DÉVELOPPEMENT D'UN MODÈLE DE CICATRISATION ÉPIDERMIQUE APRÈS UNE DÉSÉPIDERMISATION LASER

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1 UNIVERSITÉ TOULOUSE III - PAUL SABATIER TOULOUSE U.F.R MÉDECINE THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ TOULOUSE III Discipline: Ingénierie Médicale et Biologique Par M. younes FERRAQ TITRE DE LA THÈSE: DÉVELOPPEMENT D'UN MODÈLE DE CICATRISATION ÉPIDERMIQUE APRÈS UNE DÉSÉPIDERMISATION LASER Directeur de thèse: Professeur Jean-Louis GROLLEAU JURY Président Jean Louis GROLLEAU professeur des Universités & praticien Rapporteurs Hassan ZAHOUANI professeur des Universités, UMR 5513 Dominique CASANOVA PH PU, Hôpital Nord, Marseille Examinateurs Serge MORDON Directeur de recherche, INSERM- Lille Jean-Pierre CHAVOIN PH PU Membre invité Anne Marie SCHMITT Dermatologue David BLACK Docteur, IRPF/I2C

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3 REMERCIEMENTS Je tiens d'abord à remercier le professeur Jean-Louis GROLLEAU, pour avoir accepter de diriger cette thèse, au sein du laboratoire d'anthropobiologie, sous la direction de Monsieur Eric CRUBEZY. De la même manière que je remercie le Dr Anne-Marie SCHMITT pour m'avoir accueilli au sein du Centre européen de Recherche sur la peau [Institut de Recherche Pierre Fabre], dans l'équipe d'ingénierie cutanée, et tout particulièrement M. Jean- Michel LAGARDE et le Dr David BLACK, pour m'avoir accueilli à leurs côtés, pour la confiance qu'ils m'ont accordé, pour leur enthousiasme et leur plaisir à partager leurs connaissances. Je remercie également le Pr. Serge MORDON et le Dr Serge DAHAN pour leurs aides précieuses, ainsi que G.JOSSE, G.GEORGE et N.DZIK pour leur disponibilité et leurs conseils avisés. Je suis très sensible à l honneur que m ont fait Messieurs Hassan ZAHOUANI, professeur à l'école Centrale de Lyon, le professeur Dominique CASANOVA dermatologue à l'hôpital Nord Marseille, en acceptant d être rapporteurs de ce travail et de le juger. J adresse mes remerciements à Monsieur Serge MORDON, Directeur de recherche dans une unité de recherche INSERM, d avoir accepté de faire partie de mon jury de thèse. Je remercie également les personnes du laboratoire avec qui j ai travaillé, pour la contribution qu ils ont apportée à mon travail de doctorat et spécialement le Dr J.Theunis, les membres du laboratoire de biologie cellulaire et du laboratoire de la biochimie cutanée du centre Jean Louis Alibert. Sans oublier le personnel et les étudiants du laboratoire de neuro-gastroentérologie et nutrition à l'inra-toulouse. Je tiens à remercier tous mes collègues du laboratoire et très spécialement M. Jean Louis FRERE et Madame Sabine PUTAU pour leur bonne humeur. Je n oublie pas dans mes remerciements tout le personnel du CRP (Chercheurs, Techniciens, Secrétaires) que j ai côtoyé et qui ont facilité mon intégration au sein du groupe

4 Ce manuscrit étant, pour ainsi dire, le point final à de nombreuses années d études, c est ici l occasion de remercier les deux personnes sans lesquelles ce travail n'aurai pas pu être réaliser: Mes Parents qui ont toujours étés là pour moi et qui ont su m encourager dans mes choix. Sans oublier Ma Pharmacienne, et Mon Informaticien "Privés", qui ont su me soutenir dans mon travail

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6 TABLE DES MATIERES LISTE DES ABRÉVIATIONS CONTEXTE CHAPITRE I: INTRODUCTION I. LA PEAU I.A. Généralités I.B. Structure de la peau I.B.1. L'épiderme I.B.2. Le derme I.B.3. L'hypoderme I.C. Vascularisation de la peau I.D. Innervation de la peau I.E. Annexes Cutanées II. LA CICATRISATION CUTANÉE II.A. La cicatrisation normale II.A.1. phase inflammation & formation de caillot II.A.2. Phase de prolifération II.A.3. Phase de remodelage II.B. La cicatrisation pathologique II.C. cicatrisation: Méthode d'étude II.C.1. Les lésions non-contrôlées: traumatique et patho-logiques II.C.2. Lésions contrôlées: expérimentales induites II.D. Techniques d'évaluation de la cicatrisation III. LASER III.A. Généralité III.B. Notions de base III.C. Les laser: différents types III.D. Domaines d'applications III.E. Laser médicaux III.E.1. Interaction lumière-tissu III.E.2. Lasers en dérmatologie III.F. Interet de l'outil laser IV. OBJECTIFS DE LA THÈSE

7 CHAPITRE II: MESURE DE L'ÉPAISSEUR DE L'ÉPIDERME IN VIVO I. INTRODUCTION & OBJECTIFS: II. MATÉRIELS ET MÉTHODES II.A. Modèles de peau utilises II.B. Évaluation Histologique de l'épiderme II.C. Évaluation de l'épiderme par tomographie à cohérence optique III. RÉSULTATS III.A. Comparaison qualitative entre histologie et oct: structure de la peau III.B. Comparaison quantitative de l'épaisseur de l'épiderme: histologie et oct IV. DISCUSSION & CONCLUSION CHAPITRE III: PROFONDEUR D'ACTION DU LASER EN FONCTION DE LA FLUENCE APPLIQUÉE I. INTRODUCTION ET OBJECTIFS II. PARTIE 1: PEAU HUMAINE EX VIVO II.A. Matériels et méthodes II.A.1. Modèle de peau II.A.2. Ablation laser II.A.3. Évaluation topographique de la profondeur d'ablation II.B. RÉSULTATS III. PARTIE 2: PEAU DES RATS HAIRLESS IN VIVO III.A. Matériels et méthodes III.A.1. Modèle de peau III.A.2. Ablation laser III.A.3. Évaluation Topographique de la profondeur d'ablation III.A.4. Évaluation Histologique III.A.5. Déroulement de l'étude III.B. RÉSULTATS III.B.1. Évaluation Topographique III.B.2. Évaluation Histologique IV. DISCUSSION & CONCLUSION CHAPITRE IV: VALIDATION DE LA TECHNIQUE D'INDUCTION DES LÉSIONS CHEZ L'ANIMAL

8 I. INTRODUCTION II. PARTIE 1: LASER ER:YAG MONO-SPOT II.A. objectif II.B. MATÉRIELS ET MÉTHODES II.B.1. Protocole d'étude II.B.2. Modèle animal utilisé II.B.3. Laser utilisé II.B.4. Évaluation et analyse des lésions par imagerie 3D II.B.5. Évaluation de la fonction barrière (PIE) II.B.6. évaluation histologique II.C. RÉSULTATS II.C.1. Analyse des lésions induites II.C.2. Cinétique du rétablissement de la fonction barrière: III. PARTIE 2: LASER ER:YAG À BALAYAGE III.A. Contexte et objectifs III.B. Matériel et méthodes III.B.1. Réglage du système de balayage (sur papier) III.B.2. Application sur modèle animal III.C. RÉSULTATS IV. DISCUSSION CONCLUSIONS : CHAPITRE V: VALIDATION DE LA TECHNIQUE D'INDUCTION DE LÉSION CHEZ L'HOMME I. INTRODUCTION II. MATÉRIELS ET MÉTHODES III. RÉSULTATS III.A. QUALITÉ D'INDUCTION DES LÉSIONS III.A.1. Observation clinique: Photographie calibrée III.A.2. Évaluation des reliefs de la lésion par empreintes 3D & histologique: III.B. QUALITÉ DU RÉTABLISSEMENT DE LA FONCTION BARRIÈRE IV. DISCUSSION & CONCLUSION CONCLUSION GENERALE

9 BIBLIOGRAPHIE ANNEXE

10 Liste des annexes Annexe 1: Illustration des différents types cellulaires de la peau, avec ses différentes couches. (1) SC, (2) le stratum compactum, (3) la couche épineuse, (4) la couche granuleuse et (5) la couche Basale. Annexe 2: Différents types de laser utilisés en dermatologie. Annexe 3: Valeurs mesurées des épaisseurs de l'épiderme séparé thermiquement. Annexe 4: Fluences appliquées en fonction des paramètres du faisceau laser utilisée Annexe 5: Protocole et paramètres d'acquisition des images par technique de projection de frange.(protocole EoTech.) Annexe 6: Valeurs mesurées des épaisseurs de l'épiderme de peau entière Annexe 7: Protocole de réalisation et de coloration de coupes histologiques (inclusion en paraffine). Annexe 8: Valeurs des profondeurs de trois lésions réalisées au moyen de 10, 50 et 200J/cm². Annexe 9: Valeurs mesurées des différentes profondeurs réalisées par 10, 20, 30, 40 et 50 J/cm² Annexe 10: Valeurs mesurées des différentes lésions induites chez des rats Hairless. Étude de reproductibilité de l'induction des lésions (fluence=20j/cm²). Annexe 11: Valeurs mesurées des différentes lésions induites chez des rats Hairless. Étude de reproductibilité de l'induction des lésions (fluence=100j/cm²). Annexe 12: Valeurs mesurées de la PIE en fonction du temps. Annexe 13: Protocole comité de l'étude clinique de validation du laser Er:YAG. Annexe 14: Prototype de la pompe utilisée pour créer les bulles de succions Annexe 15: illustration du laser SMART 2940 (DEKA ). (a): le laser SMART 2940, (b): le scanner, (c): pièce à main pour le balayage. Annexe 16: Évaluation de la taille des lésions, après induction, par photos couleur calibrées. les lésions induites par laser et BS. Annexe 17: Mesure de profondeur d'exemple de lésions induite par laser et par bulle de succion Annexe 18: Évaluation de la taille des lésions par photos couleur calibrées en fonction du temps. Les valeurs sont des moyennes de toutes les lésions des différents volontaires. Annexe 19: Évaluation de la profondeur des différents types de lésions, après induction, par technique d empreintes cutanées couplée à la projection de frange. Annexe 20: Évaluation de la mise en place de la fonction barrière de la peau par mesure de la perte insensible en eau (PIE). Annexe 21: Mesure du flux sanguin cutané par laser doppler, au niveau des différentes lésions. Annexe 22: Mesures de la contraction des deux types de lésions

11 LISTE DES ABRÉVIATIONS

12 APTD Ar 2 CO ² CSF1 EGF Er: YAG Er 3+ HeNe IGF IR IL1 ILGF1 KGF Kr 2 KTP MCP1 MEC MMP Nd 3+ OCT PDGF PDL QS TGFα&β TNFα UV VEGF Xe 2 YAG β FGF CW ROI PIE Argon Pumped Tunable Dye Argon Dioxyde de carbone Colony-stimulating factor 1 Epidermal growth factor Erbium: Yttrium Aluminium Garnet Erbium Hélium-néon Insulin-like growth factor Infrarouge Interleukin-1 Insulin-like growth factor 1 Keratinocyte growth factor Krypton potassium-titanyl-phosphate Monocyte Chemoattractant Protein 1 Matrice extracellulaire Matrix Metalloproteinase Néodyme Optical Coherent Tomography Platelet differentiation growth factor Pulsed Dye Laser Quality-switched Transforming growth factor α & β Tumor Necrosis Factorα Ultra violet Vascular Endothelial growth factor xénon Yttrium Aluminium Garnet β fibroblast growth factor Continuous Wave Region Of Interest Perte Insensible en eau

13 CONTEXTE

14 Contexte La peau et les épithéliums sont en général les seuls tissus humains capables de se régénérer. Cette propriété confère à la peau un rôle protecteur essentiel au maintien de l'homéostasie de l'organisme. Cette régénération est normalement active pour renouveler et maintenir la fonction barrière, ou exceptionnellement active lors de la réparation suite à une lésion ou plaie cutanée. Ce processus coordonne la prolifération synchronisée de plusieurs tissus (épithélial, connectif, endothélial) afin de restituer la barrière cutanée le plus rapidement possible. Ainsi, chez des sujets sains, ce processus se déroule sans complication. En revanche, chez les personnes développant certaine maladie systémique peuvent être sujet à des complications. En effet, ce processus de régénération tissulaire est compromis et se traduit par un dysfonctionnement d'un ou plusieurs composants du processus, entraînant une cicatrice non-réparée, prolongée ou dystrophique. Un exemple d'une complication de cicatrisation est l'ulcère de jambe chez des personnes atteintes d'une insuffisance veineuse chronique. La pathologie est complexe, mais en générale, la cicatrisation est ralentie laissant exposer la plaie à des infections microbiennes, qui ralentissent encore processus. L'impacte socio-économique de telles complications est très important, notamment par le coût élevé des soins des malades en raison d'un long séjour d'hospitalisation. Il a été estimé, en 2002, aux États Unis, que sur 350 patients, 14% présentent des complications post-chirurgicales au niveau des lésions. En Europe, les dépenses engendrées par ces complications sont importante est se chiffre entre 1.45 à 19.1 milliards d'euros[1]. Ces constatations s'appliquent aussi à d'autres types de lésions, ainsi les ulcères de jambe qui touchent 3.6% de la population au Royaume-Uni et coûtent 150 à 400 millions de livres sterling par an. De la même manière, les ulcérations par pression représentent, à eux seuls, 4% des dépenses du NHS (National Health Service) au Royaume-Unis. L'augmentation de ces dépenses est d'autant plus importante que la durée des séjours hospitaliers de ces patients est prolongée. Ce problème risque de s'aggraver en raison des changements du style de vie (sédentaire, alimentation ) qui seraient à l'origine d'une augmentation de l'incidence de diabètes qui est souvent la cause des plaies chroniques sur les membres inférieures. De ce fait, il est impératif d'améliorer la prise en charge des malades avec des plaies chroniques et leurs traitements afin de prévenir ces dépenses. Les recherches portant sur la compréhension du processus de cicatrisation sont nécessaires à la définition des meilleures modalités thérapeutiques. Un des obstacles dans la recherche sur la cicatrisation est le manque d'un modèle humain du processus qui est suffisamment fiable pour permettre des études d'investigation objectives et non-invasives. La fiabilité d'un tel modèle dépend donc de plusieurs critères tels que l'endroit d'induction des plaies qui doit être standardisée afin d'être comparable

15 Le contexte L'originalité de cette thèse est la présentation d'une nouvelle technique d'induction des lésions épidermiques chez l'homme par laser, et leur évaluation par des méthodes instrumentales non-invasives

16 Le contexte

17 CHAPITRE I: INTRODUCTION

18 Chapitre I Introduction: La peau I. LA PEAU I.A. GÉNÉRALITÉS Figure 1: Représentation 3D de la peau humaine avec les structures annexes. [2] La peau est définie comme étant l'organe de revêtement extérieur du corps de l'homme et des animaux. Elle est constituée de trois tissus superposés: l'épiderme, le derme et l'hypoderme (Figure 1). Ses annexes, localisées dans le derme, sont représentées par les phanères (poils et ongles), les glandes sébacées et les sudoripares. Le derme contient aussi des récepteurs sensoriels à la pression et à la température, associé à un réseau microcirculatoire et de fibres nerveuses. L'épaisseur de la peau varie selon le sexe, l'âge et la région du corps. Elle est plus mince chez les femmes, chez les personnes âgées, au niveau des paupières et des organes génitaux (1 mm). En revanche, elle est plus épaisse au niveau de la zone palmo-plantaires (environ 4 mm). La peau possède de nombreuses fonctions impliquées principalement dans le maintien de l'homéostasie de l'organisme, et notamment dans la thermorégulation, la défense contre les agressions extérieures et les agents exogènes. Elle joue également un rôle dans les fonctions sensorielles et métaboliques tel que la synthèse de vitamine D

19 Chapitre I Introduction: La peau I.B. STRUCTURE DE LA PEAU I.B.1. L'ÉPIDERME L'épiderme est la couche la plus superficielle de la peau. Il est constitué d'un épithélium pavimenteux, stratifié et kératinisé et mesure en moyenne 0,1mm d'épaisseur. Il est constitué de quatre populations cellulaires différentes: les kératinocytes, les mélanocytes, les cellules de Langerhans et les cellules de Merkel. I.B.1.1. CELLULES DE L'ÉPIDERME Les Kératinocytes (du grec kéras, corne) sont les cellules les plus abondantes, environ 80% de la population cellulaire de l'épiderme. Leur principale caractéristique est leur capacité à se différencier en fabriquant de la kératine selon un processus appelé kératinisation. La kératine est une protéine fibreuse, qui confère à l'épiderme sa fonction de protection. Les kératines (ou cytokératines) appartiennent à une famille de protéines fibreuses à structure α-hélicoïdale. Il s'agit de dimères à six chaînes polypeptidiques s'organisant pour former des filaments de 8 nm de diamètre. Il existe vingt formes distinctes de kératine dans l'épithélium humain et dix autres dans les cheveux et les ongles [3]. Les kératinocytes naissent au niveau de la couche la plus profonde de l'épiderme (la couche basale), et migrent à la surface en se différenciant. La différentiation des kératinocytes se fait de façon centrifuge, au fur et à mesure qu'elles s'éloignent de la jonction dermo-épidermique. Ces cellules épithéliales se chargent de kératine pour se transformer de kératinocytes basaux en kératinocytes cornés (cornéocytes). Ces derniers sont caractérisés par un cytoplasme rempli de tonofilaments et un feuillet interne épaissi. Les mélanocytes (du grec melas, noir) sont des cellules capables de synthétiser la mélanine localisée dans des granules appelés mélanosomes. La mélanine possède la propriété d'absorption des rayons UV du soleil qui n'ayant pas été réfléchis par la surface de la peau. Elle absorbe les rayonnements de 200 à 2000 nm, et protège ainsi les cellules et ses organites vitaux. Seules les cellules de Langerhans localisées au niveau de l'épiderme appartiennent au système immunitaire. Ces cellules ressemblent à la famille des cellules dendritiques, et remplissent le rôle de sentinelle au niveau de l'épiderme. Elles jouent un rôle dans l'immunité non-spécifique par présentation d'antigène phagocyté aux lymphocytes T au niveau des ganglions lymphatiques.[4] Les cellules de Merkel: sont des cellules neuro-endocrines. Elles sont impliquées dans le tact et produisent des substances neuroactives tels que le VIP ( peptide intestinal

20 Chapitre I Introduction: La peau vasoactif), la substance P[5], la somatostatine et la sérotonine. Ces molécules permettent probablement l'échange d'informations avec les neurones adjacents. I.B.1.2. ORGANISATION DE L'ÉPIDERME L'ensemble des cellules de l'épiderme est organisé en plusieurs strates. Les kératinocytes sont ainsi répartis en quatre ou cinq couches superposées, expliquant le caractère stratifié de l'épiderme (Figure.2): Le stratum basal appelé aussi couche germinative est la couche la plus profonde de l'épiderme, en contact avec la jonction dermo-épidermique. Ses kératinocytes, de forme cylindrique et perpendiculaire aux papilles dermiques, forment une couche monocellulaire. Comme la plupart des cellules, les kératinocytes sont reliés par des jonctions de types gap, canaux transmembranaires formés de molécules de connexines, qui permettent des échanges directs entre les cellules. La communication par ces jonctions joue un rôle essentiel dans le contrôle de l'homéostasie kératinocytaire, et l'apport de nutriments à l'épiderme. Le cytoplasme des kératinocytes de la couche basale est riche en organites cellulaires ainsi qu'en mélanosomes. Ces derniers, synthétisés par les mélanocytes voisins, migrent dans les kératinocytes pour se concentrer autour du noyau le protégeant ainsi en partie contre les UV. Au niveau de cette couche, le nombre de cellules germinatives est justifié par l'activité mitotique intense de ces cellules. En effet, ces kératinocytes se divisent activement, chacun donnant naissance à deux cellules filles identiques. L'une des cellules filles reste sur place pour se diviser à nouveau alors que l'autre peut suivre trois voies distinctes: rester quiescente, être rapidement éliminée par apoptose ou, pour la plupart d'entre elles, s'engager dans un processus de différentiation afin de reconstituer les couches suprabasales de l'épiderme. Le stratum spinosum ou couche épineuse est constitué d'une superposition d'environ 5 strates de kératinocytes. Volumineuses, elles ont une forme polygonale et ont tendance à s'aplatir dans les régions les plus superficielles. Ces cellules sont pourvues d'un gros noyau possédant souvent deux nucléoles. On y trouve de nombreux ribosomes impliqués dans la fabrication de la kératine. Ces cellules sont attachées par un nombre plus grand de desmosomes, ce qui leur donne une allure épineuse en observation histologique. Ces attaches desmosomiales assurent une grande cohésion entre les cellules et sont responsables, en partie, de la très grande résistance mécanique de cette couche cellulaire

21 Chapitre I Introduction: La peau Figure 2: Schéma d'une coupe transversale de l'épiderme avec ses 4 différentes couches. Et les différents stades de la différentiation des kératinocytes.1) couche basale, 2) couche granuleuse, 3) couche épineuse et 4) stratum corneum. [6] Le Stratum granulosum ou couche granuleuse est formée de 3 strates de kératinocytes aplatis, possédant un noyau ovale et dense, dont la chromatine se raréfie, de la même manière que les organites cellulaires. Au niveau cytoplasmique on trouve deux sortes de granulations: les premières sont des granulations de kératohyaline, volumineuses et basophiles, les secondes, plus petites, appelées kératinosomes ou corps lamellaires d'odland. Ces structures migrent vers la périphérie de la cellule, fusionnent avec la membrane plasmique et déversent leur contenu dans l'espace extracellulaire. Il s'agit de lipides qui vont jouer un rôle de ciment intercellulaire pour consolider, avec les desmosomes, les adhésions cellulaires. Le stratum corneum (SC) est constitué suivant la région du corps, de 4 à 20 couches de cellules aplaties et complètement kératinisées. Les kératinocytes appartenant au SC ne possédant plus de noyau, ni d'organites cytoplasmiques sont les cornéocytes. La cellule est remplie de kératine qui se présente sous forme de faisceaux de filaments enrobés dans une matrice dense inter-filamenteuse amorphe. Cette couche peut être subdivisée en deux sous-couches. Le stratum compactum, faisant suite à la couche granuleuse, est formé de cellules kératinisées étroitement soudées. Il assure la fonction barrière de l'épiderme. Les desmosomes sont remplacés par des structures très simplifiées, les cornéodesmosomes qui continuent à assurer une certaine cohésion entre les cornéocytes. On trouve dans les cornéodesmosomes des protéines spécifiques comme la cornéodesmosine. Cette strate est surmontée par une couche desquamante ou stratum disjonctum qui se trouve en surface et au niveau de laquelle les cellules

22 Chapitre I Introduction: La peau cornées subissent la desquamation. L'ensemble de ces couches épidermiques se renouvelle entièrement au bout de 30 à 45 jours, avec tout d'abord un renouvellement de cellules germinatives, puis une migration des cellules à travers l'épaisseur de l'épiderme. Le temps de transit d'un kératinocyte à travers la couche cornée est d'environ 14 jours. Dans un certain nombre de maladies, tel que le psoriasis, le temps de renouvellement de l'épiderme est considérablement diminué (8 jours). Au cours de la réépidermisation d'une plaie la migration cellulaire prend naissance au niveau de la marge épithéliale de la plaie, ainsi qu'au niveau des annexes cutanées, notamment la gaine épithéliale externe du follicule pileux et des canaux sudoripares. (cf.annexe.1) I.B.1.3. RÉGULATION DE L'HOMÉOSTASIE ÉPIDERMIQUE De nombreuses molécules, sécrétées localement ou circulantes, sont impliquées dans le contrôle de la balance prolifération / différenciation épidermique. Cette régulation fait appel en grande partie aux facteurs de croissance [7]. Il a été montré que les kératinocytes produisent des facteurs de croissance qui peuvent agir localement en activant ou en bloquant les mitoses et en régulant les programmes de différentiation. Ainsi le facteur EGF et le TGFα stimulent la prolifération et la migration des kératinocytes, notamment des kératinocytes basaux. Alors que le TGFβ inhibe la prolifération cellulaire et assure ainsi la sortie des kératinocytes du cycle cellulaire. Cette première étape est indispensable à leur entrée dans le processus de différenciation. Ce rôle est partagé par le TNFα, qui inhibe aussi la prolifération kératinocytaire et stimule la différentiation. Ceci est bien visible lors des altérations de la barrière cornée où la concentration en TNFα augmente brutalement, permettant ainsi d'induire un phénomène de réparation cornéocytaire rapide. D'autres éléments interviennent aussi dans cette homéostasie, les ions et les oligoéléments. Ainsi le calcium intervient dans la différentiation des kératinocytes. In vivo, on constate l'existence d'un gradient calcique croissant depuis les couches basales vers les couches superficielles de l'épiderme. D'autres oligo-éléments (zinc, cuivre, manganèse ), jouent un rôle anti-radicalaire et par conséquent participe à l'élimination des radicaux libres qui favorisent le vieillissement et la carcinogenèse. (Le zinc à un rôle anti-inflammatoire sur les kératinocytes. Le cuivre intervient dans la synthèse de la kératine). La régulation de la cicatrisation fait intervenir également des hormones et facteurs apparentés. Cependant à forte concentration (10-6 M), l'acide rétinoïque inhibe la différenciation épidermique, en se liant à des récepteurs nucléaires qui permettent la régulation de l'expression de gène codant pour des protéines épidermiques. De la même manière, les vitamines telle que la vitamine A qui stimulent la division mitotique ou encore la vitamine D qui inhibe la prolifération des kératinocytes et induit leur différentiation en stimulant la synthèse de kératines et l'activité transglutaminase

