THÈSE présentée par :

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1 UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS DE TOURS ÉCOLE DOCTORALE SSBCV Equipe ««Biologie Intégrative de l Ovaire»-INRA UMR 7247 CNRS-Université de Tours-Haras Nationaux THÈSE présentée par : Camille MANSANET soutenue le : 10 décembre 2013 pour obtenir le grade de : Docteur de l université François - Rabelais de Tours Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie et Santé Contrôle génétique et physiologique de la prolificité en race ovine Lacaune : caractérisation de la mutation causale et rôle fonctionnel du gène FecL THÈSE dirigée par : M. FABRE Stéphane Chargé de recherche (HDR), INRA Val de Loire RAPPORTEURS : Mme COTINOT Corinne Directeur de recherche, INRA Jouy-en-Josas M. DEWAILLY Didier Professeur des universités, Université de Lille 2 JURY : Mme Cotinot Corinne Directeur de recherche, INRA Jouy-en-Josas M. Dewailly Didier Professeur des universités, Université de Lille 2 Mme Duittoz Anne Professeur des universités, Université François Rabelais Tours M. Fabre Stéphane Chargé de recherche (HDR), INRA Val de Loire M. Gougeon Alain Directeur de recherche, INSERM Lyon M. Persani Luca Professeur des universités, Université de Milan

2 A tous ceux qui m ont accompagné dans cette aventure,

3 Remerciements Voilà trois années d une belle aventure qui s achèvent et il est venu le moment fatidique des remerciements où ma seule crainte est d oublier de remercier une personne qui aura fait un bout de chemin avec moi. J adresse mes premiers remerciements aux Départements PHASE (Physiologie Animale et Systèmes d Elevage) et GA (Génétique Animale) ainsi qu à la Région Centre pour m avoir permis d effectuer ce travail. Je suis très reconnaissante envers Florian Guillou, Thierry Magallon ainsi que Philippe Mulsant et Martine Bouissou-Matet Yerle de m avoir accueillie au sein de l Unité Physiologie de la Reproduction et des Comportements de Tours et du Laboratoire de Génétique Cellulaire de Toulouse. Je tiens également à remercier les membres du jury pour avoir consacré de leur temps à l évaluation de mon travail de thèse, Corinne Cotinot et Didier Dewailly pour avoir accepté d en être les rapporteurs et Anne Duittoz, Alain Gougeon et Luca Persani pour avoir accepté d en être les examinateurs. Merci aux membres de mon comité de thèse, qui ont aussi pris de leur temps pour suivre l évolution de mon travail : Danielle Monniaux, Sophie Christin-Maitre, Philippe Mulsant, Anne Harduin-Lepers. A Stéphane, mon directeur de thèse, un grand merci d avoir cru en moi. Oui, je sais, la distance n a pas toujours été facile à gérer. Toulouse, les briques roses, le soleil, le «Sherpa» et ses délicieuses crêpes non mais quelle idée?!! Il n empêche que tu as su me donner un encadrement des plus complets, quoi que tu en dises, la distance c est un mal pour un bien et je ne regrette rien. Merci pour ta disponibilité, ton écoute, tes conseils, ton soutien, ton énergie et ta patience (pas toujours facile avec une tête en l air, qui quand elle ne se tord pas un genou, se fracture un orteil). Je pars avec une promesse, celle d un jour arriver à dépasser le maître et réussir à te contredire. Tu me connais, je suis coriace, alors tiens-toi prêt! MERCI pour tout Chef! Qu aurait été cette thèse sans Danielle, que dis-je, Mamida! Mamida, je ne te remercierai jamais assez pour ton aide, ta présence, ton écoute, tes bons conseils et ton optimisme durant ces trois années. Tu avais déjà bien à faire et pourtant tu as toujours été là pour moi et ça, ça vaut bien plus qu une médaille en chocolat! Un grand merci à l équipe BINGO et sa bonne humeur : Pascal, Sébastien, Virginie, Sandrine, Alice. Philippe, merci pour ces nombreuses discussions, scientifiques ou non, toujours très intéressantes! Je pense que beaucoup de personnes auraient été curieuses de te voir faire la chenille dans ton jardin. J avoue avoir été une privilégiée! Ah, tu pensais peutêtre que j allais emmener ça dans ma tombe Une longue vie à Déclic & Clac! Rozenn, je te souhaite de merveilleux moments avec ta jolie petite famille, merci pour tout! Linda, merci pour les coups de mains! Sveta, toujours souriante, merci pour tes conseils et ton énergie! Je compte sur toi pour m apprendre les rudiments de la langue russe! Géraldine, toi aussi tu as préféré partir sur Toulouse, décidément, je ne comprends pas merci pour tous ces bons 1

4 moments et d avoir été là pour moi! Enfin, M dame Peggy, une belle amitié est née rue du Coteau! Je ne te remercierai jamais assez de m avoir fait partager de merveilleux moments, des souvenirs plein la tête. A quand de nouvelles aventures?! Ma thèse a été à l interface entre la physiologie et la génétique, alors je tiens à remercier tout particulièrement les toulousains : Gwenola, Julien, Juliette, Kamila, Francis, Agnès, Katia, Sophie, Pitou, la liste est longue! Une dédicace spéciale à Laurence, merci pour ton aide scientifique, ta générosité et ta bonne humeur. Merci également de m avoir accueillie sur Toulouse. N oublie jamais que l oxygène sous l action des UV forme l ozone et que non, l ozone ça ne sent pas le poulet! Je tiens également à remercier toutes les personnes de l Unité Expérimentale de Langlade ainsi que Catherine Viguié de l Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, pour leur accueil et leur disponibilité. Alors voilà, qui dit d être loin de son directeur de thèse, dit de se mettre en mode «MacGyver» et d aller toquer à toutes les portes de labo de l unité PRC. Je crois ne pas en avoir oublié une seule! Les pauvres Une chose est sûre, c est que vous avez tous été formidables avec moi, pas un râteau! Un grand merci au laboratoire de spectrométrie de masse. Valérie, merde pour ta thèse! Merci à toute l équipe Gonadotropines. Claire et Yves, votre soutien et votre aide sont pour moi une chance incommensurable. Danièle, je crois que tu as été la plus courageuse, je dois battre les records de fréquentation du labo! Vous avez été au top du top quand j étais dans les méandres des western-blots! Merci à l équipe ER3, Maryse et Martine pour l immuno-fluo, Pascal pour m avoir confié des enseignements et pour ton soutien durant ces 3 ans, Anne, pour le tour de poney que tu viens de me proposer,.. Merci à l ER1, tout particulièrement à Elodie ;-). Merci également à l ER2 pour m avoir sauvée des pénuries de milieux de culture. Catherine, un grand merci pour le temps que tu m as accordé et pour m avoir permis de me servir de temps en temps dans ton frigo! Claude, ça été un grand plaisir de te connaître, MERCI pour tout. Prépare-toi à me voir débarquer à Nouzilly! A l ER5, merci à tous pour tout ce que vous m avez appris, pour votre gentillesse et votre bonne humeur! Je n oublie pas l ER7 : merci à Guillaume pour ta patience et ton savoir. Ton aide a été précieuse. Merci à Pascal et à Yann pour ces bons moments partagés plus ou moins proches de la piscine. Enfin, merci à l ER10. Yves je te remercie de ton écoute et de tes bons conseils. Je tiens également à remercier Madame Sophie, le sourire de l accueil. Tu es quelqu un que j apprécie énormément. Merci pour tous ces bons moments et les coups fourrés montés avec le personnel de l hôpital. Merci à Marie-Françoise. Pascale, pour ces nombreuses discussions sur l avenir, un grand merci pour ton écoute. Maurice et Gaël, les patrons de la débrouille. Vous faites un souhait et ils vous le réalisent (oui j exagère un peu, ah vous devriez être flattés!). Que vous dire si ce n est que sans vous le quotidien aurait été plus calme! Vous m avez drôlement fait rire, je ne vous remercierai jamais assez pour votre générosité. 2

5 C est fou ce que la thèse peut apporter. Voilà une belle expérience humaine, faite d entraide et de partage. C est au tour des amis, je promets de ne pas être trop longue. Je commence par remercier les amis de l ADOCT (Association des Doctorants de Tours) avec qui j ai passé d excellents moments : Marmotte, Rimo, FX, Mimsy, Claire, Lucie, Aurore, A la bande de fous furieux de la PRC, vous avez été de vrais amis. Loulou, je n oublierai jamais notre escapade à Strasbourg, mais la prochaine fois prends un GPS! Mon ti Jérém, je compte sur toi pour ne jamais divulguer la dite photo, ou alors attends que ma soutenance soit passée. Je t adore. Ma chouquette, les mots me manquent. J ai rencontré une personne formidable, une amie, une confidente et une partenaire de soirée inégalable! Longue vie aux chouquettes! Stéph, par ta simplicité, ton honnêteté et ta générosité, j ai eu la chance de t avoir comme amie. Flambie, la p tite dernière, je compte sur toi pour mettre l ambiance au dernier étage. Reste comme tu es! A vous tous, pardon de m être un peu effacée ces derniers temps. Tenez-vous prêts, The Chouquette is coming back! A Pauline et Willy, qui nous ont quittés pour une nouvelle vie sur Grenoble, merci pour tous ces bons moments et merci de m avoir fait confiance. Je vous souhaite beaucoup de bonheur les jeunes mariés! A la bande de Lolo : Maëlle, William, Rom, Angele, Stako, Fred, Jean-Phi, que vous dire si ce n est que l amitié qui vous unit fait chaud au cœur. Merci de m avoir acceptée dans cette jolie petite famille et merci pour votre soutien. Vous êtes des personnes extraordinaires. Au cours de mon Master 2, un parrainage a été mis en place. J ai alors pris sous mon aile une personne que j étais loin d imaginer devenir mon frère. Fillot, voilà maintenant 4 ans que nous sommes comme les deux doigts de la main. Je n oublierai jamais la phrase de Mamida disant que notre amitié, si forte, serait une amitié pour la vie. Tu m en auras fait baver pendant ces 3 années entre les bombes de carboglace sous la chaise de mon bureau, les batailles de pipettes d alcool, les camemberts cachés dans l open-space, les lendemains de soirée plus que difficiles et les nombreux fous rires! A côté de cela tu as toujours été là pour moi. Je te souhaite de merveilleuses choses pour l avenir ainsi qu une belle fin de thèse. Ce préambule est aussi l occasion pour moi de partager ce moment avec ma famille : Ma tite maman, mon baboun, vous avez toujours été là pour moi, même cachés loin au fin fond du Pilat. C est grâce à vous que j en suis là aujourd hui et je souhaite vous témoigner tout l amour que j ai pour vous, je suis fière de vous avoir à mes côtés. A ma choune et mon chachou, la fratrie, vous êtes ma force. Un grand merci à mes grands-parents pour tout leur amour et leur soutien. Vous me manquez. A tout le reste de la famille, les tantes, les oncles, les cousins/cousines du sud et de la région parisienne, merci d avoir été là, merci d être ma famille. Un grand merci à toute la belle famille pour leur accueil chaleureux et tous leurs encouragements. Enfin, Loïc les mots me manquent. Que dire si ce n est que je suis heureuse de partager ma vie avec toi. Merci d avoir été mon bras droit pendant cette thèse. Merci pour ta patience et tout ton amour (rassure-toi, je n écrirai qu une seule thèse). Merci pour tout ce que tu m as fait découvrir. Je suis si fière de t avoir à mes côtés. 3

