Imagerie du petit animal. ******** Un exemple d imagerie moléculaire

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1 Imagerie du petit animal ******** Un exemple d imagerie moléculaire Pr Pierre-Olivier Kotzki Certificat optionnel: Imagerie métabolique et moléculaire

2 I- La transgénèse Addition d'un gène étranger, appelé transgène, L'organisme ou la cellule vivante qui reçoit l'adn étranger réagit en fonction de l'information génétique qui lui est transmise, par exemple en fabriquant une protéine non synthétisée naturellement. Comme toute manipulation génétique, la transgenèse nécessite la mise en oeuvre d'une succession d'outils et de techniques de biologie moléculaire complexes. Gènes thérapeutiques : - maladies héréditaires - infection - oncologie - maladies dégénératives

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4 Etapes - Repérer un caractère intéressant dans un organisme vivant : Examen du génome - Identifier la protéine responsable de ce caractère - Identifier et isoler le gène d'intérêt - Insertion d'un fragment d'adn (transgène) dans un plasmide - Transduction ou Transfection : Introduction du plasmide modifié dans le génome de la cellule hôte : - Transcription : transformation de l ADN étranger en ARN et synthèse protéique Contrôler l'efficacité et l expression du transfert chez l'hôte : Contrôle par imagerie : gène rapporteur

5 Plasmides : Petites molécules d'adn circulaires distinctes du chromosome bactérien. Réplication indépendante Plasmide

6 Transgène : plasmide + gène d intérêt (thérapeutique) Promoteur Induit la transcription Facilitateur Régule la transcription Plasmide Gène d intérêt

7 Gène rapporteur : gène différent du gène d intérêt non présent dans la cellule transfectée produisant une protéine facilement identifiée : imagerie Promoteur Facilitateur Gène rapporteur Gène d intérêt

8 Différents modes de transduction : - injection intra-tissulaire directe : peu efficace - liposomes : membrane biologique capable de fixer la l ADN pouvant s absorber sur la membrane cellulaire Lipoplexe : injection intra-tissulaire

9 Différents modes de transduction : - vecteurs biologiques bactériens et surtout viraux - rétrovirus - adénovirus - herpes virus - blocage de la réplication virale et infection de la cellule par le virus : expression des gènes du virus sf réplication, du gène thérapeutique et du gène rapporteur injection intra-tissulaire ou IV

10 - Incorporation dans le génome cellulaire du transgène

11 - Cas particulier : greffe d un gène inducteur de cancer chez la souris Séquence stop rend le gène inducteur silencieux Gène rapporteur Gène de coupure inhibe la séquence stop en Présence d une enzyme Gène inducteur

12 II- Imagerie de la transgenèse Principe : - visualisation in-vivo des effets du gène rapporteur - témoin de l incorporation et de l expression du gène d intérêt (thérapeutique) Méthodes : - Fluorescence: détection d une protéine fluorescente - Bioluminescence : détection d une protéine émettrice de lumière visible (luciférase) - SPECT ou TEP : - prodrogue radiomarquée - ligand radiomarqué d un récepteur cellulaire

13 II- 1 Fluorescence

14 II-1- Fluorescence

15 Gène rapporteur = gène d une protéine fluorescente Gène Fluorescent Protéine 3 types : Green Fluorescent Protein Red Fluorescent Protein Yellow Fluorescent Protein Protéine d intérêt Plasmide Gène d intérêt Transduction Transcription ARNm protéine Fluorescent Protéine Fluorescent Protéine Traduction

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19 II- 2 Bioluminescence gène rapporteur : gène de la luciférase Transcription : synthèse de luciférase qui en présence de Luciférine (colentézarine) induit l émission de lumière visible ( nm)

20 Plasmide Gène d intérêt Gène Luciférase Injection de colentézarine Colentézarine Protéine d intérêt Colentézarine Transduction Transcription ARNm luciférase Lumière Luciférase Traduction

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22 D G Injection de cellules tumorales dans les 2 épaules: - Epaule G : gène tumoral seul - Epaule D : gène tumoral et gène de la luciférase Evolution de la bioluminescence après injection de luciférine-colentézarine