23 Chapitre I Introduction: La peau I.B.2. LE DERME Le derme, couche sous-jacente à l'épiderme, est innervé et très vascularisé et renferme les glandes annexes (glande sudoripares, glandes sébacées et des follicules pileux). Cette couche est ainsi divisée en deux parties: le derme papillaire (ou superficiel) riche en cellules, et en profondeur le derme réticulaire (ou profond). Ces couches sont riches en fibres (fibre de collagène et d'élastine) et représente environ 4/5 du derme. La limite entre les deux parties n'est pas toujours visible au microscope. Le derme est séparé de l'épiderme par une membrane basale, bien visible sur la coloration PAS (Periodic acid-schiff) délimitant les papilles dermiques par ses ondulations. Cette structure permet d'augmenter considérablement la surface d'échange dermo-épidermique et de s'adapter à ses étirements. La présence de replis dermoépidermique (à l'origine du réseau micro-dépressionnaire de surface) compense ainsi le peu d'élasticité de l'épiderme. I.B.2.1. CELLULES DU DERME Les cellules présentent dans le derme sont regroupées en deux groupes. Le premier est composé de fibroblastes ces cellules fusiformes dont le rôle principal est la synthèse des composantes de la matrice extracellulaire (MEC) tel que: le collagène, l'élastine, la substance fondamentale et des glycoprotéines. Le deuxième groupe est composé des cellules migratrices, impliquées dans les mécanismes de défense et de réponse immunitaire: leucocytes, mastocytes, macrophages. I.B.2.2. ORGANISATION DU DERME La Matrice ExtraCellulaire désigne tous les composants matriciels de l'espace extracellulaire de tous les tissus, dont le tissu conjonctif de la peau. Il s'agit de macromolécules produites par des cellules, et sécrétées dans l'espace extracellulaire où elles sont immobilisées par des interactions avec d'autres molécules. Le volume relatif de la MEC dans le derme reflète son rôle assez important. L'ensemble de ce réseau fibrillaire baigne dans la substance fondamentale. Les fibres sont en grande partie du type collagène ou élastine. Le rôle essentiel des 25 types de collagène est d'absorber les forces de tension. Le derme est particulièrement constitué de fibres de collagène de types I et de type III (fibres de réticuline). Les fibres d'élastine mises en évidence par la coloration d'orcéine, s'organisent en réseau. Elles sont constituées d'une protéine, l'élastine, qui possède des propriétés mécaniques exceptionnelles car elle peut s'allonger ou se rétrécir

24 Chapitre I Introduction: La peau La substance fondamentale est formée d'eau (20 à 40% d'eau totale du corps), de sels minéraux et de macromolécules tels que les glycosaminoglycanes et les glycoprotéines de structure. Le derme papillaire est formé de fibres de réticuline et de fibres élastiques lâches et fines baignant dans une substance fondamentale abondante. Une couche de derme papillaire se prolonge autour des annexes. Le derme réticulaire est un tissu conjonctif plus dense dont les fibres sont mieux organisées. Cette couche présente une épaisseur variable en fonction de l'âge (augmentation au cours de l'enfance et l'adolescence, puis stabilisation et diminution après 50 ans), et de la région (le derme du dos est plus épais que ce lui des membres). I.B.3. L'HYPODERME L'hypoderme est le tissu graisseux sous-cutané. C'est la couche la plus profonde de la peau. Il est composé de tissus conjonctifs spongieux parsemés d'adipocytes qui emmagasinent l'énergie. Ces cellules graisseuses sont groupées en un gros amas en forme de coussins. I.C. VASCULARISATION DE LA PEAU La vascularisation cutanée est très abondante et liée aux nombreuses fonctions de la peau. Elle assure non seulement l'oxygénation et la nutrition des différentes structures de la peau, mais aussi le contrôle de la thermorégulation, le maintien de la pression artérielle et de l'équilibre hydrique de l'organisme. Boucle capillaire Plexus superficiel Plexus profond Figure 3: Schéma de la vascularisation de la peau, montrant les 2 plexus et les boucles papillaire[6, 8]

25 Chapitre I Introduction: La peau L'apport du sang provient des artères sous cutanées qui cheminent en profondeur parallèlement à la surface cutanée et envoie des collatérales dans le "septa" de l'hypoderme. À la base du derme ce réseau forme le plexus profond. De ce plexus partent des artérioles plus fines qui forment au niveau de jonction du derme réticulaire et derme papillaire, le plexus superficiel. De ce dernier naissent les capillaires artériels qui se distribuent dans les papilles dermiques et se prolongent par les capillaires veineux en formant une anse capillaire. Cette circulation sanguine n'atteint pas l'épiderme, d'où sa non vascularisation. (Figure.3) La circulation veineuse est parallèle à la circulation artérielle constituant les capillaires papillaires, plexus superficiel, plexus profond, veine sous cutanée. Les vaisseaux lymphatiques ont un trajet pratiquement parallèle au réseau sanguin. Il existe un capillaire en doigt de gant au niveau de chaque papille. Cette distribution permet la mise en place d'anastomoses capables de court-circuiter une partie du réseau vasculaire. Au niveau de la peau, existent des anastomoses pré-capillaires (entre artérioles précapillaires et veinules post-capillaires) et artério-veineuses au niveau du derme. Cellesci, entouré de fibres nerveuses et musculaires lisses, forment le glomus de Masson. Lorsque les fibres musculaires sont relâchées, le glomus s'ouvre, permettant un retour rapide du sang. Enfin, la régulation du débit sanguin est assurée de façon directe par le système nerveux sympathique (dont la stimulation entraîne une vasoconstriction), et de façon indirecte par différents stimuli: mécanique (le grattage), physique (la température) ou chimique (la pression partielle en oxygène, en gaz carbonique ou le ph). I.D. INNERVATION DE LA PEAU La peau constitue l'organe du toucher, où se distinguer l'innervation sensitive et végétative. La première est formée d'un réseau dermique de fibres nerveuses et des récepteurs. Ces récepteurs sont sensibles aux stimulations mécaniques, thermiques et douloureuses. Les fibres nerveuses forment le plexus dermique profond à la jonction dermo-hypodermique et le plexus superficiel du derme papillaire et réticulaire. Les terminaisons nerveuses issues de ces plexus forment deux types de récepteurs sensoriels, libres en majorité ou encapsulés (corpuscules spécialisés, mecanothermorécepteurs). Les corpuscules les plus connus sont les corpuscules de Meissner, situés dans les papilles dermiques des zones sensibles à la friction (paume, plante, peau glabre, lèvre et organe génitaux), et les corpuscules de Pacini, stimulés par les fortes pressions, situés dans le derme profond, particulièrement au niveau des doigts (Figure.4)

26 Chapitre I Introduction: La peau Figure 4: Représentation 3D de la peau humaine, montrant l'innervation au niveau de la peau. [2] L'innervation végétative est représentée seulement par le système sympathique, composé de fibres nerveuses intrinsèques aux fibres sensitives. Elles innervent les muscles poly-moteurs, les glandes sudoripares et les vaisseaux sanguins. Initialement, le système nerveux cutané, a été classifié comme étant afférent contrôlant les fonctions eccrines, le flux sanguin et l'érection de poils, ou efférent transmettant le signal sensoriel vers le système nerveux central [9]. Ces données ont été controversées par la découverte du premier neuropeptide, "la substance P" [10]. En effet, il a été montré que ces peptides découverts dans les fibres sensorielles sont soupçonnés d'être bioactifs au niveau de la peau au-delà des fonctions de base. Ainsi elles interviennent dans la modulation de la réponse immunitaire. Ces molécules ont pour cible majeure les kératinocytes et les fibroblastes cutanés. Parmi ces neuropeptides on trouve la famille des tachykinines tel que la "SP", la famille des neurokinines tels que la neurokinine A et le meuropeptide Y. I.E. ANNEXES CUTANÉES Les Glandes sudoripares renferment deux types de glandes: les glandes acrines, très nombreuses (100 à 200/cm²), fonctionnelles dès la naissance, elles produisent la plus grande partie de la sécrétion sudoripare. Ces glandes exocrines sont situées au niveau du derme profond ou à la limite dermo-hypodermique, et elles présentent une ouverture au niveau de la surface, contrairement aux glandes appocrines qui s'ouvrent au niveau du

27 Chapitre I Introduction: La peau follicule pileux. Ces dernières sont localisées au niveau des aisselles des régions génitales, ainsi qu'au niveau du visage. Le nombre et l'activité de toutes les glandes sudoripares diminuent avec l'âge. Les glandes Sébacées sont localisées au niveau du derme moyen. Elles sont associées aux follicules pileux (50 à 100/cm²), sauf au niveau des régions spécialisées (aréole du sein, lèvres), où elles s'abouchent à la surface cutanée. Leurs tailles et leurs densités varient en fonction de leur localisation cutanée. Associé aux précédentes glandes, le follicule pileux avec sa structure cylindrique constituée de cinq couches cylindriques et concentriques de cellules épithéliales permet la croissance du poil. Ce dernier est une structure kératinisée propre aux mammifères. Cependant la couleur, la taille et la répartition des poils sont variables en fonction de la race, de l'âge, du sexe et de la région du corps. Seules les paumes, les plantes et les dermo-muqueuses buccales et génitales en sont dépourvues. Chez l'homme, les poils possèdent essentiellement une fonction tactile, esthétique et accessoirement un rôle de protection thermique. Leur croissance ainsi que celle des cheveux est sous la dépendance de facteurs exogènes (génétiques, hormonaux), d'autant que certaines structures pilaires sont sensibles aux hormones stéroïdes. En plus des poils, les phanères renferment les ongles. Ces derniers représentent une annexe cutanée kératinisée, située à la partie supérieure des extrémités des doigts et des orteils. Ils jouent un rôle esthétique et sensitif du nombre des terminaisons qui y sont associées. Ils ont un rôle mécanique, de protection, de préhension et d'agression. La peau et les différentes couches qui la composent, remplissent des fonctions aussi multiples qu'essentielles au bon fonctionnement de l'organisme: Protection mécanique: cette propriété est assurée en premier lieu par la couche cornée, et ses cellules mortes, engorgés de kératines qui, en desquamant permettent une réduction des microorganismes de la surface de la peau. Ceci est amélioré par un film lipidique, sécrété par les glandes sébacées (avec les glandes sudoripares). Ainsi, ce film qui tapisse la surface de la peau, permet de contrôler les microorganismes cutanés. Cette couche cornée joue également un rôle de barrière imperméable. Dans un premier temps, elle s'oppose à l'infiltration de certaines substances de l'environnement vers le milieu interne, ceci grâce à la kératine et à la structure compactée de ses cellules jointes entre elles par l'intermédiaire des lipides secrétés dans le milieu extracellulaire. Cette imperméabilité n'est pas parfaite car elle laisse passer d'autres substances. Et dans un deuxième temps, elle s'oppose à la déshydratation du corps par perte d'eau à travers la peau. La peau joue un rôle d'amortisseur de choc. Cette fonction est remplie par le derme dont la structure fibrillaire confère à la peau une élasticité lui permettant une protection contre les chocs. Cet amortissement est augmenté garce aux coussinets du tissu graisseux sous cutané

28 Chapitre I Introduction: La peau Protection immunitaire: La peau, au moyen des cellules immunitaires présente la première barrière de défense de l'organisme contre les microorganismes. Ainsi, les cellules de Langerhans qui jouent un rôle de macrophage d'épiderme, permettent la présentation de l'antigène aux autres cellules immunitaires (lymphocytes). Protection contre les UV: La protection de la peau contre des éléments extérieurs en globe aussi la protection contre les radiations, particulièrement les UV. Ces rayons (visible et UVA)sont en partie, réfléchis par la surface de la peau, et l'autre partie est absorbée par la peau. Ces rayons ionisants provoquent des lésions au niveau cellulaire, entraînant l'induction de modification de l'adn et la production des radicaux libres. Contre les rayons absorbés la peau, par production de mélanine, contribue à la protection de l'adn. Les mélanosomes se regroupent autour des noyaux, est absorbent ainsi les rayons. De la même manière, la mélanine peut aider à l'élimination des radicaux libres. Fonction de Thermorégulation: la peau constitue un élément essentiel dans la régulation de la température du corps. Ces mécanismes font appel à la microcirculation papillaire, au niveau de laquelle le sang se refroidit par échanges thermiques à travers l'épiderme. Dans le cas contraire, ces capillaires subissent une constriction pour garder la température de l'organisme. Cette dernière est conservée à l'aide de la couche graisseuse de l'hypoderme. La thermorégulation du corps fait appel à d'autres mécanismes tel que la sudation qui est sous contrôle endocrinien (adrénergique), et le mécanisme d'horripilation, qui permet l'augmentation de l'épaisseur de la couche d'air, au contact de la peau, par érection des poils. Fonction Métabolique: la peau, et particulièrement l'hypoderme, constitue une réserve d'énergie représentée par le tissu adipeux (transformation des lipides en glucides au niveau du foie). De même que la peau est le site de synthèse de la vitamine D, en utilisant les rayons du soleil. Ceci est montré par la carence en vitamine-d dont souffrent les personnes à peau noire et résidant dans les pays du Nord. Fonction sensorielle: la présence de fibres nerveuses et des récepteurs sensoriels, confère à la peau le rôle d'organe du toucher. Ainsi la peau joue un rôle de capteur d'informations cognitives. Elle est le siège de la perception variée: chaleur, froid, tact, douleur, qu'elle transmet au cerveau, permettant de défendre et de s'adapter au milieu environnant

29 Chapitre I Introduction: La cicatrisation II. LA CICATRISATION CUTANÉE II.A. LA CICATRISATION NORMALE La cicatrisation est l'ensemble des phénomènes physiologiques naturels aboutissant à partir d'une plaie à la restauration de la structure cutanée. De cette manière les tissus humains et animaux sont capables de réparer des lésions localisées par des processus de réparation et de régénération qui leurs sont propres. La réparation des lésions est un alignement complexe de différents processus dynamiques, qui ne sont pas encore complètement compris. Ce phénomène naturel inclus plusieurs aspects et événements moléculaire et cellulaire. Ainsi, dans la présentation schématique usuelle, le déroulement de la cicatrisation est divisé en trois phases: phase inflammatoire, phase de prolifération et formation de tissu et enfin la phase de remodelage tissulaire. Cette division traditionnelle est quelque peu arbitraire, du fait d'un chevauchement partiel de ces phases, par exemple la formation tissulaire commence alors que l'inflammation est installée. (Figure 5) INFLAMMATION PROLIFERATION REMODELAGE ACCUMULATION DE COLLAGENE % DE REPONSE MAXIMALE TEMPS (JOURS) Figure 5: Chronologie des différentes phases de la cicatrisation. (D'après N.Fournier et al. 2005)[11] La cicatrisation est réglée et synchronisée par un groupe de cytokines, tels que le PDGF, FGF, TNF, IGF, et le TGF α et β [12]. Ces derniers sont sécrétés par les thrombocytes, les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes, cellules endothéliales et les fibroblastes. Ces facteurs interviennent dans toutes les étapes de la cicatrisation. Lorsqu'elles ne sont ni trop profondes, ni trop étendues, la plupart des plaies ou brûlures cutanées cicatrisent rapidement en quelques semaines. On distingue 3 phases

30 Chapitre I Introduction: Cicatrisation successives: la phase inflammatoire et formation du caillot (0 à 3 jours), la phase proliférative ou formation de tissu (3 à 12 jours) et la phase de remodelage tissulaire. II.A.1. PHASE INFLAMMATION & FORMATION DE CAILLOT Figure 6: Illustration de la phase d'inflammation (d'après AJ. Singer, 1999[13]) La plupart des blessures cutanées comportent des effractions vasculaires, qui entraînent l'irruption du sang en dehors des vaisseaux. Après agrégation et dégranulation des plaquettes, la coagulation du sang conduit à la formation d'un caillot fibrinoplaquettaire. Ce dernier est composé de plaquettes incluses dans un réseau formé en majorité de fibrine ainsi que de fibronectine plasmatiques, de vitronectine et de thrombospondine. Ce caillot permet, en même temps, de rétablir l'étanchéité de la peau et de fournir aux kératinocytes une matrice extracellulaire temporaire pour leur migration. Cependant, les plaquettes incluses dans le caillot jouent un double rôle, la coagulation et la libération de médiateurs de guérison, tel que le PDGF, qui attire et active les macrophages et les fibroblastes. Toutefois, en absence d'hémorragie, les plaquettes ne sont pas essentielles à la cicatrisation

31 Chapitre I Introduction: Cicatrisation La libération des différents médiateurs vasoactifs et facteurs chimiotactiques par les plaquettes et les cellules épithéliales activées, permettent le recrutement précoce, des cellules immunitaires inflammatoires au niveau du site de la lésion [14]. L'implication de ces cellules commence par l'expression et la sécrétion de certaines molécules (cytokines et interleukines). Ces molécules comportent la sélectine qui permet l'adhésion des leucocytes aux parois de vaisseaux, ainsi que les β 2 -intégrines qui permettent la transmigration des leucocytes activés vers l'espace extra-vasculaire. À ces molécules se rajoutent des cytokines pro-inflammatoires tel que l'il-1 et le TNFα, qui elles même induisent la production d'autres interleukines. (Figure 6) En réponse à des chimioattracteurs spécifiques, tels que des fragments de protéine de la MEC, le TGFβ, et le MCP1, les monocytes s'infiltrent au niveau du site de la lésion et deviennent des macrophages activés. Ces derniers secrètent des facteurs de croissances tel que PDGF et le VEGF qui initient la formation de tissu de granulation. Les macrophages se lient aux protéines de la matrice extracellulaire à l'aide des récepteurs aux intégrines. Cette action stimule la phagocytose des microorganismes et les fragments de la MEC [15]. Ce rôle de détersion est partagé par les neutrophiles infiltrés, qui débarrassent la surface lésée des particules étrangères et des bactéries. L'adhésion à la matrice extracellulaire stimule aussi la transformation des monocytes en macrophages inflammatoire. Leur adhésion induit la synthèse de puissantes cytokines inflammatoires tels que le CSF1, le TNFα, ainsi qu'un puissant chimioattracteur et mitogène pour les fibroblastes le PDGF. D'autres cytokines importantes sont sécrétées par les monocytes et macrophages comme le TGFα, TGFβ, interleukin-1 [16], et le ILGF1. Ces facteurs de croissance semblent nécessaires à la mise en place et la propagation du processus de la formation du tissu dans la lésion. Une étude réalisée chez des animaux dépourvus de macrophages a démontré une réparation de blessure défectueuse [17]. Ainsi, il apparaît que les macrophages jouent un rôle central dans la transition entre la phase inflammatoire et la formation tissulaire [18] II.A.2. PHASE DE PROLIFÉRATION Au bout de trois jours, le caillot fibrino-plaquettaire se rétracte laissant apparaître le tissu conjonctif sous-jacent qui prend le nom de tissu de granulation, du fait de la présence des granulations roses qui apparaissent à la surface du nouveau derme et qui correspondent aux nombreux capillaires qui l'envahissent. Cette néo-vascularisation est due à l'angiogénèse, qui est déclenchée et entretenue principalement par le VEGF et le β-fgf, sécrétés par les cellules endothéliales lésées et les macrophages

32 Chapitre I Introduction: Cicatrisation Outre les vaisseaux sanguins, le tissu de granulation contient principalement des macrophages et des fibroblastes qui sécrètent les constituantes de la MEC et en particulier le collagène. La réépithélialisation commence dans les heures qui suivent la blessure. Les cellules épidermiques des annexes de la peau, tel que les follicules de cheveux, par leur prolifération enlèvent rapidement le sang coagulé et le stroma endommagé au niveau de la lésion (Figure 7). En même temps, ces cellules subissent une altération phénotypique marquée, qui incluent l'apparition et la rétraction des filaments intracellulaires [19], et la dissolution de la plupart des desmosomes et hémidesmosomes. Ce qui permet d'augmenter la mobilité cellulaire [20, 21]. De la même manière les cellules épidermiques et dermiques n'adhérent plus les unes aux autres, permettant ainsi le mouvement latéral des cellules épidermiques. L'expression des récepteurs membranaires aux intégrines, leur permet d'interagir avec des protéines matricielles autre que le collagène-i (la fibronectine et la vitronectine) [22-24]. Ainsi la migration et la desquamation au niveau des lésions permettent la séparation entre la croûte et le tissu vivant. La migration des cellules entre le derme et le caillot, nécessite la dégradation de la MEC. Cette dégradation dépend aussi bien de la production des collagènases par les cellules épidermiques [25], que de l'activation de la plasmine par le "plasminogen activator" produit par ces mêmes cellules [26]. Ce dernier, active aussi les collagènases (MMP-1) [27], et facilite donc la dégradation du collagène et des protéines matricielles. Un à deux jours après la blessure, les cellules épidermiques migrantes commencent la prolifération derrière les cellules qui migrent activement. Les stimuli pour la migration et la prolifération durant la ré-épithélialisation n'ont pas été déterminés, mais plusieurs possibilités existent. Ainsi l'absence des cellules voisines lors de la phase de migration (l'effet "free edge") peut être à l'origine de l'activation de la prolifération et la migration des cellules épidermiques. De la même manière, la libération locale des facteurs de croissance et une augmentation de l'expression de leurs récepteurs peuvent aussi stimuler ce processus. Les principaux facteurs de croissance intervenant sont EGF, TGFα, et le KGF[28-30]

33 Chapitre I Introduction: Cicatrisation Figure 7: Illustration de la phase de prolifération (d'après AJ. Singer, 1999)[13] A la suite de la ré-épithélialisation, les protéines de la membrane basale réapparaissent dans un ordre bien précis de la marge vers l'intérieur de la blessure, d'une manière identique à une fermeture éclaire [31]. Les cellules épidermiques retrouvent leur phénotype normal une fois qu'elles sont fermement attachées à la membrane basale néoformée. II.A.3. PHASE DE REMODELAGE La phase de remodelage débute après fermeture de la plaie, par une régression du tissu granuleux qui peut persister pendant 2 ans. La contraction des plaies est achevée vers le 21 e jour associé à un contenu maximal en collagène. De même que la résistance de la cicatrice à l'étirement n'atteint qu'environ 15% de celle de la peau normale [32]. Enfin cette résistance est augmentée de façon considérable jusqu'à 70%, grâce au remodelage. Initialement nécessaires à la migration et à la prolifération cellulaire, la fibronectine et l'acide hyaluronique sont progressivement lysés et remplacés par le collagène, les fibres élastiques et les glycoaminoglycanes constituant une matrice plus résistante aux forces de traction. Différents éléments interviennent dans ce phénomène, des cellules, tels que les polynucléaires et les macrophages, et des enzymes tel que les protéases synthétisées par

34 Chapitre I Introduction: Cicatrisation les fibroblastes. Ces éléments interviennent de façon importante dans les phénomènes de remodelage matriciel, en favorisant la lyse et la synthèse de nouvelles molécules, mieux orientées et organisées. L'âge, les forces de tension et la pression influencent la synthèse et l'organisation des molécules de collagène. Toutefois les cicatrices sont, dans tous les cas, moins résistantes et moins élastiques que la peau normale, en partie à cause d'un certain déficit en élastine et en raison de la reconstitution d'une matrice relativement désorganisée. II.B. LA CICATRISATION PATHOLOGIQUE Le déroulement anormal des mécanismes de la cicatrisation, peut conduire à des cicatrices pathologiques qui se présentant sous différentes formes. Ainsi, les plaies chroniques, les cicatrices rétractiles et les cicatrices chéloïdes résultent respectivement d'un retard, d'une altération et d'un excès de ce processus de cicatrisation. Les cicatrices excessives ou chéloïdes, sont des pseudotumeurs cutanées intradermiques fibreuses, exubérantes qui récidivent en cas d'ablation chirurgicale. Elles s'opposent aux cicatrices hypertrophiques qui sont limitées à la zone traumatisée. Ne présentant pas d'extension elles ont tendance à régresser spontanément. Ces cicatrises surviennent après des interventions chirurgicales, des traumatismes, des brûlures ou de simples réactions inflammatoires (ex. Folliculite d'acné). Lors de leur formation, les chéloïdes présentent une activité fibroblastique excessive, responsable d'une production importante de fibres de collagène épaissies et hyalinisées. La région de cicatrisation peut subir une rétraction excessive, ce qui est souvent le résultat d'une plaie mal orientée par rapport aux lignes de tractions physiologiques de cette région. Elles surviennent après des brûlures profondes, et elles peuvent avoir des répercussions fonctionnelles tel que sur la mobilité des membres. La cicatrisation pathologique peut être sous forme de retard du processus. Ce retard peut être lié à plusieurs facteurs locaux ou généraux, qui peuvent entraver le déroulement des différentes phases de la cicatrisation. Ainsi, les carences alimentaires (protéique, vitaminique ), l'état physiologique (hypo vascularisation, dénervation, affection endocrinienne) ou aussi les infections virales ou bactériennes, peuvent être à l'origine du retard de la cicatrisation. II.C. CICATRISATION: MÉTHODE D'ÉTUDE Les études du phénomène de la cicatrisation étaient réalisées auparavant par étude des lésions traumatiques suite à des accidents ou des pathologies, ou encore celles issues

