdünntem Wash Buffer einweichen lassen (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.3). Verdünnten Wash Buffer ersetzen und die Schnitte weitere 3 Minuten lang einweichen. Mit Schritt 3, FISH-Sonde, fortfahren oder Anhang 2 die optimale Andauungszeit entnehmen (optional). Methode B: Pepsin, gebrauchsfertig Inkubation bei 37 C Proben mit Pepsin bei 37 C in den Dako Hybridizer oder einen vorgewärmten Heizblock geben. 2 6 Minuten lang bei 37 C inkubieren. Dies ist für die nach Abschnitt Gewebevorbereitung vorbereiteten Proben zumeist ausreichend. Die optimale Inkubationszeit ist von Gewebetyp, Gewebefixierung, Schnittdicke und Probenreifung abhängig und sollte vom Anwender ermittelt werden. Diese Faktoren können die erforderlicher Andauungszeit auf 7 15 min oder noch höher verlängern. Anwender, die das Verfahren zum ersten Mal durchführen, sollten die optimale Andauungszeit durch Test an repräsentativen Geweben mit Zeiten von jeweils 1, 3, 6, 12 und 18 Minuten ermitteln. Pepsin abklopfen und Schnitte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in verdünntem Wash Buffer einweichen lassen (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.3). Verdünnten Wash Buffer ersetzen und die Schnitte weitere 3 Minuten lang einweichen. Mit Schritt 3, FISH-Sonde, fortfahren oder Anhang 2 die optimale Andauungszeit entnehmen (optional). Methode C: Pepsinlösung Eintauchen der Objektträger in 37 C warme Pepsinlösung Die in diesem Kit enthaltenen Reagenzien sind ausreichend für vier separate Durchläufe (60 ml Pepsinlösung, kleiner Behälter für sechs Objektträger) oder einen einzelnen Durchlauf (240 ml Pepsinlösung, großer Behälter für 24 Objektträger). Pepsinlösung, wie in Abschnitt A.5 beschrieben, vorbereiten. Deckel auf den Behälter setzen und die Pepsinlösung im Wasserbad eine Temperatur von 37 (±2) C annehmen lassen. Die Temperatur muss stabil bleiben. Temperatur im Behälter mit einem kalibrierten Thermometer messen, um die korrekte Temperatur zu gewährleisten. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 59/74

60 Überschüssigen Wash Buffer abklopfen. Objektträger in die 37 (±2) C warme Pepsinlösung eintauchen und Minuten lang inkubieren Bei den meisten Proben ist eine Inkubationszeit von Minuten angemessen. Bei den meisten Proben ist eine Inkubationszeit von Minuten angemessen. Die optimale Inkubationszeit schwankt jedoch in Abhängigkeit von der Gewebefixierung und/oder Dicke des histologischen Schnitts und muss vom Anwender ermittelt werden. Überschüssige Pepsinlösung durch Abklopfen entfernen und Gewebeschnitte in verdünntem Wash Buffer 3 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) einweichen lassen. Wash Buffer ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen. Mit Schritt 3, FISH-Sonde, fortfahren oder Anhang 2 die optimale Andauungszeit entnehmen (optional). HINWEIS: Es wird empfohlen, das Verfahren im Abschnitt Gewebevorbereitung zu befolgen. Unzureichend angedautes Gewebe führt u.u. zu keinen oder nur verschwommenen Signalen, häufig mit einem stark grünen Zytosolhintergrund. Schritt 3: FISH-Sonde (vom Anwender bereitgestellt) HINWEIS: Wenn Reagenzien aus dem Dako Histology FISH Accessory Kit, Code-Nr. K5799, zusammen mit Reagenzien aus Code-Nr. K5731 verwendet werden, muss das in der Packungsbeilage für Code-Nr. K5731 beschriebene Verfahren befolgt werden. Der folgende Schritt sollte unter einer Abzugshaube durchgeführt werden. Zu starke Lichteinstrahlung kann für Fluorochrom-markierte Sonden schädlich sein. Den Rest dieses Verfahrens nicht bei hellem Licht, wie z. B. direktem Sonnenlicht, durchführen. Die Gewebeschnitte über eine abgestufte Reihe von Ethanol-Bädern dehydrieren: 2 Minuten in 70 %igem