6 Résumé Chez les ovins, l identification de mutations dans des gènes majeurs influençant la prolificité (gènes Fec) est à la fois une source d amélioration génétique de ce caractère pour l élevage et une source d information biologique pour une meilleure compréhension de la fonction ovarienne et des pathologies associées. Une telle mutation dans un locus nommé FecL contrôle la prolificité en race Lacaune. Elle est localisée sur le chromosome 11 dans une région de 250kb. Les objectifs de cette thèse étaient d une part de poursuivre l étude génétique afin d identifier la mutation causale FecL L au sein du locus et d autre part, de caractériser les conséquences moléculaires de la mutation FecL L sur la fonction ovarienne. Une analyse de clonage positionnel développée à partir du séquençage haut débit (Roche 454) du locus de 250kb a permis d identifier de nouveaux polymorphismes informatifs utilisés pour réduire l intervalle de localisation de FecL à 194,6kb. Ce locus réduit ne contient plus que deux gènes candidats pour FecL, IGF2BP1 (insulin-like growth factor 2 mrna binding protein 1) et B4GALNT2 (beta-1,4-n-acetyl-galactosaminyl transferase 2). Dans ce locus, 2 polymorphismes de type SNP en déséquilibre de liaison total avec FecL L ont été identifiés dans des régions non codantes du locus et représentent donc l haplotype causal FecL L. L analyse d expression des deux gènes candidats positionnels montre une surexpression ectopique de B4GALNT2 codant une enzyme de glycosylation dans l ovaire des brebis hyperprolifiques FecL L. Cette surexpression est à la fois associée à la présence de la protéine et à une activité de glycosylation atypique uniquement dans les cellules de granulosa des brebis mutées. Ces différentes observations désignent B4GALNT2 comme étant le gène FecL. Parmi les glycoprotéines ovariennes cibles de cette enzyme identifiées par spectrométrie de masse, les sous-unités alpha et betaa de l inhibine A représentent des candidates physiologiques évidentes pour expliquer l augmentation de la prolificité observée chez les brebis FecL L. La glycosylation atypique de ces sous-unités semble être à l origine d une production favorisée d inhibine A intra-folliculaire. Paradoxalement, les concentrations circulantes d inhibine A sont 3 fois moins importantes chez les brebis FecL L et n ont pourtant aucune incidence sur les niveaux circulants de FSH. L hypothèse retenue serait une action de la glycosylation atypique par B4GALNT2 sur la biodisponibilité et /ou la bioactivité de l inhibine A, modifiant son rôle paracrine au cours du phénomène de sélection des follicules, conduisant à une augmentation du nombre d ovulations. B4GALNT2 n appartient pas au système TGFß/BMP comme les autres gènes Fec déjà découverts chez la brebis (BMP15, GDF9 et BMPR1B), néanmoins cette thèse met en évidence que via l inhibine A, ce système reste au cœur du contrôle de la prolificité chez la brebis Lacaune. Mots clés : B4GALNT2, inhibine A, ovaire, prolificité, brebis Lacaune 4

7 Abstract In sheep, the identification of mutations in key genes influencing prolificacy (called Fec genes) is both a source of genetic improvement of this breeding trait and a source of biological information for a better understanding of the ovarian function and its associated pathologies. Such a mutation in a locus called FecL L controls prolificacy in Lacaune sheep. FecL L was previously located on chromosome 11 within a 250kb region. The objectives of this thesis were firstly to go on with the genetic study in order to identify the FecL gene and the FecL L causal mutation in this locus and secondly, to characterize the molecular consequences of the mutation on the ovarian function. Genetic positional cloning developed from high-throughput sequencing (Roche 454) of the 250kb locus identified new informative polymorphisms used to reduce the localisation interval of FecL L to kb. This reduced the locus containing only two candidate genes for FecL, IGF2BP1 (insulin-like growth factor 2 mrna binding protein 1) and B4GALNT2 (beta-1,4- N-acetyl-galactosaminyl transferase 2). In this locus, two single-nucleotide polymorphisms (SNP) identified in non-coding regions were in total linkage disequilibrium with FecL L and thus represent the causal FecL L haplotype. Expression analysis of the two positional candidate genes highlighted ectopic overexpression of the B4GALNT2 gene encoding a glycosylation enzyme specifically in the ovary of the mutated hyperprolific sheep. This overexpression is both associated with the presence of the protein and atypical glycosylation activity only in granulosa cells of mutant ovaries. Based on these different observations, we assume that B4GALNT2 is the FecL gene. Among the B4GALNT2 glycoproteins targets identified by mass spectrometry in the ovary, alpha and betaa subunits of inhibin A are obvious physiological candidates to explain the increased prolificacy observed in FecL L sheep. Atypical glycosylation of these subunits is associated to increased production of intrafollicular inhibin A. Paradoxically, circulating levels of inhibin A are three times lower in FecL L ewes and yet have no impact on circulating levels of FSH. The assumption would be an action of atypical glycosylation by B4GALNT2 on the bioavailability and/or bioactivity of inhibin A, amending its paracrine role on follicle selection and leading to an increased ovulation rate. B4GALNT2 does not belong to the TGF/BMP system as other Fec genes already discovered in sheep (BMP15, GDF9 and BMPR1B), however this thesis shows that this system via inhibin A is still at the center of mechanism controlling prolificacy in Lacaune sheep. Keywords : B4GALNT2, inhibin A, ovary, prolificacy, Lacaune sheep 5

8 Table des matières Remerciements... 1 Résumé... 4 Table des matières... 6 Liste des tableaux... 9 Liste des procédures expérimentales (PE) Liste des abréviations INTRODUCTION I. Exploitation du déterminisme monogénique de la prolificité dans le domaine agronomique A. Exemple en race Mérinos : cas du gène Booroola B. Identification d autres gènes de prolificité II. Exploitation du déterminisme monogénique de la prolificité pour l étude de la fonction ovarienne A. Le système BMP Composition du système de signalisation BMP Régulation de la voie de signalisation des BMPs B. La fonction ovarienne : quelques notions La folliculogenèse L atrésie C. Conséquences des mutations du système BMP associées à l hyperprolificité sur la fonction ovarienne FecB/BMPR1B FecX/BMP FecG/GDF Modèles de contrôle du nombre d ovulations chez la brebis D. Implication des gènes de prolificité ovins chez la souris et l homme Chez la souris Chez l Homme SITUATION DU SUJET ET OBJECTIFS DE LA THESE I. Le gène de prolificité FecL en race ovine Lacaune A. Création des familles expérimentales et mise en évidence du gène FecL

9 B. Localisation du locus FecL (thèses F. Lecerf et L. Drouilhet) C. Etude de l expression des gènes candidats positionnels (thèse L. Drouilhet) D. Caractérisation du phénotype L/L (thèse L. Drouilhet) II. Objectifs de la thèse III. Principaux résultats acquis RESULTATS I. Réduction de l intervalle FecL et identification de la mutation causale : Analyse du séquençage 454 : A. Réduction de l intervalle FecL B. Annotation bioinformatique du locus FecL C. Annotation fonctionnelle du locus FecL D. Identification des polymorphismes et étude du partage allélique II. Mécanisme d action moléculaire de la mutation FecL L A. Hypothèse 1 : Altération de sites de fixations des facteurs transcriptionnels B. Hypothèse 2 : Altération des marques épigénétiques par méthylation A l échelle globale : Hypométhylation du génome Ilots CpG : Séquençage Bisulfite et Digestion enzymatique méthyl-sensible III. Choix du gène candidat A. Localisation ovarienne d IGF2BP1 et de B4GALNT B. Caractérisation des activités biologiques ovariennes d IGF2BP1 et de B4GALNT2. 59 IV. Conséquences cellulaires de l activité de glycosylation par B4GALNT A. Profils des cibles protéiques de l activité transférase B. Purification et identification des glycoprotéines cibles de B4GALNT V. Conséquences physiologiques de FecL L : sur la piste de l Inhibine A/Activine A A. Confirmation des sous-unités de l inhibine A comme cibles de B4GALNT B. Influence de FecL L sur l expression des gènes du système inhibine/activine C. Concentrations intra-folliculaire et plasmatique d inhibine A et d activine A DISCUSSION I. Caractérisation du locus FecL II. Mécanisme d action moléculaire de la mutation FecL L III. Les gènes candidats pour FecL A. IGF2BP1 peut-il être le gène FecL? B. B4GALNT2, le nouveau gène de prolificité FecL

10 1. Les arguments expérimentaux Les protéines cibles de B4GALNT C. B4GALNT2/Inhibine A, siège de la régulation de la prolificité? Expression et activité des sous-unités de l inhibine A dans l ovaire Sécrétion ovarienne d inhibine A et d activine A Perspectives Hypothèses de contrôle du nombre d ovulations par B4GALNT CONCLUSION BIBLIOGRAPHIE ANNEXES: PROCEDURES EXPERIMENTALES (PE) ARTICLE Drouilhet-Mansanet et al, Liste des publications Résumé Abstract

11 Liste des tableaux TABLEAU 1. RACES OVINES DANS LESQUELLES SEGREGE UN GENE MAJEUR TABLEAU 2. COMPARAISON DES EFFETS DES MUTATIONS NATURELLES OVINES (M) ET DES INACTIVATIONS DE GENES DE LA SOURIS (KO) SUR LE TAUX D OVULATION DES FEMELLES TABLEAU 3. DENOMBREMENT FOLLICULAIRE APRES DISSECTION D OVAIRES LACAUNE HOMOZYGOTES L/L ET SAUVAGES +/ TABLEAU 4. CONCENTRATIONS PLASMATIQUES D OESTRADIOL, LH, FSH ET PROGESTERONE AU COURS D UN CYCLE ŒSTRIEN SYNCHRONISE CHEZ DES BREBIS HOMOZYGOTES MUTEES L/L ET SAUVAGES +/ TABLEAU 5. POLYMORPHISMES IDENTIFIES DANS LE LOCUS MINIMAL FECL LOCUS ET LEUR PARTAGE ALLELIQUE (TABLEAU 1, DROUILHET-MANSANET ET AL., 2013) TABLEAU 6. PROTEINES PURIFIEES PAR LA LECTINE DBA DANS LES LIQUIDES FOLLICULAIRES, IDENTIFIEES PAR SPECTROMETRIE DE MASSE (TABLEAU 2, DROUILHET-MANSANET ET AL., 2013) TABLEAU 7. SEQUENCES DES SONDES DOUBLE-BRINS BIOTINYLEES (EMSA) TABLEAU 8. SEQUENCES DES AMORCES DE PCR EN TEMPS REEL ET LEUR EFFICACITE