35 Chapitre I Introduction: Cicatrisation des interventions chirurgicales. Ces lésions présentent des origines diverses, avec des paramètres non contrôlés ne permettant pas une bonne comparaison entre différentes lésions. Afin de remédier à ces problèmes, des études de cicatrisations sont actuellement réalisées par induction expérimentale des lésions cutanées. II.C.1. LES LÉSIONS NON-CONTRÔLÉES: TRAUMATIQUE ET PATHO- LOGIQUES L'étude de la cicatrisation des lésions est réalisée par appréciation clinique des lésions en fonction du temps. Ces lésions non-contrôlées englobent des lésions dont les origines sont différentes et classées sous deux groupes: les plaies aiguës et chroniques. Les plaies aiguës regroupent les lésions traumatiques largement utilisés comme modèle d'études tel que des lésions résultantes d'accidents (coupures, contusion et lacération), les plaies d'origine iatrogène (ex.: interventions chirurgicales) et les brûlures de différentes origines (thermique, électrique, chimique et radioactives) [William H. Arch Otolaryngol head neck surg.vol123, Apr 1997]. Les plaies chroniques englobent les lésions d'origine pathologique, particulièrement dans les cas d'escarres, d'ulcère de jambe et l'ulcère diabétique afin d'étudier les pertes de matière ainsi que le recouvrement des plaies par diffèrent moyens. (L'étude de l'effet des greffes sur la réparation de ces lésions) Dans la grande majorité de ces études, les objectifs sont l'évaluation et l'estimation de la cinétique de cicatrisation (vitesse), et les possibilités de l'améliorer par différents moyens (molécules actives, des matériaux de substitution particulièrement dans le cas des grands brûlés). II.C.2. LÉSIONS CONTRÔLÉES: EXPÉRIMENTALES INDUITES Afin de remédier aux aléas des lésions traumatiques et pathologiques, des lésions expérimentales, plus contrôlées, sont induites en utilisant différents modèles. Ces derniers peuvent être classés en trois groupes: II.C.2.1. MODÈLES PHYSIQUES: Principalement utilisé lors des prélèvements des greffons de peau (derme et épiderme), le rasoir à dermatome permet de régler la profondeur du prélèvement. Cette propriété est aussi exploitée dans les études de cicatrisation et réparation tissulaire de peau. Ce modèle permet d'avoir une profondeur assez uniforme, cependant cette dernière peut varier selon différents facteurs tel que la pression exercée.[33]

36 Chapitre I Introduction: Cicatrisation Cette variabilité d'utilisation est résolue par l'utilisation de la technique de bulle de succion, qui permet de séparer mécaniquement l'épiderme du derme. Néanmoins, la profondeur de la plaie dépend de l'épaisseur de l'épiderme, qui varie en fonction des individus. Elle est utilisée comme modèle d'étude de lésion du 1 er degré et dans les études de traitement de maladie bulleuses [34]. De la même manière, cette variabilité de profondeur est observée dans le cas des punchs à biopsies, qui permet la réalisation de plaies à forme identique mais avec une profondeur variable [35]. D'autres modèles physiques, tel que les brûlures par immersion dans une eau chauffée (90 /10s), sont utilisés comme modèle d'étude de brûlure thermique. II.C.2.2. MODÈLES CHIMIQUES: L'induction de lésions chimiques est réalisée en grande partie pour reproduire des cas accidentels, par exemple en utilisant l'acide chlorhydrique[36], afin d'étudier la phase inflammatoire et de développer des traitements adéquats. II.C.2.3. ÉTUDES IN VITRO La contraction des plaies, au cours de leurs réparations, est difficilement appréciable, à partir de là, la peau reconstruite est un bon modèle d'étude[37]. En effet le derme équivalent et la peau reconstruite présentent l'avantage d'avoir des caractéristiques proches de la peau in vivo, et de permettre l'observation, ainsi que l'étude des phénomènes qui se déroulent lors de la cicatrisation. Ainsi l'observation de la réépithélialisation sur le modèle de la peau reconstruite est plus appréciable, que sur le modèle in vivo. Dans ce dernier cas, l'observation est rendue difficile par la formation de la croûte sur la plaie qui s'accompagne d'une contraction importante du derme. (Figure.8)

37 Chapitre I Introduction: Cicatrisation A B C D Figure 8. Fabrication du modèle de plaie par génie tissulaire. A. Feuillet obtenu après 28 jours de culture. B. Peau reconstruite après différenciation de l'épiderme. C. Formation de la plaie et ajout d'un feuillet dermique sous la peau lésée. D. migration des kératinocytes sur le feuillet de migration après 3 jours de cicatrisation. Ce modèle présente l'avantage de n'être composé que des kératinocytes et fibroblastes, ce qui permet de révéler les événements uniquement dus à ces deux types cellulaires. Breetveld et al[38] montrent le comportement de ces cellules à la suite de lésions par brûlure à la chaleur et au froid. II.D. TECHNIQUES D'ÉVALUATION DE LA CICATRISATION Les études de la cicatrisation cutanée passe par deux phases, la première étant l'induction et le contrôle des lésions suivi d'une phase d'évaluation et de suivi de la cinétique de ce phénomène. Dans un premier temps le suivi est réalisé par simple observation clinique, complété par des prélèvements histologiques, ce qui rend cette évaluation invasive. Ces méthodes présentent des inconvénients liés à la subjectivité de l'évaluation des individus et l'invasivité de la technique histologique. Toutefois, d'autres méthodes basées sur les propriétés physiques de la peau sont utilisées pour ces études. Ainsi, la cicatrisation peut être évaluée par mesure directe des dimensions de la plaie à la règle, une largeur et longueur [39]. L'utilisation de calques transparents, permet le relevé du contour sur du papier millimétré [40]. Ces techniques présentent l'inconvénient de nécessiter un contact direct avec la lésion. Une autre technique présentant le même inconvénient, mais permettant la mesure du volume des plaies par un moulage au moyen d'une gomme siliconée [41]. La cicatrisation peut également être évaluée par photographie étalonnée. Ce procédé évite un contact direct avec la plaie, le contact qui peut être douloureux ou source de

38 Chapitre I Introduction: Cicatrisation contamination. Cependant, il s'agit d'un procédé indirect, nécessitant la connaissance de l'échelle. Cette méthode ne présente pas de différence significative avec la méthode directe [42]. Toutefois, la photographie permet d'apprécier d'autre aspect de la plaie tel que l'aspect de tissu du lit de la plaie, le changement de la couleur avec la présence de nécrose, de tissu de granulation et d'épithélialisation [43]. D'autres techniques optiques sont utilisées pour l'évaluation et la quantification de la réparation des plaies. La Tomographie par Optique Cohérente à polarisation sensitive utilisé par Oh.JT et al [44] permet de visualiser la régénération des fibres de collagène ainsi que de quantifier l'effet de certaines molécules sur le processus de réparation des plaies[44]. L'ensemble de ces techniques peut être complété par d'autres techniques, tel que la PIE (la perte insensible en eau), et la vélocimétrie par laser doppler. De cette manière, la mesure de la PIE ou la perte insensible en eau permet de donner des informations sur le rétablissement de la fonction barrière de l'épiderme. Alors que la technique de vélocimétrie à laser Doppler, permet de mesurer le flux sanguin au niveau de la lésion. Ce flux augmente au fur et à mesure que l'inflammation s'installe, la diminution de sa valeur informe donc sur l'évolution du processus de la cicatrisation.[45]

39 Chapitre I Introduction: Laser III. LASER III.A. GÉNÉRALITÉ Laser est l'acronyme de l'expression anglaise Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, en fait le laser est un amplificateur de lumière fonctionnant grâce au principe de l'émission stimulée de rayonnement. L'histoire du laser a débuté avec Albert Einstein, il y a un siècle. En 1905, il a postulé que l'énergie associée aux photons était directement proportionnelle à la fréquence de la lumière, selon la relation : E= h.ν [h: la constante de Planck, ν: la fréquence de la lumière]. En 1917, il a présenté sa théorie de l'émission stimulée, selon laquelle un matériau pouvait émettre de la lumière s'il était correctement excité. Par la même occasion, il a exposé sa théorie de l'effet photo-électrique, pour laquelle il a reçu le prix Nobel de physique de Il a fallu attendre 1960 pour que le premier laser fonctionnel soit fabriqué par Theodore Maiman. Il a découvert que les ions de chrome d'un rubis artificiel, émettaient de la lumière rouge lorsqu'ils étaient irradiés par la lumière verte d'une lampe au xénon. En déposant une couche d'aluminium à chaque extrémité de la tige de rubis, Maiman réussit à produire le premier laser optique. L'année suivante, le laser à hélium-néon, l'un des plus couramment utilisés aujourd'hui, est inventé. En 1963, le Docteur Leon Goldman [46] a été le premier à utiliser le laser pour une application médicale, dans le traitement de certaines pathologies cutanées par le laser à rubis. D'autres lasers ont été développés, par la suite, comme ceux en argon et le dioxyde de carbone. Le laser utilisé en dermatologie a été révolutionné en 1980, par l'introduction de la théorie de photo-thermolyse par Anderson et Parrish [47]. L'application de cette théorie, implique la destruction sélective de la cible dans la peau avec un minimum de dégâts thermiques. Durant ces vingt dernières années, une bonne compréhension du complexe d'interaction laser tissu, couplée à une avancée de la technologie laser ont permis d'améliorer la chirurgie laser. Actuellement le laser est considéré comme le premier moyen de traitement pour plusieurs problèmes congénital de peau ou autres lésions vasculaires et pigmentaires, ainsi que tatouage et les cheveux non désirés. Les lasers sont employés de plus en plus en médecine. Ainsi des lasers de haute puissance servent à découper et enlever des tissus lors d'interventions chirurgicales, d'autres de plus faible puissance sont utilisés pour le diagnostique médical. Il nous est

40 Chapitre I Introduction: Laser apparu logique d'explorer cette technique pour évaluer son potentiel pouvant être appliqué à notre problématique. III.B. NOTIONS DE BASE III.B.1. LASER: PRINCIPE Les lasers se composent de trois principales éléments: un milieu actif caractérisé par la présence de particules émettant des photons après excitation et qui possédant au moins un état d'énergie excité métastable, un mécanisme de pompage qui apporte au système la quantité d'énergie suffisante pour une excitation des particules, et enfin un résonateur optique ou cavité résonante. Ce dernier est constitué de deux miroirs parallèles entre lesquels est placé le milieu actif. Le premier miroir, le réflecteur, est totalement réfléchissant alors que le second, le coupleur, est semi-transparent, pour permettre à la lumière de sortir de la cavité. a Figure 9: schéma d'émission de lumière: spontanée (a), et stimulée (b). b Le laser ou amplification de la lumière, est la résultante de deux évènement: l'émission spontanée où libération de photon par les particules (atomes) excitées, et l'émission stimulée par progression des photons dans le milieu actif induisant la désexcitation d'éléments excités. Une réaction en chaîne peut alors se produire, entraînant une multiplication des photons dans le milieu actif. Cependant, le résonateur optique contribue en grande partie à l'amplification de la lumière laser. Ses deux miroirs parallèles, permettant la réflexion des photons et par conséquent, la multiplication des passages dans le milieu actif provocant l'émission stimulée d'un plus grand nombre de

41 Chapitre I Introduction: Laser photons. De plus, le résonateur est généralement construit de manière à favoriser des longueurs d'onde bien précise. (Figure 9) L'émission de la lumière laser peut être soit continue, soit sous forme d'impulsions. Cela dépend du mécanisme de pompage utilisé pour exciter le milieu actif et de la capacité de ce dernier à supporter l'énergie qui lui est fournie. III.B.2. LASER: CARACTÉRISTIQUES Un faisceau laser présente un ensemble de propriétés. Ainsi le faisceau laser est un faisceau unidirectionnel de lumière très intense concentrée, le plus souvent, sur des petites surfaces de l'ordre de quelques millimètres carrés. Contrairement à la lumière émise par le Soleil ou par une ampoule à incandescence qui est polychromatique, la lumière produite par un laser est monochromatique. Elle contient très peu de longueurs d'onde, lesquelles sont confinées très près de la longueur d'onde d'opération du laser. Enfin cette lumière laser est cohérente et ordonnée dans le temps et dans l'espace. Ainsi, chaque photon qui la compose oscille en même temps et de la même manière. Le processus d'émission stimulée, est responsable de toutes ces caractéristiques. III.C. LES LASER: DIFFÉRENTS TYPES Depuis l'invention du laser, les modes de production de rayonnement laser se sont multipliés. On compte aujourd'hui, pratiquement, autant de lasers différents qu'il y a d'applications pour ceux-ci. En général, les lasers sont classés selon différents critères, mais principalement ils sont classés selon la nature de leur milieu actif. De cette manière trois groupes de lasers sont distingués: III.C.1. LASERS À GAZ Les lasers à gaz, dont le milieu actif est composé d'un gaz pur ou mélangé, peuvent être excités habituellement par une décharge électrique, mais aussi de manière optique. Ils ont une efficacité moyenne, une directivité exceptionnelle et une puissance variable. L'un des lasers à gaz les mieux connus, est le laser Hélium-néon (He-Ne). Le laser He- Ne émet dans le rouge (632.8nm), avec une pureté de sa longueur d'onde et de sa directivité de faisceau. Il est très utilisé dans le positionnement pour la radiographie

42 Chapitre I Introduction: Laser D'autres lasers ont pour milieu actif un gaz moléculaire, dont le plus connu est le laser à dioxyde de carbone (CO 2 ). Le milieu actif de ce laser est le plus souvent constitué d'un mélange d'hélium, d'azote et de dioxyde de carbone, mais c'est le CO 2 qui produit le rayonnement laser. Il est surtout reconnu pour sa forte puissance (1 W à 1 kw). Cette caractéristique exceptionnelle lui permet de sectionner un tissu organique et d'empêcher le saignement au cours de l'intervention. Il émet à de nombreuses longueurs d'onde dans l'infrarouge mais est surtout utilisé à 9,4 et à 10,4 µm. D'autres gaz moléculaires sont utilisés couramment dans la fabrication de laser : N 2, H 2, CO et N 2 O. Enfin les lasers Excimer possèdent également, un milieu actif gazeux avec des molécules diatomiques excitées, comme le Xe 2, le Kr 2 et le Ar 2. Ce type de laser a été développé pour sa grande puissance d'émission dans l'ultraviolet (10 à 100 MW). Le laser excimer produit de petites impulsions qui permettent de réaliser des ablations de tissus ainsi que des incisions, d'où son utilisation en ophtalmologie particulièrement pour la chirurgie de la cornée. III.C.2. LASERS À SOLIDE Les lasers à solide utilisent comme milieu actif des verres ou des cristaux. Ce dernier se présente sous forme de tige dont les extrémités sont parfaitement parallèles et recouvertes d'un matériau réfléchissant. Ils fonctionnent généralement grâce à un pompage optique, que ce soit par la lumière d'une lampe à décharge ou par un autre laser. Cette catégorie de laser, couvre une grande partie du spectre électromagnétique, de l'infrarouge à l'ultraviolet. Mais ils présentent le risque d'endommager leur milieu actif si sa température devient trop élevée. C'est pour cette raison que les lasers à solide fonctionnent généralement en mode à impulsions, permettant ainsi de préserver le matériau. Trois exemples représentatifs de laser se distinguent: i) laser à rubis fut le premier laser fonctionnel. Le rubis est un cristal d'oxyde d'aluminium (Al 2 O 3 ) contenant des impuretés de chrome (Cr 3+ ). Ce laser émet à une longueur d'onde de 694 nm et couramment utilisé pour l'épilation au laser. ii) le laser à néodyme, dont le milieu actif est une petite plaquette (moins de 1mm d'épaisseur) de composés contenant du néodyme excitée par un laser à argon. iii) le laser YAG est l'acronyme de Yttrium Aluminium Garnet (Y 3 AL 5 O 12 ). Dans ce type de laser la lumière est émise par des impuretés qui dopent le cristal, produisant un rayonnement infrarouge d'une puissance variante de 10 à 100 W. Il excite différents éléments dopant dont le l'erbium (Er 3+ ), le néodyme (Nd 3+ ), ou d'autres ions trivalents de terres rares tels que l'holmium (Ho 3+ ) et le Thulium (Tm 3+ ). Au sein de ce dernier groupe, le laser Er:YAG est largement utilisé en médecine. Ce laser présente un cristal de grenat d'alumine à l'yttrium dopé aux ions trivalents (Er 3+ ). Ce grenat est un cristal isotropique, résistant et présentant d'excellentes qualités optiques. Les ions de terres rares sont excités à des longueurs d'onde du visible ou du proche infrarouge, autorisant ainsi le pompage par la lampe flash (ex.: lampe flash à Xénon)

43 Chapitre I Introduction: Laser Le changement des éléments de dopage du cristal permet la modification de la longueur d'onde émise, par exemple, le laser Er:YSCG (Yttrium Scandium Gallium Garnet) fonctionnant lui aussi sur un principe similaire. Seule sa matrice cristalline est différente, et par conséquent la longueur d'onde nominale est à 2.79 µm. III.C.3. LES AUTRES TYPES DE LASER Il existe d'autres types de laser, dont le milieu actif est différent. Ainsi, on trouve les lasers chimiques dont la lumière laser est produite par la désexcitation des molécules produites par une réaction chimique. On trouve aussi des lasers à colorant, où un colorant organique est pompé optiquement pour produire un rayonnement laser. Ce type de laser est peu pratique vu la forme liquide de son milieu actif. Par contre, il peut produire un rayonnement puissant en mode à impulsion. III.D. DOMAINES D'APPLICATIONS L'ensemble des applications du laser fait appel aux caractéristiques propres au laser. Ainsi la directivité et la cohérence d'un faisceau laser sont grandement appréciables dans les outils de mesures de grande précision. Dans le domaine médical et esthétique, l'utilisation du laser est toujours en augmentation notamment dans le traitement d'anomalies cutanées, tel que les tumeurs bénignes et les angiomes, dans l'effacement des ridules ou des tatouages, ainsi que dans l'épilation, et en ophtalmologie pour la correction des problèmes de vision (myopie, cataracte et décollement de la rétine). En parallèle aux applications médicales du laser, il est également utilisé dans le domaine du diagnostic, par exemple la technique de vélocimétrie Doppler. Cette technique utilise un faisceau laser pour mesurer le flux sanguin. Le laser est également utilisé en mammographie laser, et contrairement à la technique aux rayons X (dangereuse et douloureuse), cette technique permet un diagnostique précoce, sans danger et sans douleur, du cancer en détectant des anomalies dans les tissus. III.E. LASER MÉDICAUX III.E.1. INTERACTION LUMIÈRE-TISSU L'action thérapeutique de l'énergie laser est basée sur la propriété de la lumière laser elle-même et le complexe d'interaction entre le laser et le tissu. [48, 49] [50]. La peau peut être schématisée par une superposition de trois couches d'épaisseur variable et de

44 Chapitre I Introduction: Laser composition hétérogène. Ainsi, l'atteinte d'une cible précise au sein d'un organe, dépend de nombreux facteurs, et particulièrement de l'interaction lumière-tissu. En générale, l'interaction entre le tissu et la lumière peut être caractérisée par trois principes optiques de base: la réflexion, l'absorption et la diffusion. Lorsqu'un faisceau de lumière passe d'un milieu à un autre avec un indice différent. Une partie de ce faisceau est réfléchie au niveau de la frontière entre les deux milieux, alors qu'une seconde partie traverse cette frontière et pénètre le second milieu. Au niveau des milieux opaques, tel que la peau le phénomène de réfraction laisse place à l'absorption et la diffusion. Dans la peau, on parle du phénomène de réflexion dans le cas d'interface des milieux à indice optique très différent. Ainsi deux grandes frontières se distinguent: air-épiderme et épiderme-derme. La première est constituée du stratum corneum qui avec sa forte irrégularité de surface reflète la lumière d'une manière diffuse. La deuxième est représentée par la jonction dermo-épidermique. La présence d'invagination épidermique dans le derme, la différence de structure et de texture entre les deux couches et la présence de chromophores de la peau peut modifier la réflexion de la lumière. Lorsque la lumière incidente traverse un matériau non diffusif, son atténuation est seulement due à l'absorption. Lors de ce processus l'énergie lumineuse est soit convertie en chaleur soit entraîne la disruption de molécule. L'absorption de la lumière par un matériau dépend de divers facteurs: la constitution en atomes et molécules, la longueur d'onde du rayon lumineux utilisé et la concentration d'agent absorbant. Au niveau cutané, le tissu renferme des agents absorbants sous forme de chromophores endogènes ou exogènes. Les chromophores endogènes sont principalement composés de protéines, d'hémoglobine, d'eau et de mélanine ou aussi l'ancre de tatouage (Figure 10). Les composants cutanés et ces chromophores ont des spectres d'absorption avec des différents piques d'absorption en fonction des longueurs d'ondes

45 Chapitre I Introduction: Laser Figure 10: Spectre d'absorption des principaux chromophores endogènes (documentation Cohérente) Selon la première loi de la photobiologie (loi de Grotthus-Draper) la lumière doit être absorbée par le tissu pour exercer un effet, alors que la transmission et la réflexion ne produisent pas d'effet. D'ailleurs, l'eau absorbe dans la région infrarouge (IR), les protéines absorbent dans la région des ultraviolets (UV). Afin d'atteindre un chromophore qui absorbe, dans le spectre visible il est très important de tenir compte de l'absorption des autres chromophores. Le rapport entre la pénétration d'un faisceau et l'absorption tissulaire nécessite l'utilisation de faisceau avec des longueurs d'onde peu absorbées afin d'atteindre des cibles profondes (Figure 11)

46 Chapitre I Introduction: Laser Figure 11: Profondeur de pénétration de la lumière dans la peau pour différentes longueurs d'onde exprimée en (%) d'énergie traversant l'épiderme et/ou le derme (Illustration des auteurs d'après données publiées par Sliney et Worlbarsh 1980[51]) Le troisième devenir de la lumière au sein d'un tissu est la diffusion. Cette propriété est définie comme étant l'interaction du photon avec la matière à l'issu de laquelle la direction du photon incident est modifiée. Pour un tissu donné, la part respective de l'absorption et de la diffusion dépend de la longueur d'onde du rayon incident. Dans la peau le phénomène de la diffusion est essentiellement localisé dans le derme et est principalement induit par la présence des fibres de collagène. III.E.2. L'EFFET DU LASER SUR LES TISSUS L'action de la lumière sur un tissu génère une grande variété d'interaction. Cette diversité dépend du grand nombre de paramètres mis en jeu dans ce type d'interaction tels que les paramètres optiques du tissu (réflexion, absorption, diffusion), les caractéristiques physiques de la cible, et les caractéristiques de la source laser. Les actions du laser sur le tissu peuvent être classées en quatre catégories, à savoir un effet photochimique, photothermique, photomécanique et photoablatif. Ces effets dépendent uniquement de la durée de l'impulsion, pour une même dose d'énergie, (Figure 12)