Ethanol, 2 Minuten in 85 %igem Ethanol und 2 Minuten in 96 %igem Ethanol (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.4). Gewebeschnitte an der Luft vollständig trocknen lassen. Eine angemessene Menge der Fluorochrom-markierten Sonde, z. B. 10 µl einer Dako FISH- Sonde, in das Zentrum des Gewebeschnitts geben. Sonde sofort mit einem Deckglas von 18 mm x 18 mm (oder z. B. 22 mm x 22 mm) abdecken und unter dem Deckglas gleichmäßig verteilen lassen. Einschluss von Luftblasen vermeiden. Falls doch Luftblasen auftreten, vorsichtig mit einer Pinzette abklopfen. Deckglas durch Aufbringen von Coverslip Sealant um den Rand des Deckglases herum versiegeln. Das Coverslip Sealant das Deckglas und den Objektträger so überlappen lassen, dass es eine Abdichtung rund um das Deckglas bildet. Das Coverslip Sealant muss den Rand des Deckglases vollständig versiegeln. Objektträger in den Dako Hybridizer (Code-Nr. S2450/S2451) geben und bei Verwendung von Dako FISH-Sonden die Denaturierung 5 Minuten lang auf 82 C und die Hybridisierung über Nacht (14 20 h) auf 45 C einstellen. Mit Tag 2, Schritt 4 der Stringenz-Waschung fortfahren. Nähere Anleitungen siehe Hybridizer-Handbuch. HINWEIS: Alternativ können ein Heizblock, ein Hybridisierungsofen und eine Hybridisierungskammer verwendet werden; siehe unten. Die Objektträger auf eine auf 82 (±2) C vorgewärmte flache Oberfläche aus Metall oder Stein legen (Heizblock oder Block in einem Hybridisierungsofen). 5 Minuten lang denaturieren, um sicherzustellen, dass die Temperatur des Blocks nicht unter 80 C fällt. Objektträger in eine vorgeheizte befeuchtete Hybridisierungskammer legen. Bei Verwendung von Dako FISH-Sonden die Proben in der verschlossenen Kammer über Nacht (14 20 Stunden) bei 45 (±2) C inkubieren. TAG 2 Schritt 4: Stringenz-Waschung Zwei Färbeschalen mit verdünntem Stringent Wash Buffer befüllen (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.2). Für 1 6 Objektträger in einer Färbeschale ist eine Mindestmenge von 100 ml verdünntem Stringent Wash Buffer erforderlich. Bei mehr als 6 Objektträgern mindestens 15 ml Puffer pro Objektträger verwenden. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 60/74

61 Eine Färbeschale mit verdünntem Stringent Wash Buffer bei Raumtemperatur unter eine Abzugshaube und die andere Färbeschale in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und den verdünnten Stringent Wash Buffer auf 65 (±2) C erwärmen. Sicherstellen, dass sich die Temperatur stabilisiert hat. Schale mit Deckel versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden. Temperatur in der Schale mit einem kalibrierten Thermometer messen, um die korrekte Temperatur zu gewährleisten. Objektträger aus der Hybridisierungskammer nehmen. Mit einer Pinzette das Coverslip Sealant und den Deckel vorsichtig entfernen und den Objektträger in die raumwarme Vorwasch- Färbeschale legen. Sobald alle Deckel entfernt worden sind, die Objektträger wieder aus der Vorwasch-Schale mit der raumwarmen Lösung herausnehmen und in die 65 (±2) C warme Schale im Wasserbad legen. Deckel der Schale schließen und danach den Deckel auf das Wasserbad legen. Die Waschung mit stringentem Waschpuffer genau 10 Minuten lang bei 65 (±2) C vornehmen. Objektträger aus dem verdünnten Stringent Wash Buffer herausheben und Schnitte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 25 C) in verdünntem Wash Buffer einweichen. Verdünnten Wash Buffer ersetzen und Schnitte 3 weitere Minuten lang einweichen. Die Gewebeschnitte über eine abgestufte Reihe von Ethanol-Bädern dehydrieren: 2 Minuten in 70 %igem Ethanol, 2 Minuten in 85 %igem Ethanol und 2 Minuten in 96 %igem Ethanol (siehe GEBRAUCHSANWEISUNG, Abschnitt A.4). Schnitte