12 Liste des figures FIGURE 1. ARBRE PHYLOGENETIQUE DES LIGANDS DE LA SUPER FAMILLE DU TGF-Β FIGURE 2. REPRESENTATION SCHEMATIQUE DE LA STRUCTURE PRIMAIRE DES BMPS FIGURE 3. SCHEMA RECAPITULATIF DE LA SECRETION ET DE LA BIODISPONIBILITE DES BMPS FIGURE 4. FAMILLE DES RECEPTEURS TGFΒ DE TYPE I ET II FIGURE 5. RECAPITULATIF DES VOIES DE SIGNALISATION INDUITES PAR LES BMPS FIGURE 6. LES TROIS SOUS-CLASSES DE SMADS FIGURE 7. VOIE DE SIGNALISATION DE LA SUPER-FAMILLE DU TGF-Β FIGURE 8. LES DIFFERENTS NIVEAUX D INHIBITION DE LA VOIE DE SIGNALISATION DE LA SUPER-FAMILLE DU TGF-Β FIGURE 9. PRINCIPALES ETAPES DU DEVELOPPEMENT FOLLICULAIRE ET DE LA MATURATION OVOCYTAIRE FIGURE 10. SECRETIONS HORMONALES AU COURS DU CYCLE OESTRIEN DE LA BREBIS FIGURE 11. REGULATIONS DE LA SELECTION ET DU DEVELOPPEMENT TERMINAL DU FOLLICULE OVULATOIRE PENDANT LA PHASE FOLLICULAIRE DU CYCLE OVARIEN CHEZ UNE ESPECE MONO-OVULANTE FIGURE 12. TRACTUS GENITAUX DE BREBIS ROMNEY SAUVAGE ET INVERDALE FIGURE 13. COUPES HISTOLOGIQUES D OVAIRES HOMOZYGOTES FECX L /FECX L FIGURE 14. CONSEQUENCES DES MUTATIONS DES GENES DE PROLIFICITE SUR LA FOLLICULOGENESE ET LE NOMBRE D OVULATIONS CHEZ LA BREBIS- MODELE PHYSIOLOGIQUE FIGURE 15. RELATIONS FONCTIONNELLES ENTRE BMP15, GDF9 ET BMPR1B FIGURE 16. MODELE MOLECULAIRE DU CONTROLE DU NOMBRE D OVULATIONS EN CAS DE MONO-OVULATION FIGURE 17. MODELE MOLECULAIRE DU CONTROLE DU NOMBRE D OVULATIONS PAR LES MUTATIONS FEC FIGURE 18. ILLUSTRATION SCHEMATIQUE DES DIFFERENTS POLYMORPHISMES CONNUS DANS BMP15 DETECTES DANS DES CAS D INSUFFISANCE OVARIENNE PRECOCE (IOP) FIGURE 19. SCHEMA EXPERIMENTAL FAMILIAL LACAUNE FIGURE 20. THEORIE DE L EXISTENCE D UN GENE MAJEUR FIGURE 21. CREATION DES FAMILLES EXPERIMENTALES FIGURE 22. UTILISATION DE MEIOSES RECOMBINANTES EN CARTOGRAPHIE FINE FIGURE 23. NOTION DE PARTAGE ALLELIQUE FIGURE 24. REPRESENTATION DE LA REDUCTION DE LA ZONE DE LOCALISATION DU LOCUS FECL TYPAGE DES MARQUEURS ISSUS DU SEQUENÇAGE 454 D UN ANIMAL L/+, SUR LES ANIMAUX RECOMBINANTS FIGURE 25. POSITION DES DEUX SNP NON PARTAGES ISSUS DU SEQUENÇAGE ROCHE FIGURE 26. EXPRESSION DES GENES SITUES DANS LE LOCUS MINIMAL DE FECL (FIGURE 2 ET FIGURE S1, DROUILHET-MANSANET ET AL., 2013) FIGURE 27. SCHEMA RECAPITULATIF DE LA STRATEGIE UTILISEE POUR REDUIRE L INTERVALLE DE FECL ET POUR IDENTIFIER LA MUTATION CAUSALE FIGURE 28. REPRESENTATION DE LA ZONE DE LOCALISATION DE FECL APRES LE SEQUENÇAGE ROCHE 454 DES ANIMAUX L/L ET +/+ (CAPTURE D ECRAN DU LOGICIEL DE VISUALISATION APOLLO)

13 FIGURE 29. RECAPITULATIF DE LA REDUCTION DE LA ZONE DE LOCALISATION DE FECL APRES LE SEQUENÇAGE ROCHE 454 DES BREBIS +/+ ET L/L FIGURE 30. CARTE DU LOCUS FECL SUR LE CHROMOSOME 11 OVIN (FIGURE 1, DROUILHET-MANSANET ET AL., 2013) FIGURE 31. ANALYSE PAR EMSA DES INTERACTIONS PROTEINE-ADN AU NIVEAU DES SNPS CANDIDATS FIGURE 32. EFFET DE DIFFERENT DEGRES D HYPOMETHYLATION SUR L EXPRESSION DES GENES DU LOCUS (B4GALNT2 ET IGF2BP1) ET AVOISINANT LE LOCUS (GNGT2, ABI3 ET PHOSPHO1) FECL FIGURE 33. REPRESENTATION DE LA POSITION DES ILOTS CPG DANS LE LOCUS FECL FIGURE 34. REPRESENTATION DE LA POSITION DES ILOTS CPG AU NIVEAU DES SEQUENCES REGULATRICES EN AMONT DE B4GALNT FIGURE 35. PROFILS D AMPLIFICATION DES ILOTS CPG PUTATIFS EN AMONT DE B4GALNT2, APRES DIGESTION ENZYMATIQUE METHYL-SENSIBLE FIGURE 36. VOIE DE SYNTHESE DU CARBOHYDRATE SD(A) FIGURE 37. IMMUNOMARQUAGE D IGF2BP1 ET DE B4GALNT2 DANS LES OVAIRES DE BREBIS LACAUNE (FIGURE 3, DROUILHET- MANSANET ET AL., 2013) FIGURE 38. EXPRESSION DES GENES CIBLES D IGF2BP1 DANS LES CELLULES DE GRANULOSA DES BREBIS LACAUNE (FIGURE S2, DROUILHET-MANSANET ET AL., 2013) FIGURE 39. ACTIVITE TRANSFERASE DE B4GALNT2 REVELEE A L AIDE D UN MARQUAGE PAR LA LECTINE DBA ET L ANTICORPS KM694 (FIGURE 4, DROUILHET-MANSANET ET AL., 2013) FIGURE 40. PROFIL DE L ACTIVITE TRANSFERASE DE B4GALNT2 AU COURS DE LA CROISSANCE FOLLICULAIRE DANS DES OVAIRES DE BREBIS LACAUNE L/L FIGURE 41. COMPARAISON DES PROFILS DE L ACTIVITE DE B4GALNT2 OBTENUS PAR LECTINE-/IMMUNO-HISTOCHIMIE, AU COURS DE LA CROISSANCE FOLLICULAIRE DANS DES OVAIRES DE BREBIS L/L FIGURE 42. ACTIVITE TRANSFERASE DE B4GALNT2 REVELEE A L AIDE D UN MARQUAGE PAR LA LECTINE DBA APRES LA SUREXPRESSION IN VITRO DE B4GALNT2 DANS DES CELLULES DE GRANULOSA OVINES (FIGURE 5, DROUILHET-MANSANET ET AL., 2013) FIGURE 43. ANALYSE PAR WESTERN IMMUNOBLOTTING DE L ACTIVITE TRANSFERASE DE B4GALNT2 DANS LES CELLULES DE GRANULOSA ET LES LIQUIDES FOLLICULAIRES DE BREBIS LACAUNE (FIGURE 6, DROUILHET-MANSANET ET AL., 2013) FIGURE 44. SOUS-UNITES Α (INHA) ET ΒA (INHBA) DE L INHIBINE PRECIPITEES PAR LA DBA A PARTIR DES LIQUIDES FOLLICULAIRES +/+ ET L/L FIGURE 45. EXPRESSION DES SOUS-UNITES Α (INHA) ET ΒA (INHBA) DE L INHIBINE DANS LES CELLULES DE GRANULOSA DE BREBIS LACAUNE FIGURE 46. ETUDE DE L EXPRESSION DES GENES CODANT LES SOUS-UNITES DE L INHIBINE A ET B FIGURE 47. ETUDE DE L EXPRESSION DES GENES CODANT LES RECEPTEURS MEMBRANAIRES DU SYSTEME INHIBINE/ACTIVINE FIGURE 48. CONCENTRATION INTRA-FOLLICULAIRE D INHIBINE A ET D ACTIVINE A EN PHASE FOLLICULAIRE, 36H APRES LE RETRAIT DE L EPONGE DE PROGESTAGENE, CHEZ DES BREBIS LACAUNE FIGURE 49. CONCENTRATIONS PLASMATIQUES D INHIBINE A ET D ACTIVINE A EN PHASE FOLLICULAIRE, 36H APRES LE RETRAIT DE L EPONGE DE PROGESTAGENE, CHEZ DES BREBIS LACAUNE

14 FIGURE 50. EVOLUTION DES CONCENTRATIONS PLASMATIQUES D E2, LH, FSH, P4 ET INHIBINE A AU COURS D UN CYCLE OESTRIEN SYNCHRONISE CHEZ DES BREBIS LACAUNE +/+ ET L/L FIGURE 51. REPRESENTATION SCHEMATIQUE DES CONSTRUCTIONS NECESSAIRES A L ESSAI RAPPORTEUR LUCIFERASE FIGURE 52. PRINCIPE DE LA STRATEGIE D IDENTIFICATION DES CARBOHYDRATES SYNTHETISES PAR B4GALNT2, PAR SPECTROMETRIE DE MASSE FIGURE 53. RESUME DES DIFFERENTS STADES DE DEVELOPPEMENT DES FOLLICULES ET DU CORPS JAUNE AU COURS DESQUELS LES DIFFERENTS CONSTITUANTS DE LA VOIE DE SIGNALISATION DE L INHIBINE/ACTIVINE ONT ETE IDENTIFIES, AU NIVEAU ARN ET/OU PROTEIQUE FIGURE 54. EVOLUTION DES CONCENTRATIONS PLASMATIQUES D AMH AU COURS D UN CYCLE OESTRIEN SYNCHRONISE CHEZ DES BREBIS LACAUNE FIGURE 55. REPRESENTATION SCHEMATIQUE DES SITES DE N-GLYCOSYLATION SUR INHA ET INHBA ET LES LIGNEES STABLES CHO-FLP PRODUCTRICES DES GLYCOMUTANTS INHA ET INHBA FIGURE 56. EFFETS DES MEMBRES DE LA SUPER-FAMILLE DES TGFΒ AU COURS DE LA FOLLICULOGENESE ET FENETRE D ACTION DES MUTATIONS PROLIFIQUES FECX/BMP15, FECG/GDF9 ET FECL/B4GALNT FIGURE 57. MODELE INTEGRATIF DES CONSEQUENCES DE LA MUTATION DU GENE DE PROLIFICITE FECL SUR LA FOLLICULOGENESE ET LE NOMBRE D OVULATIONS EN RACE OVINE LACAUNE FIGURE 58. PRINCIPE DU PYROSEQUENÇAGE FIGURE 59. PRINCIPE DES TYPAGES MICROSATELLITES ET SNP PAR SSCP FIGURE 60. PRINCIPE DU RETARD SUR GEL FIGURE 61. PRINCIPE DE L EFFET DU TRAITEMENT AU BISULFITE DE SODIUM FIGURE 62. PRINCIPALES ETAPES DU SEQUENÇAGE BISULFITE FIGURE 63. ENDONUCLEASES DE RESTRICTION MAJORITAIREMENT UTILISEES FIGURE 64. PRINCIPE DE LA TECHNIQUE MSRE POUR L ETUDE DE L ETAT DE METHYLATION DES SITES CPG FIGURE 65. PRINCIPE DE LA LECTINE-/IMMUNO-PRECIPITATION ET WESTERN-BLOTTING FIGURE 66. PRINCIPE DE LA STRATEGIE D IDENTIFICATION DES GLYCOPROTEINES PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE NANO- DEBIT COUPLEE A LA SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM FIGURE 67. PARALLELISME DES COURBES DE DILUTION DES LIQUIDES FOLLICULAIRES ET DES PLASMAS OVINS AVEC LA COURBE STANDARD DE L INHIBINE A ET L ACTIVINE A DES KITS ELISA