47 Chapitre I Introduction: Laser Durée d'émission (s) Ablation induite par plasma Photodisruption Effets photomécaniques Effet photoablatif Irradiance (W/cm²) Effet photothermique 1 Effet Photochimique Figure 12: Répartition des effets produits par les lasers sur le tissu biologique en fonction de la durée d'émission et de l'irradiation (d'après Boulnois 1986)[52] Cependant, ces effets ne peuvent pas être strictement séparés en fonction de la durée d'émission. Or, les effets photothermiques jouent un rôle important aussi bien dans le déroulement du processus photochimique que dans le processus photomécanique. Effet photochimique: il s'agit d'un effet de la lumière sur les molécules et les tissus. Cet effet est représenté dans la thérapie photodynamique (PDT). Le principe de la PDT consiste à marquer un tissu biologique par un photosensibilisant puis à irradier la zone à traiter avec un laser dont la longueur d'onde correspond à un pic d'absorption du photosensibilisant. Après excitation de la molécule, la molécule retrouve son état basal, engendre soit une dégradation thermique, soit une émission de rayonnement fluorescent, soit par un transfert énergétique intramoléculaire à l'origine des réactions phototoxique permettant la génération d'agent cytotoxiques. (Ex.: dérivés porphyriques) Effet photothermique: ce terme renferme un large groupe de types d'interactions caractérisées par un changement de température significatif au sein du tissu irradié. En fonction de la durée du chauffage réalisé, et de l'élévation de la température du tissu, différents effets se distinguent comme l'hyperthermie, la coagulation, la volatilisation, la carbonisation

48 Chapitre I Introduction: Laser Le processus de l'effet photochimique résulte de la succession de trois phénomènes: i) la conversion de la lumière laser en chaleur par excitation et agitation moléculaire, ii) le transfert de la chaleur dans le milieu et iii) la réaction tissulaire dépendante de la température. L'utilisation d'un laser ayant une durée d'émission très brève (10ps<x<100ns) génère au niveau des tissus des effets photomécanique. Ainsi la génération d'impulsions laser sub-microseconde, associée au fait de pouvoir focaliser de manière quasi ponctuelle le faisceau laser grâce à sa cohérence spatiale, permet d'obtenir des densités de puissance qui dépasse le gigawatt/cm² et qui sont à l'origine de l'effet photomécanique. Les interactions de ce type permettent d'obtenir de très haute température, sans carbonisation des tissus adjacents, grâce à leur temps d'interaction qui est très court par rapport au temps de relaxation thermique des tissus. En fonction de l'irradiance (W/cm²) utilisée, on peut distinguer deux types d'effets: effet électromécanique et thermomécanique. III.E.3. LASERS EN DÉRMATOLOGIE Plusieurs types de lasers sont utilisés dans la chirurgie laser de la peau (cf.annexe..2). Ces lasers peuvent être classés en fonction de leur mode d'émissions. Ainsi, on distingue: Les lasers à longueur d'ondes continues: comme le CO 2 à longueur d'onde continue, ainsi que la vieille technologie argon émettant un rayon de lumière avec une longue durée d'exposition, induisant une dégradation tissulaire non sélective. Les lasers à longueur d'onde quasi continue: comme les lasers KTP (potassiumtitanyl-phosphate), le Krypton, et le laser APTD (Argon Pumped Tunable Dye), envoyant des rayons à longueur d'onde continue en petits segments et produisant une interruption de l'émission constante du laser. Le système des lasers pulsés: émet une lumière laser à énergie très élevée, dans une ultracourte pulsation, avec une durée d'interpulsation relativement longue (0,1-1s). Ce système peut avoir une longue pulsation, tel que le PDL (Pulsed Dye Laser) avec une durée de pulsation comprise entre 450ns et 40ms ou à très longue pulsation (5-100ns), comme le QS (quality-switched) alexandrite ou aussi le neodymium: yttriumaluminium-garnet (Nd:YAG). Les lasers QS possèdent un volet électro-optique, qui permet la libération de l'énergie stockée dans la cavité laser, en une rafale de courte pulsation de forte énergie, délivrant ainsi une énergie qui s'élève à 10 9 W. Basé sur le même principe, les laser Erbium:YAG sont utilisées en chirurgie esthétique pour le relissage des imperfections cutanées. Le laser Er:YAG pompé par flash peut fonctionner à une cadence de 10 à 50 Hz (barreau et lampe avec refroidissement par circulation d'eau) puisqu'il présente une bonne conductivité thermique. Il peut délivrer

49 Chapitre I Introduction: Laser des impulsions de 200 µs avec une énergie de 1 Joule bien que le rendement de ce laser ne soit faible, l'intérêt majeur de celui-ci est son absorption par l'eau, qui est de 10 fois supérieur à celle du CO 2 (Figure 13). Le terme superpulsé est réservé au laser CO 2, qui est modifié pour produire une très courte pulsation, permettant une réduction du dommage thermique ainsi qu'une évaporisation de tissu. Figure 13: Spectre d'absorption de l'eau (d'après S.Mordon) Les systèmes pulsés à longueur d'onde quasi continue (à l'opposé des systèmes à longueur d'onde continue) sont les mieux adaptés pour la chirurgie cutanée, car leur action est basée sur le principe de la photothermolyse sélective, dû le temps de relâchement thermique très court, de la plupart des chromophores cutanés. Ainsi, le choix du laser doit se baser sur les caractéristiques individuelles d'absorption du chromophore cible

50 Chapitre I Objectifs III.F. INTERET DE L'OUTIL LASER Les propriétés et les caractéristiques de la lumière laser (la cohérence, la directivité et la puissance constante et contrôlable), font de ce dernier un bon outil d'induction de lésions cutanées contrôlées. Cet outil permet, au niveau de la peau, d'enlever progressivement des couches du tissu de façon précise au moyen d'un réglage de l'énergie laser [53, 54]. De nombreuses études ont été réalisées afin de comparer les différentes techniques d'induction de lésion, telles que le dermatome, la dermabrasion ou encore le punch à biopsie [55], ainsi que la technique de bulle de succion, permettant la séparation entre le derme et l'épiderme [56]. Ces techniques ont été comparées aux lasers CO 2 et erbium:yag, de points de vue contraction et réparation de lésions ainsi que sur la présence de dommage thermique [57]. Ainsi, le laser Er:YAG n'induit pas de contraction de la lésion, contrairement au laser CO 2 qui provoque, selon cette étude, une importante contraction de la lésion. Cependant l'er:yag permet une ablation des couches superficielles de la peau progressivement, avec un minimum de dommage thermique résiduel. D'autres études utilisant l'er:yag, ont été utilisé dans l'amélioration de la perméabilité du stratum corneum à certaines molécules chimiques et même de l'adn [53, 58], ou pour déterminer son rôle dans l'amélioration des cicatrices post-brûlure. [59] Les avantages et les caractéristiques du laser Er:YAG, le place en tête de liste des techniques susceptibles d'induire des lésions expérimentales sans une interférence avec le processus normal de réparation tissulaire. De ce fait, le laser Er:YAG a été adopté pour la réalisation des lésions expérimentales

51 Chapitre I Objectifs IV. OBJECTIFS DE LA THÈSE La peau ou tégument remplit une multitude de fonctions dont celles de la survie des êtres. Ainsi, toute blessure cutanée serait mortelle sans processus de réparation: la cicatrisation. Afin de comprendre ce mécanisme et pour mieux l'améliorer, des études ont été réalisées sur des cas cliniques de lésions traumatiques. Ces lésions sont d'origines diverses, d'où la nécessité d'utiliser par la suite des modèles expérimentaux d'induction de lésions cutanées tels que la bulle de succion, le dermatome ou le scalpel. L'ensemble de ces modèles actuels présente un certain nombre de points négatifs, principalement la non-reproductibilité des lésions. Dans le cadre de l'évaluation de l'effet des actifs améliorant la cicatrisation, il est essentiel de pouvoir comparer les résultats obtenus sur un modèle de lésions standards afin de mieux suivre l'évolution de ces lésions. Dans ce but et comme finalité du travail de cette thèse, nous allons valider le laser Er:YAG comme technique répondant à nos perspectives d'induction de lésions standards. Il est alors nécessaire de déterminer les paramètres optimaux d'utilisation, à savoir l'énergie en fonction de la profondeur épidermique à atteindre. Pour cela, nous nous sommes fixé les objectifs suivants: Détermination de l'épaisseur de l'épiderme de manière non invasive. Détermination de l'énergie du laser à utiliser en fonction de la profondeur à atteindre. Évaluation qualitative et quantitative des lésions épidermiques induites par le laser, premièrement in vivo sur un modèle animal et deuxièmement in vivo chez l'homme en comparaison à un modèle de référence

52 Chapitre I Objectifs

53 CHAPITRE II: MESURE DE L'ÉPAISSEUR DE L'ÉPIDERME IN VIVO

54 Chapitre II I. INTRODUCTION & OBJECTIFS: La technique de tomographie par cohérence optique (OCT) ou "Biopsie optique", permet une visualisation du milieu interne, apportant ainsi une solution au problème de la mesure de l'épaisseur de l'épiderme et par la suite la quantification du tissu enlevé. Largement utilisée en ophtalmologie, l'oct est aussi utilisée en dermatologie permettant la visualisation des couches superficielles de la peau. Toutefois, La visualisation de ces couches ne permet pas la détermination et la mesure exacte de l'épaisseur de l'épiderme. De ce fait, l'objectif principal de cette partie est la validation de la technique d'oct comme technique de mesure de l'épaisseur de l'épiderme de manière non invasive, par comparaison à la technique de référence: l'histologie. II. MATÉRIELS ET MÉTHODES II.A. MODÈLES DE PEAU UTILISES Des explants de peau humaine ont été obtenus lors d'interventions de chirurgie plastique au niveau de la région mammaire. Pour cette étude, trois explants ont été recueillis sur trois sujets sains (âgés de 17, 65 et 66 ans). Ces explants ont été lavés dans une série de bains de PBS (phosphate buffer saline) 5x5 min, afin d'éliminer d'éventuels résidus de sang. Ce premier lavage est suivi d'un rinçage dans deux bains d'éthanol 70. L'analyse par histologie et par OCT a été réalisée sur des prélèvements de peau de 6 mm de diamètre: 15 échantillons de peau entière de 6mm de diamètre (5 biopsies par sujet). 1 échantillons de peau strippée par 20 passages de ruban adhésif, éliminant ainsi la totalité du stratum corneum (SC) [60]. 3 échantillons dont l'épiderme est séparé par un choc thermique à 60 C pendant une minute (1min) [61]. II.B. ÉVALUATION HISTOLOGIQUE DE L'ÉPIDERME Pour évaluer l'épaisseur de l'épiderme, des prélèvements ont été effectués sur les explants à l'aide de "punch à biopsie". Les biopsies ont été inclues dans un milieu d'inclusion, (Tissu tek, OCT SAKURA, Pays-Bas) puis congelées immédiatement par immersion dans l'azote liquide. Au moyen d'un cryotome avec une température de - 20 C pour la chambre et -24 C pour le porte objet, des coupes de 5µm d'épaisseur ont

55 Chapitre II été réalisées puis colorées de manière standard à l'hémalun Éosine, un colorant nucléaire (DiaPath, Italie) et l'éosine un colorant cytoplasmique (DiaPath, Italie). Les coupes ont été observées à l'aide d'un microscope optique (Zeiss-Axioskop20, Zeiss, GmbH, Allemagne) et photographiées au moyen d'un appareil photo numérique. Les images numérisées sont analysées par la suite avec le logiciel, développé en interne, "AnImTomo", permettant de mesurer l'épaisseur moyenne de l'épiderme. II.C. ÉVALUATION DE L'ÉPIDERME PAR TOMOGRAPHIE À COHÉRENCE OPTIQUE II.C.1. PRINCIPE D'OCT La tomographie par cohérence optique (OCT), est une technique d'imagerie optique qui permet de visualiser in vivo des tissus en profondeur allant jusqu'à 1 à 2mm. Elle fait appel à un large spectre de lumière. Le tomographe à cohérence optique basée sur l'interféromètre de Michelson est décrit en figure 14. Une lumière de largeur spectrale Δλ et de longueur d'onde centrale λ0 est divisée (50/50) par un séparateur puis dirigée d'une part sur un miroir de référence placé à une distance parfaitement définie (bras 1) et d'autre part sur l'échantillon tissulaire à étudier (bras 2). Cette lumière est réfléchie par le miroir et par l'échantillon. Les 2 faisceaux réfléchis se recombinent uniquement lorsque les deux distances parcourues sont identiques. Le déplacement du miroir de référence permet de recueillir une réflexion provenant de l'échantillon à des distances variables. Sa faible longueur de cohérence lui permet d'avoir une résolution spatiale en profondeur, inférieure à 10µm. En revanche, avec cette résolution, le signal est atténué et ceci en fonction des tissus à étudier [62, 63]. II.C.2. RÉALISATION D'IMAGES L'appareil OCT utilisé est un Skindex300 (ISIS Optronics GmbH, Mannheim, Allemagne) ayant une source lumineuse proche de l'infrarouge (1300nm) et une puissance lumineuse de 20µW. Il permet l'acquisition d'images 2D de 1mm (largeur) x 0,9mm (profondeur), ainsi que d'images 3D d'une résolution de 3µm (largeur)x 5µm (profondeur) [12, 64]. Avant chaque acquisition d'image, une couche d'aquagel (Supragel, LCH medical product, Paris-France), est appliquée sur l'échantillon afin d'obtenir un bon couplage optique. Pour chaque échantillon de peau (entière, strippée et où épiderme séparé), dix images de dix coupes ont été réalisées

56 Chapitre II Figure 14: Schéma d'un tomographe à cohérence optique. II.C.3. ANALYSE D'IMAGES Les images ont été analysées par la suite à l'aide d'un logiciel de traitement d'images (AnImTomo -logiciel développé par le service Imagerie et Ingénierie Cutanées au CRP- ) qui permet la mesure semi-automatique de l'épaisseur moyenne de l'épiderme. Pour celle-ci les frontières inférieures et supérieures de l'épiderme sont définies et l'aire est calculée puis divisée par sa longueur (longueur de la fenêtre). Avant cette analyse, la qualité de l'image est améliorée au moyen d'algorithmes qui diminuent le bruit d'interférence et corrigent la différence de luminosité et contraste de l'image. Ensuite, l'image est segmentée permettant ainsi l'extraction automatique de l'interface gel/épiderme (frontière supérieure) et l'interface épiderme/derme (frontière inférieur). III. RÉSULTATS III.A. COMPARAISON QUALITATIVE ENTRE HISTOLOGIE ET OCT: STRUCTURE DE LA PEAU Deux images de la peau entière par OCT et en histologie sont montrées à la même échelle dans la figure 15. L'image OCT montre la présence de trois couches avec une intensité lumineuse et une texture bien distincte. Une première couche très brillante (a), suivie d'une seconde couche plus épaisse et d'intensité lumineuse plus faible (b) et enfin, une dernière couche très épaisse ayant une texture moins homogène (c). On retrouve

57 Chapitre II cette même structuration en trois couches au niveau de la coupe histologique. Ces trois structures sont le SC, l'épiderme et le derme. Membrane Gel a b 100µm A c B 50µm Figure 15: Peau entière humaine. (A) image OCT, (B) coupe histologique (x200). (a) Stratum corneum, (b) Épiderme, (c) Derme. L'épaisseur histologique moyenne de l'épiderme est de 52±18µm. Afin de confirmer cette interprétation quant à l'identification de l'épiderme vivant, l'explant humain strippé, sans SC est montré dans les figures 16 et 17. Bien que l'histologie montre une absence du SC (Figure 16B), l'image OCT montre toujours une couche brillante mais mince (*). En regardant de plus près la peau avant et après stripping (Figure 17), le SC entier semble être constitué d'une épaisse couche brillante et qu'après enlèvement par ruban adhésif, il n'en reste qu'une couche mince. Cette dernière pourrait correspondre au stratum compactum ou au stratum granulosum de l'épiderme vivant. * 100µm A B 50µm Figure 16: Peau strippée. (A) image OCT et (B) coupe histologique. (*): couche brillante (interface gel/épiderme).(coloration HE, Gx200)

58 Chapitre II SC A Figure 17: Images OCT illustratives de la différence de l'épaisseur du SC, (A) avant et (B) après stripping (Gx2,5). B 100µm A B 25µm Figure 18: Séparation thermique de l'épiderme et du derme. (A) image OCT, et (B) coupe histologique (Gx400). Épaisseur d'épiderme (84±42µm) et (79±22µm) respectivement. 100µm A 50µm B Figure 19: Images de l'épiderme séparé thermiquement (A) OCT, (B) histologie (Gx200)

59 Chapitre II Derme 100µm A B 50µm Figure 20: Images du derme séparé thermiquement. (A)OCT et (B) histologie (Gx200). La séparation thermique entre le derme et l'épiderme permet une conservation des papilles dermiques intactes, bien visible au niveau des images OCT (Figure 18A). L'image histologique confirme la séparation des deux couches (Figure 18B). Les images de l'épiderme et du derme prises séparément (Figure 19 et Figure 20), montrent la forme ondulée de l'interface de ces deux structures avec une même épaisseur (Figure 19). III.B. COMPARAISON QUANTITATIVE DE L'ÉPAISSEUR DE L'ÉPIDERME: HISTOLOGIE ET OCT Les mesures d'épaisseur de l'épiderme effectuées par AnImTomo, à partir d'images OCT et histologie, ont été réalisées sur des échantillons d'épiderme séparés thermiquement du derme (cf.annexe.3). L'analyse de la correspondance entre les mesures obtenues par OCT et par histologie montre une corrélation raisonnable avec un coefficient r = 0,88. Les mesures histologiques sont environ 30% plus faibles que leurs équivalentes en OCT (Figure 21). Ces résultats sont différents de ceux obtenus à partir des échantillons de peau entière. Où la corrélation est plus faible (r = 0,68) (Figure 21). Ceci est probablement du au faible nombre d'échantillons et la petite gamme d'épaisseurs mesurées de 50 à 75µm pour l'oct, et 45 à 90 pour l'histologie, rendant ainsi la conclusion difficile

60 Chapitre II 120 r = r 0,6899 = 0, r Rr= = 0, Epaisseur-Histologie (µm) Epaisseur-Histologie (µm) Epaisseur-OCT (µm) A Epaisseur-OCT (µm) B Figure 21: Corrélation des mesures d'épaisseur de l'épiderme obtenues par OCT et histologie. (A) épiderme isolé thermiquement (n=15, r=0.88). (B) peau entière (n=36, r=0.68) IV. DISCUSSION & CONCLUSION Dans l'objectif de déterminer l'épaisseur de l'épiderme de manière non invasive, l'utilisation de la technique de tomographie par cohérence optique permet de distinguer clairement deux grandes structures [60, 65-68]. De la même manière la comparaison de ces résultats aux coupes histologiques, réalisées auparavant, a permis l'identification de deux couches: l'épiderme suivi d'un derme. Welzel et al. ont définis la première couche brillante, au niveau d'une image de peau normale prise par OCT, comme étant une interface de contact entre la peau et le milieu extérieur. Par la suite, l'identification du stratum corneum a été réalisée sur des cas pathologiques, tels que le psoriasis et les inflammations dues au UV, où le SC est très épais et où il apparaît comme une bande épaisse et très brillante [66, 67, 69]. L'utilisation de la technique de stripping, sur une peau normale, permet d'éliminer le SC (Figure 16B) [60, 70]. Ainsi, la comparaison d'image OCT d'une peau strippée au témoin, permet d'identifier la première couche brillante, comme étant le SC, ce qui a été confirmé, histologiquement, par la suite (Figure 15, 16). Ainsi, le SC est suivi de l'épiderme vivant et qui peuvent être séparées par une fine bande sombre. La séparation thermique de l'épiderme de ses ancrages dermiques permet de démontrer que la deuxième structure visible au niveau de l'image OCT est bien l'épiderme, suivi d'une dernière couche: le derme [61]. Les images OCT de ces deux couches, prises séparément, montrent des papilles dermiques et épidermiques bien conservées correspondant aux observation obtenu à partir de la peau normale (Figure 19, 20). L'utilisation de la méthode de détermination de l'épaisseur de l'épiderme, à partir d'images OCT, basée sur le scan-a [65] a été remplacé par une mesure manuelle. Cette

61 Chapitre II dernière est basée sur une délimitation visuelle de limite inférieure de l'épiderme. En effet, les travaux de Yamashita et al.[71] ont montré que la bande sombre, limitée par les invaginations épidermiques d'un côté, et par le derme réticulaire de l'autre, représente bien le derme papillaire. La corrélation entre les mesures obtenues par histologie ainsi que par OCT, est loin d'être facile à confirmer même après réalisation de coupes histologiques sériées [68]. Cette difficulté est due d'une part aux limites d'échantillonnage avec une absence d'échantillons aux épaisseurs extrêmes, et d'autre part aux limites techniques de l'appareil OCT avec une atténuation du signale. Cette perte d'information en profondeur est due à la constitution hétérogène de la peau [68] liée en grande partie à la présence de la matrice extracellulaire, en particulier aux faisceaux de collagènes et leurs orientations [67, 68]. L'étude comparative des épaisseurs de l'épiderme seul séparée thermiquement, mesurée par histologie et par OCT, révèle une correspondance entre les différentes valeurs sans corrélation parfaite. Les mesures histologiques sont plus faibles d'environ 30% par rapport à celle obtenues par OCT En conclusion, la technique de tomographie à cohérence optique a permis la visualisation des 3 principales couches de la peau de manière non-invasive: le SC, l'épiderme et le derme. Cette visualisation est rendue possible grâce à la présence des textures caractéristiques pour chacune de ces couches. Ainsi elle pourra être utilisée dans l'appréciation du stade de la cicatrisation cutanée par une détection de cette couche brillante (SC) et par conséquent de la présence d'un nouvel épiderme fonctionnel. Cependant, il est souvent difficile d'identifier avec certitude les interfaces des 3 couches afin de mesurer leur épaisseur. Ceci expliquerait l'absence d'une corrélation acceptable lors de la comparaison des mesures obtenues par OCT avec celles obtenus par histologie pour l'épaisseur de l'épiderme. Par conséquent son utilisation comme technique noninvasive de mesure de l'épaisseur de l'épiderme in vivo n'est pas conseillée. Cette utilisation est liée à l'établissement d'une corrélation entre les mesures obtenues par les deux techniques, sur des échantillons d'une large gamme d'épaisseur

62 CHAPITRE III: PROFONDEUR D'ACTION DU LASER EN FONCTION DE LA FLUENCE APPLIQUÉE

63 Chapitre III I. INTRODUCTION ET OBJECTIFS La technique d'imagerie OCT présente un certain nombre d'avantages, dont principalement la visualisation des couches superficielles de la peau de manière noninvasive. Cependant, son utilisation n'a pas pu aboutir à des résultats concluants pour la détermination de l'épaisseur de l'épiderme. Or, il est primordial de déterminer la relation entre l'énergie laser et la profondeur atteinte. À ce titre, nous avons choisi la technique d'empreintes cutanées associée à l'imagerie tridimensionnelle. La technique d'empreintes cutanées, est utilisée seule [72, 73] ou couplée à la profilométrie par projection de franges, dans l'étude des micro-topographies des rides [74, 75]. Les objectifs du travail de cette partie expérimentale se résumaient en l'évaluation de la profondeur d'ablation par laser en fonction de l'énergie appliquée. En conséquence, le travail a été réalisé en deux parties i) ex vivo, sur la peau humaine et ii) in vivo sur la peau des rats Hairless. II. PARTIE 1: PEAU HUMAINE EX VIVO II.A. MATÉRIELS ET MÉTHODES II.A.1. MODÈLE DE PEAU Des explants cutanés humains (Cf. partie I) ont été utilisés comme modèle de peau pour cette étude. II.A.2. ABLATION LASER Après immobilisation des rats, les plaies ont été induites à l'aide d'un laser Erbium:YAG (Yittrium-Alluminium-Garnet) (Dermablat, Aesculap-Allemagne), avec une longueur d'onde de 2,94 µm et d'une durée de pulsation de 3 ms. 'Les paramètres de réglage du faisceau laser focalisé, utilisés étant un diamètre de 1,6, 3 ou 5mm, avec une fréquence de 10Hz et des énergies de 100, 200, 400, 600, 800 ou 1000mJ

64 Chapitre III II.A.3. ÉVALUATION TOPOGRAPHIQUE DE LA PROFONDEUR D'ABLATION Camera CCD Projecteur Zoom objectif A B Figure 22: Appareil de projection de franges, (A) l'ensemble du système, (B) schéma de l'arrangement projecteur et caméra. L'évaluation tri-dimensionnelle topographique de la lésion induite par le laser a été réalisée avec une technique basée sur la projection de franges d'interférence. Cette technique permet de reconstruire en 3D le micro- et le macro-relief d'une surface et de quantifier sa rugosité, son volume et sa profondeur [76]. Le système est composé d'une caméra CCD et d'un module de projection de franges. Ces dernières sont projetées sur la surface à analyser et des images de franges sont acquises par la camera à un angle de 45 par rapport au projecteur de franges (Figure 22). La résolution du système dépend de la largeur de la frange projetée et de l'angle entre l'axe optique de la caméra et celui du projecteur. La déformation des franges audessus du plan de référence est proportionnelle à la hauteur séparant l'objet de ce plan. Ainsi, une série d'images de franges, contenant l'information de la hauteur de l'objet analysé, est reconstruite en une seule image 3D. Le système de projection de franges utilisé est un Dermatop comportant un logiciel d'acquisition d'images OPTOCAT (Breuckmann-Allemagne). Ce système a été utilisé directement sur la surface à évaluer, comme la peau ou indirectement sur des répliques ou empreintes en polymère siliconé de la même surface. Un logiciel de traitement d'images Toposurf (Imagerie Digitale, Besançon, France), permet d'analyser la topographie reconstituée en 3D avec des paramètres standards de rugosité et des outils d'analyse de la profondeur et du volume. C'est avec ces derniers outils que des profils de profondeurs des lésions ont été générés permettant le calcul des profondeurs moyennes des lésions. Ainsi, pour chaque lésion induite, nous avons extrait 4 profils dont la profondeur moyenne est mesurée en 10 points du profil (Figure 23a, b)