an der Luft vollständig trocknen lassen. Schritt 5: Eindeckung Im Zielbereich des Objektträgers 15 µl des eine blaue Fluoreszenz-Gegenfärbung enthaltenden Fluorescence Mounting Medium (Behälter 5) aufbringen und mit einem Deckglas (z. B. 24 mm x 50 mm oder 24 mm x 60 mm) eindecken. Das Medium unter dem Deckglas gleichmäßig verteilen lassen. HINWEIS: Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger kann nach 15 Minuten oder innerhalb von 7 Tagen nach dem Eindecken erfolgen. Werden die Objektträger Lichteinwirkung oder hohen Temperaturen ausgesetzt, kommt es zum Verblassen. Objektträger im Dunkeln bei - 18 C bis 8 C aufbewahren. Qualitätskontrolle 1. Signale müssen hell, deutlich und leicht zu bewerten sein. 2. Normales Gewebe, das bekanntermaßen gute FISH-Resultate gezeigt hat, als Kontrolle beim Assay mitführen. 3. Normale Gewebezellen müssen klar sichtbare Fluoreszenzsignale aufweisen, ein Anzeichen dafür, dass die FISH-Sonden erfolgreich in die Zielbereiche hybridisiert sind. 4. Das Ausbleiben von Signalen in normalen Gewebezellen zeigt das Versagen des Assays an, die Ergebnisse sind für ungültig zu erklären. 5. Durch das Schneiden des Gewebes weisen einige der normalen Zellen weniger als die erwartete Anzahl an Signalen auf. 6. Bei der Bewertung mit einem DAPI-Filter muss die Zellkernmorphologie intakt sein. Zahlreiche Schattenzellen, Zellen mit Doughnut-Struktur und eine insgesamt schlechte Zellkernmorphologie sind Anzeichen für eine zu starke Andauung oder Denaturierung der Probe, die zum Signalverlust bzw. zur Signalfragmentierung führen kann. Periphere Anfärbung, Löcher in Zellen (DAPI-Filter) und/oder stark grüne Zytosolhintergrundanfärbung, die man bei einem Texas Red/FITC-Doppelfilter beobachtet, kann auf eine zu geringe Andauung hinweisen, die zum Signalverlust führen kann. Solche Proben müssen als ungültig angesehen werden. 7. Unterschiede bei der Gewebefixierung und -eindeckung im Labor des Anwenders können Variationen der Resultate hervorrufen und eine regelmäßige Evaluation der laborinternen Kontrollen erforderlich machen. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 61/74

62 Auswertung der Ergebnisse Mehrere Bereiche von Zellen abtasten, um Ursachen für mögliche Heterogenität festzustellen. Einen Bereich mit einer guten Zellkernverteilung auswählen. Mit der Analyse im linken oberen Quadranten des ausgewählten Bereichs beginnen, dabei von links nach rechts vorgehen, entsprechend den untenstehenden Richtlinien die Anzahl der Signale innerhalb der Zellkerngrenzen jedes ausgewerteten Zellkerns zählen. Auf- und abwärts fokussieren, um alle Signale im jeweiligen Zellkern ausfindig zu machen. Zellkerne ohne Signale nicht werten. Es dürfen keine Zellkerne einbezogen werden, bei denen ein subjektives Urteil gefällt werden muss. Zellkerne mit schwacher Signalintensität und unspezifischer oder hoher Hintergrundanfärbung sind zu übergehen. Der Anwender muss entscheiden, wie viele Zellkerne für jede Sonde zu zählen sind. Bereiche mit nicht eindeutigen Zellkernrändern auszuklammern. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 62/74

63 Fehlerbehebung Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Signale oder schwache Signale 1a. Unpassende Andauungszeit. 1a. Es dürfen nur formalinfixierte, paraffineingebettete Schnitte verarbeitet werden. Möglicherweise hilft eine verlängerte Andauungszeit von 7 15 Minuten oder noch länger bei 37 C. Siehe Abschnitt B.3.a oder B.3.b, Schritt 2, Fehlerbehebung, Punkt 4d, 4e und Anhang 2. 1b. Kit wurde während Transport oder Aufbewahrung hohen Temperaturen ausgesetzt. 1c. Falsche Vorbehandlungsbedingungen. 1d. Unzulässige Bedingungen bei der Denaturierung. 1e. Unzulässige Hybridisierungstemperatur. 