L3-BH01 Cours n 10 Modifications post-transcriptionnelles

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1 L3-BH01 Cours n 10 Modifications post-transcriptionnelles Ce cours est présent sur le web à l adresse suivante :

2 Plan (cours n 10 & 11) Introduction I- Maturation de l ARN messager coiffe queue poly(a) excision-épissage édition II- Maturation des ARN ribosomiaux III- Maturation des ARN de transfert IV- Stabilité des ARN messagers V- Exportation des ARN messagers Récapitulatif

3 Le flux de l information génétique DOGME CENTRAL

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6 MATURATION DES ARNm Les transcrits primaires (ARN prémessagers) ne sont que très rarement fonctionnels. Synthèse de l ARN pré-messager plusieurs modifications sont nécessaires pour former un ARNm mature codant pour une protéine. Addition de la structure coiffe Addition de la queue poly-a Epissage Edition ARNm mature

7 MATURATION DES ARNm ARNm monocistronique : ARN représentant un seul gène (plutôt rare chez les procaryotes) ARNm polycistronique : ARNm codant plusieurs protéines; renferme un cluster de gènes adjacents (forment un opéron s ils sont contrôlés comme une seule entité génétique) 2 types de régions pour tous les ARNm REGION CODANTE REGION qui précède le codon d initiation : région leader ou 5 -UTR REGION qui suit le codon stop : région trailer ou 3 -UTR 5 -UTR Région codante 1 Région intercistronique Région codante 2 3 -UTR 5 3 START STOP START STOP

8 Transcription & traduction sont étroitement liées chez les bactéries

9 Chez les eucaryotes La transcription démarre et en moins de 1 min l extrémité de l ARNm synthétisé est modifiée À la 6 ème minute, l extrémité 3 de l ARNm est coupée À la 20 ème minute, le processus d addition de la queue poly(a) est achevé À la 25 ème minute, l ARNm est exporté vers le cytoplasme En quelques heures, les ribosomes ont traduit l ARNm

10 RESUME des ETAPES conduisant des gènes aux protéines chez les procaryotes et les eucaryotes BACTERIES : transcription et traduction se produisent dans le même et unique compartiment cellulaire 2 processus qui se déroulent quasiment simultanément ARNm instable, traduit en quelques minutes. CELLULES EUCARYOTES : synthèse et maturation de l ARNm se produisent uniquement dans le noyau après exportation dans le cytoplasme, l ARNm est traduit ARNm relativement stable pouvant être traduit après plusieurs heures.

11 Maturation des ARNm eucaryotes Le transcrit primaire, l'arn pré messager doit subir des modifications pour produire l'arn messager fonctionnel.

12 Coiffe en 5

13 Extrémité 5 des ARNm eucaryotes STRUCTURE COIFFE DES ARNm Le premier nucléotide du transcrit primaire comporte un groupement triphosphate en 5'. En général, la base correspondante est une base purique (A ou G)

14 Synthèse de la coiffe suite à l initiation de la transcription par l ARN polymérase II ( ~ 20 nucléotides) 1 Élimination du phosphate γ 2 3 Méthylation du résidu G 4 Méthylation du ribose

15 Synthèse de la coiffe suite à l initiation de la transcription par l ARN polymérase II (~ 20 nucléotides) 1 Élimination du phosphate γ

16 Synthèse de la coiffe suite à l initiation de la transcription par l ARN polymérase II (~ 20 nucléotides) 1 Élimination du phosphate γ 2 Addition d un groupement GMP

17 Synthèse de la coiffe suite à l initiation de la transcription par l ARN polymérase II (~ 20 nucléotides) 1 Élimination du phosphate γ NH 2 N N COO - CH 3 N N 2 Addition d un groupement GMP HC C H 2 C H 2 S + O NH 3 + OH OH 3 Méthylation du résidu G S-Adénosyl-méthionine

18 Synthèse de la coiffe suite à l initiation de la transcription par l ARN polymérase II (~ 20 nucléotides) 1 Élimination du phosphate γ 2 Addition d un groupement GMP 3 Méthylation du résidu G 4 Méthylation du ribose Enzymes intervenant aux étapes 1, 2 et 3 : enzymes nucléaires (processus co-transcriptionnel) Enzyme de l étape 4 : enzyme cytosolique (processus post-transcriptionnel)

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20 STRUCTURE COIFFE DES ARNm FONCTIONS Impliquée : - stabilité Protège l ARNm d une dégradation enzymatique (par les nucléases cellulaires) - transport Aide l exportation de l ARNm dans le cytoplasme

21 STRUCTURE COIFFE DES ARNm Impliquée : FONCTIONS -traduction - épissage Différentes études ont montré : - les ARNm non coiffés ne sont pas traduits efficacement - des analogues de la structure coiffe constituent des inhibiteurs spécifiques de la traduction des ARNm coiffés - la présence du groupement m7g à l extrémité 5 des ARNm est nécessaire pour la liaison efficace des ARNm à la sous unité ribosomale 40S lors de l initiation de la traduction; c est le facteur eif-4e intervenant dans l initiation qui reconnaît spécifiquement la coiffe des ARNm Protéines CBP20 et CBP80 interagissent avec la coiffe(méthylation importante). Promeut l interaction entre U1snRNP et le site 5 d épissage. En absence de structure coiffe, l intron le plus près de l extrémité 5 n est pas enlevé efficacement.