65 Chapitre III (1) (2) (3) (4) A Figure 23: Représentation tridimensionnelle d'une ablation tissulaire induite par laser (A), et un exemple d'un profil en 2 dimensions (B). B II.A.4. ÉVALUATION HISTOLOGIQUE Des biopsies de 6 mm de diamètre ont été réalisées, incorporant la lésion et un peu de peau saine autour. Les biopsies ont été fixées à froid (cryo-congélation). Les cryocoupes sont réalisées par congélation, dans l'azote liquide, des biopsies incluses dans une résine (Tissu tek, OCT SAKURA, Pays-Bas). À l'aide d'un cryotome à - 25 C, on réalise des coupes de 7µm. Ces coupes sont colorées à l'hématoxyline - Éosine (HE). L'observation des coupes histologiques a été réalisée au moyen d'un microscope optique (Axioskop 20, ZEISS). Les images acquises à l'aide du logiciel d'image (Spot V3.5, Diagnostic Instruments. Inc, Sterling Heights, MI, USA), permettent la mesure de l'épaisseur des couches de la peau. En pratique, ces mesures ont consisté en la mesure de la longueur des traits dessinés perpendiculairement entre la surface de la peau et la base de la couche à mesurer (SC et épiderme) (Figure 24). Le logiciel permet le calcul de la taille moyenne des traits et par conséquent le calcul de l'épaisseur moyenne de la couche analysée. Ainsi, l'épaisseur moyenne de l'épiderme et du SC ont été mesurées sur la peau normale non-lésée afin de connaître les dimensions de ces structures. La même approche a été appliquée sur les images des lésions, dans la limite du possible, pour évaluer la profondeur du tissu ablaté

66 Chapitre III Stratum corneum Épiderme Derme Figure 24: Mesure de l'épaisseur du stratum corneum et de l'épiderme. (Gx200). II.A.5. PROTOCOLE D'ÉTUDE EX VIVO: LA PEAU HUMAINE Les énergies à tester ont été choisies à partir de la littérature. Ainsi nous avons choisi des énergies qui sont un multiple de 10 J/cm². De ce fait nous avons induit des lésions en appliquant les fluences suivantes: 10, 50 et 200 J/cm². Ces différentes fluences nous permettent d'atteindre des niveaux structuraux différents de la peau (SC, épiderme et derme). Des explants mammaires de deux sujets (17 et 66 ans) ont été obtenus lors d'interventions de chirurgie plastique. Le même jour, un échantillon de chaque explant a été placé dans une boîte de pétri, puis des lésions ont été induites au moyen du laser. Ainsi, chaque fluence a été appliquée une fois sur chacun de ces échantillons. Au total six lésions ont été réalisées. Immédiatement après l'induction, des images ont été prises par la technique de projection de frange pour une analyse de la profondeur. Les biopsies de ces lésions ont été prélevées et préparées pour l'histologie. II.B. RÉSULTATS II.B.1. ÉVALUATION TOPOGRAPHIQUE Les résultats de cette évaluation sont présentés dans les figures 25 et 26 montrant respectivement les images reconstruites en trois dimensions des trois lésions induites, et leurs profils moyens calculés. Avec la fluence de 10 J/cm², l'emplacement du faisceau laser est visible par une absence du microrelief de la peau (Figure 25a). Cette absence est illustrée au niveau du profil de la lésion (Figure 26), qui montre une faible dépression d'une profondeur moyenne d'environ 18 µm par rapport à la peau saine. Dans le cas de la fluence 50 J/cm², la dépression est plus marquée avec une profondeur moyenne d'environ 44 µm. On observe aussi la présence d'irrégularités au niveau de l'image 3D (Figure 25b), qui semblent être présentes également au niveau du profil (Figure 26). La fluence de 200 J/cm² a permis quant à elle la réalisation d'une lésion profonde aux bords bien nets (Figure 25c). Au fond de la cavité, la présence de pics correspondrait à une présence de débris tissulaires ou à un artefact de mesure lié aux

67 Chapitre III parois abruptes de la lésion. Le profil calculé, de cette dernière, montre une cavité d'une profondeur maximale d'environ 800 µm (Figure 26). a b c Figure 25: Exemples d'images reconstruites en 3D des ablations laser réalisées à des fluences de (a) 10J/cm², (b) 50J/cm² et (c) 200J/cm². II.B.2. ÉVALUATION HISTOLOGIQUE Les figures 27 b-d montrent des exemples de coupes histologiques correspondant aux 3 fluences appliquées ainsi qu'une coupe de peau témoin (Figure 27a). La figure 27b montre un SC fragmenté et déstructuré à la suite d'une application de 10 J/cm². L'utilisation de la fluence de 50 J/cm² (Figure 27c) montre une ablation complète de l'épiderme à l'endroit de l'impact du faisceau, avec la présence d'une bande de tissu amorphe et sombre qui serait une partie coagulée du derme papillaire. On observe également des irrégularités sous forme d'ondulations pourrant correspondre aux microcavités visibles au niveau de l'image 3D de la même lésion (Figure 27b)

68 Chapitre III Largeur de la lésion (mm) 0 0,5 1 1, Profondeur (µm) J/cm² 50J/cm² 200J/cm² Figure 26: Profil moyen des lésions obtenues par utilisation des fluences 10, 50 et 200 J/cm². En ce qui concerne la fluence de 200 J/cm², nous avons constaté une ablation totale de l'épiderme, du derme papillaire ainsi qu'une partie du derme réticulaire (Figure 28d). L'image histologique permet une mesure de la profondeur de la lésion qui donne une valeur moyenne de 284 ±126 µm. Toutefois, le diamètre mesuré sur l'image 3D de la même lésion représente le diamètre réel de l'impact laser, et correspond à 1,4 mm (Figure 26c). L'analyse de l'image histologique (Figure 38d) permet de déterminer la largeur de la lésion et par conséquent son diamètre qui est de 1,14 mm, soit une diminution de 20% par rapport au diamètre mesuré sur l'image 3D. Cette diminution peut être attribuée à une déformation tissulaire lors du prélèvement et de la fixation de l'échantillon pour l'histologie.( cf.annexe. 8) En tenant compte d'une contraction de 20%, nous avons redimensionné l'image histologique (Figure 28c), afin de simuler la morphologie réelle de la lésion, en agrandissant sa largeur et en diminuant sa hauteur de 20% (Figure 28a). À partir de l'image redimensionnée (Figure 28b), une profondeur moyenne de 238 ±102 µm a été mesurée. Cela correspond mieux à la profondeur mesurée par la technique d'imagerie 3D. Le tableau 1 présente les valeurs de profondeur des lésions mesurées par les deux techniques ainsi que la correction des valeurs obtenues par histologie. Ces données sont aussi présentées dans le graphique de la figure 28b

69 Chapitre III a b c d 150 µm 1.14m Figure 27: Histologie de la peau humaine ex vivo (a) avant, et (b) après ablation laser à des fluences de10 J/cm², (c) 50 J/cm² et (d) 200 J/cm² (Gx100). L'endroit d'impact du faisceau est indiqué par les flèches. Le diamètre de la plaie (d) est de 1,14 mm (Gx200). Fluence (J/cm²) Technique 3D Histologie Histologie Corrigée Moyenne (µm) Écart type (µm) Moyenne (µm) Écart type (µm) Moyenne (µm) Écart type (µm) Tableau 1: Comparaison des mesures de la profondeur des lésions obtenues par la technique 3D et par 'histologie, avant et après correction, (n = 3)

70 Chapitre III Ø Ø+20% P P- 20% A Profondeur (µm) D Histology Fluence (J/cm²) B 1.4mm Figure 28: (A) Schéma explicatif de la correction de l'artefact induit par l'histologie. La correction est apportée aux coupes histologiques, pour compenser l'effet de la contraction due à la fixation. (B) Le graphique présente la comparaison entre les résultats 3D et ceux obtenus après correction de l'histologie. (C) La coupe histologique montre le diamètre corrigé (1,4 mm). (Gx100, coloration HE. La barre=150 µm). C

71 Chapitre III III. PARTIE 2: PEAU DES RATS HAIRLESS IN VIVO À l'issu de l'étude ex vivo, il a été constaté que la fluence nécessaire pour une ablation de l'épiderme est comprise entre 10 et 50 J/cm² environ. Par conséquent, dans cette partie nous avons testé cette gamme de fluence. III.A. MATÉRIELS ET MÉTHODES III.A.1. MODÈLE DE PEAU Dans cette partie nous avons choisi les rats Hairless (Charles River France, Les Oncins, France) comme modèle d'étude. L'absence de poils chez ce modèle facilite la visualisation des lésions induites. Deux rats mâles âgés de 7 semaines sont utilisés pour l'induction des lésions au niveau de la région dorsale de part et d'autre de la colonne vertébrale. Avant l'induction des plaies, le rat est anesthésié (120mg/kg kétamine, IMALGÈNE 500). Cette solution anesthésiante est mélangée, volume pour volume, à l'acépromazine (Calmivet, Vétroquinol, France), avant administration. III.A.2. ABLATION LASER Au moyen du même laser utilisé précédemment Erbium:YAG (cf. II.B.). Les lésions ont été induites à l'aide d'un faisceau laser d'un diamètre de 5mm, des fluences de 10 à 50 J/cm² ceci par une multiplication de passage à l'aide d'un faisceau de 10J/cm² et une fréquence de 1 Hz.( cf.annexe.4) III.A.3. ÉVALUATION TOPOGRAPHIQUE DE LA PROFONDEUR D'ABLATION La morphologie de la plaie est évaluée à l'aide d'empreintes cutanées avec un polymère siliconé (SILFLO, Flexico Developements, UK). L'empreinte est réalisée en mélangeant 4 gouttes du catalyseur à 3ml du polymère siliconé, et en étalant le mélange sur la région cible. L'analyse des empreintes cutanées est réalisée par acquisition et traitement d'images de projection de franges (cf. II.A.3)

72 Chapitre III III.A.4. ÉVALUATION HISTOLOGIQUE Des biopsies de 6 mm de diamètre ont été réalisées, incorporant la lésion et un peu de peau saine au tour. Les biopsies ont été fixées au Formol à 10% dans du tampon phosphate 0,2 M, à ph 7,2. Par la suite les biopsies sont montées dans des blocs de paraffine, et qui seront coupée par la suite à l'aide d'un microtome à des épaisseurs de coupes de 5µm. Ces coupes sont colorées à l'hématoxyline - Éosine (HE). III.A.5. DÉROULEMENT DE L'ÉTUDE Une gamme de fluence allant jusqu'à 50J/cm² a été appliquée sur chacun des deux rats Hairless. Ainsi, sur deux rats les fluences 10, 20, 30, 40 et 50J/cm² ont été appliquées deux fois sur chaque rat, de part et d'autre de la colonne vertébrale (Figure 29). Immédiatement après induction des lésions, des empreintes siliconées ont été réalisées pour analyser la profondeur par la technique de projection de franges. Dans ce but, "n" profils ont été évalués sur chaque lésion (n=4 lésions par fluence) Flu-5 Flu-4 Flu-3 Flu-2 Flu-1 Ar. Flu-5 Flu-4 Flu-3 Flu-2 Flu-1 Av. 1,5 cm Figure 29: Schéma représentatif des zones ablatées. (Flu.: Fluence) Témoin III.B. RÉSULTATS III.B.1. ÉVALUATION TOPOGRAPHIQUE Les résultats de cette évaluation sont présentés dans la figure 30 montrant les images reconstruites en trois dimensions des cinq lésions induites. Les profondeurs moyennes atteintes par les différentes fluences utilisées sont montrées au niveau du tableau 2. Ces profondeurs augmentent en fonction des fluences utilisées. Ainsi, une fluence de 10J/cm², induit une lésion avec une profondeur d'environ 28µm, cette profondeur

73 Chapitre III augmente en fonction de la fluence utilisée pour atteindre une profondeur moyenne de 69µm. La représentation graphique de ces résultats (Figure 31) montre clairement la progression de la profondeur des lésions atteintes en fonction des différentes fluences. III.B.2. ÉVALUATION HISTOLOGIQUE L'analyse histologique des lésions induites par le biais du laser montre une ablation nette des tissus superficiels de la peau. La détermination des profondeurs atteintes est rendue difficile par la déformation des échantillons du aux traitements histologiques. L'utilisation d'une énergie de 10 J/cm² permet l'ablation d'une partie de l'épiderme dont l'épaisseur témoin moyenne est de 56±9 µm (Figure 32a). Cette ablation est bien visible au niveau de la figure 32a qui laisse apparaître le reste des cellules épidermiques non pulvérisées. L'augmentation de la fluence utilisée à 20 J/cm² permet une ablation de l'épiderme sauf à quelques rares endroits, pouvant correspondre aux papilles épidermiques. La limite de l'impacte du faisceau laser est visible au bord de la lésion par l'absence du SC et de l'épiderme (Figure 32b)

74 Chapitre III (a) (b) (c) (d) (e) Figure 30: Exemples d'images reconstruites en 3D des abrasions laser réalisées par les fluences (a) 10, (b) 20, (c) 30, (d) 40 et (e) 50 J/cm²

75 Chapitre III Fluences (J/cm²) Profondeurs (µm) 27.7± ± ± ± ± 10.8 Tableau 2: Mesures des profondeurs moyenne des lésions (n=4). Profondeur (µm) Fluence (J/cm²) Figure 31: Courbe de profondeur en fonction de la fluence du faisceau laser. Les essais sont réalisés par un simple tir. L'utilisation d'une fluence de 30 J/cm² permet l'ablation complète de l'épiderme ainsi qu'une partie du derme papillaire (Figure 32c). L'épaisseur des tissus ablatés, est difficile à déterminer en se basant sur les coupes histologiques, qui sont déformées sous l'effet des traitements histologiques. Au niveau de cette coupe histologique une région de coagulation est décelée au milieu de la coupe. Cette zone de coagulation est bien présente et de plus en plus importantes au niveau des lésions induites par des fluences plus importantes (40 et 50 J/cm²) (Figure 32d,e). Une fluence de 40 J/cm² permet d'induire une lésion qui atteint la partie supérieure du derme réticulaire, de même que la fluence utilisée de 50 J/cm² permet d'avoir une ablation plus profonde. Ces lésions atteignent les glandes annexes (glande sébacée)

76 Chapitre III Figure 32: Coupes histologiques, représentatives d'abrasions cutanées induites au moyen d'un faisceau laser de 1,6 mm et les fluences 10, 20, 30, 40 et 50 J/cm², respectivement a, b, c, d et e. (Coloration HE. La barre=250 µm Gx200.) IV. DISCUSSION & CONCLUSION L'acquisition d'images par projection de frange des empreintes cutanées permet une reproduction des reliefs de la peau. Les empreintes ou répliques cutanées ont déjà été utilisées pour l'évaluation morphologique des ulcères de jambe pour une détermination précise de leurs volumes [41]. Depuis lors cette technique est largement utilisée dans l'étude du relief de la peau [77], elle permet d'obtenir des résultats précis et répétables

77 Chapitre III [76]. Cette précision permet son utilisation dans la détermination des profondeurs des lésions induites par lasers. Les résultats obtenus lors des études ex vivo nous ont permis la vérification du rapport entre l'énergie utilisée et la profondeur des tissus atteints. Ces résultats vont dans le même sens que ceux obtenus par Lee et al. [53]. Ainsi l'application d'une fluence de 10 J/cm² enlève tout le relief de la peau et par conséquent enlève la totalité du SC, ce qui est visible au niveau de la représentation 3D (Figure 25a), et confirmé à l'aide des coupes histologique (Figure 27b). La comparaison de la mesure du diamètre de la lésion histologiquement montre un diamètre inférieur au diamètre théorique du faisceau laser (diamètre 1,4 mm), avec une diminution de 20% du diamètre au niveau des coupes histologiques. Cette différence pourrait être due à une contraction des tissus, notamment le derme suite au prélèvement et sous l'effet du traitement histologique. La correction de valeurs des profondeurs mesurées par histologie permet d'obtenir des résultats identiques à ceux de l'imagerie par projection de franges (Figure 27). L'étude réalisée par la suite in vivo chez les rats Hairless, a permis la réalisation des mêmes lésions dans les conditions de la peau normales (tensions mécaniques). L'évolution des profondeurs est proportionnelle aux fluences utilisées. Selon les travaux de Lee [53], l'utilisation d'une fluence de 1,56 J/cm² permet l'ablation d'une couche épidermique d'une épaisseur d'environ 13 µm. L'ensemble de ces travaux souligne l'importance de contrôler la profondeur de tissu ablaté par contrôle de la fluence. Contrairement aux travaux réalisés jusqu'alors où le contrôle des lésions laser est réalisé par un examen clinique et histologique [53, 78], cette technique d'imagerie permet un contrôle non invasif des profondeurs de tissus atteints. L'histologie, considérée comme un standard de mesure des dimensions des structures, peut être faussée sous l'effet du comportement tissulaire (contraction sous l'effet de fixateurs utilisés). L'inflammation au niveau des tissus peut causer une augmentation de la taille et du volume des berges des lésions et par conséquent fausser les mesures. Afin de remédier à ce problème, il est important de réaliser les empreintes des lésions le plus rapidement possible sachant que l'inflammation commence à s'installer dans les vingt premières minutes [11]. Le manque de précision des résultats obtenus au niveau des lésions de faible profondeur (faible fluence 10 J/cm²) montre une limite de la technique, d'imagerie 3D qui dépend des caractéristiques techniques. En conclusion, l'ensemble des résultats obtenus au cours de ces études nous a permis de valider la technique d'analyse par projection de franges comme technique d'évaluation et de mesure de la profondeur des lésions cutanées induites. De la même manière, ces

78 Chapitre III résultats montrent l'erreur introduite par la technique d'histologie dans la détermination des profondeurs de lésions. Ainsi cette technique non invasive présente des avantages lui permettant une utilisation adaptée aux études ultérieures. Cette technique est rapide, utilisable in vivo, serait utile pour des évaluations itératives lors des études de cicatrisation. De plus, elle s'affranchit d'artefacts dus aux traitements histologiques. Néanmoins elle présente des limites pour la détermination des profondeurs très faibles. Cette difficulté est vraisemblablement due aux limites de résolution du capteur optique. La courbe du rapport entre l'énergie choisie et la profondeur atteinte nous a permis de choisir une densité d'énergie qui permettra de réaliser une désépidermisation, sans dommage significatif du derme. Ainsi la fluence de 20J/cm² sera utilisée dans les études qui suivent

79 Chapitre III

80 CHAPITRE IV: VALIDATION DE LA TECHNIQUE D'INDUCTION DES LÉSIONS CHEZ L'ANIMAL

81 Chapitre IV I. INTRODUCTION Il est évident que l'utilisation de la technique d'empreintes cutanées et d'imagerie 3D permet la meilleure reproduction des lésions induites, et par conséquent une meilleure mesure de leurs caractéristiques. Cette utilisation nous permettra une bonne évaluation des résultats obtenus lors des études de validation de l'induction de lésions cutanée par technique laser. Les essais réalisés jusqu'alors au moyen d'un laser mono-spot (sans balayage) ont permis la détermination de paramètres optimaux d'utilisation. L'usage de ces paramètres a permis l'obtention d'une désépidermisation (une évaporation de l'épiderme) sans endommager le derme. Les paramètres d'utilisation ainsi définis, il est nécessaire de vérifier la reproductibilité de l'induction de ces lésions et par conséquent de valider cette technique sur un modèle animal. Toutefois, si on veut utiliser un laser mono-spot dans une étude clinique, il faudra effectuer un balayage. Afin d'obtenir une plaie qui est plus grande que le diamètre du faisceau. La deuxième partie de ce chapitre concerne l'utilisation d'un laser Er:YAG à balayage sur le même modèle animale, une étape clé à réaliser avant de transférer la technique chez l'homme.

82 Chapitre IV II. PARTIE 1: LASER ER:YAG MONO-SPOT II.A. OBJECTIF Dans cette partie nous nous sommes intéressés à la vérification des résultats précédemment obtenus. Ainsi, la reproductibilité des lésions induites et leurs cinétiques de réparation, seront vérifiées. II.B. MATÉRIELS ET MÉTHODES II.B.1. PROTOCOLE D'ÉTUDE Les conditions de manipulation sont identiques à ceux de la première expérience sur modèle animal. Ainsi nous avons utilisé un faisceau laser à énergie et diamètre constants, prédéterminés à partir des résultats obtenus lors de la première expérience (20 J/cm²) (cf. chapitre III). Les plaies ont été réalisées en 6 temps, tous les deux jours, sur une durée de 10 jours (Figure 33). Les plaies ont été induites sur une zone du corps assez plane, au niveau de la région dorsale de part et d'autre de la colonne vertébrale. Ar. Jour-3 Jour-2 Jour-1 Jour-6 Jour-5 Jour-4 Av. 1,5 cm Témoin Figure 33:L'emplacement des plaies induites au niveau du rat en fonction du temps. Après induction de lésion, leur morphologie a été évaluée par empreintes cutanées, et leur cinétique par mesure de la perte insensible d'eau (PIE). Cette dernière mesure est effectuée à tous les temps, avant et après chaque induction de plaies. Le prélèvement des différentes biopsies est effectué au 10 ème e même temps que le témoin. Ce schéma d'étude est reproduit sur cinq rats. (n= 4)

83 Chapitre IV II.B.2. MODÈLE ANIMAL UTILISÉ Le modèle d'étude utilisé est le rat Hairless (cf. Chap. III.). Les rats sont anesthésiés avant chaque induction de lésions, et ils sont sacrifiés avant de prélever les biopsies. II.B.3. LASER UTILISÉ Les plaies sont induites à l'aide du laser Er:YAG Dermablat (cf. Chap.II.). Les paramètres du faisceau laser utilisés, sont fonction des résultats obtenus lors de la première étude réalisée sur ce même modèle. Ainsi le faisceau utilisé a un diamètre de 5mm, une énergie de 1J, une fluence d'environ 5J/cm² et 4 passages. II.B.4. ÉVALUATION ET ANALYSE DES LÉSIONS PAR IMAGERIE 3D L'évaluation topographique, par projection de franges, a été réalisée par analyse d'empreintes de lésions. L'évaluation topographique et l'analyse des empreintes cutanées, sont réalisées par projection de frange par la société EoTech. Les images obtenues ont subi un redressement du niveau pour réduire l'effet de la déformation de la peau (cf.annexe.5: Paramètre d'analyse réalisée par EoTech). II.B.5. ÉVALUATION DE LA FONCTION BARRIÈRE (PIE) La perte insensible en eau (Perspiratio insensibilis) correspond à la diffusion passive de l'eau à travers la peau à travers la couche cornée. La quantité d'eau traversant le stratum corneum (SC) par cette voie est évaluée entre 300 et 400ml par jour dans des conditions normales, c'est-à-dire 1/10 à 1/20 de la transpiration, et elle est exprimée en g/m²/h. La barrière de diffusion est entièrement située dans la couche cornée. La PIE représente un phénomène passif conséquent au gradient de pression de vapeur d'eau de chaque côté de l'épiderme. L'épiderme est bien hydraté puisqu'il est directement au contact du derme. À l'inverse, sa surface, au contact de l'air ambiant généralement beaucoup plus sec, présente une concentration en eau plus faible. Le gradient est d'environ 37 mol. [79], si l'humidité relative extérieure, atteint les 100%, la PIE atteint le zéro, en revanche par une humidité relative de 0%, la PIE est maximale. L'ensemble des mesures de la PIE est réalisé au moyen du Multi Probe Analyser 5 (MPA5) fabriqué par Courage-Khazaka (Kölen, Allemagne) qui permet à l'aide de sa sonde "Twamètre". De même que cet appareil permet aussi le contrôle de l'hygrométrie et la température à l'aide de sa sonde. Cet appareil utilise la méthode de mesure en cylindre ouvert. Une sonde appliquée sur la peau délimite une chambre, cylindrique, ouvert à l'air ambiant. À l'intérieur de cette