1b. Lagerungsbedingungen überprüfen. Bei Entgegennahme der Lieferung muss Trockeneis vorhanden gewesen sein. Überprüfen, ob Behälter 2 und 5 bei 2 8 C gelagert wurden und Behälter 5 im Dunkeln aufbewahrt worden ist. 1c. Immer die empfohlenen Vorbehandlungstemperature n und Zeiten einhalten. Ferner überprüfen, ob die Dauer der Andauungsinkubation optimiert wurde; ggf. in Abschnitt B.3.a oder B.3.b, Schritt 2 nachschlagen. Je näher die Vorbehandlungstemperatur am Siedepunkt liegt, um so stärker die Signale. Pepsin muss bei der korrekten Temperatur gehandhabt werden. Siehe Abschnitt B.1. 1d. Immer die empfohlenen Denaturierungstemperature n und Zeiten einhalten. 1e. Dako FISH-Sonden immer bei 45 (±2) C hybridisieren. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 63/74

64 Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1f. Verdunstung des Sondenpuffers während der Hybridisierung. 1g. Unzulässige Bedingungen bei der Stringenzwaschung. 1h. Funktionsstörung des Mikroskops - Unangemessener Filtersatz - Ungeeignete Lampe - Quecksilberdampflampe zu alt - Ausgebrannte Filter - Verschmutzte und/oder gesprungene Sammellinsen - Ungeeignetes Immersionsöl 1i. Abgeschwächte verblasste Signale. 1f. Für ausreichende Feuchtigkeit in der Hybridisierungskammer sorgen. Den Dako Hybridizer (Code-Nr. S2450/S2451) und Feuchtigkeitskontrollstreifen für den Hybridizer (Code-Nr. S2452) verwenden. Coverslip Sealant verwenden. Siehe Fehlerbehebung Punkt 5a und 5b. 1g. Empfohlene Volumen, Temperaturen und Zeiten für die Stringenzwaschung einhalten und Deckgläser vor diesem Waschschritt entfernen. 1h. Überprüfen, ob die verwendeten Filter für die Verwendung mit Fluorochromen geeignet sind, dass sie nicht verschlissen sind und dass eine geeignete Quecksilberlampe verwendet wird, die noch nicht über die erwartete Lebensdauer hinaus benutzt wurde (siehe Anhang 1). Geeignetes Immersionsöl für die Fluoreszenz verwenden. Im Zweifelsfall bitte Kontakt mit dem Mikroskop-Lieferanten aufnehmen. 1i. Übermäßig lange mikroskopische Untersuchung vermeiden und so wenig wie möglich starkem Lichteinfall aussetzen. 2. Bereiche ohne Signal 2a. Zu geringes Sondenvolumen. 2a. Das Sondenvolumen muss zum Abdecken des Bereichs unter dem Deckglas ausreichen. 2b. Während Sondenaufbringung oder Fixierung Luftblasen eingeschlossen. 2b. Einschluss von Luftblasen vermeiden. Falls doch Luftblasen auftreten, vorsichtig mit einer Pinzette abklopfen. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 64/74

65 Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 2c. Schlechte Entparaffinierung. 2c. Das Paraffin muss vollständig von den Schnitten entfernt sein. Siehe Abschnitt B Übermäßige Hintergrundanfärbung 3a. Unpassende Andauungszeit. Ein stark grüner Zytosolhintergrund kann auf eine zu geringe Andauung hinweisen. 3b. Schnitte sind in Abschnitt B.3 getrocknet. 3c. Paraffin nicht vollständig entfernt. 3d. Zu niedrige Temperatur bei Stringenzwaschung. 3e. Hybridisierter Schnitt war zu lange hellem Licht ausgesetzt. 3f. Abgelaufene oder ungeeignete Objektträger können zu einer übermäßigen roten Färbung ( Sternenhimmel ) führen. 3a. Es dürfen nur formalinfixierte, paraffineingebettete Schnitte verarbeitet werden. Möglicherweise hilft eine verlängerte Andauungszeit von z. B Minuten bei 37 C. Siehe Abschnitt B.3.a oder B.3.b., Schritt 2, Fehlerbehebung, Punkt 4e und Anhang 2. 3b. Die Anweisungen befolgen und ein Austrocknen der Objektträger vermeiden, außer wenn ausdrücklich verlangt. 3c. Die Verfahren für Entparaffinierung und Rehydrierung in Abschnitt B.2 durchführen. 3d. Immer die empfohlene Temperatur für die Stringenz-Waschung verwenden. 3e. Übermäßig lange mikroskopische Untersuchung vermeiden und so wenig wie möglich starkem Lichteinfall aussetzen. 3f. Empfohlene Objektträger verwenden und gewährleisten, dass das Verfallsdatum noch nicht überschritten ist. Siehe Abschnitt Paraffineingebettete Schnitte. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 65/74

