LES TECHNIQUES EN IMMUNOLOGIE

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1 LES TECHNIQUES EN IMMUNOLOGIE FICHE TECHNIQUE N 1 PLAN I/ Les Anticorps monoclonaux et anticorps polyclonaux A. Les anticorps polyclonaux B. Les anticorps monoclonaux Rappel Principe II/ Les réactions antigènes / anticorps A. Généralités B. La réaction de précipitation En milieu liquide : - Exemple du «ring test» En milieu gélifié : - Immunodiffusion double (Ouchterlony) - Immunodiffusion radiale (Mancini) - Electro-immnunodiffusion (Laurell) - Immuno-électrophorèse C. La réaction d agglutination Principe : potentiel ζ Paramètres internes et externes Agglutination active : ex système ABO Agglutination indirecte Agglutination passive Hugo MOUQUET, INSERM U519

2 I/ Les anticorps polyclonaux et monoclonaux A. Anticorps polyclonaux (sérum polyclonal, immunosérum) Un immunosérum renferme des Acp de classes et de sous-classes différentes, d affinités diverses et reconnaissent plusieurs déterminants antigéniques. Ag : de différente nature, pour les haptènes (< 3 kda) ou les peptides synthétiques (10-15 AA), ces Ag sont couplés à une protéine porteuse de haut PM («carrier») ex : BSA, thyroglobuline, hémocyanine par l action d agents de couplage ex : glutaraldéhyde (NH2, SH), carbodiimides (NH2, COOH). Voies d administration : sous-cutanée, intradermique, intramusculaire et intraveineuse. Animaux : souris, lapin, mouton, chèvre Protocoles d immunisation : Les animaux sont immunisés avec l Ag en présence d adjuvant de Freund ; complet pour la première immunisation et incomplet pour les rappels. Les durées entre les rappels varient. Les animaux sont prélevés et la réactivité des sérums est testée (ELISA, IFI, WB ). B. Anticorps monoclonaux (Milstein, ) 1. Rappel Un clone lymphocytaire B possède un programme génétique unique qui par les mécanismes de réarrangement code pour une IgG de surface (BCR) spécifique du clone B. Le BCR qui se lie aux épitopes antigéniques est identique au niveau structural à l immunoglobuline sécrétée par le plasmocyte dérivant du clone B. 2. Principe La production d Acm chez la souris ou le rat se fait par la technique d hybridation cellulaire. Elle consiste à fusionner des cellules productrices d Ac et des cellules d une lignée myélomateuse. Cette fusion conduit à la production de cellules hybrides ou hybridomes.

3 Sécréteur HGPRT + Mortel L B PEG M Myélome (immortel) Non sécréteur HGPRT - Hétéromyélome Sécréteur HGPRT + immortel HM Culture sur milieu HAT (Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine) Aminoptérine Voie de synthèse des Bases azotées Nucléotides nucléotides «de novo» HGPRT Thymidine Kinase Voie de «sauvetage» HX Thymidine II/ Les réactions antigènes / anticorps A. Généralités 2 La réaction Ag/Ac est due à l interaction 1 entre l épitope et le paratope. Le complexe (immun) Ag/Ac fait intervenir des liaisons Epitope Ag faibles ; hydrogène, électrostatiques, les 3 forces de Van der Waals et interactions Ag + Ac Ag-Ac apolaires. La constante d association K varie K = k1 / k2 entre 10 4 et L/M. K = [Ag Ac] / [Ag].[Ac] Epitope séquentiel (linéaire) / épitope conformationnel Ac Paratope

4 Ac monoclonal Sérum polyclonal (Ac polyclonaux) Si l antigène est moléculaire et soluble; les complexes Ag/Ac forment un précipité, si l antigène est particulaire ou cellulaire (bactéries, hématies, billes de latex ); les complexes immuns forment un agglutinat. B. La réaction de précipitation 1 : En milieu liquide : le test de l anneau («Ring Test») [Ac] croissantes [Ag] constante ZONE D EQUIVALENCE Paramètres physico-chimiques de la réaction : La température ; à θ=37 C, la précipitation est accélérée et à θ=0 C, la quantité de précipité est augmentée La force ionique µ ; chez les mammifères, la quantité maximale de précipité est obtenue pour [NaCl] < 0,15 M. Le ph ; la réaction est inhibée aux ph extrêmes (en dessous de 6 et au-dessus de 8,5). Effet dissociant des ph acides (élution). Les adjuvants de précipitation ; accélère la réaction ( ex : PEG).