22 STABILITE des ARNm coiffés STRUCTURE STABILITE TRADUCTIBILITE m 7 GpppG m 7 GpppGm GpppG Gpppm ppg pppg pppgm

23 Synthèse de la coiffe : quelques détails

24 Synthèse de l adénosylméthionine NH 2 NH 2 N N N N - O O P O - O O P O - O O P O- O O N N adénosyl transférase HC COO - C H 2 NH 3 + C H 2 CH 3 S + O N N adénylate OH OH PPi + Pi OH OH O OH C + S-Adénosyl-méthionine CH C H 2 C S CH 3 H 2 NH 2 méthionine Donneur de groupes méthyl

25 La coiffe en 5 l essentiel première modification affectant les transcrits primaires consiste en l addition d une coiffe en 5 est formée par l ajout d une guanosine avec une liaison inhabituelle 5-5, immédiatement après le début de la transcription catalysée par une enzyme nucléaire, la guanylyl transférase ajout d un groupement méthyl en position 7 par une guanine-7-méthyltransférase est impliquée dans la protection du messager contre la dégradation est impliquée dans l initiation de la traduction (la coiffe est reconnue par le facteur eif4f) est impliquée dans le transport des ARNm vers le cytoplasme chez les eucaryotes unicellulaires, seule la m7g est produite dans le cytoplasme, d autres méthylations peuvent se produire (avec une coiffe de type m2,3,7g) (méthylations additionnelles sur les 2 premiers nucléotides en position 2 du ribose)

26 Queue poly-a en 3

27 Polyadénylation : qu est-ce que c est? L extrémité 3 des ARNm est caractérisée par la présence de nombreux résidus A qui sont ajoutés post-transcriptionnellement

28 Mise en place de la queue polya présence d un signal de polyadénylation (AAUAAA) ARN pré-messager est coupé ~ 20 nucléotides en aval du signal de polyadénylation addition de ~ 200 AMPs mécanisme de synthèse complexe (~12 protéines interagissent avec CTD) presque tous les ARNm ont une queue poly(a)

29 Signal de polyadénylation la séquence AAUAAA est hautement conservée et est retrouvée pb avant le site de polyadénylation la délétion de AAUAAA élimine la polyadénylation ; des mutations de AAUAAA réduisent la polyadénylation Tous les ARNm sauf histones Fin traduction ~100 nucléotides Site de polya nucléotides Fin transcription préarnm Signal principal AAUAAA Signal secondaire 5 Riche G-U nucléotides Site de polya ~50 nucléotides

30 2 phases dans le processus de polyadénylation Initiation dépend du signal AAUAAA addition lente d au moins 10 A (oligoa) Élongation indépendante de AAUAAA dépend de l oligoa ajouté lors de l initiation addition rapide de requiert des facteurs additionnels : poly(a)-binding protein II (PAB II)

31 Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-arnm dans les cellules de mammifères

32 Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-arnm dans les cellules de mammifères (2)

33 Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-arnm dans les cellules de mammifères (3)

34 Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-arnm dans les cellules de mammifères (4)

35 Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-arnm dans les cellules de mammifères (5) Une protéine de fixation du polya se fixe sur la séquence de 12 A

36 Modèle du clivage et de la polyadénylation des pré-arnm dans les cellules de mammifères (6)

37 Complexe de polyadénylation

38 Fonctions de la queue polya Augmente la stabilité des ARNm Augmente l efficacité de la traduction Impliquée dans l épissage du dernier intron en 3 Bonus : Purification des ARNm en laboratoire Stabilité: ARNm sans queue polya sont dégradés rapidement par des ARNases Synergie entre la présence de la coiffe et de la queue polya Protéine PABI se lie à l extrémité polyadénylée et à la protéine eif4g (permet d accroître davantage la liaison aux ribosomes) Épissage est affecté par la présence de la queue polya Si l ARN est non coiffé, l intron le plus près de l extrémité 5 n est pas enlevé efficacement. Si l ARN n est pas polyadénylé, l intron le plus près de l extrémité 3 n est pas enlevé efficacement.

39 Illustration expérimentale ARNm Non coiffé ½ vie ARNm Luciférase (min) Activité Luciférase (U/mg prot.) sans poly(a) avec poly(a) (0,2%) (0,3%) Coiffé sans poly(a) avec poly(a) (4,7%)

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41 récapitulatif

42 récapitulatif

43 la polyadénylation l essentiel tous les ARNm possèdent une queue polya (sauf ceux codant les histones) se produit côté 3 de l ARNm synthèse d une queue de 200 à 250 adénosines la queue polya est liée par une protéine, la PABP (polya binding protein) ; un monomère de PABP se lie tous les 10 à 20 A produite de façon post-transcriptionnelle par un clivage endonucléolytique au site de polyadénylation ; site précédé d une séquence de reconnaissance (de séquence consensus AAUAAA) 10 à 35 pb en amont du site de polyadénylation production d une extrémité 3 -OH par clivage endonucléolytique qui sert d amorce à la polya polymérase l ext. C-ter de l ARN polii permet le recrutement des facteurs nécessaires au clivage du préarnm après le signal de polyadénylation dans le cytoplasme la queue polya est graduellement dégradée permet la purification des ARNm par chromatographie d affinité (billes couplées à un polymère d oligo d(t)).