66 Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 3g. Nicht-fluoreszierendes Immersionsöl wurde mit Fluorescence Mounting Medium vermischt. 3g. Bei der Fixierung die empfohlenen großen Deckgläser verwenden. Siehe Abschnitt B.3.a oder B.3.b., Schritt 5. So wird ein Vermischen des Immersionsöls mit dem Fixiermittel vermieden, Autofluoreszenz und versehentliches Entfernen der Deckgläser mit dem Mikroskopobjektiv werden vermieden. 4. Schlechte Zellkernmorphologie oder schwache Färbung der Zellkerne. 4a. Unzulässige Vorbehandlungsbedingungen können zu Unklarheit oder Trübung führen. 4b. Das Sieden während der Vorbehandlung kann zu Morphologieschäden und zum Ausbleiben von Signalen führen. 4a. Immer die empfohlenen Vorbehandlungstemperature n und Zeiten einhalten. Siehe auch Fehlerbehebung Punkt 4b e. 4b. Sieden vermeiden. Siehe Abschnitt B.3, Schritt 1. Siehe außerdem Fehlerbehebung Punkt 4d. 4c. Falsche Pepsin-Vorbehandlung. 4c. Die empfohlenen Pepsin- Inkubationszeiten befolgen. Siehe Abschnitt B.3, Schritt 2, sowie Anhang 2. Ferner Punkte 1a, 1c, 3a, 4d und 4e der Fehlerbehebung. 4d. Eine zu lange Pepsin- Behandlung kann das Gewebe auflösen und zum Ausbleiben von Signalen führen. Eine zu starke Andauung kann zu Schattenzellen oder ringförmigen Zellen und zu einer insgesamt schlechten Zellkernmorphologie führen. 4d. Inkubationszeit mit Pepsin verkürzen. Siehe Abschnitt B.3.a oder B.3.b, Schritt 2 und Anhang 2. Die Schnittdicke muss immer 2-6 µm betragen. Siehe Punkte 1a, 1c, 4b und 4e der Fehlerbehebung. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 66/74

67 Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 4e. Eine zu kurze Pepsin- Behandlung kann zum Ausbleiben von Signalen führen. Zu schwach angedaute Gewebe können zu einer Färbung an der Peripherie des Zellkerns, zu Löchern im Zellkern (DAPI-Filter) und zur starken grünen Zytosolhintergrundanfärbung (Texas Red/FITC-Doppelfilter) führen. Es ist wichtig zu beachten dass Zellkerne im schwach angedauten Gewebe eine bessere Morphologie im Vergleich zu denen im zu stark angedauten Gewebe haben. 4e. Inkubationszeit mit Pepsin verlängern um z. B. 2 3-mal länger als die zuvor verwendete Andauungszeit. Siehe Fehlerbehebung Punkt 1a, 1c, 3a, 4a und 4d. 5. Nach der Hybridisierung haften die Deckgläser fest am Glasobjektträger und lassen sich nur schwer entfernen. 4f. Die Denaturierungstemperatur muss 82 (±2) C betragen. 4g. Unzulässige Hybridisierungsbedingungen. 5a. Deckglas schlecht auf Glasobjektträger gelegt. 4f. Immer die empfohlene Denaturierungstemperatur verwenden. 4g. Siehe Fehlerbehebung Punkt 1f und 5b. 5a. Keine Deckgläser mit Gewalt vom Objektträger trennen, wenn diese stark am Glasobjektträger haften. Objektträger fünf Minuten in Gefäß mit verdünntem Stringent Wash Buffer von Raumtemperatur tauchen und Deckgläser dann entfernen. Empfehlungen für die Anwendung von Coverslip Sealant in Abschnitt B.3.a oder B.3.b, Schritt 3 befolgen. Siehe auch Fehlerbehebung Punkt 1f und 5b. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 67/74