5 2 : En milieu gélifié Gel (agar de 5 à 20 g/l en tampon PBS ph 7,2 ou d agarose) de 3-4 mm. Immunodiffusion double (Ouchterlony) Cette technique est basée sur la double diffusion Ag et Ac dans un gel en fonction de leur PM. Elle permet l analyse qualitative d un mélange d Ag en solution. IDENTITE OUI NON PARTIELLE Antigènes Ag A Ag B Ag A Ag B Ag A Ag B Ag Ac Anticorps Ac anti-a Ac anti-a Ac anti-b Ac anti-b Les Ag A et B n ont aucun déterminant antigènique commun Les Ag A et B possèdent des épitopes communs Immunodiffusion radiale (Mancini) Cette technique quantitative permet le dosage d un antigène (protéine). Protéine Gel Anticorps Diffusion selon un gradient de concentration décroissant Formation d un anneau de précipitation ; réseau Ag/Ac

6 [Ag] d 2 = a.[ag] + b Etalon 1 ; 1,5 mg/l diamétre Etalon 2 ; 3 mg/l Etalon 3 ; 6 mg/l [Ag] inconnue ;? mg/l [Protéine] (mg/l) dosage des IgG sériques Electro-immunodiffusion (Laurell) Cette technique permet d accélérer le temps de diffusion en obligeant l Ag à migrer sous l effet d un champ électrique, dans un gel contenant l Ac. Le ph du gel est choisi de façon que les Ac soient immobiles (pi des Ig) et que l Ag chargé négativement migre (blocage des NH2 ; carbamylation, formylation). «Rockets» h hauteur (h) ? Etalons [Protéine] (mg/l) La hauteur des «fusées» (lignes de précipitation) est proportionnelle à la [Ag].

7 Immuno-électrophorèse (Grabar et Williams) Cette technique renforce le pouvoir analytique des doubles diffusions en identifiant les constituants d un mélange par 2 propriétés indépendantes, leur mobilité électrophorètique et leur spécificité antigènique. 1 er tps ; un mélange d Ag est soumis à un champ électrique (de 5 à 8 V) le long duquel les constituants se répartissent en fonction de leur mobilité électrophorètique. (Tampon Véronal-Tris) 2 e tps ; un immunosérum polyspécifique diffuse dans un sens perpendiculaire à celui de la piste électrophorètique dont les fractions diffusent en sens inverse. L exploitation des résultats est basée sur celle de la technique d Ouchterlony. C. La réaction d agglutination 1 : Principe Les réactions d agglutination mettent en jeu un Ag situé à la surface d une particule de taille comprise entre le dixième et la dizaine de micron (globules rouges, globules blancs, plaquettes, spermatozoïdes, micro-organismes, billes de latex ou de sépharose). C est un phénomène complexe au cours duquel les Ac s unissent aux Ag portés par la particule formant ainsi des ponts spécifiques entre ces particules permettant leur réunion en amas.

8 2 : Le potentiel Zêta Deux forces antagonistes jouent un rôle dans l interaction des particules entre elles : - la tension interfaciale, qui tend à agréger les particules entre elles. - la force de répulsion (prédominante), à effet opposé, elle provient des charges électriques identiques des particules Pollack : _ GR _ _ ζ = σ / (D x µ) σ : charge électrique D : constante diélectrique du milieu µ : force ionique du milieu + ζ HOOC H H OH OH H HO HO O H NH 2 CH 2 OH C C H H H NANA (acide sialique) La force de répulsion est fonction du potentiel ζ (-16 mv pour [NaCl] = 0,15 M). Lorsque les Ac recouvrent les GR, l état électrique est modifié, en cela les IgM s avèrent plus efficaces. 3 : Les paramètres de réaction Les Ac ; dits agglutinants (IgM en majorité) sont capables de produire une agglutination des particules en suspension dans un milieu salin de [NaCl] = 0,15 M. dits non-agglutinants sont incapables de provoquer une agglutination dans ces conditions. Les Ag ; il existe une relation entre l agglutinabilité et : - le nombre de sites antigéniques - leur localisation