15 Liste des procédures expérimentales (PE) PE 1. AMPLIFICATION DES LONGS FRAGMENTS PCR PE 2. PRINCIPALES ETAPES DU SEQUENÇAGE ROCHE PE 3. SEQUENÇAGE 454 : APPLICATION AUX GENOTYPES ETUDIES PE 4. IDENTIFICATION DES POLYMORPHISMES, GENOTYPAGE ET CARTOGRAPHIE FINE PE 5. SEQUENÇAGE SANGER EN MARCHE SUR LE CHROMOSOME PE 6. ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAYS (EMSA) PE 7. HYPOMETHYLATION TEST 5-AZA-2 -DEOXYCYTIDINE PE 8. SEQUENÇAGE BISULFITE/ CONVERSION PAR LE BISULFITE PE 9. DIGESTION ENZYMATIQUE METHYL-SENSIBLE (MSRE, METHYLATION-SENSITIVE RESTRICTION ENZYME) PE 10. ANIMAUX PE 11. HISTOCHIMIE PE 12. TRANSCRIPTION INVERSE ET PCR QUANTITATIVE PE 13. ANALYSE PAR WESTERN-BLOTTING PE 14. TRANSFECTION TRANSITOIRE DE CELLULES DE GRANULOSA PE 15. LECTINE/IMMUNO-PRECIPITATION PE 16. IDENTIFICATION DES GLYCOPROTEINES PAR SPECTROMETRIE DE MASSE PE 17. DOSAGES ELISA

16 Liste des abréviations ABI3: Abscisic Acid Insensitive 3 ActR/ACVR1: Activin Receptor 1 ADN: Acide désoxyribonucléique ADNc: ADN complémentaire ALK: Activin-Like receptor AMH: Hormone anti-müllerienne AMPc: Adénosine Monophosphate cyclique ATP5G1: ATP Synthase, H+ Transporting, Mitochondrial Fo Complex, Subunit C1 AZDC: 5-Aza-2 -Déoxycytidine B4GALNT2: Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase 2 BAMBI: BMP and Activin Membrane Bound Inhibitor BMP: Bone Morphogenetic Protein BMPR1B: Bone Morphogenetic Protein Receptor type 1B BRAM1: Bone Morphogenetic Protein Receptor Associated Molecule 1 BSA: Bovin Serum Albumin BTA: Bos Taurus CALCOCO2: Calcium Binding And Coiled-Coil Domain 2 Co-SMAD: Common Smad CYP19: Aromatase DAN family: Deadenylating Nuclease E2: Oestradiol EMSA: Electrophoretic Mobility Shyft Assay ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements ERK: Extracellular Signal Regulated Kinase Fec: Fecundity gene FkBP12: 12-kDa FK506-Binding Protein FSH: Folliculostimulating Hormone GDF9: Growth and Differenciation Factor 9 GDNF: Glial cell line Derived Neurotrophic Factor GIP: Gastric Inhibitory Polypeptide GNGT2: Guanine Nucleotide Binding Protein Gamma Transducing Activity Polypeptide 2 GnRH: Gonadotropin Releasing Hormone HSA: Homo Sapiens IGF: Insulin-like Growth Factor IGF2BP1: Insulin-Like Growth Factor 2 MRNA Binding Protein 1 INH: Inhibine I-SMAD: Inhibitory Smad JNK: c-jun N-terminal Kinase KISS1: KiSS-1 Metastasis-Suppressor LH: Luteinizing Hormone LHCGR: Luteinizing Hormone/choriogonadotropin - Receptor NHKB: Nuclear Factor Kappa Beta OAR: Ovis Aries PHOSPHO1: Phosphatase Orphan 1 PI3K: Phosphoinositide 3 Kinase PK: Protein Kinase R-SMAD: Receptor Regulated SMAD SAP: Shrimp Alkaline Phosphatase SNF8: ESCRT-II Complex Subunit, Homolog SNP: Single nucleotide polymorphism TAB1: TAK1 Binding Protein TAK1: TGFβ Activated Kinase TALEN: Transcription activator-like effector nucleases TGFBR3: Transforming Growth Factor Beta Receptor 3 TGFβ: Transforming Growth Factor Beta UBE2Z: Ubiquitin-Conjugating Enzyme E2Z VCAN: Versican XIAP: X-linked Inhibitor of Apoptosis protein 14

17 INTRODUCTION 15

18 De nos jours, les élevages ovins de la filière allaitante (ou ovins-viande) s orientent vers des systèmes de production durables, alliant performances, rentabilité et respect de l environnement. Parmi les composantes zootechniques pouvant influencer cette production, la prolificité des brebis, ou le nombre d agneaux nés par brebis et par mise bas, apparaît évidente [1]. L objectif de cette filière est de produire un optimum de 2 agneaux par portée par brebis et par an. Ainsi, l amélioration génétique de ce caractère en vue de maintenir des animaux plus performants au sein des troupeaux devient une garantie de rentabilité économique [2, 3]. Néanmoins, pour assurer cette viabilité économique, la principale difficulté de ce système est de pouvoir maintenir une production numérique proche de l optimum. Effectivement, en deçà de cet optimum, un plus faible nombre d agneaux nés est synonyme d un manque à gagner. Au delà, une production numérique plus importante entraîne des charges additionnelles associées à l allaitement artificiel et l engraissement des agneaux surnuméraires. Par ailleurs, cette espèce présente une certaine variabilité pour ce caractère de prolificité [4]. En effet, alors que l existence de races de brebis dites prolifiques (Romanov, Finnoise) présentant des tailles de portée égales à trois, constitue un atout non négligeable en filière ovin-viande, il existe également des races peu prolifiques (Mérinos d Arles, Charolais) dont les tailles de portée proches de un pourraient être améliorées. L amélioration génétique est en partie dépendante du déterminisme génétique régissant le caractère d intérêt. Comme pour la plupart des caractères quantitatifs, la prolificité est sous l hypothèse d un contrôle génétique de type polygénique. C est le cas en races ovines Romanov et Finnoise [5-7], où le caractère est sous l influence plus ou moins prononcée de plusieurs gènes occupant différentes régions du génome. Dans ce cas, la variabilité phénotypique est due à une interaction cumulative des différents gènes ainsi que de facteurs environnementaux. Néanmoins, au sein de certaines races non prolifiques, l observation de brebis avec des prolificités élevées a permis de mettre en lumière l existence d un déterminisme de type monogénique pour lequel un seul gène, appelé gène à effet majeur ou encore gène de fécondité (Fec), contribue à lui seul à expliquer la variabilité de la taille de portée dans ces races [8-10]. Parce qu ils ont un effet prépondérant sur ce caractère d intérêt économique, cette première partie introductive de ma thèse s attachera donc à présenter l identification, la caractérisation et l utilisation des gènes de fécondité en filière ovine allaitante. D un point de vue appliqué, l identification des gènes Fec et des mutations associées affectant la prolificité permet une classification exacte des animaux dès leur naissance comme porteurs ou non de 16

19 l allèle prolifique, en s affranchissant du phénotype de prolificité établi tardivement chez la brebis adulte. Ils deviennent alors des outils de sélection particulièrement intéressants dans des stratégies de sélection génétique contrôlée et rapide. D un point de vue cognitif, l identification de ces gènes Fec et de leurs mutations permet d accéder aux mécanismes biologiques régissant la prolificité. Cette prolificité découlant directement du nombre d ovulations, les brebis porteuses de mutations dans les gènes Fec deviennent alors des modèles de prédilection dans la compréhension de la fonction ovarienne et des pathologies associées notamment observées chez la femme. Ces aspects feront partie de la seconde partie de cette introduction. I. Exploitation du déterminisme monogénique de la prolificité dans le domaine agronomique A. Exemple en race Mérinos : cas du gène Booroola La première mise en évidence de la transmission monogénique de la prolificité, très particulière pour un caractère quantitatif complexe à l époque, date de 1980 par l observation d une forte fréquence de femelles très prolifiques dans l élevage Booroola de race Mérinos (peu prolifique) en Australie. Cette fréquence de naissances multiples s expliquait mal par un déterminisme polygénique. Sur la base d études familiales, notamment du taux d ovulation enregistré après endoscopie, l hypothèse avancée fut celle d un gène majeur dont la mutation aboutissait à une prolificité accrue [11, 12]. Cette hypothèse s est confirmée une vingtaine d années plus tard par l identification de la mutation causale Booroola, notée FecB B (FecB pour Booroola Fecundity gene), un polymorphisme à nucléotide unique (SNP) localisé dans le gène BMPR1B (Bone Morphogenetic Protein Receptor 1B) porté par le chromosome 6. Les femelles de race Mérinos Booroola qui possèdent un allèle du gène muté (hétérozygotes FecB B /FecB + ) ont une prolificité d environ 2, et lorsqu elles possèdent les deux allèles (homozygotes FecB B /FecB B ) elle est d environ 3 agneaux par mise-bas [13-15]. A la suite de cette découverte, un certain nombre d études s est intéressé à l introgression de FecB dans d autres races ovines non prolifiques, dans le but d améliorer rapidement la prolificité par voie génétique et de développer des outils pour une gestion précise du gène dans les troupeaux. 17