84 Chapitre IV chambre, deux détecteurs semi-conducteurs sensibles à l'humidité et couplés chacun à un thermistor sont situé dans une position verticale l'un au-dessus de l'autre. L'éloignement des détecteurs de la surface de la peau est calculé de manière à mesurer, dans des conditions optimales, le gradient de vapeur d'eau se mettant en place entre la surface cutanée et l'air ambiant [80]. Les conditions de la prise des mesures: 20 ±2 C et 45 ±4.55%. II.B.6. ÉVALUATION HISTOLOGIQUE Une fois les empreintes cutanées réalisées, le rat sont sacrifié par injection de 2ml du Pentobarbital (CEVA). Les biopsies sont réalisées à l'aide d'un Punch de 6mm de diamètre, et sont immédiatement mises dans une solution de fixation du Formol à 10% dans du tampon phosphate 0.2M, à ph 7.2. Après 12 heures de fixation, les biopsies sont rincées à l'eau distillée pendant 30 minutes, puis transférés dans de l'alcool 70, ceci avant de commencer le cycle de déshydratation. Après déshydration, les biopsies sont inclues dans de la paraffine avant d'être coupés à l'aide d'un microtome (épaisseur de coupes de 5µm). Ces coupes sont ensuite colorées par coloration standard (hématoxyline, éosine).(cf. Annexe.6) L'analyse de ces résultats permet de fournir des données qualitatives (tissus atteints, la forme) sur les plaies réalisées en fonction de l'énergie des faisceaux. II.C. RÉSULTATS II.C.1. ANALYSE DES LÉSIONS INDUITES L'utilisation de la technique de projection de franges a rendu possible la détermination des profondeurs des tissus ablatés (cf. chapitre III). Les mesures réalisées à partir des profils de lésions ont permis la détermination d'une profondeur moyenne d'environ 101µm (cf. Annexe.XX: tableau avec les données et la moyenne de profondeur). La figure 34A montre une représentation tridimensionnelle de la lésions avec des bords bien précis, confirmé par le profile de lésion extrait de l'image 3D. Ce profil rappelle celui de la forme du profil d'un faisceau gaussien. La forme du profil est moins visible au niveau des coupes histologiques, ce qui rend difficile l'appréciation et la mesure de la profondeur des lésions. Toutefois la coupe histologique permet de visualiser une ablation complète de l'épiderme, avec des bords de lésion indiquée par les flèches (Figure 34C). La mesure de la profondeur des lésions par la technique d'imagerie 3D, a permis la comparaison des différentes profondeurs, par conséquent décrire une reproductibilité interindividuelle

85 Chapitre IV A B Figure 34: Un exemple de lésion réalisée chez le rat Hairless. A) représentation 3D de la lésion. B) le profil de la lésion. C) coupe histologique de la lésion. Les flèches correspondent aux bords de la lésion. Coloration HE. Gx100 C Profondeur (µm) rat 1 rat 2 rat 3 rat 4 Echantillon Figure 35: Variabilité des profondeurs de lésions en fonction des rats

86 Chapitre IV II.C.2. CINÉTIQUE DU RÉTABLISSEMENT DE LA FONCTION BARRIÈRE: II.C.2.1. MESURE DE LA PIE Les mesures de la perte insensible en eau, immédiatement après induction des lésions, montrent une baisse rapide de sa valeur. Cette valeur passe, au bout de deux jour, de 69,23 g/m²/h à 14,91 g/m²/h, en deux jours, et elle tend à atteindre la valeur de base au quatrième jour (7,60 g/m²/h).(figure 36) PIE (g/m²/h) valeur basale Temps (Jour) Figure 36: Évolution de la valeur de la PIE en fonction du temps II.C.2.2. HISTOLOGIE L'épiderme normal comporte une couche de cellules basales et deux, rarement trois couches de cellules intermédiaires surmontées par trois couches de cellules granuleuses. Cet ensemble mesure environ 40µm d'épaisseur. (Figure 37) (cf. Annexe. XX) L'application du faisceau laser sur la peau permet une ablation complète de l'épiderme. Ainsi le derme, mis à nu, ne présente aucune modification significative. La figure 37.B présente un épiderme intact au niveau des berges de la lésion sans aucune trace de coagulation ni de réaction inflammatoire. Deux jours après l'induction laser, la ré-épidermisation est subtotale mais laisse subsister deux à trois "puits" ulcérés non recouverts, de moins de 200 µm de diamètre. En même temps une présence d'un épais exsudat fibrino-leucocytaire de surface. (Figure 37 C) L'épiderme hypertrophié, néo-formé, présente une épaisseur régulière d'environ 53 µm. Il comporte une à deux couches de cellules basales, quatre à cinq couches de cellules intermédiaires et trois couches de cellules granuleuses. Le derme, sous-jacent, présente

87 Chapitre IV une discrète densification de fibroblastes vers la surface, sans montrer d'exagération de l'infiltrat lymphocytaire. Quatre jours après l'induction laser, l'exsudat fibrino-leucocytaire a disparu, avec une réépidermisation complète. Ce néo-épiderme atteint une épaisseur maximale de 84 µm, accompagné d'une apparition d'une inflammation sous-épidermique discrète (Figure 37.D). Cette dernière commence à se réduire à partir du sixième jour, après induction laser. Le derme superficiel est toujours légèrement densifié mais on note un début de diminution de la densité de l'infiltration lymphoïde. (Figure 37.E) Huit jours après l'induction laser, l'hypertrophie réactionnelle de l'épiderme tend encore à se réduire et l'épaisseur ne dépasse pas 50 µm. Ceci est accompagné d'une diminution progressive de la densité de l'infiltration lymphocytaire du derme papillaire. Il subsiste toutefois une discrète densification du derme papillaire par des fibroblastes. (Figure 37.F) À dix jours après induction Laser, l'épiderme mesure 40 µm d'épaisseur, ce qui tend vers l'épaisseur normale. En même temps, l'infiltrat inflammatoire du derme a pratiquement disparu. Par rapport au témoin, une légère densification fibroblastique du derme papillaire sous-épithélial est observée. (Figure 37.G)

88 Chapitre IV A B C D E F Figure 37: Coupes histologiques de la dynamique de la réparation d'une lésion induite par laser (Ø= 5mm & 20 J/cm²) chez le rat Hairless. A, B, C, D, E, F et G, sont respectivement le témoin, J0, J2, J4, J6, J8 et J10. (Gx100, Barre=100 µm). G

89 Chapitre IV III. PARTIE 2: LASER ER:YAG À BALAYAGE III.A. CONTEXTE ET OBJECTIFS Afin de désépidermiser la peau de manière uniforme par un ou plusieurs balayages avec un laser Er:YAG, un système permettant de régler et contrôler ce balayage est nécessaire. Ce laser existe pour le laser Er:YAG Smart 2940 (DEKA). Ainsi, ce laser a été utilisé dans le but de créer des plaies de taille plus grande (164 cm²). Cette partie décrit les travaux réalisés. Premièrement pour déterminer le chevauchement des spots laser pour l'obtention d'une désépidermisation uniforme, et deuxièmement pour évaluer la qualité et la cinétique de la réépidermisation des plaies induites sur modèle animal. III.B. MATÉRIEL ET MÉTHODES L'utilisation du nouveau laser et de son scanner (tête de balayage in vivo, nécessite la vérification notamment du chevauchement des faisceaux. Ce réglage a été réalisé d'abord sur un support papier puis in vivo III.B.1. RÉGLAGE DU SYSTÈME DE BALAYAGE (SUR PAPIER) Différents paramètres sont testés sur un papier thermique. De cette manière nous avons testé le chevauchement, les différentes longueurs de pulsation ainsi que la répétabilité. a b c d e f Figure 38: Illustration du test de chevauchement lors d'un balayage avec un faisceau de 1,5mm de diamètre. Les chevauchements présentés sont: 100, 113, 126, 139, 152 et 165% (valeurs du constructeur). L'observation des résultats des différents essais de chevauchements montrent des superpositions croissantes des impacts laser. De cette manière un chevauchement nul à "113%" et un chevauchement parfait à 139% (valeur de constructeur). La superposition de deux faisceaux provoque une décoloration du papier plus importante que celle observée au centre du faisceau. Lors de ces balayages les dimensions des surfaces sont indépendantes des valeurs de chevauchement. Cette valeur de chevauchement a été utilisée dans l'étude suivante sur les rats Hairless

90 Chapitre IV III.B.2. APPLICATION SUR MODÈLE ANIMAL III.B.2.1. PROTOCOLE Le protocole et le modèle animal d'étude sont identiques à l'étude précédente (cf. Chapitre III). Lors des manipulations nous avons sous estimer la fluence appliquée et nous avons appliqués une fluence cinq fois plus importante ( 100 J/cm²), avec un faisceau laser de 1,5 mm de diamètre et une surface balayée en hexagonale de 4,5 mm de diamètre (2 mm du côté). Ces plaies ont été réalisées chaque jour pendant une durée de 10 jours. Les lésions sont évaluées par empreintes cutanées ainsi que la mesure de la perte insensible en eau (PIE). Ce dernier paramètre est mesuré avant et après chaque induction de plaie. À la fin de l'étude, au dixième jour, le témoin ainsi que les neuf autres biopsies sont prélevées en même temps. Ce schéma d'étude est reproduit sur trois rats. (n=3) III.B.2.2. LASER Le laser Er:YAG utilisé est le SMART 2940 (DEKA M.E.L.A, Italie). Comme le laser précédemment utilisé, la longueur d'onde est de λ = 2,49 µm et l'énergie maximale émise est de 800 mj. Les longueurs d'impulsions varient 200 à 850 µm, avec une fréquence de 5 à 20 Hz. L'utilisation d'une tête de balayage (scanner) permet l'utilisation d'un faisceau pour balayer uniformément une surface de dimension variable, à l'aide d'un faisceau de 1,5mm de diamètre. III.B.2.3. ÉVALUATIONS Toutes les évaluations réalisées ont été identiques à celles déjà décrites dans le chapitre VI. Partie 1, à savoir les profondeurs par empreintes, la PIE ainsi que l'histologie. III.C. RÉSULTATS III.C.1. APPLICATION SUR MODÈLE ANIMAL III.C.1.1. VÉRIFICATION DES PROFONDEURS ATTEINTES: L'utilisation d'un laser avec balayage pour induire des lésions cutanées a permis la réalisation de lésions avec des bords bien nets. Ceci est plus appréciable au niveau de la représentation 3D de la lésion induit (Figure 39.A), et renforcer par le profil de la lésion extrait à partir de l'image 3D (Figure 39.B)

91 Chapitre IV Le profile de la lésion montre un fond de lésion avec des fluctuations qui peut être dus au chevauchement des faisceaux laser, ainsi qu'aux irrégularités du tissu atteint (le derme réticulaire). Ceci est visible au niveau de la coupe histologique, qui montre les impacts des faisceaux laser qui se chevauchent entre eux. Enfin l'analyse de ces coupes montre la présence d'une coagulation des tissus dermiques atteints.(figure 39.C) A B C Figure 39: Représentation d'une lésion réalisée, par laser à 400 J/cm² sur le modèle animal. (A) image 3D de la lésion. (B) profil de la lésion.(c) coupe histologique (Gx200, barre:350 µm). La déformation des prélèvements de peau sous l'effet des traitements histologiques rend l'appréciation des profondeurs atteintes difficile. De ce fait la détermination des profondeurs des tissus ablatés est réalisée à partir des profils de lésions, ce qui nous a permis de mesurer une profondeur moyenne de 163 µm.(cf. Annexe.. 10)

92 Chapitre IV Prfondeurs (µm) Rat 1 Rat 2 Rat 3 Rats Figure 40:Profondeurs moyennes des tissus ablatés chez les trois rats.(n=32) Ainsi et, pour une fluence de 100 J/cm², nous avons atteint une profondeur moyenne de 163 µm environ. Les mesures réalisées chez les rats séparément montrent une reproductibilité d'induction de lésions (Figure 40) L'évaluation comparative des profondeurs de lésions, atteinte en fonction des individus, permet de décrire une reproductibilité entre les différents rats. III.C.1.2. CINÉTIQUE DE RECOUVREMENT: Les mesures de la PIE réalisées au niveau des lésions immédiatement après induction montrent une baisse rapide de sa valeur. Cette valeur passe de 77 g/m²/h à 15 g/m²/h en trois jours.(figure 41) La baisse de la valeur de la PIE, coïncide avec la formation d'une croûte (caillot fibrinoplaquettaire) composée par un exsudat fibrillaire. Cette baisse continue avec la mise en place du nouvel épiderme jusqu'à ce qu'elle atteigne la valeur de base (5,25±1,98 g/m²/h) après 6 jours de l'induction de la plaie. (cf. Annexe. 11)

93 Chapitre IV PIE (g/m²/h) Temps (jour) Figure 41: Courbe de l'évolution des valeurs de la PIE en fonction du temps III.C.1.3. HISTOLOGIE L'épiderme normal comporte une couche de cellules basales et deux couches de cellules intermédiaires surmontées par trois couches de cellules granuleuses. Cet ensemble mesure 30µm d'épaisseur.( Figure 42) Immédiatement, après l'application laser l'épiderme est entièrement ablaté de même qu'une partie supérieure du derme réticulaire. Cette coupe ne présente aucune trace de coagulation ni de réaction inflammatoire (ces deux réponses n'ont pas le temps de se mettre en place) avec un épiderme latéral intact. À un jour de l'ablation laser, la lésion est recouverte d'une couche d'exsudat fibrinoleucocytaire (Figure 42.J-1). Cette croûte est partiellement souple se durcissant au temps J-2. Le caillot fibrino-plaquettaire est bien mis en place sur la totalité de sa longueur. Cette coupe présente un début d'épaississement, à savoir une hyperplasie de l'épiderme néoformé. (Figure 42.J-3). Après ce temps, le caillot ou la croûte et l'exsudat fibrino-leucocytaire sont complètement enlevés et ils sont remplacés par les premières couches cellulaires du stratum corneum

94 Chapitre IV Figure 42: Coupes histologiques de la dynamique de la réparation d'une lésion induite par laser chez le rat Hairless.(Gx200, Barre=150µm)

95 Chapitre IV Quatre jours après l'induction laser, la ré-épidermisation est totale et présente une hyperplasie, de moins de 2 µm de profondeur. Par ailleurs, il existe un épais infiltrat cellulaire au niveau du derme papillaire (Figure 42.J-4). L'épiderme néo-formé, au bout de 5 jours est complet et d'épaisseur régulière. D'un autre côté, le derme présente une discrète densification de fibroblastes vers la surface, sans montrer d'exagération de l'infiltrat lymphocytaire. (Figure 42.J-5) Sept jours après l'induction des lésions, l'épiderme est complet avec un SC de taille normale, et ce néo-épiderme retrouve une épaisseur quasi normale (Figure 42.J-7). Au niveau du derme supérieur, l'infiltration lymphoïde baisse de densité. Cette baisse continue au cours du huitième jour après l'induction laser. L'hypertrophie réactionnelle de l'épiderme a complètement disparu. Il subsiste toutefois une discrète densification du derme papillaire par des fibroblastes.(figure 42.J-8) À dix jours de l'induction des lésions, l'épiderme mesure environ 40 µm d'épaisseur, ce qui tend vers l'épaisseur normale. Par rapport au témoin, on note seulement une légère densification fibroblastique du derme papillaire sous-épithélial.(figure 42.J-10) IV. DISCUSSION CONCLUSIONS : Nous avons obtenu par utilisation du laser Er:YAG (Dermablat ), une reproductibilité de lésions induites au niveau de différents rats. Ces lésions réalisées au moyen d'un laser mono-spot ont permis d'établir les paramètres du faisceau laser à utiliser. Ainsi une fluence de 20 J/cm² permet une ablation complète de l'épiderme sans dommage visible du derme. L'analyse des coupes histologiques montre une coagulation du derme atteint avec une faible profondeur, ce qui est due aux propriétés du laser Er:YAG qui est bien absorbé par la peau, minimisant, ainsi, son effet thermique sur les tissus adjacents [81, 82]. Les profondeurs des ablations étaient déterminées à partir des coupes histologiques prélevées à leur niveau [83-85]. Ces résultats ne prenaient pas en considération les effets des traitements histologiques, et par conséquent, la déformation et la contraction des échantillons, d'où l'intérêt de l'utilisation de la technique des empreintes cutanées. De cette manière les mesures obtenues nous ont permis de décrire une profondeur moyenne de 101 µm, plus grande que l'épaisseur moyenne de l'épiderme (40µm). Cette disparité d'épaisseur mesurée serait due en partie à l'installation de l'inflammation [55], et à la contraction de la peau après induction des lésions au laser, ce qui a pour conséquence l'augmentation du volume des bords de ces dernière (Figure 43)

96 Chapitre IV Figure 43: Profil d'une lésion laser réalisée chez un rat Hairless. Les bords de la lésion sont plus élevés que le niveau de peau normale. Le diamètre déterminé à partir du profil de la plaie d'environ 5 mm, correspondant au diamètre théorique du faisceau laser utilisé, ce qui est différent du diamètre histologique de l'impact du faisceau (Ø 3,9 mm). La comparaison entre les deux valeurs des diamètres mesurés, montre une différence d'environ 23%, correspond à la contraction de l'échantillon après prélèvement et sous l'effet des traitements histologique. De cette manière, nous pouvons expliquer la grande profondeur atteinte, après une ablation avec une fluence de 20 J/cm². Ainsi la mesure de ces valeurs est faussée [53, 86]. L'analyse métrique des profondeurs de lésions réalisées chez les différents individus, séparément, montre une grande variabilité. Les résultats obtenus lors de l'étude de la validation de la technique 3D ont permis de visualiser l'irrégularité du fond de la lésion après ablation laser (cf. Chapitre II). Toutefois la comparaison des profondeurs mesurées en fonction des différents rats, permet de décrire une bonne reproductibilité interindividuelle. L'utilisation du nouveau laser a permis l'obtention de lésions par un balayage à l'aide d'un faisceau de petit diamètre. L'utilisation de ce balayage explique l'apparition de traces d'impact de faisceaux au niveau du lit de la lésion, ce qui augmente son irrégularité. De cette manière, la variabilité entre les différentes lésions est augmentée, sans grande variabilité interindividuelle. Cette étude nous a permis en même temps de décrire la cinétique de réépidermisation de manière physiologique. De points de vue physiologique, cette réépidermisation est évaluée par mesure de la perte insensible en eau, qui permet de déterminer la cinétique du rétablissement d'une barrière cutanée fonctionnelle. Lors de la première étude, nous avons constaté un retour de la valeur de la PIE à sa valeur de base entre le 4 ème et le 5 ème jour, ce qui a été vérifié par la suite et qui a confirmé le retour à la valeur de base au bout du 5 ème jour. La différence de profondeurs de lésions induites, lors des deux études (20 et 100 J/cm²), ne semble pas avoir effet sur la vitesse de réépidermisation. Ainsi, la différence de profondeurs, pour une même taille de lésion, est indépendante de la vitesse de réépidermisation. Cependant la rapidité de la mise en place du nouvel épiderme peut

97 Chapitre IV être expliquée par la présence d'un grand nombre de glandes annexes (Ex.:glande sébacées) qui contribuent à la réépidermisation. L'évaluation de cette cinétique par le biais de la mesure de la PIE, en fonction du temps, indique un rétablissement progressif de la fonction barrière de la peau, localisée dans le SC, et par conséquent le rétablissement d'un nouvel épiderme fonctionnel. L'évolution de la perte insensible en eau est comparable au stade cellulaire de la réépidermisation. Ainsi les différentes phases de la courbe de la PIE correspondent à un état d'évolution de l'épiderme L'utilisation de la technique d'induction de lésion au moyen d'un laser permet la réalisation de lésions reproductibles d'un individu à un autre. Cette reproductibilité est conservée même en utilisant des énergies variables (20 ou 100J/cm²). La correspondance entre les deux cinétiques montre la mise en place rapide du nouvel épiderme quelque soit l'énergie utilisée, mais pour une surface relativement petite. Cette conclusion ne peut être confirmé pour des lésions de grande taille. Dix jours après, l'épiderme peut être considéré comme normal. Il n'existe pas de cicatrice dermique conjonctive. En revanche, une discrète fibrose séquellaire sousépidermique se distingue

98 Chapitre IV

99 CHAPITRE V: VALIDATION DE LA TECHNIQUE D'INDUCTION DE LÉSION CHEZ L'HOMME

100 Chapitre V I. INTRODUCTION Les résultats obtenus dans le chapitre précédent ont démontré la répétabilité des inductions ainsi qu'une équivalence entre la désépidermisation en balayage et celle réalisée par simple faisceau. Ainsi la suite logique à ces résultats est le transfert et validation de la technique chez l'homme. En même temps, il est impératif de comparer cette technique à une technique de référence de désépidermisation, celle de la bulle de succion [87]. II. MATÉRIELS ET MÉTHODES II.A. PROTOCOLE D'ÉTUDE L'étude réalisée a été autorisée par le comité de protection des personnes, Toulouse I (16/01/2006). Cette étude clinique, monocentrique, sans bénéfice individuel direct, a été réalisée sur 10 volontaires sains, de sexe masculin, ayant une tranche d'âge comprise entre 18 et 35 ans et un phototype maximum de III selon la classification de Fitzpatrick [88]. Les volontaires ont été répartis en deux groupes de cinq (5) volontaires, pour récupérer des données tous les jours pendant huit jours. Les lésions ont été induites au niveau de deux zones randomisées sur les avant-bras. (cf.annexe. 12) A -J0- les zones d'induction des lésions ont été sélectionnées, au niveau de la face interne des avant-bras. Ensuite des mesures de flux sanguin, de la perte insensible en eau (PIE), ainsi que l'épaisseur de l'épiderme par tomographie a cohérence optique ont été réalisées. Par la suite les lésions ont été induites par la technique de bulle de succion et par laser (Er:YAG), au niveau des deux avant-bras. Afin de suivre la cinétique de ré-épidermisation, des deux types de lésions, des mesures de flux sanguin et de la PIE ont été réalisées pendant les différents jours suivants. Les mesures ont été effectuées dans des conditions d'expérimentation contrôlées de température et d'hygrométrie (20 ± 2 C - 45 ± 10 % RH) dans une salle climatisée, et après 15 minutes à l'air libre

101 Chapitre V Biopsie (Grp1&2) Biopsie (Grp1) Biopsie (Grp2) Avant J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 LDF PIE OCT Induction Empreinte LDF PIE OCT Photographie Biopsie LDF PIE OCT Photographie Figure 44: Schéma représentatif du déroulement de l'étude clinique. II.A.1.1. MESURE DU FLUX SANGUIN CUTANÉ: LASER DOPPLER À BALAYAGE La technique de vélocimétrie par laser Doppler est souvent utilisée pour l'évaluation de la microcirculation cutanée in vivo. Elle est appliquée aussi bien dans le domaine médical que dans le domaine cosmétique. Ainsi cet appareil permet, de cartographier la circulation sanguine dans le derme, des grands brûlés. Il est alors possible de déterminer à quels endroits il y a eu destruction des vaisseaux sanguins. Ces endroits ne pourront pas guérir d'eux-mêmes et nécessiteront une greffe de peau.[89] Le principe de l'imagerie de perfusion par laser doppler est basé sur l'effet doppler des ondes électromagnétique (rayonnements monochromatiques, Ex.:Laser), appliqué à des objets en mouvement (les globules rouges) dans le réseau microvasculaire. Un faisceau laser (λ= 670 nm) est projeté sur la surface de la peau. Quand ce faisceau est reflété par les hématies en mouvement, une partie du faisceau réfléchit est captée par une photodiode et convertie par la suite en impulsions électriques. Ces impulsions constituent des signaux qui sont représentatif du degré de perfusion du tissu en chaque point. Ces degrés de perfusion sont représentés sur une échelle de couleur (en fausse image ou image de synthèse). L'appareil utilisé pour ces études est un PeriScan PIM II laser Doppler Perfusion Imager (Perimed, Stockholm, Suède). Les mesures sont réalisées sur les zones repérées préalablement avant et après chaque induction de lésion. La zone balayée est de 2x2 cm, situé à une distance de la "tête laser" de 15 cm. Les images récupérées permettent une mesure de la perfusion sanguine, au niveau d'une zone délimité par une région d'intérêt "R.O.I" de 1cm²

102 Chapitre V Figure 45: illustration de la mesure du flux sanguin au niveau d'une lésion laser. le rectangle représente les dimension d'une lésion laser. II.A.1.2. MESURE DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU: L'ÉVAPORÉMETRIE. La mesure de la perte insensible en eau (PIE) a été réalisée au moyen d'une sonde évaporomètre (Tewametre, Courage & Khazaka), cette technique a été décrite dan le chapitre IV. Les mesures de la PIE sont réalisées avant et après les inductions de lésions. Les valeurs obtenues sont des valeurs moyennes de 60 mesures (une mesure par minute). Des mesures de la PIE ont été réalisées sur chacune des quatre zones d'intérêt, avant et immédiatement après induction de lésion, ainsi qu'à chaque temps de mesure pendant l'étude et en fonction des groupes. II.A.1.3. IMAGERIE DE L'ÉPIDERME: "OCT" Les images OCT ont été prises avant et après l'induction des lésions, afin d'évaluer le niveau atteint après ablation laser. Le suivi de la cinétique de cicatrisation est réalisé par prise d'image OCT après induction de lésion et à chaque temps. Les lésions sont observées au niveau des bords des lésions, ce qui nous permet de visualiser plus nettement l'évolution de la cicatrisation. (Figure 46) SC Épiderme Derme Figure 46: (a) Image OCT obtenue de la peau normale, avant induction des lésions, avec pour comparaison (b) image histologique (x 100) à la même échelle