9 Les facteurs expérimentaux ; - La température, plus elle est élevée plus l agitation moléculaire est importante (augmentation de p (rencontre)). L agglutination est plus rapide à 37 C, cependant la quantité finale d Ac fixés est plus élevée à basse température (après 24 h). On distingue des Ac «chauds» et des Ac «froids». - Le ph, optimum entre 6 et 8 - La force ionique (effet quasi nul), elle contrarie l union Ag-Ac mais favorise la formation du réseau (par la diminution du potentiel ζ). 4 : Les réactions Agglutination active Elle résulte d une union spécifique entre un Ac agglutinant et un Ag appartenant en propre à la particule. Elle peut se faire en tubes, en microplaques ou sur lame et peuvent être qualitatives ou quantitatives (la dernière dilution du sérum où l on observe encore une agglutination). Sérogroupages bactériens (Salmonella, Shigella, E. coli, entérophathogènes ) Groupage sanguin ABO

10 Agglutination indirecte Elle se produit entre un Ac non agglutinant et un Ag faisant normalement partie intégrante de la particule, en faisant appel à un artifice. De façon générale, on peut obtenir une agglutination avec des Ac non agglutinants en diminuant le potentiel ζ ( σ ou D ou µ). Les techniques : 1. Ajout au MR des macromolécules qui pontent les Ac unis à des cellules voisines (par րd). ex la BSA, le Dextran, le Ficoll 2. Hydrolyse des glycoprotéines présentes à la surface des cellules par protéases (la papaïne, la fucine, la broméline, la trypsine ). Leur action permet la diminution de σ (libération de NANA), une meilleure accessibilité des Ag (mise en place de liaison hydrophobe) et une redistribution des récepteurs aux Ag. 3. Utilisation Ac anti-ac GR GR Ac anti-isotype Phénotypage Rhésus Agglutination passive Elle est réalisée entre un Ac et un Ag normalement soluble, mais rendu particulaire par fixation sur un support : 1. Les billes de latex ; l Ag est fixé par simple contact (ph 8,2) 2. Les hématies ; l Ag est fixé par simple contact, par traitement à l acide tannique, par fixation chimique (glutaraldéhyde, di-nitro chloro-benzéne ) ou par fixation immunologique (cas des Ac dirigés contre des épitopes du GR).

11 Inconvénients : - fragiles, elles s hémolysent en 3 semaines (utilisation d hématies formolées, stables plusieurs mois à 4 C) - elles portent une mosaïque d Ag recherche du facteur rhumatoïde (réaction de Waaler Rose ; IgG lapin anti-gr de mouton + GR mouton test de grossesse, détection de l hormone gonadotrophine chorionique (HGC) dans l urine ; GR recouverte d hormone mise en contact des Ac anti-hgc et l urine de la femme suspectée d être enceinte. Les [GR-HGC] et [Ac anti-hgc] sont optimums pour l agglutination. Agglutination Oui Non HGC dans l urine Non Oui Réaction Equilibre Excès d Ag non enceinte enceinte

12 FICHE TECHNIQUE N 2 PLAN Les techniques immuno-enzymatiques I/ Les techniques ELISA A. Principe B. Différentes méthodes Dosage d Ag Dosage d Ac C. Applications II/ L immuno-empreinte A. Séparation des Ag par SDS-PAGE B. Le transfert des protéines sur membrane C. La révélation immunologique III/ L immunofluorescence A. Indirecte (IFI) Principe Rappel sur la fluorescence Organigramme expérimental Applications B. Directe (IFD) IV/ La purification d immunoglobulines Méthodes chimiques, chromatographiques, physiques Purification d Ac spécifiques