20 L introduction de la mutation Booroola dans les populations telles que les Mérinos de Rambouillet (USA), d Arles (France), d Australie [16-18] ainsi que la Malpura (Inde) [19] et l Assaf (Israël) [20, 21], a permis d augmenter les performances de production. En effet, les brebis hétérozygotes FecB B /FecB + présentent un taux d ovulation plus élevé et des tailles de portée plus grandes [22]. Toutefois il existe une certaine variabilité de l effet de la mutation en fonction de la race. A titre d exemple, les brebis de race Mérinos d Arles ont un taux d ovulations augmenté de +1,2 et donnent naissance à 0,7 agneau supplémentaire par agnelage, alors que les brebis Mérinos de Rambouillet ont un taux d ovulations augmenté de +1,7 et une taille de portée supérieure de 0,9 agneau [16, 18]. En Mérinos d Australie la présence d une copie de l allèle Booroola n augmente la taille de portée que de 0,9 agneau, alors qu en race Malpura, les brebis donnent naissance à deux fois plus d agneaux supplémentaires (1,7) [17, 19, 23, 24]. Toutefois cette introgression a aussi ses limites. En dépit d un plus fort taux d ovulation, les animaux qui héritent de deux allèles FecB B présentent une plus grande mortalité embryonnaire et périnatale par rapport aux animaux hétérozygotes FecB B /FecB +. Les brebis homozygotes FecB B /FecB B de race Romney ont un taux d ovulation de 6,3 mais pour une taille de portée de 2,3, soit une perte de 4 fœtus. Avec un taux d ovulation plus faible (4,1) les brebis hétérozygotes FecB B /FecB + présentent pourtant la même prolificité (2,4) s expliquant par moins de perte embryonnaire [25]. Il faut donc prendre des précautions pour éviter l hyperprolificité et insister sur l importance d une gestion rigoureuse des hétérozygotes FecB B /FecB + dans les troupeaux [26, 27]. Afin de profiter de l amélioration de la taille de portée offerte par la mutation Booroola, cette plus forte mortalité des agneaux nés peut être en partie contournée grâce aux croisements avec des races assujetties à un système de production intensif ou bien dotées de qualité maternelle importante. C est le cas de la lignée canadienne Boolys (croisement Booroola x Dorset-Leicester-Suffolk) pour laquelle la présence du gène Booroola en fait une lignée maternelle particulièrement performante. Le nombre de kg d agneau sevré par femelle a augmenté de 80% (63,7kg par brebis par année), le nombre d agneaux nés de 35% (1,9 agneaux nés par agnelage) et le nombre d agneaux sevrés de 45% (1,5 agneaux sevrés par agnelage) [26]. Les approches de génétique moléculaire ont permis de développer des tests ADN sur la base de l identification de la mutation Booroola afin de contrôler les individus porteurs dans les populations sélectionnées [28]. Ces tests sont utilisés pour suivre la mutation Booroola dans les stratégies d introgression mises en place à l échelle internationale [28-31] et ont 18

21 également permis de la localiser à l état naturel dans différentes populations. Ainsi, la mutation Booroola est présente dans les races prolifiques Garole, Javanèse, Hu et Small Tailed Han [19, 32]. Il semblerait d ailleurs que la mutation Booroola présente en race Merinos d Australie puisse avoir comme origine la race Garole importée d Inde vers l Australie au 18 ème siècle [28, 33]. A l heure actuelle, elle est recensée dans 48 populations ovines présentes dans 19 pays différents [29]. L exemple du gène Booroola illustre donc une amélioration génétique rapide et importante du caractère de prolificité grâce à la sélection génétique et à la présence d un gène à effet majeur. Il s agit là d un bouleversement pour la filière ovine-viande, surtout lorsque l on considère que la plupart du temps la prolificité a un déterminisme polygénique qui entraîne une très faible héritabilité (transmission des parents à la descendance faible) et la difficulté d obtenir des progrès génétiques par méthode classique de sélection (les sélections successives sur les meilleurs animaux constituent un processus lent). Dès lors, les gènes de fécondité ont suscité beaucoup d intérêt. B. Identification d autres gènes de prolificité Suite à la mise en évidence du gène Booroola, la recherche de gènes majeurs affectant la prolificité s est élargie à de nombreuses populations ovines en s appuyant sur des méthodes de génétique quantitative [27, 34]. Ces dernières requièrent des résultats zootechniques tels que: - la collecte d informations de performances individuelles pour le caractère de taille de portée, - la distribution de la prolificité au sein de la population et sa répétabilité, - les informations généalogiques (pedigree des animaux), - l analyse de l hérédité du caractère de prolificité à travers les générations. Lorsqu une hypothèse de ségrégation d une mutation à effet majeur est posée, les données s enrichissent du nombre d ovulations observé par endoscopie. 19

22 Tableau 1. Races ovines dans lesquelles ségrège un gène majeur Race Genotype, Allèle muté (autre appellation) Gène, Coordonnée de la mutation (acides aminés) Effets sur le taux d ovulation (TO) et la taille de portée (TP) Classe, Référence Akkaraman [35] Aragonaise Rasa Aragonesa, FecX R BMP15, R+ : TP +1,3 W154NfsX55 RR : stérile [36, 37] Belclare, FecX B BMP15, S367I B+ : TO +1,0 / BB : sterile Belclare Galway, FecX G BMP15, Q239X G+ : TO +0,7 / GG : sterile [38, 39] High Fertility, FecG H GDF9, S395F H+: TO +1,4 / HH: stérile Belle-Ile TO 1-8 ; TP 1-7 [40] Galway, FecX G (FecC) BMP15, Q239X G+ : TO +0,7 / GG : sterile Cambridge High Fertility, FecG H GDF9, S395F H+: TO +1,4 / HH: stérile [38, 39] (FecC) Chios TO : 2,37±1,01 (Sakiz) TP : 1,93±0,76 [41-43] Coopworth Woodlands, FecX2 W W+ : TO +0,4 ; TP +O,25 WW : TO & TP W+ [44] Florina TO : 1,79±0,63 TP : 1,34±0,52 [41] Garole Booroola, FecB B BMPR1B, Q249R B+ : TO +1,5 ; TP +1,0 BB : TO +3,0 ; TP +1,5 [28, 45] Grivette Grivette, FecX Gr BMP15, T317I Gr+ : TO +0,5 ; TP +0,1 GrGr : TO +2 ; TP +0,7 [46] Han Booroola, FecB B Galway, FecX G BMPR1B, Q249R BMP15, Q239X B+ : TO +1,5 ; TP +1,1 BB : TO +3,0 ; TP +1,4 G+ : TP +0,55 [47, 48] [49] GG : sterile Icelandic Thoka, FecG T (FecI) GDF9, S427R I+ : TO +1,2 ; TP +0,7 II : stérile [50] Javanese Booroola, FecB B (FecJ) BMPR1B, Q249R B+ : TO +1,5 ; TP +1,0 BB : TO +3,0 ; TP +1,5 [14, 51] Karya [42] Lacaune Lacaune, FecX L BMP15, C321Y L+ : TO +2 / LL : sterile [52] Lacaune, FecL L+: TO +1,5 / LL: TO +3 [53] Merinos Booroola, FecB B BMPR1B, Q249R B+ : TO +1,5 ; TP +1,0 BB : TO +3,0 ; TP +1,5 [25, 28, 54] Olkuska Olkuska, FecX O BMP15, N337H O+ : TO +1 ; TP +0,6 OO : TO +1,6 ; TP +1,2 [46] Romney Inverdale, FecX I Hanna, FecX H Wishart, FecW BMP15, V299D BMP15, Q291X I+ : TO +1,0 ; TP +0,6 II : sterile H+ : TO +1,0 ; TP +0,6 HH : sterile W+: TO +0,9 / WW: stérile [55] [55] [22] Sangsari FecG? GDF9? [56] Santa Ines Embrapa, FecG E GDF9, F345C E+ : TP +0,3 / EE : TO +1 ; TP +0,7 [57] White Norwegian WNS, FecG WN GDF9, V371M WN+ : TP +0,2 / WNWN : TP +0,5 [58] Liste non exhaustive des races ovines à gène majeur. Fec : Fecundity gene ; Classement des populations selon : le gène majeur est putatif, le gène est localisé mais la mutation n est pas connue, la mutation est identifiée. 20

23 Lorsqu on fait un point sur les études menées (Tableau 1), on trouve des résultats qui vont de la démonstration statistique de l existence d un gène majeur (gène putatif), en passant par sa primo-localisation sur le génome, jusqu à l identification moléculaire de la mutation causale [27, 34]. L hypothèse de la ségrégation d un gène majeur sans analyse moléculaire ultérieure a pu être établie dans différentes races telles que Chios, Karya, Ankkaraman, Florina [35, 41-43]. C est également le cas au sein de notre cheptel français puisque qu en Ile-de-France, Monton Vendéen ou Belle-Ile [27, 40] la variabilité du taux d ovulation et des tailles de portée ainsi qu une forte répétabilité et/ou un mode de transmission élevés font suspecter la ségrégation d un gène majeur. Il en est de même avec la Noire du Velay qui présente au sein de sa population un certain nombre de femelles dont la prolificité exceptionnelle n est pas expliquée par un déterminisme polygénique. L effet (ou la fréquence) de ces mutations inconnues est variable puisque l on observe une prolificité moyenne de 1,3 (Florina) à 1,9 (Sakiz), voire une stérilité possible (mutation Wishart en Romney). Pour d autres races, la ségrégation d un gène majeur affectant la prolificité est démontrée et la primo localisation a été réalisée. C est le cas en Coopworth où ségrège la mutation Woodlands (FecX2 W ) [22, 44]. Cette mutation qui a un effet limité sur la prolificité (+0,25/copie) a été positionnée sur le chromosome X. Elle a une ségrégation particulière liée au fait que le gène majeur serait soumis à une empreinte épigénétique maternelle [44]. En race Lacaune également, un gène majeur (FecL) qui a un effet important sur le taux d ovulation et la prolificité (+1,5/copie) est localisé sur le chromosome 11 ovin [53, 59, 60]. C est d ailleurs cette mutation qui fait l objet du travail présenté dans ce manuscrit de thèse. Enfin, pour plusieurs races, l existence d un gène majeur a été démontré, le gène a été localisé et la mutation causale identifiée. Comme nous l avons déjà vu, c est le cas de la mutation Booroola sur le chromosome 6 dans le gène BMPR1B qui substitue une Glutamine en Arginine en position 249 de la protéine (BMPR1B Q249R ) et qui ségrège dans de nombreuses populations [13, 15, 22, 29]. Les mutations Inverdale (FecX I ) et Hanna (FecX H ) présentes en race Romney ont été localisées sur le chromosome X et identifiées dans le gène BMP15 (Bone Morphogentic Protein 15) causant respectivement, soit une substitution V299D soit un codon STOP prématuré (Q291X) dans la protéine [55, 61]. L effet de ces mutations est particulier puisque les brebis hétérozygotes ont une prolificité augmentée (+0,6), mais les brebis homozygotes sont stériles. De façon intéressante, 6 autres mutations dans BMP15 (toutes différentes) ont été identifiées associées à l augmentation de prolificité dans les races 20