68 Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 6. Stark grüne Autofluoreszenz auf den Objektträgern einschließlich Bereiche ohne FFPE-Gewebe 5b. Unzulässige Hybridisierungsbedingungen. Kann zu verringerten oder keinen Signalen, Beschädigungen der Gewebe oder Hintergrundanfärbung führen. 6. Verwendung abgelaufener oder nicht empfohlener Glasobjektträger. 5b. Für ausreichende Feuchtigkeit in der Hybridisierungskammer sorgen. Den Dako Hybridizer (Code-Nr. S2450/S2451) und Feuchtigkeitskontrollstreifen für den Hybridizer (Code-Nr. S2452) verwenden. Anweisungen in der Packungsbeilage zu den Feuchtigkeitskontrollstreifen für den Hybridizer folgen. Siehe die empfohlenen Hybridisierungsbedingungen in Abschnitt B.3.a oder B.3.b, Schritt 3. Siehe auch Fehlerbehebung, Punkt 1f und 5a. 6. Gewährleisten, dass die beschichteten Glasobjektträger (Dako Silanized Slides, Code-Nr. S3003, oder Poly-L-Lysinbeschichtete Objektträger) das Verfallsdatum noch nicht überschritten haben. HINWEIS: Falls das Problem keiner der oben genannten Ursachen zugewiesen werden kann oder wenn die vorgeschlagene Maßnahme das Problem nicht behebt, bitte den technischen Kundendienst von Dako verständigen. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 68/74

69 Anhang 1 Histology FISH Accessory Kit, Code-Nr. K5799 Technische Daten des Fluoreszenzmikroskops Dako empfiehlt für Dako FISH-Sonden die Verwendung des Histology FISH Accessory Kit mit folgender Ausrüstung: 1. Mikroskoptyp Epifluoreszenzmikroskop. 2. Lampe 100-W-Quecksilberlampe (grundsätzlich alle 200 Stunden auswechseln) 3. Objektive Für die Gewebeabtastung mittels Fluoreszenzmikroskopie eignen sich Trockenobjektive mit 10-facher bzw. Immersionsobjektive mit 16-facher Vergrößerung. Für die Hochleistungsvergrößerung und Signalauswertung werden nur Immersionsobjektive mit z. B. 63-facher oder 100-facher Vergrößerung empfohlen. 4. Filter Für bestimmte Fluorochrome sind individuelle Filter entwickelt worden, die dementsprechend auszuwählen sind. Dako empfiehlt mit Dako FISH-Sonden die Verwendung eines bestimmten DAPIFilters in Verbindung mit einem hochwertigen Texas Red/FITC-Doppelfilter. DAPI-Filter, z. B. Omega Optical-Filter Nr. XF06 oder Chroma-Filter Nr Texas Red/FITC-Doppelfilter, z. B. Filter Nr. XF53 von Omega Optical oder Chroma Filter Nr Texas Red- und FITC-Einzelfilter können zur Bestätigung eingesetzt werden, z. B. Omega Optical-Filter Nr. XF102-2 bzw. XF202. Fluorochrom Anregungswellenlänge Emissionswellenlänge FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filter sind für jeden Mikroskoptyp spezifisch, und die Verwendung geeigneter Filter ist für die Auswertung von Bedeutung. Nähere Einzelheiten bitte bei Ihrem Mikroskophersteller oder Ihrer Dako-Vertretung erfragen oder der Dako-Website entnehmen. 5. Öl Nicht-fluoreszierendes Immersionsöl. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Für bestimmte Fluorochrome ist eine unterschiedliche Ausrüstung erforderlich. Für Dako FISH- Sonden wird von einer 50-W-Quecksilberlampe abgeraten, und Rhodaminfilter können nicht verwendet werden. Außerdem werden Dreifachfilter im Allgemeinen nicht empfohlen. Beim Ablesen der fluoreszierenden Signale mit einem nicht optimierten Mikroskop können Probleme auftreten. Große Bedeutung kommt der Tatsache zu, dass die Lichtquelle nicht ihren Nutzbarkeitszeitraum überschritten hat und korrekt ausgerichtet und fokussiert wurde. Kunden müssen die Herstellerempfehlungen für die Quecksilberlampe beachten und strikt einhalten; das Mikroskop ist regelmäßig zu warten. Damit eine Abschwächung der Fluoreszenz vermieden wird, ist zu gewährleisten, dass die Probe so wenig Anregungslicht als möglich ausgesetzt wird. Wir empfehlen, dass Sie vor dem Beginn der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung die Einstellung Ihres jeweiligen Mikroskops mit dem Hersteller besprechen oder sich in der einschlägigen Literatur informieren. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 69/74