13 I/ Techniques immuno-enzymatiques : les tests ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) A. Principe Elles reposent sur l utilisation d une enzyme pour déceler les complexes immuns. Les techniques ELISA sont très utilisées en : recherche fondamentale et appliquée (reconnaissance des épitopes protéiques, des haptènes) analyse médicale, pour le dosage de nombreuses substances (Ag, Ac, hormones, marqueurs tumoraux, médicaments ) Méthodes En phase homogène : La fixation de l enzyme au complexe immun modifie son activité (révélation directe). En phase hétérogène : Activité enzymatique inchangée après la fixation (besoin d une étape de séparation entre les complexes marqués et l Ag ou Ac marqués). Systèmes biologiques Ag : liquide biologique, une préparation brute ou purifiée de l Ag ou de l haptène. Ac : immunosérum total, des Ig purifiées ou des Acm (évite les réactions croisées). Phase solide et «fixation» Par adsorption passive sur du verre, du plastique, du polystyrène, latex sous forme de billes, de plaques, de tubes, de microplaques Par liaison covalente entre l Ag ou l Ac à la phase solide appropriée (cellulose activée, agarose ou acrylamide par le glutaraldéhyde). Conjugués, enzymes et substrats en phase hétérogène L agent chimique utilisé pour coupler une enzyme à un Ag ou à un Ac ne doit pas altérer l activité enzymatique ni celle du réactif immunologique. On utilise : le glutaraldéhyde, du bromure de

14 cyanogène, le carbodiimide. Besoin de séparation de l enzyme en excès par chromatographie d exclusion moléculaire. ENZYME ORIGINE SUBSTRAT Peroxydase (1) Raifort (radis noir) Diaminobenzidine, H 2 O 2 Tétraaminobenzidine, H 2 O 2 Phosphatase alcaline E. coli ou muqueuse 4-nitro-phényl-phosphate (2) intestinale de veau ß-D galactosidase (3) E. coli 2-nitro-phényl-ß-Dgalactopyrannoside (ONPG) Glucose oxydase Aspergillus niger Chromogène + H 2 O 2 Glucose 6 phosphate déshydrogénase Leuconostoc mesenteroïdes Glucose 6 phosphate + NAD + (1) : pour les dosages rapides (2) et (3): pour un grand nombre d échantillon En fonction du substrat, le produit de la réaction est mesuré par spectrophotométrie, colorimétrie (examen visuel) ou par fluorométrie. B. Différentes méthodes d ELISA en phase hétérogène 1 : Dosage des antigènes Par compétition : Vis à vis d Ac présents en quantité limitée, et fixés sur un support, il y a compétition entre l Ag à doser et l Ag marqué (de même spécificité) ajouté en quantité définie dans le même temps.

15 Méthode en «sandwich» S applique aux Ag possédant au moins 2 épitopes (identiques ou non) Réaction Ag à doser Addition du second Ac marqué Révélation de la réaction S P Ac en excès Ag à doser Ac marqué en excès Activité enzymatique liée au support (DO) Activité (DO) = k. [Ag x] [Ag x] Directe : Dosage immuno-enzymométrique ou IEMA Amplification par le système avidine-biotine (ABC) La biotine (coenzyme facile à lier aux Ig) a une très forte affinité pour l avidine (blanc d œuf) et la streptavidine (Streptomyces avidinii). L Ac biotynilé se lie sur l Ag fixé à la phase solide puis, de la streptavidine conjuguée à une enzyme se lie à la biotine (complexe ternaire). Avidine Biotine

16 2 : Dosage des anticorps Indirecte avec Ag marqué Réaction Ag / Ac Addition de l Ag marqué Révélation de la réaction S P Ag en excès Ac à doser Ag marqué en excès Activité enzymatique liée au support (DO) Activité (DO) = k. [Ac] [Ac x] Indirecte avec Ac secondaire marqué Puits négatif Puits positif

17 Activité enzymatique liée au support (DO) Activité (DO) = k. [Ac] [Ac] Protocole expérimental en TP Un seuil de positivité est déterminé par un index calculé à partir des DO de témoins connus (moyenne DO sujets sains σ pour ex). C. Applications Dosage des protéines : la ß2m, drogues, hormones (insuline, glucacon ), médicaments, enzymes (énolase, lipase ), les facteurs rhumatoïdes, vitamines, IgE Diagnostic sérologique : parasitaire, bactériologique par titrage d anticorps (Brucella, Salmonelle, Treponema ), virologique (HIV, rubéole, hépatite A-B, varicelle, herpés, grippe ) Maladies auto-immunes : recherche et dosage des FR, des Ac anti-adn, anti-histones, anti-dsg1/3