103 Chapitre V II.A.1.4. OBSERVATION CLINIQUE ET MESURE DE LA SURFACE DS LÉSIONS: PHOTOGRAPHIE COULEUR CALIBRÉE Pour la mesure de la surface des lésions en cours de réépidermisation, des photographies calibrées en couleur ont été réalisées selon la procédure décrite par Vander Haeghen & Naeyaert [90]. Cette procédure consiste en l'incorporation dans l'image d'une mire de couleurs avec des cordonnées trichromatiques connues. Ainsi, l'image prise peut être corrigées par rapport à la référence -mire- (figure 47). Cette mire permet d'avoir un repère de couleurs et de longueur. L'application de cette procédure permet de standardiser la couleur des images afin d'effectuer des analyses de couleur, comparables directement à partir de l'image. De cette manière les images calibrées ont été obtenues à chaque temps de mesure et la surface de le croûte mesuré avec un logiciel (ImageJ, Version 1.33u), ce qui représente la zone de réépidermisation active. Figure 47: Photographie de lésions laser et bulle de succion prise avec une mire de couleur (Macbeth). II.A.1.5. EVALUATION DE LA MORPHOLOGIE DES LÉSIONS: TECHNIQUE D'EMPREINTE CUTANÉE On utilisant la même technique décrite dans le précédant chapitre, des empreintes siliconées des lésions ont été réalisées immédiatement après leurs inductions. Pour les lésion de bulle de succion le toit a été découper et enlevé avant la réalisation d'empreintes (environ une minute). La topographie des empreintes a été évaluée par la technique de projection de franges, afin de calculer la profondeur moyenne de chaque lésion en micromètre. II.A.1.6. DÉSÉPIDERMISATION PAR TECHNIQUE DES BULLES DE SUCCION La technique de référence adoptée pour l'induction de lésions épidermiques standard, est celle de la bulle de succion (BS). Le principe est d'applique une dépression constante

104 Chapitre V sur la peau afin de séparer mécaniquement l'épiderme du derme. La technique a été décrite pour la première fois par Kiistala [87], puis reprise par Devitt, Bruun et par Levy [34, 54, 91], pour induire des lésions superficielles dans l'étude de la réparation de la peau. L'appareil utilisé est composé d'une pompe à vide réglable (KNF Neuberger, Allemagne), reliée aux chambres d'aspirations par des tuyaux. Ces chambres faites en plexiglas, ont un diamètre de 10mm. La dépression appliquée contre la peau était 350 mbar pour une durée maximum de 2 heures ou jusqu'à la formation d'une bulle de succion. Les chambres ont été maintenues et fixées par une rondelle de ruban adhésif double face. Après formation de la bulles, les toits ont été découpés et enlevées.(figure 47, 48) (cf. Annexe. 14) Figure 48: Photographie d'une bulle de succion. (Diamètre= 10 mm) II.A.1.7. DÉSÉPIDERMISATION PAR LE LASER ER:YAG Les paramètres du réglage du laser Er:YAG (DEKA) ont été déterminer lors des études précédentes (cf. Chapitre IV). Ainsi, et pour réduire le risque d'abîmer le derme. Nous avons choisi de réduire la fluence du laser utilisé à 15J/cm², ce qui correspond aux fluences retrouvées dans la littérature. Cette énergie a été appliquée en trois temps (3 x 5 J/cm²) en balayant une zone de 11 x 11 mm, par un faisceau laser de 1,5 mm de diamètre et une fréquence de 5 Hz, et un chevauchement de faisceaux de 175%. II.A.1.8. ÉVALUATION TISSULAIRE: HISTOLOGIE Des prélèvements par biopsies de 4 mm de diamètre, ont été réalisée sur chaque volontaire immédiatement après induction des lésions ainsi qu'au dernier temps de la cinétique. Ces prélèvements ont été réalisés au niveau des deux types de lésions, précisément les biopsies ont été réalisées sur la jonction des lésions afin d'inclure la peau saine et la peau lésée. Les prélèvement ont été réalisées après anesthésie locale de la zone cible par injection sous-cutanée de Xylocaïne (Astrazeneca, France). Une fois les biopsies réalisées, des steri-strip (3M, France) sont posés sur les zones biopsiées

105 Chapitre V Ces prélèvements ont permis l'évaluation de la profondeur de tissu ablaté par laser par comparaison histologique d'une zone saine (témoin), au niveau de la face interne d'un avant-bras selon randomisation. Les biopsies des temps J4 et J7 permettent d'évaluer la régénération tissulaire à différents temps par rapport au témoin normale. III. RÉSULTATS III.A. QUALITÉ D'INDUCTION DES LÉSIONS III.A.1. OBSERVATION CLINIQUE: PHOTOGRAPHIE CALIBRÉE Les résultats obtenus par cette technique nous montre une uniformité des lésions obtenues par la technique d'ablation laser, contrairement aux bulles de succion (Figure 49). Cette différence est d'autant plus frappante que les lésions intra-volontaires sont différentes. a b c d Figure 49: Photographies calibrées prises chez deux sujets immédiatement après induction des lésions. (a,b) sujet 7, lésion laser et BS respectivement, (c,d) sujet 4, lésion laser et BS respectivement. Cette différence de réalisation des lésions et leurs non-uniformités est bien observée au niveau des figures 49 et 50. L'importante différence entre les résultats des deux techniques réside dans le nombre des lésions réalisées; les lésions de la bulle de succion ne montrent que 60% de réussite avec une dispersion de valeurs. (cf. Annexe. 15) Les lésions laser présentent moins de variabilités de surface que les BS avec des écarts types moyens moins important (Figure 50). (cf. Annexe.16)

106 Chapitre V 1,6 BS Laser 1,4 Surface (cm²) 1,2 1 0,8 0,6 M=1,17 0,4 M=0,47 0, Volontaires Figure 50: Courbes représentatives de la variabilité des surfaces des lésions laser, et bulle de succion. III.A.2. ÉVALUATION DES RELIEFS DE LA LÉSION PAR EMPREINTES 3D & HISTOLOGIQUE: Les empreintes siliconées des deux types de lésions nous ont permis de décrire la différence entre les caractéristiques des lésions des deux techniques. Ainsi, les empreintes cutanées des bulles de succion montrent une variabilité aussi bien en mesure de surface qu'on profondeur d'ablation, contrairement aux lésions laser ayant des dimensions uniformes, ce qui va dans le même sens que les observations cliniques. La figure 51, montre la différence entre les lésions réalisées par laser et celle réalisée par bulle de succion. Ainsi, les lésions induites par laser présentent une uniformité, absente au niveau des lésions de BS, qui montrent des profondeurs très variables [profondeur maximale : 420 µm, et une profondeur moyenne : 140 µm] (Figure 52). La comparaison entre des profondeurs des différentes lésions chez l'ensemble des volontaires montre la grande variabilité entre ces profondeurs. La courbe comparative de ces lésions réalisées par bulle de succion met en évidence des fluctuations avec une profondeur moyenne de 140±100 µm, et une valeur maximale de 420 µm de profondeur (Figure 53). Contrairement à ce résultat, la courbe des profondeurs des lésions laser montre une valeur moyenne de 54±14 µm avec une valeur maximale de 83 µm. Ces dernières valeurs se rapprochent de la valeur mesurée au niveau des coupes histologiques (71,8±7,5 µm). Les profondeurs des BS sont plus importantes que l'épaisseur moyenne de l'épiderme. (cf. Annexe.17)

107 Chapitre V a b Figure 51: représentation 3D des lésions induites par laser (a) et bulle de succion (b) Lo ngueur de lésion ( mm) Laser BS Figure 52: profils de deux lésions; laser et BS. Profondeur (µm) Volontaire M=-54 M= Laser BS Figure 53: Courbe comparative des profondeurs moyennes des deux types de lésions des différents volontaires (n=10)

108 Chapitre V III.B. QUALITÉ DU RÉTABLISSEMENT DE LA FONCTION BARRIÈRE. III.B.1. LA MESURE DE LA PERTE INSENSIBLE EN EAU La détermination de la cinétique de cicatrisation est liée à la détermination de l'évolution de certains paramètres représentatifs de la réparation tissulaire. Ainsi la mesure de la perte insensible en eau permet le suivi de cette cinétique (Figure 54). La comparaison des valeurs de la PIE entre les deux types de lésions révèle une baisse de sa valeur en fonction du temps. Cette baisse est comparable pour les deux types de lésions. Le suivi de cette cinétique en fonction de ce paramètre, sur une durée de huit jours ne permet pas l'observation du retour à la valeur de base de la PIE. (cf. Annexe.18) Ainsi, la réparation de la peau et la mise en place de sa fonction barrière, sont déclenchée au jour 0, et elle continue au-delà du 7 ème jour Evolution de la PIE Laser BS PIE (g/m²/h) Temps (jour) Figure 54: Courbes comparatives des valeurs moyennes de la PIE des lésions laser et BS, en fonction du temps après induction III.B.2. MESURE DU FLUX SANGUIN CUTANÉ: RÉACTION INFLAMMATOIRE & CINÉTIQUE Les mesures du flux sanguin par la technique du laser doppler illustre l'installation et l'évolution de l'inflammation dans le temps. Différent de la valeur de base (0,47 g/h/m²) dès le temps (J0), ce paramètre atteint sa valeur maximum au 3 ème jour, suivi d'une baisse continue sans revenir à sa valeur de base (Figure 55). La réparation de l'épiderme

109 Chapitre V et sa réorganisation structurale, peuvent être évaluées par la technique d'imagerie OCT (Figure 56, 57). 5 Evolution du flux sanguin, tous sujets 4,5 4 3,5 Flux (V) 3 2,5 2 Laser 1,5 1 0,5 valeurs basales BS Nb jours après induction Figure 55: Courbes comparative des valeurs moyennes du flux sanguin des différentes lésions (laser et BS), en fonction de temps (jours après induction de lésion). Cette technique permet de visualiser les différentes couches de la peau (Figure 46), ces couches qui sont plus visibles au niveau des bulles de succion (Figure 56). SC Épiderme Derme Figure 56: Image OCT obtenue d'une bulle de succion, démontrant la séparation de l'épiderme (largeur1mm, hauteur 1mm). Au niveau de cette dernière photographie l'épiderme et le SC, séparés du derme se distinguent, permettant une meilleure discrimination des couches de la peau. Au cours de la cinétique on observe l'absence de l'épiderme des deux lésions au temps (J1), suivi d'un dépôt de culot dans le lit de la lésion (Figure 57 a,b). Ce culot s'épaissit et s'opacifie en fonction du temps (Figure 57 b,c). (cf. Annexe. 20)

110 Chapitre V Lésion Lésion a 1 b 2 c 3 d

111 Chapitre V e 5 SC Derme Derme f 6 SC SC Nouvel Épiderme Derme g Derme 7 Nouvel Épiderme h 8 Figure 57: Images OCT des deux types de lésions, Laser et Bulle de succion au différents temps. "a- h" et "1-8" représentent les images OCT d'une lésion laser et BS respectivement, aux différents temps (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7 jour)

112 Chapitre V Au niveau des images OCT, le SC est caractérisé par une structure en deux couches, brillante suivie d'une sombre. Cette couche blanche est la résultante de la réflexion de la lumière due à la présence de molécules au niveau du SC reflétant la lumière. Cette couche brillante est visible, à travers la croûte, à partir du 4 ème jour (Figure 58 e). La réflexion s'étend progressivement à la surface de la lésion, pour donner au 6 ème jour une couche brillante suivie d'une couche sombre. Cette structure est comparable à celle du SC, ce qui a été prouvé histologiquement (figure 58). a c e b d f Figure 58: Coupes histologiques des différentes lésions aux temps 0, 4 et 7 jours. a, c et e lésion de BS et b, d et f lésions laser aux temps 0, 4 et 7 jour respectivement. ColorationHE, Gx100. La réalisation de la coupe histologique permet de visualiser la cinétique de cicatrisation d'un point de vue tissulaire. Au niveau des lésions obtenues à la suite d'une bulle de succion, tout l'épiderme a été enlevé (Figure 58), ce qui n'est pas le cas des lésions obtenues par ablation laser. Ces dernières présentent des îlots d'épiderme et de ses invaginations. Au 4 ème jour après induction de lésion, le lit des plaies est envahi par un infiltrat cellulaire qui décrit la phase inflammatoire de la cicatrisation. En même temps, des nouvelles cellules épidermiques apparaissent et prennent naissance au niveau des glandes annexes (les follicules pileux). Au bout de 7 jours, l'infiltrat cellulaire se dissipe et l'épiderme est hyperplasié. La présence de la croûte au niveau des plaies (Figure 60) ne permet pas la visualisation de l'épiderme avec ses différentes couches dont le SC qui est déjà mis en place

113 Chapitre V Figure 59: Coupe histologique d'une peau normale témoin.(coloration HE, Gx100). Une autre manière de suivre et d'évaluer la cinétique de réparation de la peau consiste en l'analyse des photographies calibrées prises à tous les temps de la cinétique. Ces résultats nous permettent de visualiser l'étendue de l'inflammation des lésions, et par la suite l'évaluation de leurs contractions. (Figure 60) La mesure de la taille de la lésion a permis la détermination d'un taux de contraction (Figure 61). Cette courbe montre une augmentation de la contraction des deux types de lésions en fonction du temps pour atteindre plus de 50% de leur taille initiale au 7 ème jour. Les deux contractions ont un profil comparable. (cf. Annexe.21) Bulle de succion J 0 J 3 J4 J5 J6 J7 laser Figure 60: Photographie des lésions de BS et Laser (groupe 2)

114 Chapitre V Contraction (%) Temps (jour) moy BS moy Las.. Figure 61: Contraction des lésions. Pourcentage de la contraction des lésions par rapport à la taille initiale IV. DISCUSSION & CONCLUSION Dans cette étude les lésions réalisées par laser chez des volontaires sains ont été comparées à celles obtenus au moyen d'une technique référence de désépidermisation[92]. Ainsi, nous pouvons décrire une différence possible entre ces deux techniques de point de vue qualitative et de réparation. La comparaison entre les deux techniques, commence lors de la réalisation, ainsi les observations cliniques et les résultats obtenus par mesure de la superficie des lésions au niveau de photographie calibrées, montrent une grande variabilité. Cette variabilité est d'autant plus accentuée qu'elle peut être intra-individuelle (figure 50). Cette différence de dimension de lésion est comparable a la différence de profondeur des tissus enlevée, ainsi l'analyse de leurs empreintes cutanée a permis de mettre en évidence, d'une part la grande profondeur des lésions faites par BS et qui dépasse l'épaisseur moyenne de l'épiderme (environ 71µm) contrairement au lésions induites par laser, et d'autre part la différence entre les résultats obtenus par les deux techniques étudiées. Le contrôle des paramètres du faisceau laser offre la possibilité de mieux contrôler dans le temps l'induction des lésions, ainsi l'étude de la répétabilité de réalisation des lésions, par comparaison de lésions des différents individus. La mesure des profondeurs des différentes lésions, à partir des empreintes cutanées, laisse apparaître une répétabilité de lésions laser, aussi bien pour la profondeur atteinte que pour le taux de réalisation. Contrairement à la désépidermisation par bulle de succion qui montre un taux de réalisation de 60% avec un manque de reproductibilité de quantité de tissus enlevés. Ces observations à partir des images reconstruites en 3D sont confirmées par la suite histologiquement. Ainsi les coupes histologiques au niveau des lésions laser montrent une uniformité avec une existence de derme papillaire, qui n'est pas le cas au niveau des

115 Chapitre V lésions par bulles de succion. Ces dernières montrent un derme sans papille dermique. Cette absence de papilles dermique n'explique pas à elle seule les grandes profondeurs mesurées par la technique 3D, ainsi le relâchement de la texture du derme dû à une absence d'épiderme, accentué par la pression exercée par le liquide cumulé dans les bulles formées. Afin de valider la technique d'ablation au laser comme modèle standardisé, cette étude doit être complétée par une description biométrique de la cinétique de réépidermisation. Ainsi, des études d'analyses fonctionnelles ont déjà été réalisées auparavant, pour évaluer la réparation des de lésions cutanées tel que des brûlures[93]. De cette manière l'analyse de la perfusion sanguine au niveau de la lésion (Ex.: brûlure thermique), au moyen de la technique du laser doppler, permet une indication fonctionnelle et objective de la réparation des lésions [94-96]. Cette technique a permis de décrire une augmentation du flux sanguin superficiel au niveau des lésions de peau [97]. Ces résultats vont dans le sens des résultats obtenus chez les volontaires de cette étude, chez les quels l'évolution de la valeur de la perfusion des deux types de lésions montre une augmentation du flux sanguin (Figure 57). Cette valeur continue à augmenter pour atteindre un maximum après 3 jours, pour baisser par la suite, ce qui rappelle l'installation de la phase de l'inflammation au niveau de la lésion [11]. L'évolution, en fonction du temps, de la valeur de la perfusion entre les deux types de lésions montre une correspondance, avec une différence de valeurs qui peut être liée à la différence de la surface entre les lésions. Cette différence est aussi détectable au niveau des résultats de la mesure de la perte insensible en eau. La PIE, technique déjà utilisé par Levy J.J. et al. [54], permet de suivre l'évolution de la régénération de l'épiderme. De cette manière, l'analyse comparative entre les deux types de lésions permet de déterminer une cinétique identique de réparation de la fonction barrière au niveau des deux lésions (Figure 54). Utilisée par Singer A.J. et al.[98], la tomographie par cohérence optique a permis une visualisation, après quatre jours de l'incision, d'une couche brillante qui correspond au nouvel épiderme. Ces résultats ne montraient pas de cinétique de mise en place du nouvel épiderme. Et afin de répondre à cette question, des images OCT ont été prises à différents temps de l'étude. La présence d'une couche brillante au niveau des images OCT était expliquée, par une interface entre peau et milieu externe [69]. L'apparition d'une couche brillante au 4ème jour, sous la croûte, va à l'encontre de ces observations. Ainsi la réalisation de coupes histologique au niveau de ces lésions permet d'observer la mise en place d'un épiderme complet avec un stratum corneum (Figure 58). L'apparition d'un nouvel épiderme est identique au niveau des deux types de lésions, décrivant ainsi une même évolution pour ces différentes lésions. A partir de l'ensemble de ces résultats, nous pouvons conclure de la différence entre les deux techniques d'induction. De même, l'analyse des empreintes cutanées confirme ces observations. Chez un même individu la différence entre les deux types de lésions au niveau du même bras est très importante. Cette différence est d'autant plus importante

116 Chapitre V que les deux types de lésions n'ont pas la même fréquence de réalisation. La réalisation de BS permet de mettre à nu le derme contrairement la technique laser. Cependant, selon les travaux de Tanzi et al. [86], après plusieurs passages de laser, les îlots de cellules épidermiques sont morts sous l'effet thermique résiduel, donc ne fonctionnent pas et ne participent pas à la réépidermisation. Ce qui nous conduit à estimer qu'à la suite d'une ablation laser, l'épiderme est entièrement détruit. L'analyse des paramètres physiologiques des deux types de lésions permet de constater l'évolution comparable de ces lésions en fonction du temps. La mesure de la surface des lésions au cours de la cinétique permet de consolider ces conclusions sur le comportement comparable des différentes lésions, or elles subissent une contraction de 50% au bout de 7 jours après induction de lésions. L'évolution comparable entre les deux types de lésions nous a conduit à conclure sur la similitude des lésions et par conséquent celle des techniques. Sur un plan qualitatif, et hormis la rapidité de réalisation, le laser comme moyen d'induction de lésion, présente plus d'avantage que la technique des bulles de succion, sans interférer dans le mécanisme de réparation tissulaire[55]

117 Chapitre V

118 CONCLUSION GENERALE

119 Conclusion générale À l'origine de cette thèse, le souhait était de proposer une technique d'ablation de l'épiderme de manière contrôlée et standardisée afin d'étudier sa ré-épidermisation. En outre nous cherchions un modèle de désépidermisation qui était plus simple à réaliser et plus précis en terme de la quantité de tissu (épiderme) enlevé, que les techniques existantes (ex.: bulle de succion, dermatome, dermabrasion). Ces dernières techniques présentent de nombreuses contraintes quant à leur praticité: anesthésie, durée de réalisation, non-maîtrise de l'épaisseur de tissu enlevée. Notre choix s'est porté sur une technique laser, le laser Er:YAG, dont la particularité est d'agir sur l'eau tissulaire, sans effets significatifs sur les autres pigments de la peau (hémoglobine, mélanine, etc.). En parallèle, nous avons cherché à valider une méthode non-invasive pour évaluer la quantité d'épiderme enlevé par ce laser. Une telle méthode est primordiale dans une étude de ré-épidermisation ou de cicatrisation de la peau, sans pour autant agir sur le déroulement normal et donc modifier ces mécanismes. En conséquence, la recherche d'une telle méthode est devenu l'objectif secondaire de cette thèse. A-t-on remplit nos objectifs? Oui, hors le coût élevé et la nécessité d'une pièce dédiée et du personnel formé, le laser utilisé permet d'enlever l'épiderme de manière simple, rapide, contrôlée et standardisée, contrairement à la bulle de succion, moins chère et qui ne nécessite pas de formation nécessaire, mais lente et imprécise. Contrairement à la technique de bulle de succion, qui enlève tout l'épiderme ainsi qu'une partie du derme papillaire, la désépidermisation au laser laisse des îlots de cellules épidermiques, donc une désépidermisation tissulaire partielle, néanmoins nonfonctionnels [86]. L'utilisation de cette technique laser nécessite une prédétermination de l'épaisseur de l'épiderme en fonction des zones cible du corps. Ceci permet de régler la fluence du laser en fonction de ces épaisseurs, d'où la nécessité d'une technique de mesure non invasive et performante. Ensuite, et pour répondre à l'objectif secondaire, de mesure non invasive de la qualité des lésions réalisées, deux techniques ont été testées: 1. L'OCT permet de voir à travers la peau et de distinguer différentes structures. Ces structures semblent correspondre, mais sans certitude, aux différentes couches de la peau. De cette manière, cette technique ne peut être utilisée, à l'heure actuelle, pour remplacer la technique d'histologie, d'où le besoin d'une technique d'oct plus performante. 2. Les empreintes 3D couplées à la technique de projection de frange, ne permettent d'apprécier que la profondeur sans connaître le tissu atteint, mais sachant que l'épaisseur de l'épiderme au niveau de l'avant bras est d'environ 50µm, nous pouvons estimer le niveau de tissu atteint. Sur un autre endroit du

120 Conclusion générale corps où c'est plus ou moins épais (l'épiderme), on doit établir le rapport de nouveau. Ce travail de validation de la technique laser devait être complété, par une étude de la cinétique de la réépidermisation ainsi que le rétablissement de la fonction barrière. Pour ce fait l'utilisation de technique de la PIE ainsi que la mesure du flux sanguin, couplées à une technique de photographie, a permis le suivi de ce phénomène et la détermination d'une courbe d'évolution en fonction du temps de ces différents paramètres. L'utilisation de la technique de tomographie par cohérence optique, a permis la visualisation de l'apparition du nouvel épiderme (apparition d'un stratum corneum). De cette manière nous avons pu établir une corrélation entre les mesures physiologiques et les observations obtenues par imagerie (OCT). Enfin, et à la suite de ces résultats, le laser Er:YAG comme technique de désépidermisation, présente plus d'avantages que la technique référence: la bulle de succion. Ce travail peut être compléter par une analyse biochimique comparative afin de vérifier les mécanismes intervenants, ainsi qu'une différence, probable, entre les deux techniques. Le laser Er: YAG ainsi validé, pourra être utiliser dans d'autres études sur la cicatrisation proprement dite, en augmentant la fluence pour atteindre le derme. Ou inversement en réduisant la fluence utilisée, et par conséquent n'atteindre que le SC et induire ainsi des irritations

