Interprétation des résultats

Transcription

1 Plateforme de séquençage Cochin Interprétation des résultats Grace à la base de données vous avez un accès direct à vos séquences. Pour valider la qualité de ces séquences vous devez visualiser leur chromatogramme. Pour interpréter un chromatogramme, vous avez besoin de logiciels d édition téléchargeables via la partie téléchargement de la page web. Un contrôle qualité de la plaque sur laquelle se trouve votre séquence est effectué par le service. En cas de problème sur cette plaque vous serez averti par . Lorsque le chromatogramme de votre séquence ne présente pas la qualité que vous attendez, vous pouvez vous référer aux profils, ci-dessous, présentant des caractéristiques que nous avons sélectionnées. Si vous ne résolvez pas votre problème, vous pouvez nous appeler au ou envoyer un à : sequencagecochin@eurofins.com. Vous êtes également les bienvenus dans notre laboratoire. Comment interpréter un chromatogramme sur sequence scanner (logiciel d analyse en téléchargement gratuit sur le site d Applied Biosystems) Ci-dessous un chromatogramme de bonne qualité Les icônes présentes dans le coin inférieur gauche, donnent accès à certaines informations

2 En cliquant sur Sequence, vous avez accès à la séquence en format texte. Attention, les corrections effectuées sur le chromatogramme seront automatiquement effectuées sur ce fichier texte. En cliquant sur Annotation, vous aurez accès à la feuille d annotation ci-dessous. Celle-ci renferme des données qui peuvent être importantes dans l analyse de vos résultats. Dans Trace File Name : vous avez accès au numéro de la plaque sur laquelle est passée cette séquence (ici G1299) et la position de la séquence sur cette plaque (ici H02). Dans Average Raw Signal Intensity : vous avez accès aux valeurs d intensité moyenne de la séquence pour les 4 bases. Une intensité de moins de 50 points pour le G signifie que la séquence est de mauvaise qualité. En cliquant sur EPT, vous aurez accès aux données d électro injection. En cliquant sur Raw vous obtenez la séquence non analysée (donnée brute à la sortie du séquenceur).

3 Profils caractéristiques : 1) réaction de séquence en échec

4 Le chromatogramme est fortement bruité avec un mélange de pics non cohérent et une qualité faible. Il y a peu ou pas de signal lorsqu on visualise les données brutes (raw data). La séquence n est pas reconnue dans GenBank comme séquence attendue ou toute autre séquence connue. Causes possibles du problème : Cela peut venir de la pauvre qualité de l ADN, d une perte du matériel, d une trop grande quantité d ADN ou de l utilisation du mauvais primer. Pour résoudre le problème : Il est recommandé de déposer sur gel d agarose pour vérifier la pureté, ainsi que de vérifier la concentration de chaque échantillon, de même préférez une dilution fraiche du primer autant pour obtenir un produit de PCR que pour le séquençage. 2) signal faible

5 Les pics sont lisibles mais le bruit de fond est visible et devient gênant pour la bonne lecture de la séquence. Le signal brut (raw) est faible. Le signal chute et devient illisible. Cause possible du problème : Il peut y avoir trop ou pas suffisamment d ADN (plus généralement il s agit de pas assez d ADN), cela peut venir aussi d une préparation d ADN trop ancienne ou d une région difficile à séquencer, par exemple à cause d une région riche. Pour résoudre le problème : Refaire une préparation fraiche à une bonne concentration d ADN ou/et nous préciser (si vous la connaissez) la structure présente, car il sera alors peut être possible d utiliser un protocole de séquençage différent. 3) présence d un mélange de 2 signaux

6 Le chromatogramme montre au moins 2 pics au même endroit. Le deuxième pic peut avoir la même taille que le premier ou jusqu à environ 20% de sa taille. Si le deuxième pic fait moins de 20% du premier, normalement le KB attribue la base la plus forte. Le signal a une intensité normale. La séquence obtenue a beaucoup de N et n est pas reconnue comme la séquence attendue notamment lors d un assemblage dans GenBank. Cause possible du problème : Au moins 2 échantillons ou 2 primers sont présents dans la réaction de séquence. Il peut aussi y avoir au moins 2 sites d amorçage pour le primer. Pour résoudre le problème : Refaire la préparation en faisant bien attention qu il n y ait qu un produit de PCR ou qu un clone, ou changer le primer si cela est possible 4) N-1 Présence d un mélange de 2 séquences identiques décalées d une base. La plupart du temps, ce mélange est lisible car la séquence décalée a une intensité beaucoup moins forte. Il peut y avoir des N si, notamment pour le G, le signal de la séquence attendue est faible. Cause possible du problème : Cela peut venir d une dégradation du primer. Pour résoudre le problème : Faire une nouvelle dilution à partir de la solution mère. 5) Slippage

7 Mélange de séquences ayant un nombre de bases de l homopolymère qui varie. La Taq patine ce qui rend la suite de la séquence illisible. Cause possible du problème : Cela est du à la séquence en elle-même (homopolymère). Pour résoudre le problème : Utiliser un primer reverse afin de lire l autre brin ou utiliser une chimie différente. 6) Stop brutal du signal

8 Le signal correctement lisible chute brutalement. A la suite de cette chute il n y a plus de signal ou un signal très faible. Lorsqu il s agit d un produit de PCR de petite taille, cette chute brutale du signal est caractéristique de la fin, les dernières bases peuvent être difficilement lisibles car soit trop larges, soit il y a un trou, (cela correspond souvent à la région du primer permettant le séquençage de l autre brin). Cause possible du problème : Cela peut venir d un plasmide ouvert ou d une structure secondaire. Pour résoudre le problème : Vérifier par digestion que l insert est bien présent, ou faire un essai de séquençage avec un protocole différent (séquençage avec une chimie différente par exemple). 7) Chute du signal Le signal chute et devient illisible. Cause possible du problème : Cela peut venir d une concentration trop faible ou trop forte de l ADN. Pour résoudre le problème : Redoser l ADN et fournir une concentration correspondant à votre produit.

9 8) Présence d un bruit de fond La séquence est lisible mais un second signal plus ou moins faible est visible. La plupart du temps la séquence est exploitable mais cela devient gênant quand il y a une recherche de mutation ponctuelle. Cause possible du problème : Cela peut venir de la présence d une séquence contaminante en concentration plus faible. Pour résoudre le problème : Refaire la préparation de l ADN en vérifiant qu il n y ait qu un produit.