24 Aragonaise (FecX R ), Belclare (FecX B ), Cambridge (FecX G ), Grivette (FecX Gr ), Olkuska (FecX O ) et Lacaune (FecX L ) [36-39, 46, 52]. Toutefois, il n y a que pour les races Olkuska et Grivette que la mutation homozygote dans BMP15 ne rend pas les brebis stériles. Enfin, un troisième gène est la cible de mutations hyperprolifiques, il s agit du gène GDF9 (Growth and Differentiation Factor 9) sur le chromosome 5. En effet, 4 mutations différentes créant des substitutions non conservatives, F345C, V371M, S395F et S427R ségrègent dans les races Santa Ines (FecG E ), Norwegian White (FecG NW ), Belclare (FecG H ) et Icelandic (FecG T ), respectivement [38, 39, 50, 57, 58]. A l image des mutations dans BMP15, les mutations FecG H et FecG T dans GDF9 rendent les brebis prolifiques à l état hétérozygote et stériles à l état homozygote. Seules les homozygotes FecG E et FecG WN restent prolifiques. Au bilan, les effets sur la prolificité sont assez variables en fonction des races et des mutations, allant de +0,5 à +2 agneaux par brebis pour BMP15, ou de +0,5 à +1,4 pour GDF9. A titre comparatif, une copie de Booroola altérant BMPR1B augmente de +1,5 la taille de portée. Avec l identification de 12 mutations dans seulement 3 gènes et le développement des tests de génotypage associés, ces gènes sont devenus des candidats moléculaires très forts pour la recherche du déterminisme génétique de la prolificité. Ainsi, FecB B /BMPR1B Q249R initialement identifiée en Mérinos et Romney a été détectée en Garole, Han et Javanese [19, 28, 32, 33]. De la même façon FecX G /BMP15 Q239X identifiée en Belclare et Cambridge est présente en Han [49]. Ces mêmes mutations présentes dans des races géographiquement éloignées signent peut-être des origines communes. Pour un grand nombre de races où l on suspecte la présence d un gène majeur, ces mutations connues ont été recherchées mais sans succès [22, 35, 41-43, 59]. Ceci indique qu il y a encore de nouvelles mutations et de nouveaux gènes contrôlant la prolificité à découvrir avec ces modèles. Lorsqu on fait le bilan, on dénombre une vingtaine de mutations présentes dans des gènes à effet majeur ségrégeant dans différentes races ovines. Au sein des races dont le déterminisme de type monogénique est établi, certaines de ces mutations et leur gène Fec associé sont encore à identifier. Mais, d un point de vue appliqué, l ensemble des gènes Fec mis en évidence et leurs mutations sont source d une meilleure appréhension du déterminisme monogénique de la prolificité et d une meilleure gestion de sa génétique dans les troupeaux ovins-viande dans le cadre d une agriculture raisonnée. L introgression des mutations dans des races peu prolifiques ou la gestion des animaux porteurs de ces mutations au sein des 21

25 Figure 1. Arbre phylogénétique des ligands de la super famille du TGF-β (Weiskirchen et al., 2009). 22

26 populations sont des leviers de l amélioration génétique de ce caractère. Cependant il ne faut pas perdre de vue qu une meilleure prolificité nécessite de gérer les états d homo-/hétérozygotie, pour limiter l hyperprolificité ou la stérilité et d améliorer les systèmes d élevage afin d être en mesure d élever un plus grand nombre d animaux. II. Exploitation du déterminisme monogénique de la prolificité pour l étude de la fonction ovarienne Comme nous l avons vu, à l heure actuelle, toutes les mutations prolifiques ont été identifiées dans seulement 3 gènes, BMP15, BMPR1B et GDF9. De façon intéressante mais inattendue, ces trois gènes appartiennent à un même système de signalisation cellulaire, les Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), connu initialement pour contrôler le développement embryonnaire précoce, et la différenciation osseuse et cartilagineuse. Ainsi d un point de vue fondamental, l identification de ce système met en lumière un rôle primordial des BMPs dans les mécanismes biologiques du fonctionnement de l ovaire, du contrôle du nombre d ovulations et donc de la prolificité. Avant de vous présenter comment l identification des gènes Fec et de leurs mutations associées a permis d approfondir nos connaissances sur la physiologie de la fonction ovarienne, je souhaite introduire quelques notions sur le système des BMPs et faire quelques rappels sur la fonction ovarienne. A. Le système BMP Les Bone Morphogenetic Proteins ou BMPs appartiennent à la super-famille du Transforming Growth Factor β (TGFβ) [62]. D un point de vue phylogénétique, cette famille d une trentaine de protéines se répartit en quatre sous-groupes, que sont les TGFβs, les GDNF (Glial cell line-derived Neurotrophic Factor), les Activine/Inhibine (comprenant l AMH, hormone anti-müllérienne) et les GDFs (Growth and Differenciation Factor)/BMPs (Figure 1) [63]. 1. Composition du système de signalisation BMP a) Les ligands Les BMPs sont des cytokines sécrétées sous la forme de dimères (homo ou hétérodimères) dans la grande majorité des cas, liés par des ponts disulfures. Les BMPs, comme les autres membres de la super-famille du TGFβ, sont synthétisées sous la forme de précurseurs contenant un peptide signal hydrophobe, un pro-domaine de taille variable 22

27 Figure 2. Représentation schématique de la structure primaire des BMPs. Elles sont sécrétées sous forme de précurseur contenant un peptide signal hydrophobe ainsi qu un site de coupure RXXR permettant la libération du domaine mature après clivage par une endoprotéase. C : cystéine Figure 3. Schéma récapitulatif de la sécrétion et de la biodisponibilité des BMPs (adapté de Bradgon et al., 2011). (A) Processus conduisant à la sécrétion des BMPs. 1) Transcription des BMPs dans le noyau, 2) Traduction dans le réticulum endoplasmique, 3) Modifications posttraductionnelles dans l appareil de Golgi, 4) Clivage protéolytique du prodomaine et dimérisation des monomères, 5) Sécrétion par les cellules des BMPs sous forme dimérique, complexées ou non aux prodomaines, ou contenues dans des vésicules. (B) Devenirs des molécules BMPs après leur sécrétion. 1) Sécrétion des BMPs dimérisées, liées ou non aux prodomaines et leur interaction avec la matrice extracellulaire (fibrillin), 2) Les BMPs peuvent aussi être sécrétées dans des vésicules de la matrice, 3) ou dans la circulation sanguine, 4) mais peuvent également interagir avec les cellules avoisinantes. 23

28 contenant des sites potentiels de N-glycosylation et un domaine C-terminal ou domaine mature. Le clivage de ces précurseurs par des protéines convertases au niveau d un motif RXXR, permet la libération du domaine C-terminal, qui porte l activité biologique, du prodomaine N-terminal (Figure 2). Le rôle du pro-domaine est encore mal défini, néanmoins il semble être impliqué dans la stabilité et la spécificité de la pro-protéine, et s avère être nécessaire à la formation du dimère [64]. Pour certains dimères BMPs formés, le pro-domaine clivé reste lié de façon non-covalente avec le domaine mature, on parle alors de formes latentes (Figure 3) [65, 66]. C est notamment le cas pour TGFβ1, GDF5 et 8, BMP4, 7, 9 à 11 et l AMH [67]. Ces formes se concentreraient au niveau de la matrice extracellulaire [68, 69]. La présence du pro-domaine ne modifie pas l activité du dimère en comparaison aux dimères non complexés, a l exception des TGFβs, de BMP10 et GDF8, pour lesquels la bioactivité est dépendante de leur libération à la fois du pro-domaine et de la matrice extracellulaire par une seconde protéolyse [69, 70]. Enfin, si les domaines matures C-terminal des hormones sont très conservés entre sous-groupes de la super-famille, il existe une plus grande variabilité entre les pro-domaines des différentes BMPs. Le domaine mature des membres de la super famille du TGFβ présente quant à lui, une structure particulière dite en «nœud de cystéine». Six des sept cystéines présentes dans le domaine mature forment des ponts disulfures deux à deux. La septième cystéine, située en amont de la cystéine 4 est impliquée dans la formation du dimère [71]. Cependant, toutes les protéines de la famille ne possèdent pas cette cystéine impliquée dans la dimérisation [72]. C est le cas pour BMP15 et GDF9 pour lesquelles cette cystéine est remplacée par une sérine [73], les sous-unités ne peuvent donc pas se lier de façon covalente, ce qui suggère un autre type de liaison pour la dimérisation de ces molécules [74], probablement des interactions labiles de type électrostatiques et hydrophobes [75]. De plus, les BMPs peuvent former des hétérodimères. C est notamment le cas entre BMP15 et GDF9 [76, 77]. L inhibine et l activine sont également concernées. En effet, l homodimérisation de deux sous-unités β, βa ou βb, est à l origine de la formation de l activine A et de l activine B respectivement, alors que l hétérodimérisation d une sous-unité α avec l une des deux sous-unités β forme l inhibine A ou l inhibine B [78]. Certains hétérodimères ont même une activité biologique supérieure à celle des homodimères. Les hétérodimères BMP2/BMP7 ou BMP2/BMP6 ont une activité 5 à 10 fois supérieure à celle de l homodimère BMP2/BMP2 sur la formation de cartilage et d os [79, 80]. 23

29 Figure 4. Famille des récepteurs TGFβ de type I et II (Massagué, 1998). Pour les récepteurs de type I, le domaine protéine kinase est précédé d un domaine GS (riche en Gly-Ser). La séquence caractéristique du motif GS du TβR1 est indiquée avec ses sites de phosphorylation. Les membres des familles de récepteurs listés sont présents chez les vertébrés, sauf indication contraire : D, Drosophila ; C, Caenorhabditis elegans ; X, Xenopus. Le dendrogramme indique le niveau relatif d identité des acides aminés présents sur le domaine kinase. 24

30 b) Les récepteurs Les cytokines vont se lier principalement à deux types de récepteurs membranaires, les récepteurs de type I et de type II à activité sérine thréonine kinase qui vont former ensemble un complexe tétramérique. Chez les mammifères, sept récepteurs de type I et cinq récepteurs de type II ont été décrits (Figure 4) [81]. Le récepteur de type II impliqué dans la signalisation des BMP est BMPR2. Néanmoins les récepteurs de l activine, ActR2 et ActR2B peuvent participer à la signalisation des BMPs, mais avec une affinité pour les BMPs plus faible que pour l activine [82]. Ces récepteurs présentent une activité kinase constitutive qui n est pas régulée par la liaison du ligand [83]. Lorsque l activine et les TGFβ vont lier leur récepteur de type II, ce complexe ligand/récepteur II va recruter le récepteur de type I de moindre affinité. Ce mécanisme d action est légèrement différent pour les BMPs puisqu ils sont capables, de lier leurs récepteurs de type II comme leurs récepteurs de type I avec la même affinité [84]. Trois récepteurs de type I (ALK, Activin-Like-Receptor) sont également impliqués dans la voie de signalisation des BMPs : BMPR1A/ALK3, BMPR1B/ALK6 et ACVR1/ActR1/ALK2. Seuls BMPR1A et BMPR1B sont spécifiques de la signalisation BMPs alors que le récepteur ACVR1 participe aussi à la signalisation de l activine. Les récepteurs de type I sont composés d un domaine N-terminal extracellulaire de liaison au ligand, d un passage transmembranaire et d une partie cytoplasmique. La partie cytoplasmique est constituée d un domaine GS juxta-membranaire riche en glycine et sérine, qui est le site de phosphorylation par l activité kinase du récepteur II, et du domaine kinase qui possède une partie spécifique de liaison aux protéines SMADs qui sont les principaux effecteurs intracellulaires de la voie de signalisation [85, 86]. Enfin, il existe un récepteur de type III, TGFBR3 ou bétaglycan, un proteoglycan de surface connu pour être co-récepteur pour l inhibine [87, 88]. TGFBR3 reconnait directement l inhibine et conduit à la formation d un complexe stable et de grande affinité avec les récepteurs de type II de l activine et des BMPs. La séquestration du récepteur de type II empêche ainsi les interactions avec les ligands, le recrutement du récepteur de type I et par conséquent la transduction de leur signal [88-92]. 24