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130 ILLUSTRATION

131 Illustration LISTE DES FIGURES Figure 1: Représentation 3D de la peau humaine avec les structures annexes. [2] Figure 2: Schéma d'une coupe transversale de l'épiderme avec ses 4 différentes couches. Et les différents stades de la différentiation des kératinocytes.1) couche basale, 2) couche granuleuse, 3) couche épineuse et 4) stratum corneum. [6] Figure 3: Schéma de la vascularisation de la peau, montrant les 2 plexus et les boucles papillaire[6, 8] Figure 4: Représentation 3D de la peau humaine, montrant l'innervation au niveau de la peau. [2] Figure 5: Chronologie des différentes phases de la cicatrisation. (D'après N.Fournier et al. 2005)[11]28 Figure 6: Illustration de la phase d'inflammation (d'après AJ. Singer, 1999[13]) Figure 7: Illustration de la phase de prolifération (d'après AJ. Singer, 1999)[13] Figure 8. Fabrication du modèle de plaie par génie tissulaire. A. Feuillet obtenu après 28 jours de culture. B. Peau reconstruite après différenciation de l'épiderme. C. Formation de la plaie et ajout d'un feuillet dermique sous la peau lésée. D. migration des kératinocytes sur le feuillet de migration après 3 jours de cicatrisation Figure 9: schéma d'émission de lumière: spontanée (a), et stimulée (b) Figure 10: Spectre d'absorption des principaux chromophores endogènes (documentation Cohérente) Figure 11: Profondeur de pénétration de la lumière dans la peau pour différentes longueurs d'onde exprimée en (%) d'énergie traversant l'épiderme et/ou le derme (Illustration des auteurs d'après données publiées par Sliney et Worlbarsh 1980[51]) Figure 12: Répartition des effets produits par les lasers sur le tissu biologique en fonction de la durée d'émission et de l'irradiation (d'après Boulnois 1986)[52] Figure 13: Spectre d'absorption de l'eau (d'après S.Mordon) Figure 14: Schéma d'un tomographe à cohérence optique Figure 15: Peau entière humaine. (A) image OCT, (B) coupe histologique (x200). (a) Stratum corneum, (b) Épiderme, (c) Derme. L'épaisseur histologique moyenne de l'épiderme est de 52±18µm Figure 16: Peau strippée. (A) image OCT et (B) coupe histologique. (*): couche brillante (interface gel/épiderme).(coloration HE, Gx200) Figure 17: Images OCT illustratives de la différence de l'épaisseur du SC, (A) avant et (B) après stripping (Gx2,5) Figure 18: Séparation thermique de l'épiderme et du derme. (A) image OCT, et (B) coupe histologique (Gx400). Épaisseur d'épiderme (84±42µm) et (79±22µm) respectivement Figure 19: Images de l'épiderme séparé thermiquement (A) OCT, (B) histologie (Gx200) Figure 20: Images du derme séparé thermiquement. (A)OCT et (B) histologie (Gx200) Figure 21: Corrélation des mesures d'épaisseur de l'épiderme obtenues par OCT et histologie. (A) épiderme isolé thermiquement (n=15, r=0.88). (B) peau entière (n=36, r=0.68) Figure 22: Appareil de projection de franges, (A) l'ensemble du système, (B) schéma de l'arrangement projecteur et caméra

132 Illustration Figure 23: Représentation tridimensionnelle d'une ablation tissulaire induite par laser (A), et un exemple d'un profil en 2 dimensions (B) Figure 24: Mesure de l'épaisseur du stratum corneum et de l'épiderme. (Gx200) Figure 25: Exemples d'images reconstruites en 3D des ablations laser réalisées à des fluences de (a) 10J/cm², (b) 50J/cm² et (c) 200J/cm² Figure 26: Profil moyen des lésions obtenues par utilisation des fluences 10, 50 et 200 J/cm² Figure 27: Histologie de la peau humaine ex vivo (a) avant, et (b) après ablation laser à des fluences de10 J/cm², (c) 50 J/cm² et (d) 200 J/cm² (Gx100). L'endroit d'impact du faisceau est indiqué par les flèches. Le diamètre de la plaie (d) est de 1,14 mm (Gx200) Figure 28: (A) Schéma explicatif de la correction de l'artefact induit par l'histologie. La correction est apportée aux coupes histologiques, pour compenser l'effet de la contraction due à la fixation. (B) Le graphique présente la comparaison entre les résultats 3D et ceux obtenus après correction de l'histologie. (C) La coupe histologique montre le diamètre corrigé (1,4 mm). (Gx100, coloration HE. La barre=150 µm) Figure 29: Schéma représentatif des zones ablatées. (Flu.: Fluence) Figure 30: Exemples d'images reconstruites en 3D des abrasions laser réalisées par les fluences (a) 10, (b) 20, (c) 30, (d) 40 et (e) 50 J/cm² Figure 31: Courbe de profondeur en fonction de la fluence du faisceau laser. Les essais sont réalisés par un simple tir Figure 32: Coupes histologiques, représentatives d'abrasions cutanées induites au moyen d'un faisceau laser de 1,6 mm et les fluences 10, 20, 30, 40 et 50 J/cm², respectivement a, b, c, d et e. (Coloration HE. La barre=250 µm Gx200.) Figure 33:L'emplacement des plaies induites au niveau du rat en fonction du temps Figure 34: Un exemple de lésion réalisée chez le rat Hairless. A) représentation 3D de la lésion. B) le profil de la lésion. C) coupe histologique de la lésion. Les flèches correspondent aux bords de la lésion. Coloration HE. Gx Figure 35: Variabilité des profondeurs de lésions en fonction des rats Figure 36: Évolution de la valeur de la PIE en fonction du temps Figure 37: Coupes histologiques de la dynamique de la réparation d'une lésion induite par laser (Ø= 5mm & 20 J/cm²) chez le rat Hairless. A, B, C, D, E, F et G, sont respectivement le témoin, J0, J2, J4, J6, J8 et J10. (Gx100, Barre=100 µm) Figure 38: Illustration du test de chevauchement lors d'un balayage avec un faisceau de 1,5mm de diamètre. Les chevauchements présentés sont: 100, 113, 126, 139, 152 et 165% (valeurs du constructeur) Figure 39: Représentation d'une lésion réalisée, par laser à 400 J/cm² sur le modèle animal. (A) image 3D de la lésion. (B) profil de la lésion.(c) coupe histologique (Gx200, barre:350 µm) Figure 40:Profondeurs moyennes des tissus ablatés chez les trois rats.(n=32) Figure 41: Courbe de l'évolution des valeurs de la PIE en fonction du temps Figure 42: Coupes histologiques de la dynamique de la réparation d'une lésion induite par laser chez le rat Hairless.(Gx200, Barre=150µm) Figure 43: Profil d'une lésion laser réalisée chez un rat Hairless. Les bords de la lésion sont plus élevés que le niveau de peau normale

133 Illustration Figure 44: Schéma représentatif du déroulement de l'étude clinique Figure 45: illustration de la mesure du flux sanguin au niveau d'une lésion laser. le rectangle représente les dimension d'une lésion laser Figure 46: (a) Image OCT obtenue de la peau normale, avant induction des lésions, avec pour comparaison (b) image histologique (x 100) à la même échelle Figure 47: Photographie de lésions laser et bulle de succion prise avec une mire de couleur (Macbeth) Figure 48: Photographie d'une bulle de succion. (Diamètre= 10 mm) Figure 49: Photographies calibrées prises chez deux sujets immédiatement après induction des lésions. (a,b) sujet 7, lésion laser et BS respectivement, (c,d) sujet 4, lésion laser et BS respectivement Figure 50: Courbes représentatives de la variabilité des surfaces des lésions laser, et bulle de succion Figure 51: représentation 3D des lésions induites par laser (a) et bulle de succion (b) Figure 52: profils de deux lésions; laser et BS Figure 53: Courbe comparative des profondeurs moyennes des deux types de lésions des différents volontaires (n=10) Figure 54: Courbes comparatives des valeurs moyennes de la PIE des lésions laser et BS, en fonction du temps après induction Figure 55: Courbes comparative des valeurs moyennes du flux sanguin des différentes lésions (laser et BS), en fonction de temps (jours après induction de lésion) Figure 56: Image OCT obtenue d'une bulle de succion, démontrant la séparation de l'épiderme (largeur1mm, hauteur 1mm) Figure 57: Images OCT des deux types de lésions, Laser et Bulle de succion au différents temps. "ah" et "1-8" représentent les images OCT d'une lésion laser et BS respectivement, aux différents temps (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 et 7 jour) Figure 58: Coupes histologiques des différentes lésions aux temps 0, 4 et 7 jours. a, c et e lésion de BS et b, d et f lésions laser aux temps 0, 4 et 7 jour respectivement. ColorationHE, Gx Figure 59: Coupe histologique d'une peau normale témoin.(coloration HE, Gx100) Figure 60: Photographie des lésions de BS et Laser (groupe 2) Figure 61: Contraction des lésions. Pourcentage de la contraction des lésions par rapport à la taille initiale LISTE DES TABLEAUX: Tableau 1: Comparaison des mesures de la profondeur des lésions obtenues par la technique 3D et par 'histologie, avant et après correction, (n = 3)

134 ANNEXE

135 Annexes Annexe 1: Illustration des différents types cellulaires de la peau, avec ses différentes couches. (1) SC, (2) le stratum compactum, (3) la couche épineuse, (4) la couche granuleuse et (5) la couche Basale

136 Annexes Annexe 2: Différents types de laser utilisés en dermatologie. LASER LONGUEUR D ONDE CHROMOPHORE APPLICATION CO 2 pulsé 10,6µm Eau Relissage CO 2 continu 10,6µm Eau Ablation des tissus Erbium:YAG pulsé 2,94µm Eau Relissage Erbium:Glass 1,54µm Eau Acné Mélanine Dépigmentation Encres Détatouage Nd:YAG Q-Switched 1,06µm Mélanine Épilation Carbone Nd:YAG milliseconde 1,06µm Mélanine Épilation Diode milliseconde 810nm Mélanine Épilation Mélanine Dépigmentation Alexandrite Q-Switched 755nm Encres Détatouage Alexandrite milliseconde 755nm Mélanine Épilation Rubis Q-Switched 694nm Mélanine Encres Dépigmentation Détatouage Mélanine Épilation Rubis milliseconde 694nm Mélanine Épilation Colorant pompé par flash nm Hb Vasculaire Vapeur de cuivre 578nm Hb Vasculaire 510nm Mélanine Dépigmentation Nd:YAG doublé Q-Switched 532nm Hb Mélanine Encres Vasculaire Dépigmentation Détatouage IR VISIBLE Hb Vasculaire Nd:YAG doublé milliseconde 532nm Mélanine Dépigmentation Colorant pompé par Argon nm Hb Vasculaire Hb Vasculaire Argon 514nm 488nm Mélanine Dépigmentation

137 Annexes Annexe 3: Valeurs mesurées des épaisseurs de l'épiderme séparé thermiquement. OCT Histologie Épaisseur Écart type Épaisseur Écart type Ech ,32 12,47 92,17 27,84 Ech ,16 22,9 79,38 25,2 Ech ,93 15,61 62,74 29,18 Ech ,47 27,29 65,07 24,01 Ech ,73 16,78 81,8 26,82 Ech ,8 17,58 63,09 26,79 Ech ,13 30,57 106,11 43,84 Ech ,67 26,16 72,58 22,7 Ech ,25 31,6 67,58 23,42 Ech ,53 18,01 63,28 18,12 Ech ,13 14,94 63,82 27,11 Ech ,94 12,38 52,38 13,91 Annexe 4: Fluences appliquées en fonction des paramètres du faisceau laser utilisée Joule/pulsation Ø du Faisc. 1 1,5 1, Rayon mm 0,5 0,75 0,8 1 1,5 2,5 Aire mm² 0,785 1, ,0096 3,14 7,065 19,625 0,1 12,7 5,7 5,0 3,2 1,4 0,5 0,15 19,1 8,5 7,5 4,8 2,1 0,8 0,2 25,5 11,3 10,0 6,4 2,8 1,0 0,25 31,8 14,2 12,4 8,0 3,5 1,3 0,3 38,2 17,0 14,9 9,6 4,2 1,5 0,35 44,6 19,8 17,4 11,1 5,0 1,8 0,4 51,0 22,6 19,9 12,7 5,7 2,0 0,45 57,3 25,5 22,4 14,3 6,4 2,3 0,5 63,7 28,3 24,9 15,9 7,1 2,5 0,55 70,1 31,1 27,4 17,5 7,8 2,8 0,6 76,4 34,0 29,9 19,1 8,5 3,1 0,65 82,8 36,8 32,3 20,7 9,2 3,3 0,7 89,2 39,6 34,8 22,3 9,9 3,6 0,75 95,5 42,5 37,3 23,9 10,6 3,8 0,8 101,9 45,3 39,8 25,5 11,3 4, ,4 56,6 49,8 31,8 14,2 5,

138 Annexes Annexe 5: Protocole et paramètres d'acquisition des images par technique de projection de frange.(protocole EoTech.)

139 Annexes

140 Annexes Annexe 6: Valeurs mesurées des épaisseurs de l'épiderme de peau entière OCT Histologie Épaisseur Écart type Épaisseur Écart type Ech ,3 8,9 67,6 10,3 Ech ,2 6,6 57,9 11,2 Ech ,8 6,9 72,3 7,5 Ech ,4 6,8 61,2 6,7 Ech ,3 8,0 73,7 11,2 Ech ,2 6,4 74,8 11,5 Ech ,5 10,3 66,8 8,8 Ech ,8 7,9 65,8 9,5 Ech ,3 12,1 75,9 11,9 Ech ,4 13,5 81,5 14,2 Ech ,7 10,1 65,0 10,2 Ech ,8 8,2 65,9 11,4 Ech ,5 11,9 58,7 21,1 Ech ,9 6,0 75,1 26,0 Ech ,2 9,7 67,1 23,

141 Annexes Annexe 7: Protocole de réalisation et de coloration de coupes histologiques (inclusion en paraffine)

142 Annexes

143 Annexes

144 Annexes

145 Annexes

146 Annexes Annexe 8: Valeurs des profondeurs de trois lésions réalisées au moyen de 10, 50 et 200J/cm². X (µm) 10J/cm² 50J/cm² 200J/cm² 0,0 0,0 0,0 0,0 0,05 17,7-48,4-65,6 0,1 0,0-35,5-204,9 0,2-3,2-35,5-360,7 0,2-16,1-38,7-393,5 0,25-16,1-58,1-368,9 0,3-8,1-64,5-483,6 0,35-19,4-64,5-680,3 0,4-21,0-80,6-786,9 0,5-30,7-64,5-631,2 0,5-30,7-90,3-639,4 0,55-35,5-64,5-663,9 0,6-41,9-77,4-704,9 0,65-51,6-138,7-737,7 0,7-54,8-100,0-704,9 0,8-38,7-125,8-598,4 0,8-27,4-116,1-532,8 0,85-37,1-151,6-459,0 0,9-35,5-119,3-352,5 0,95-17,7-103,2-286,9 1-22,6-96,8-270,5 1,1-11,3-77,4-254,1 1,1-21,0-54,8-262,3 1,15-35,5-64,5-295,1 1,2-59,7-48,4-270,5 1,25-33,9-38,7-303,3 1,3 1,6-41,9-229,5 1,4-21,0 9,7-139,4 1,4-29,0 51,6-106,6 1,45 4,8 6,5-82,

147 Annexes Annexe 9: Valeurs mesurées des différentes profondeurs réalisées par 10, 20, 30, 40 et 50 J/cm² Lésion Fluence J/cm² Diamètre mm valeurs partielles Moyenne Écart type A 10 1,6 22,4 29,3 37,8 21,1 27,7 7,7 B 20 1,6 51,2 38,2 34,6 29,0 38,2 9,4 C 30 1,6 64,7 77,1 85,3 70,6 74,4 8,8 D 40 1,6 71,1 72,9 61,9 75,3 66,6 8,0 E 50 1,6 71,9 78,8 70,5 53,3 69,4 9,5 Annexe 10: Valeurs mesurées des différentes lésions induites chez des rats Hairless. Étude de reproductibilité de l'induction des lésions (fluence=20j/cm²). Lésion Profondeur moyenne Écart type 1 68,0 27,1 2 54,9 22,9 3 72,1 38, ,1 73, ,3 46, ,0 50, ,6 50, ,6 83,8 9 83,4 32, ,9 40, ,1 43, ,6 11, ,6 77, ,1 31, ,2 34, ,8 24, ,2 41, ,9 64,

148 Annexes Annexe 11: Valeurs mesurées des différentes lésions induites chez des rats Hairless. Étude de reproductibilité de l'induction des lésions (fluence=100j/cm²). Rat 1 Rat 2 Rat 3 Mesures épaisseur ecat type épaisseur écart type épaisseur écart type 1 145,5 26,9 121,2 13,3 126,3 14, ,7 14,3 196,8 13,8 144,4 11, ,2 12,7 186,6 20,6 139,2 13, ,9 31,7 82,0 8,5 205,3 25, ,4 34,0 201,9 19,9 136,5 24,3 6 57,8 12,4 184,4 5,1 216,9 19, ,1 16,3 129,0 8,2 94,1 13, ,0 16,9 275,0 24,2 240,4 26, ,3 10,2 169,4 18,8 moyenne 145,6 178,0 163,6 ecart type 42,7 58,7 48,0 Annexe 12: Valeurs mesurées de la PIE en fonction du temps. Mesures Avant J-0 J-1 J-2 J-3 J-4 J-5 J-6 J-7 J-8 1 2, , , ,0592 8,6 6, , , , , , , , , , ,7898 5, , , , , , , , ,9455 6, , , , , , , , ,4522 8,823 4,124 2,6198 3,2618 2, , , , , ,224 21,5516 7, , , , , , , , ,2518 5,0549 3, , , , , ,158 9, , , , , , , ,509 4, , , , , , , ,1012 3, , , , , , ,1811 6,9154 7, , , , , ,104 7,0802 6, , , , , , , , ,2145 4,8313 2, , , , ,3736 9, ,7525 4, , , , , ,6845 4, , ,492 64, ,0047 6, , , ,2184 6, ,1773 7, , ,8651 Moyenne 5,25 76,96 58,90 31,50 14,81 7,55 4,55 3,88 4,28 5,23 Écart type 1,61 10,39 11,87 20,80 12,65 4,85 1,72 1,41 3,02 0,

149 Annexes Annexe 13: Protocole comité de l'étude clinique de validation du laser Er:YAG

150 Annexes Annexe 14: Prototype de la pompe utilisée pour créer les bulles de succions Annexe 15: illustration du laser SMART 2940 (DEKA ). (a): le laser SMART 2940, (b): le scanner, (c): pièce à main pour le balayage. b a c

151 Annexes Annexe 16: Évaluation de la taille des lésions, après induction, par photos couleur calibrées. les lésions induites par laser et BS. Surface des lésions (cm²) Sujets Laser Bulle de succion p01 1,4 - p02 1,11 - p03 1,08 0,35 p04 1,05 0,42 p05 1,27 0,35 p06 1,04 0,96 p07 1,25 0,21 p08 0,99 0,65 p09 1,18 0,49 P10 1,31 0,34 Moyenne 1,17 0,47 Écart type 0,14 0,

152 Annexes Annexe 17: Mesure de profondeur d'exemple de lésions induite par laser et par bulle de succion Point Laser BS Point Laser BS 1 0,0 0, ,3-563,6 2-33,3 0, ,3-581,8 3-33,3 0, ,0-581,8 4-26,7-18, ,3-581,8 5-60,0-90, ,7-581,8 6-66,7-109, ,7-581,8 7-33,3-72, ,3-563,6 8-33,3-90, ,0-527,3 9-26,7-127, ,0-472, ,0-181, ,7-454, ,3-218, ,3-472, ,0-236, ,7-527, ,7-245, ,3-563, ,0-254, ,7-581, ,7-272, ,7-581, ,0-309, ,0-581, ,0-327, ,7-563, ,7-345, ,3-545, ,0-345, ,3-545, ,7-363, ,0-545, ,3-381, ,7-545, ,7-381, ,7-527, ,0-381, ,7-527, ,7-381, ,0-509, ,0-345, ,7-509, ,0-327, ,0-490, ,7-327, ,3-454, ,3-381, ,3-454, ,7-454, ,0-436, ,7-490, ,3-400, ,3-490, ,7-400, ,3-490, ,7-400, ,0-490, ,0-400, ,3-490, ,3-400, ,3-527, ,0-381, ,7-545, ,0-363, ,0-545, ,3-345, ,0-545, ,3-290, ,7-527, ,0-145, ,3-527, ,7-54, ,7-545, ,3-18,2 83 0,0 18,

153 Annexes Annexe 18: Évaluation de la taille des lésions par photos couleur calibrées en fonction du temps. Les valeurs sont des moyennes de toutes les lésions des différents volontaires. Temps (jour) Laser Bulle de succion Surface (cm²) Surface (%) Surface (cm²) Surface (%) Moyenne Écart type Moyenne Écart type Moyenne Écart type Moyenne Écart type 0 1,17 0,13 100,00-0,47 0,23 100,00-1 1,19 0,10 94,72 4,61 0,26 0,19 64,25 39,91 2 0,96 0,16 82,50 16,91 0,24 0,14 61,37 26,68 3 0,91 0,10 78,46 12,01 0,30 0,16 63,46 14,52 4 0,84 0,10 73,01 11,66 0,29 0,12 64,46 14,66 5 0,70 0,11 61,53 12,58 0,27 0,12 55,03 8,05 6 0,66 0,06 57,71 7,10 0,25 0,13 48,63 4,19 7 0,61 0,04 43,13 24,43 0,23 0,12 47,40 8,73 Annexe 19: Évaluation de la profondeur des différents types de lésions, après induction, par technique d empreintes cutanées couplée à la projection de frange. LASER BULLE DE SUCCION Sujet Moyenne Écart type Moyenne Écart type P01 73, P02 60, P03 83, P04 44, P05 39, P06 44, P07 54, P08 50, P09 43, P10 50, Moyenne 54,4 14, Annexe 20: Évaluation de la mise en place de la fonction barrière de la peau par mesure de la perte insensible en eau (PIE). PIE lésion Laser (g/m²/h) PIE lésion bulle de succion (g/m²/h) Temps (jour) Moyenne Écart type Moyenne Écart type Avant 6,5 1,9 6,5 1,9 0 74,0 7,0 69,1 9,3 1 71,2 13,1 51,4 29,2 2 67,3 6,4 48,4 27,1 3 62,4 12,0 50,0 20,2 4 52,7 15,3 35,0 15,4 5 35,4 10,8 23,1 9,5 6 27,7 6,3 18,5 6,0 7 24,4 5,6 15,5 6,

154 Annexes Annexe 21: Mesure du flux sanguin cutané par laser doppler, au niveau des différentes lésions. Flux sanguin, lésion Laser (V) Flux sanguin, lésion bulle de succion (V) Temps (jour) Moyenne Écart type Moyenne Écart type Avant 0,46 0,09 0,46 0, Annexe 22: Mesures de la contraction des deux types de lésions. (Pourcentage de la contraction des lésions par rapporte à la taille initiale). temps (jour) Laser Écart type BS Écart type 0 100,00 0,00 100,00 0, ,72 4,61 64,25 39, ,50 16,91 61,37 26, ,46 12,01 63,46 14, ,01 11,66 64,46 14, ,53 12,58 55,03 8, ,71 7,10 48,63 4, ,13 4,58 47,40 8,

155 Résumé de travail de thèse La peau est une barrière très efficace contre de nombreuses agressions extérieures. Son altération laisse pénétrer des agents nocifs, risquant ainsi le bouleversement de l homéostase de l organisme. Des altérations profondes de la peau comme les lésions et les brûlures doivent être réparées le plus rapidement possible afin d éviter toutes complications. Le processus de réparation et de régénération des tissus cutanés, autrement dit la cicatrisation, permet le rétablissement de l intégrité fonctionnelle de la peau. L étude de ce processus biologique dynamique et interactif, est importante afin de mieux comprendre ce phénomène. Cette étude peut se faire soit par une étude de lésions d'origines diverses et accidentelles, soit par un suivi de lésions expérimentales induites chez des volontaires sains. En raison de la grande variabilité des lésions du premier cas, la comparaison des résultats est difficile d une lésion à l autre, d'où la nécessité d induire des lésions expérimentalement et de manière standardisée. La standardisation de la taille des lésions induites (étendue, profondeur), permet de comparer le processus de cicatrisation et les facteurs pouvant l influencer. Le contrôle des paramètres du laser et son utilisation pour induire des lésions standardisées, sont un bon moyen pour explorer le processus de cicatrisation. Dans ce but, nous avons utilisé un laser Erbium: YAG nous permettant ainsi une reproductibilité de l'induction de ces lésions cutanées. Cet outil a pu être validé chez l homme en le comparant à un modèle de référence; la désépidermisation par la technique de bulles de succion. Ainsi cette étude nous permis de répondre à la question de la validation de la technique d'induction de lésions expérimentales, et par la même occasion l'établissement d'une courbe normale d'évolution de la barrière cutanée et de la réparation de la barrière cutanée, pour servir comme standard aux prochaines études. Mots Clefs: Cicatrisation cutanée, Laser:Er:YAG laser, Imagerie 3D, OCT, bulle de succion, épiderme, peau.