18 II/ L immuno-empreinte (immunotransfert ou «western blot») Cette technique combine le pouvoir de séparation de l électrophorèse et la grande sensibilité de l immunodétection, ce qui en fait un outil performant pour l identification d un Ag ou d un Ac. A. Séparation des Ag par SDS-PAGE Les protéines d un extrait tissulaire ou cellulaire ou des protéines recombinantes dénaturées et chargées négativement, migrent dans un gel d acrylamide / bis-acrylamide (de teneur x %) sous l action d un champ électrique. Elles sont séparées en fonction de leur PM. Solution de dépôt des échantillons : Solution de Laëmmli (Tris 0,5 M ph 6,8, glycérol 20%, SDS 40%, Bleu de bromophénol 0,009%, DTT 10%) A Protéine native S S B SDS Dithiotreïtol 100 C, 3 minutes A Fragments polypeptidiques B CH2 SH HC OH HC OH CH2 SH CH3 (CH2)11 SO3 - Na+ SDS DTT B A 120 V t = 2 h La migration achevée, le gel peut être colorée s il ne constitue pas SDS-PAGE la première étape du WB : Bleu de Coomassie (0,2 à 0,5 µg de protéine / piste), nitrate d argent (0,01 à 0,05 µg de protéine / piste)

19 B. Le transfert des protéines sur membrane Les protéines contenues dans le gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF sous l action d un champ électrique. ANODE Temps de transfert : 2 h (à 18 h), voltage 30 V (à 60 V) Coussins absorbants Papiers buvards Membrane de nitrocellulose Gel de polyacrylamide Papiers buvards Coussins absorbants Le tampon de transfert contient du méthanol qui augmente la capacité de la NC à absorber les protéines, et empêche le gel de gonfler CATHODE A la suite du transfert, la membrane qui contient les protéines peut être colorée à l aide de rouge Ponceau puis est décolorée avec de l acide acétique 5% et enfin séchée. 35,3-kDa 28,2-kDa 20,8-kDa Marqueur

20 C. La révélation immunologique 1/ Principe Second Ac H 2 O 2 Peroxydase Luminol oxydé Protéine Premier Ac (Sérum) Forme oxydée de l'enzyme + Luminol + Activateur LUMIERE Membrane NC Film photographique Figure. Principe de la révélation immunologique par ECL Les protéines transférées sur membrane de NC sont incubées avec des immunosérums ou des Ac. Les protéines ayant formé des complexes Ag /Ac réagissent ensuite avec des Ac (de chèvre) dirigés contre les IgG de l espèce d origine du sérum testé. Ces Ac secondaires sont couplés à la peroxydase (ou à la phosphatase alcaline). La peroxydase oxyde le luminol qui va émettre de la lumière permettant la révélation autoradiographique des complexes. 2/ Organigramme du protocole expérimental (TP) Découpage de la membrane en bandelettes Saturation dans du tampon TBS, Tween 0,05%, 5% lait Lavages dans du tampon TBST Incubation avec le(s) sérum(s) ou les Ac dilués dans du tampon TBS, Tween 0,05%, 5% lait Lavages dans du tampon TBST

21 Incubation avec les Ac secondaires (conjugués à une enzyme ; peroxydase ou phosphatase alcaline) dilués dans du tampon TBS, Tween 0,05%, 5% lait Lavages dans du tampon TBST Révélation ECL ou colorimétrique Analyse des résultats O O N H N H H2O2 Peroxydase O - O - + N2 + Lumière N H 2 O N H 2 O Figure. Principe de la chimioluminescence. La chimioluminescence est basée sur une émission de lumière provoquée par la dissipation de l'énergie d'une molécule qui se trouve dans un état excité par une réaction chimique. L oxydation du luminol est catalysée par le système HRP (horseradish peroxydase) / peroxyde d'hydrogène en conditions alcalines, celle-ci provoque l excitation du luminol qui va retourner à son état fondamental en émettant de la lumière. Ex : révélation colorimétrique SDS-PAGE 4% Extrait de peau 160 kda