31 Figure 5. Récapitulatif des voies de signalisation induites par les BMPs (Bradgon et al., 2011). (A) Un grand nombre de BMPs lient les récepteurs de type I et II aux BMPs et induisent la voix de signalisation des Smads 1, 5, 8. (B) Les BMPs (BMP 11 et 16) qui se lient aux récepteurs TGFβ peuvent initier la voie de signalisation des Smads 2, 3. (C) l activation des récepteurs aux BMPs peut également activer les voies de signalisations NFkB, p38, Smads 1, 5, 8 et JNK via les complexes TAB1 et TAK1. (D) Autres voies de signalisation Smad-indépendantes, ERK, PI3K, PKA, PKC et PKD, initiées par les BMPs mais dont les mécanismes restent à déterminer. Figure 6. Les trois sous-classes de SMADs (d après Schiffer et al., 2000). R-SMAD, spécifiques des récepteurs de type 1, Co-SMAD commune, I-SMAD inhibitrices. 25

32 c) Les effecteurs intracellulaires Les BMPs ont la capacité d activer des voies de signalisation dépendantes ou indépendantes des molécules effectrices SMADs (Similar to Mother Against DPP) et de réguler la transcription de gènes cibles impliqués dans la survie cellulaire, l apoptose, la migration et la différenciation (Figure 5). L activation de l une ou de l autre de ces voies de signalisation est dépendante du récepteur de type I qui lie le ligand [93, 94]. La voie de signalisation dépendante des SMADs est la plus étudiée. Les SMADs appartiennent à une famille multi-génique et sont classées en trois groupes : les R-SMADs, la Co-SMAD et les I-SMADs (Figure 6) [95]. Les R-SMADs (Receptor regulated SMAD) sont les SMADs phosphorylées et activées par les récepteurs de type I. On distingue deux sousgroupes dans ces R-SMADs, les SMADs 1, 5, 8 phosphorylées par les récepteurs I de type BMP (ALK2, ALK3, ALK6) et les SMADs 2, 3 phosphorylées par les récepteurs I de type Activine/TGFβ (ALK1, ALK4, ALK5). Une fois activées, elles forment des complexes hétéromériques avec la Co-SMAD ou SMAD4 (Common SMAD) commune aux deux voies (BMP et Activine/TGFβ). Le troisième groupe est celui des SMADs inhibitrices, les I- SMADs (Inhibitory Smad) qui vont inhiber le signal par compétition avec les R-SMADs. La plupart des protéines SMADs ont une structure conservée constituée d un domaine N- terminal MH-1 (MAD homology domain-1) et d un domaine C-terminal MH-2, liés entre eux par une région «linker» riche en proline, de taille et de séquence variable. Le domaine MH-1 est impliqué dans la liaison à l ADN, alors que MH-2, qui est capable d avoir une activité transcriptionnelle, est impliqué dans les différentes liaisons des SMADs au récepteur de type I, à une autre SMAD ou encore à d autres facteurs de transcription [96-98]. A l état non actif, c est-à-dire non phosphorylé, les SMADs sont sous forme monomérique dans le cytoplasme. Le domaine MH-1 interagit alors avec le domaine MH-2 pour inhiber son activité [96]. Seules les I-SMADs sont tronquées du domaine MH-1. La liaison du ligand BMP va entraîner la formation d un complexe hétérotétramérique de récepteurs, composé de deux récepteurs de type I et de deux récepteurs de type II (Figure 7) [99]. Ce rapprochement moléculaire va permettre la phosphorylation du récepteur de type I par l activité kinase constitutive du récepteur de type II. Dès lors le récepteur de type I change de conformation et découvre son affinité pour les R-SMADs et sa capacité à les phosphoryler. Les R-SMADs phosphorylées sont actives (dissociation des domaines MH-1 et MH-2) et vont 25

33 Figure 7. Voie de signalisation de la super-famille du TGF-β Les flèches en noir représentent la voie de signalisation. La liaison du ligand BMP dimérique va entraîner la formation d un complexe hétérotétramérique de deux récepteurs de type I et de deux récepteurs de type II. Ce rapprochement moléculaire permet la phosphorylation du récepteur de type I par l activité kinase constitutive du récepteur de type II. Cette activation entraîne la phosphorylation des R-SMADs, (dissociation des domaines MH-1 et MH-2) et une hétéro-oligomérisation avec SMAD4 (Co-SMAD). Les complexes R-SMAD/SMAD4 sont transloqués dans le noyau pour réguler la transcription de gènes cibles, soit en se liant directement à l ADN, soit en coopérant avec d autres facteurs de transcription. 25

34 Figure 8. Les différents niveaux d inhibition de la voie de signalisation de la super-famille du TGF-β (Ten Dijke et al., 2000). Les inhibitions de cette voie sont notées avec des traits rouges et les molécules inhibitrices sont représentées par les bulles vertes. 26

35 pouvoir s associer à SMAD4. Cette hétéro-oligomérisation permet la formation d un hétérocomplexe, soit un trimère, constitué de deux R-SMADs et de SMAD4 ou encore de deux SMAD4 et d une R-SMAD [100]. Les hétérocomplexes formés sont ensuite transloqués dans le noyau pour réguler la transcription de gènes cibles, soit en se liant directement à l ADN, soit en coopérant avec d autres facteurs de transcription. Les complexes hétérotétramériques de récepteurs activés ont également la possibilité d initier d autres voies de signalisation telles que ERK (Extracellular signal-regulated Kinase), Map kinase p38, JNK (C-Jun N-terminal kinase), NFkB (Nuclear Factor kappa Beta), PI3K (Phosphoinositide 3 Kinase), PK (Protein Kinase) A, C et D [66]. Pour ces voies de signalisation, le mode d initiation de la voie implique, au niveau intracellulaire, une interaction des récepteurs aux BMPs de type I avec les protéines BRAM1 (Bone Morphogenetic protein Receptor Associated Molecule 1) ou XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein) [101, 102]. Ces protéines permettent alors l association des récepteurs I avec le complexe TAK1 (TGFβ Activated Kinase 1) et TAB1 (TAK1 Binding protein) qui active par la suite les différentes cascades de signalisation NFkB, p38 et JNK [103]. Pour les autres voies de signalisation, le mécanisme d initiation de la voie n est pas encore décrit. 2. Régulation de la voie de signalisation des BMPs La voie de signalisation des BMPs peut-être régulée à plusieurs niveaux : au niveau des ligands, des récepteurs et des effecteurs intracellulaires (Figure 8) [99, 104, 105]. Au niveau extracellulaire, l activité des BMPs peut être modulée par différentes molécules antagonistes (Noggin, Chordin, Follistatine et les protéines de la famille DAN). En se liant aux BMPs, elles les empêchent de se fixer et de stimuler leurs récepteurs spécifiques [100, 106, 107]. Il existe le cas particulier de l inhibine, qui joue son rôle antagoniste de l activine et des BMPs en se fixant directement aux récepteurs de type II ou en recrutant le corécepteur TGFBR3. Au niveau membranaire, l activité des récepteurs BMP peut être modulée par le pseudorécepteur BAMBI (BMP and Activin Membrane Bound Inhibitor) dont la structure est proche des récepteur de type I de la super famille des TGFβ mais tronquée du domaine kinase cytoplasmique [108]. BAMBI forme un complexe stable avec les récepteurs des voies BMP/TGFβ qui fixe les ligands mais est incapable de transmettre un signal. 26

36 Figure 9. Principales étapes du développement folliculaire et de la maturation ovocytaire (Monniaux et al., 2009) 27

37 Au niveau sub-membranaire, l immunophiline FKBP-12 a été décrite comme étant un inhibiteur commun aux récepteurs de type I. En se liant au domaine GC du récepteur de type I, elle masque les sites de phosphorylation du récepteur II [109]. Au niveau intracellulaire, les I-SMADs (SMAD6 et 7) inhibent la voie de signalisation des BMPs par compétition avec les R-SMADs, soit en se fixant aux récepteurs [ ], soit en formant des complexes inactifs avec les R-SMADs [114]. Il existe également la voie de l ubiquitinylation des SMADs qui sont alors dirigées au protéasome pour être dégradées. La voie des BMP est donc un système complexe, tant par le nombre d acteurs que par les niveaux de régulation qui existent. Les interactions entre ces différents acteurs vont déterminer la spécificité du signal et par conséquent la transcription de gènes cibles particuliers. B. La fonction ovarienne : quelques notions Chez les mammifères, l ovaire renferme un stock d ovocytes formé dès la naissance. Ils sont entourés d une couche de cellules somatiques et forment les follicules primordiaux. Cette réserve ovarienne de follicules primordiaux (entre et chez la brebis) va s épuiser au cours du temps sous l influence de la folliculogenèse et de l atrésie. 1. La folliculogenèse La folliculogenèse est un ensemble de processus de croissance et de maturation des follicules ovariens du stade de follicule primordial jusqu à l ovulation. Selon que les espèces soient mono- ou poly-ovulantes, elle aboutit à la production d un ou plusieurs ovocytes aptes à la fécondation et au développement à chaque cycle sexuel. La folliculogenèse se déroule en deux étapes successives (Figure 9) [115]: - Suite au recrutement initial, la folliculogenèse basale est une croissance lente et continue, essentiellement contrôlée par des facteurs de croissance d origine ovocytaire et somatique agissant essentiellement selon un mode paracrine. C est au cours de cette phase que s effectue l essentiel de la croissance de l ovocyte et qu il acquiert la capacité à reprendre la méiose. La durée de cette première phase est d environ 6 mois chez la brebis. - La croissance folliculaire terminale commence dès la puberté et perdure toute la vie chez la majorité des mammifères. C est au cours de cette phase que s effectue la sélection du ou des follicule(s) destiné(s) à ovuler. Elle est essentiellement contrôlée par les gonadotropines hypophysaires LH (Luteinizing Hormone) et FSH (Folliculo-stimulating 27

38 Hormone) au cours du cycle, mais de nombreux autres facteurs (facteurs de croissance, matrice extracellulaire, stéroïdes) d origine locale ou endocrine interviennent également pour agir en synergie avec les gonadotropines [116]. La durée de cette croissance terminale est de 3 à 4 jours chez la brebis. a) Croissance folliculaire basale Au niveau morphologique, lors du démarrage du développement folliculaire, les cellules somatiques entourant l ovocyte deviennent cubiques et forment le follicule primaire. Le diamètre du follicule va dès lors augmenter par prolifération des cellules somatiques constituant la granulosa, pour donner lieu au follicule secondaire (deux couches) et tertiaire (multicouches). Le passage au follicule tertiaire ou pré-antral se caractérise par la formation d une thèque interne (cellules fibroblastiques) dans laquelle se développe une vascularisation. A environ 200µm de diamètre, et ce pour toutes les espèces, le follicule acquiert une thèque externe, et une cavité, ou antrum, se forme à l intérieur de la granulosa, on parle alors de follicule antral. L antrum formé devient le lieu d une accumulation de produits de sécrétion du follicule (protéines et stéroïdes) et d éléments apportés par la circulation périphérique, l ensemble constituant le liquide folliculaire. La prolifération rapide des cellules de granulosa et l accroissement du volume de l antrum se poursuivent alors, augmentant considérablement le diamètre du follicule antral pour atteindre une taille de 2 à 3 mm chez la brebis. Au niveau de la régulation du stade de follicule primordial à pré-antral, le développement est essentiellement contrôlé par un «dialogue» entre l ovocyte et les cellules de la granulosa. Des facteurs de croissance, produits localement soit par l ovocyte (BMP15, GDF9, FGFs), soit par les cellules de la granulosa (KITL), semblent être indispensables. Par contre, le passage de follicule pré-antral à antral est clairement sensible aux hormones hypophysaires, à la présence d IGF (Insuline-like Growth Factor) circulant et aux interactions physiques (gap junction) entre l ovocyte et les cellules qui l entourent. b) Croissance folliculaire terminale Cette étape, strictement dépendante de la présence des gonadotropines hypophysaires, se caractérise au niveau ovarien par un accroissement du volume de l antrum des follicules, le développement de la vascularisation thécale, la diminution de l activité de prolifération des cellules de granulosa et la différenciation des cellules de la granulosa et de la thèque en cellules stéroïdogènes. Les conséquences du dialogue endocrinien entre l ovaire et l axe 28