70 Anhang 2 Optionaler Schritt für die Optimierung der Andauungszeit mit Pepsin Mit diesem optionalen Schritt lässt sich die Wirksamkeit der Pepsin-Andauung auswerten und die Andauungszeit in Schritt 2, Pepsin, optimieren. Um zu kontrollieren, ob die gewählte Andauungszeit mit Pepsin ausreicht, den gewaschenen, mit Pepsin angedauten Gewebeschnitt mit 10 µl vorhandenem Propidiumjodid (400 ng/ml) färben. Das Propidiumjodid mit einem Deckglas von 22 mm x 22 mm abdecken und unter dem Deckglas gleichmäßig verteilen lassen. 1 Minute inkubieren. Rotfärbung der Zellkerne mit Propidiumjodid mittels eines Fluoreszenzmikroskops mit Texas Red/FITC-Doppelfilter auswerten (siehe Anhang 1). Bei akzeptabler Gewebeandauung müssen rote Zellkerne mit klar abgegrenzten Umrissen vorhanden sein. Das Propidiumjodid durch zweimaliges Einlegen der Schnitte für jeweils 3 Minuten in verdünnten Wash Buffer bei Raumtemperatur (20 25 C) entfernen und mit B.3, Färbeprotokoll, Schritt 3, FISH-Sonde fortfahren. Weisen die Zellkerne noch immer eine grüne Färbung durch Autofluoreszenz auf und wurden durch das Propidiumjodid nicht rot gefärbt, so ist der Andauungszyklus zu wiederholen: Schnitte zweimal je 3 Minuten in verdünnten Wash Buffer von Raumtemperatur (20 25 C) einlegen, um das Propidiumjodid zu entfernen. 5 8 Tropfen (250 µl) kaltes (2 8 C) Pepsin (Behälter 2) zum Bedecken der Probe aufbringen. Pepsin-Behälter immer bei 2 8 C lagern. Objektträger bei 37 C auf einem vorgewärmten Heizblock oder auf den Dako Hybridizer legen. Falls keine oder nur eine geringe Andauung stattgefunden hat, 10 Minuten inkubieren. Bei der Angabe von 10 Minuten handelt es sich um einen Richtwert; die optimale Zeit ist vom Anwender selbst zu ermitteln. Schnitte erneut zweimal je 3 Minuten in verdünnten Wash Buffer bei Raumtemperatur (20 25 C) einlegen, um das Pepsin zu entfernen. Wiederum eine Minute lang 10 µl Propidiumjodid (400 ng/ml) einwirken lassen. Färbung auswerten und Schnitte zweimal je 3 Minuten in verdünnten Wash Buffer von Raumtemperatur (20 25 C) einlegen. Zyklus ggf. wiederholen oder mit Abschnitt B.3.a oder B.3.b, Färbeprotokoll, Schritt 3, FISH-Sonde fortfahren. HINWEIS: Der Kitinhalt ist für 20 Tests ausreichend. Werden Wash Buffer und Pepsin für diesen optionalen Schritt verwendet, vermindert sich die Gesamtzahl möglicher Tests mit dem Kit. ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 70/74

71 References/ Bibliographie/ Literatur 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem : Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem : Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol : Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol : Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol : Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Explanation of symbols/ Explications des symboles/ Erläuterung der Symbole Catalogue number Référence du catalogue Bestellnummer Temperature limitation Limites de température Zulässiger Temperaturbereich Batch code Code du lot Chargenbezeichnung Irritant Irritant Reizend In vitro diagnostic medical device Dispositif médical de diagnostic in vitro In-vitro-Diagnostikum Keep away from sunlight (consult storage section) Conserver à l écart du soleil (se reporter à la section conservation) Lichtgeschützt lagern (siehe Abschnitt zur Lagerung) Use by Utiliser jusque Verwendbar bis Extremely flammable Extrêmement inflammable Hochentzündlich Consult instructions for use Consulter les instructions d utilisation Gebrauchsanweisung beachten Contains sufficient for <n> tests Quantité suffisante pour <n> tests Inhalt ausreichend für <n> Tests Manufacturer Fabricant Hersteller Dangerous for the environment Dangereux pour l environnement Umweltgefährlich ( ) SSK5799CE_003/EFG/SVM/ p. 71/74