22 III/ L immunofluorescence L immunofluorescence classique permet de déceler une réaction Ag / Ac sur des cellules en suspension, des frottis cellulaires, des microorganismes ou des coupes d organe. A. Indirecte (IFI) 1/ Principe Second Ac - FITC Premier Ac (Sérum) FLUORESCENCE Coupe tissulaire Microscope à fluorescence 2/ Rappel sur la fluorescence Luminescence : phénomène défini comme une radiation émise par un atome ou une molécule après l absorption d énergie qui l a conduit dans un état excité. λexcitation < λémission I Eémission < Eexcitation Spectre d absorption = ensemble des e- dans leur état excité. Le spectre d émission des fluorochromes est dans le visible. Fluorochromes : FITC : dérivé de la fluorescéine (λémission = 520 nm, couleur verte). Rhodamine et ses dérivés, utilisé en général pour le double marquage, donne une fluorescence rouge-orangée. Absorption Emission λ (nm)

23 Rq :Système amplificateur avidine / biotine Microscope à fluorescence : A lumière réfléchie A lumière transmise Lampes à vapeur d halogène ou de mercure Système d acquisition : appareil photos, caméra 3/ Organigramme du protocole expérimental Incubation des coupes (3-4 µm) fixées sur lame avec le sérum ou l Ac dilué dans du tampon PBS (1 h) Lavages dans du tampon PBS Incubation des complexes avec les Ac secondaires dilués dans du tampon PBS (30 min) Lavages dans du tampon PBS Montage entre lame et lamelle puis observation au microscope 4/ Applications Auto-immunité : détection des Ac anti-nucléaire, anti-organites ou Ac spécifiques d organe. Anti-ADN natif, dénaturé, anti-histones, etc. HepG2 Anti-Dsg1 Epiderme humain

24 Microbiologie : bactériologie, virologie (cinétique de multiplication de virus, détection de virus responsable d infection respiratoire) B. Directe (IFD) Méthode en «un temps», l Ag est recherché directement par l Ac spécifique marqué. Recherche des dépôts d Ig ou de complément dans les tissus. IV/ La purification d Immunoglobulines 1. Méthodes chimiques Par relargage des sels par précipitation au sulfate d ammonium en concentration quasi saturante. Par précipitation à l éthanol, les Ig précipitent entre 12 et 20% d EthOH. 2. Méthodes chromatographiques Echangeuse d ions, par ex fractionnement sur résine basique type diéthylaminoéthyl (DEAE cellulose), présence des Ig dans le 1 er pic d élution à 99,5 % de pureté. Affinité, sur colonne de protéine A (protéine de paroi de 90% des S. aureus, capable de fixer le fragment Fc des Ig) ou de protéine G (Steptococcus). Exclusion moléculaire (gel filtration, tamis moléculaire), sur Séphadex 150 (limite d exclusion 200 kda) pour fractionner les Ig (150 kda), sur Sépharose 4B (limite d exclusion 4000 kda) pour fractionner IgM (970 kda) HPLC, fractionnement d un sérum en 30 min 3. Ultracentrifugation Centrifugation du sérum à g pendant 18 h sur gradient de saccharose, IgM dans les premières fractions (19 S) puis les Ig (8 S à 6,6 S).

25 4. Purification d Ac spécifiques On récupère l Ac spécifique lié à l Ag fixé sur un support par : Fixation-élution sur l Ag immobilisé sur membrane de nitrocellulose Chromatographie d affinité, utilisant des billes de sépharose ou d agarose (activées par le bromure de cyanogène) couplées à l Ag ou à haptène. Cette méthode peut être appliquée à l isolement d un Ag (résine couplée à l Ac spécifique). Rq : les solutions d élution sont acides (ph proche de 2,5), il est donc nécessaire de neutraliser le ph du milieu rapidement.