23 II-3-Tomographie Emission de Positons a- prodrogue radiomarquée (analogues de nucléosides) - Plasmide Promoteur Facilitateur Gène rapporteur Thymidine kinase du virus Herpes Simplex V1 HSV1-tk Gène d intérêt

24 -Expression de la thymidine kinase du virus Herpes Simplex V1 (HSV1-tk): - Phosphorylation d une prodrogue radiomarquée administrée après la transgenèse - Accumulation de la prodrogue phosphorylée dans les cellules transfectées - Détection in-vivo par TEP de la radioactivité présente dans les cellules transfectées - Exemples de prodrogues radiomarquées : - Dérivés de la guanosine - 18 F-Fluoroganciclovir - 18 F-FHPG - 18 F-FHBG - Dérivés de l uracile: I-FIAU - 18 F-FMAU

25 Gène d intérêt Plasmide Gène HSV1-tk rapporteur Transduction 18 F-prodrogue Protéine d intérêt 18 F-prodrogue Phosphorylation Transcription 18 F-prodrogue -PO 4 ARNm HSV1-tk HSV1 Thymidine Kinase Traduction

26 II-3-Tomographie Emission de Positons b- ligand radiomarqué d un récepteur cellulaire - Plasmide Promoteur Facilitateur Gène rapporteur d un récepteur cellulaire Gène d intérêt

27 -Expression de la synthèse des récepteurs : - Formation de récepteur protéique sur la membrane cytoplasmique des cellules transfectées - Fixation sur les récepteurs de ligands radiomarqués - Détection in-vivo par TEP de la radioactivité présente sur les récepteurs des cellules transfectées - Exemple de systèmes récepteur-ligand radiomarqués : - Récepteur Dopamine D2 et - 11 C-raclopride I-IBZM - 18 F-FluoroEthylSpiPérone

28 Gène d intérêt Plasmide Gène du récepteur rapporteur 18 F-ligand Protéine d intérêt Transduction Transcription ARNm récepteur Récepteurs Traduction

29 SPECT Emetteurs β + : 11 C, 15 O, 18 F, 13 N, 82 Rb PET Période très courte (s, mn) sauf le 18 F et 82 Rb

30 Prodrogue Ligand récepteur D2

31 II-4-Détection associant plusieurs méthodes Ray et al Cancer Research.

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33 Ray et al Cancer Research.

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36 III- Autre applications : III-1 -Thérapie cellulaire La thérapie cellulaire consiste à remplacer des cellules anormales ou disparues par des cellules saines (greffon): - prélevés chez un donneur sain = greffe allogénique - prélevé à partir du patient ou de l animal lui-même : greffe autologue. Le greffon est ensuite réinjecté chez le patient ou l animal et peut subir au préalable une manipulation en laboratoire (sélection ou déplétion de certaines populations cellulaires). Perspectives : traitement de certains cancers (sang, foie ), du diabète, des maladies liées à la dégénérescence (Alzheimer, Parkinson ), des brûlures et maladies de peau

37 Transplantation intracardiaque de cardiomyoblastes embryonnaires exprimant HSV1-tk (PET) Contrôle = pas de gène rapporteur Wu et al., 2007

38 Transplantation intracardiaque de cardiomyoblastes embryonnaires exprimant la luciférase (bioluminescence) Contrôle = pas de gène rapporteur Wu et al., 2007

39 III- Autre applications : III-2 Imagerie fonctionnelle et effet pharmacologique Objectif : exploration des fonctions physiologiques lors de la mise au point de molécules thérapeutiques micro-pet animal

40 Métabolisme osseux au 18 F-Fluorure

41 18 F-Fluoro-Deoxy-Glucose : Métabolisme du glucose Analogue du glucose Traceur du métabolisme glucidique Accumulation par impasse métabolique Spécificité liée à la différence de métabolisme entre tissu sain et pathologique Une tumeur fixera le 18F-FDG indépendamment de son type histologique, mais d autant plus qu elle sera agressive, à croissance rapide et +/- différenciée

42 Métabolisme du glucose

43 Métabolisme cardiaque

44 Métabolisme cérébral 18 FDG Cerveau Singe

45 SPECT-CT

46 111 In-AC monoclonal

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48 125 Iomazenil

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