26 FICHE TECHNIQUE N 3 PLAN I/ Immunocriblage de banque d expression d ADNc A. Principe B. Protocole expérimental de criblage C. Application à la recherche de nouveaux auto-antigènes II/ Analyses protéomiques A. Le protéome B. Méthodologie 1 : L électrophorèse bidimensionnelle 2 : La révélation et l analyse d image 3 : Limites des 2 premières étapes 4 : Identification et caractérisation des protéines La spectrométrie de masse C. Application de l analyse protéomique ( ciblée )

27 I/ Immunocriblage de banque d expression d ADNc A. Principe BANQUE CRIBLAGE IDENTIFICATION Extraction des ARNm (à partir de tissus ou de culture cellulaire spécifique) Réverse transcription en ADNc Clonage dans un vecteur (phage ou phagémide) Transfection dans E. Coli Expression des protéines à la surface des phages Immunocriblage avec des immunosérums / Ac Isolement du clone bactérien exprimant la protéine immunoréactive Amplification et conservation du clone d intérêts PCR sur colonie Purification et séquençage de l ADNc Comparaison aux banques de données (Genebank, EMBL, DDBJ ) et identification de la protéine immunoréactive

28 B. Protocole expérimental du criblage Bactéries + phages Incubation 4 h à 42 C Incubation 4 h à 37 C Boîte de Pétri Filtre de nitrocellulose imprégné d IPTG (expression de l ADNc de chaque phage) Révélation des filtres en immuno-empreinte Prélèvement du spot correspondant sur la boîte de Pétri 1 tache positive (IPTG: isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside) Immunocriblage d une banque d expression d ADNc de kératinocytes avec le surnageant contenant l acm F12 (Pemphigus vulgaire). 7 colonies d un clone positif / 50 plages de lyse

29 C. Application à la recherche de nouveaux auto-antigènes Dans la Polyarthrite rumatoïde (PR), identification d une protéine proche de la follistatine, auto-ag chez 44% des patients (Tanaka et al) De même dans la PR, une autre cible des auto-ac présents chez 57% des malades est la calpastatine (Mimori et al) Au cours du Lupus érythémateux disséminé, 2 nouvelles protéines de la régulation transcriptionnelle, DEK et ALY, ont étés mises en évidence Le criblage d une banque de kératinocyte avec des Ac purifiés à partir de sérum de patients atteints de Pemphigus vulgaire (PV), a permis d identifier la Desmogléine 3, à l heure actuelle un véritable marqueur diagnostic de la maladie (Amagaï et al) Récemment, la pemphaxine a été cité comme un nouvel auto-ag au cours du PV.

30 II/ L analyse protéomique Objet et évolution méthodologique de l analyse protéomique, S. Thébault. M/S mai 2001, (17). A. Le protéome Il est défini (1995) comme la totalité de la partie protéique exprimée dans une cellule, un tissu, ou un organisme donnée (dans une situation donnée ; physiologique, pathologique ). C est un moyen de décodage de l expression protéique des génes et des mécanismes contrôlant cette expression. Pourquoi? Les niveaux d expression protéique ne sont pas le reflet des niveaux d expression des ARNm, les protéines peuvent être modifier (maturation co- et post-traductionnelle) et le protéome est dynamique! B. Méthodologie 3 étapes : - séparation des protéines de l échantillon biologique par électrophorèse bidimensionnelle (E-2D). - le traitement et la mise en image pour établir une carte protéique. - la caractérisation des protéines par spectrométrie de masse. 1: L électrophorèse bidimensionnelle Elle combine 2 séparations des protéines selon 2 critéres indépendants le pi et la masse (pouvoir de résolution très élevé de E- 2D). Elle est trés reproductible, a un haut pouvoir de résolution et posséde un caractère préparatif. La solubilisation des protéines: Action synergique d agents : - chaotropes (urée, thiourée) - détergents (CHAPS, sulfobétaïne) - réducteurs (DTT)

31 La première dimension, la focalisation isoélectrique (IEF) Elle permet la séparation des protéines selon leur pi. La migration est réalisée dans un gel de poly-acrylamide à gradient de ph préformé (ph 3-10) sur un support plastique qui constitue une bandelette GPIS. Réhydratation des bandelettes GPIS en contact avec la solution de lyse-solubilisation contenant l échantillon protéique à étudier (dans un sarcophage de réhydratation). tmin = 10 h Séparation des protéines selon leur pi : appareillage de migration pour l IEF (les conditions électrophorètiques comportent 3 phases : 1 h 30 à 500 V, 1 h 30 à 1000 V et 6 h à 8000 V). Equilibrage des bandelettes GPIS, cette étape fondamentale permet aux protéines de sortir du gel de 1 er dimension et de s insérer dans le gel de la 2 nd dimension. La deuxième dimension, l électrophorèse SDS-PAGE Elle permet la séparation des protéines selon leur masse. Des gels de poly-acrylamide de grande taille et de porosité en gradient (8%- 16% par ex) sont utilisés. Les bandelettes sont insérés dans de l agarose liquide (+ SDS) coulé au-dessus du gel de 2 nd dimension. Une fois l agarose gélifier, le gel est placé dans la cuve de 2 nd dimension et est soumis à un ampérage max de 40 ma et un voltage max de 500 V duant 5 h à T < 10 C. 2: La révélation et l analyse d image Méthodes de mise en image : coloration spécifique des protéines (bleu de Coomassie colloïdal, argent...) détection par fluorescence (Sypro orange, Sypro rubis ) par chimioluminescence, révélation immunochimique (Western Blot), marquage radioisotopique

32 Plasma SWISS 2D-PAGE Technologies de détection et de digitalisation: impression de plaques photographiques imager caméra CCD densitomètre Laser 3 : Limites des 2 premières étapes le caractére hydrophobe et insoluble de certaines protéines la variabilité d expression des protéines les PM > Da ou les PM < 7000 Da ainsi que certains pi difficultés dans l analyse et le traitement informatisés des cartes protéiques.

33 4 : Identification et caractérisation des protéines L analyse protéomique peut présenter des études de caractérisation structurale des protéines ; certaines modifications post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation, méthylation, hydroxylation, formation de ponts di-sulfures, sulfatation ) et mutations ponctuelles (due au polymorphisme protéique) sont décelées sur les cartes (car elles modifient la charge ou la masse de la protéine considérée). Application de la spectrométrie de masse (SM) à l identification des protéines 2 grandes avancés à la base de l identification : - le séquençage du génome (bio-informatique, banques ) - adaptation de la SM à l analyse de polyméres biologiques (capable de détecter des différences de masse de 0,1 Da) Système d ionisation MALDI (matrix assisted-laser desorption/ionization) : La protéine co-cristallisée avec une matrice absorbant les photons, est bombardée avec un rayon laser ; la matrice transmet l énergie transportée par le laser en énergie d éxitation pour l échantillon et ce mécanisme s accompagne de transfert de protons. Protéine ions monochargés (M + H) + ou (M + H) - L analyseur est responsable de la séparation des ions gazeux formés dans la source ionisation (type ToF, quadrupôle, secteurmagnétique, ou trappe à ions). Il sépare les ions sur la base de leur rapport m / z. La spectrométrie de masse en tandem SM/SM (Q-ToF) 2 analyseurs séparés par une chambre de fragmentation (CID, collision-induced dissociation).

34 Source d ionisation ESI Chambre de collision 1 er analyseur 2 ème analyseur Quadrupole ToF détecteur accélérateur Aiguille de l électrospray réflecteur Les appareils les plus souvent utilisés sont : Le MALDI-ToF pour l identification des protéines Les tandem SM/SM avec notamment le quadrupole-orthogonal time of flight (Q-ToF) et la trappe à ion pour le séquençage des peptides et leur caractérisation structurale. La stratégie d identification des tâches protéiques consiste, à analyser par SM les fragments peptidiques obtenus après excision et digestion (par la trypsine le plus souvent) d une tâche protéique. Le spectre de masse ( empreinte digitale de la protéine) obtenu par MALDI-ToF est comparé (outil informatique MS-FIT) aux spectres de masse virtuels de protéine dont le géne est caractérisé et qui sont disponibles dans les banques de données spécialisées sur internet (SWISS-PROT par ex).