39 Figure 10. Sécrétions hormonales au cours du cycle oestrien de la brebis (McNeilly et al., 1992) Pendant la phase folliculaire qui se déroule entre J16 et J18 (J0 = pic de LH), la maturation folliculaire s accompagne d une production d œstradiol. Une fois le seuil atteint, ce stéroïde déclenche le pic pré-ovulatoire de LH par un rétrocontrôle positif sur l axe hypothalamohypophysaire et l ovulation a lieu 21 heures après ce pic. Après l ovulation et pendant toute la phase lutéale, des fluctuations de FSH génèrent de nouvelles vagues de croissance folliculaire terminale. La formation du corps jaune caractérise cette phase, celui-ci sécrète de la progestérone qui inhibe alors la sécrétion de LH. En fin de phase lutéale, la régression rapide du corps jaune lève le rétrocontrôle négatif de la progestérone sur la sécrétion de LH, la fréquence des pulses de LH augmente, marquant le début d une nouvelle phase folliculaire. 29

40 hypothalamo-hypophysaire au cours de cette phase de croissance terminale se traduisent par des changements de concentrations hormonales illustrés par la Figure 10 au cours d un cycle œstrien [117]. La différenciation des cellules de la granulosa est caractérisée par une forte expression des enzymes de la stéroïdogénèse (CYP11/P450scc, CYP19/P450 aromatase) et l acquisition des récepteurs à la LH. Pour les follicules préovulatoires, le nombre de récepteurs à la LH a ainsi augmenté de façon exponentielle, l activité de stéroïdogénèse est maximale et elle se traduit par une sécrétion abondante d œstradiol (synthétisé à partir des androgènes thécaux) et d inhibine. Selon que l espèce soit mono- ou poly-ovulante, cette étape s accompagne de la sélection d un ou plusieurs follicule(s) parmi la cohorte de follicules présents, pour le(s) conduire à l ovulation (Figure 11). Cette sélection est associée à une diminution des niveaux circulants de FSH sous l effet négatif de l œstradiol et de l inhibine ovariens sur l hypophyse. Dans le même temps, l œstradiol va également exercer un rétrocontrôle positif au niveau de l hypothalamus, en augmentant la pulsatilité du GnRH (Gonadotropin Releasing Hormones) qui va se répercuter sur la pulsatilité de LH au niveau hypophysaire. Au niveau ovarien, la baisse du niveau de FSH s accompagne donc d une augmentation de la pulsatilité et des niveaux de LH. Cette dernière permet au follicule le mieux adapté, ayant acquis des récepteurs à LH en surface des cellules de granulosa, de poursuivre son développement, en s affranchissant de la baisse de FSH. Les autres follicules débutent alors un processus d atrésie puisque leur croissance n est plus soutenue par la FSH. La pulsatilité de LH va s accélérer sous l influence de l œstradiol jusqu à déclencher la décharge ovulatoire. Quelques heures après la décharge ovulatoire de LH, par une réaction de type inflammatoire, le follicule libère l ovocyte entouré de cellules du cumulus, c est l ovulation. Les cellules de granulosa et de la thèque se transforment en cellules lutéales et forment le corps jaune. Elles sécrètent majoritairement de la progestérone indispensable pour la mise en place de la gestation. Pour certaines espèces (rate, femme et truie), le corps jaune peut également sécréter de l œstradiol. Si aucune fécondation ne se produit, le corps jaune régresse par lutéolyse à la fin de la phase lutéale. 2. L atrésie L atrésie ou l involution folliculaire constitue le devenir de la majorité des follicules présents dans l ovaire des mammifères (99,9%). Elle affecte principalement les stades préantral à début d antrum chez les rongeurs [116] et les petits follicules à antrum de la vague 29

41 Figure 11. Régulations de la sélection et du développement terminal du follicule ovulatoire pendant la phase folliculaire du cycle ovarien chez une espèce mono-ovulante (Monniaux et al., 2009). La figure représente le dialogue endocrine existant entre les follicules ovariens de la vague ovulatoire et le système hypothalamo-hypophysaire, au début, au milieu et à la fin de la phase folliculaire. Au cours du temps, un seul des follicules de la vague devient progressivement l acteur essentiel de ce dialogue et du déclenchement de la décharge préovulatoire de LH, et c est le follicule qui ovulera en réponse à cette décharge. E2 : oestradiol, INH : inhibine, LH-R : récepteur à LH, CYP19 : aromatase 29

42 de croissance terminale chez les mammifères de plus grande taille. L atrésie des follicules à antrum se caractérise par un arrêt de la prolifération et la mort par apoptose des cellules de la granulosa, la perte des jonctions entre les cellules de la granulosa et la réduction de la vascularisation thécale. Dans les follicules en croissance terminale, l atrésie s accompagne également de la perte d expression et d activité de l aromatase et de la sensibilité aux gonadotropines FSH et LH des cellules de la granulosa, conduisant à la chute du rapport œstrogène/androgène dans le liquide folliculaire. C. Conséquences des mutations du système BMP associées à l hyperprolificité sur la fonction ovarienne Forts de ces quelques rappels sur la fonction ovarienne et le système de signalisation des BMPs, nous allons pouvoir aborder les conséquences des mutations hyperprolifiques des gènes du système BMP dans le contrôle de la fonction ovarienne et la régulation du nombre d ovulations. 1. FecB/BMPR1B Au niveau ovarien, les brebis FecB B /FecB B en comparaison aux brebis sauvages, présentent des follicules ovulatoires plus nombreux (reflétant le taux d ovulation pouvant être supérieur à 5), plus petits et matures plus précocement [ ]. Ces observations s expliquent par une dynamique de la phase folliculaire terminale modifiée chez les brebis FecB B /FecB B. Les follicules pré-ovulatoires atteignent leur taille maximale plus tôt (3-5mm vs 7-8mm chez les brebis non mutées) et se maintiennent tels quels jusqu à l ovulation [122]. Le nombre total de cellules de granulosa des follicules oestrogéniques par animal étant similaire entre les brebis FecB B /FecB B et FecB + /FecB + [119], il n y a pas de différence au niveau des sécrétions hormonales ovariennes (progestérone, œstradiol et inhibine A), entre les deux génotypes [123]. Au niveau hypothalamo-hypophysaire, les concentrations et les sécrétions du GnRH sont similaires entre les génotypes muté et non muté. L addition pulsatile de GnRH exogène de façon strictement identique chez des brebis porteuses ou non de la mutation rendues déficientes en GnRH (séparation chirurgicale de l hypothalamus de l hypophyse) ne modifie pas leur taux d ovulation naturel. Les brebis FecB B /FecB B conservent un taux d ovulation supérieur à celui des FecB + /FecB + [124]. Concernant la FSH, certaines études montrent une 30

43 Figure 12. Tractus génitaux de brebis Romney sauvage et Inverdale (Davis et al., 1992) (A) tractus normal de brebis sauvage de 1,5 ans, (B) tractus normal de brebis prépubère sauvage de 8 mois, et (C) tractus anormal de brebis Inverdale de 1,5ans. Les trois photographies sont à la même échelle. Les flèches rouges indiquent les ovaires. 31

44 augmentation de la concentration plasmatique de FSH en présence de la mutation comme moteur de la poly-ovulation [120, 125], alors que d autres n observent aucune différence [123]. Cette controverse a été levée par l addition de doses identiques de gonadotropines exogènes chez des brebis porteuses ou non de FecB ayant subi une hypophysectomie (suppression des gonadotropines endogènes). Dans ces conditions, Campbell et al. montrent que les brebis mutées FecB B conservent un taux d ovulation plus élevé que les brebis sauvages [126]. Ainsi, le gène FecB exerce un rôle strictement ovarien en ne modifiant pas le fonctionnement de l axe hypothalamo-hypophysaire. A l échelle cellulaire, BMPR1B (ARNm et protéine) est exprimé dans l ovocyte et les cellules de granulosa depuis le stade de follicule primordial jusqu au stade de follicule à antrum [8, 14]. Par ailleurs, les travaux de McNatty et al. [120] ont montré que les cellules de la granulosa FecB B présentaient une activité proliférative réduite et une maturité précoce se traduisant par l acquisition d une sensibilité aux hormones gonadotropes (FSH puis LH) [8, 127] et d une capacité de synthèse des stéroïdes [128] plus précoces au cours du développement folliculaire par rapport aux cellules de granulosa FecB +. Les études fonctionnelles ont permis de valider ces deux observations. Le rôle «perte de fonction» partielle de la mutation FecB B /BMPR1B Q249R localisée dans le domaine kinase du récepteur [13-15], sur l activité du récepteur BMPR1B [129] a pour conséquence une altération de la réponse des cellules de granulosa aux ligands spécifiques de BMPR1B, tels que BMP4. La stimulation de la prolifération est par conséquent abrogée et l inhibition de la synthèse de progestérone par BMP4 est réduite [13, 127, 129]. La signalisation du système BMP via BMPR1B jouerait donc un rôle important sur la stimulation de la prolifération, l inhibition de la sensibilité aux gonadotropines et de la capacité stéroïdogène des cellules de la granulosa. Dans le cas d ovaires mutés pour BMPR1B, l activité de signalisation du système BMP est réduite, diminuant ainsi la prolifération, avec moins de granulosa par follicules (ceux-ci sont donc plus petits), et favorisant une avance à la maturation folliculaire terminale par une meilleure sensibilité aux hormones gonadotropes. Il en résulte des follicules prêts à ovuler plus tôt dans un environnement endocrinien inchangé. 2. FecX/BMP15 Au niveau ovarien, les brebis homozygotes Inverdale FecX I /FecX I ou Hanna Fec H /FecX H présentent une hypoplasie ovarienne (Figure 12) qui se caractérise par une incapacité des 31

45 Figure 13. Coupes histologiques d ovaires homozygotes FecX L /FecX L (Bodin et al., 2007) Photographies de sections histologiques d ovaires sauvages (A et C) ou homozygotes mutés FecX L /FecX L (B-F). (A) Evidence de croissance folliculaire avec la présence de follicules secondaires (s) et tertiaires (t) dans les ovaires normaux. (B) Ovaires FecX L /FecX L remplis de nombreux follicules promordiaux (p) comparés aux ovaires sauvages (A et C) sans follicule secondaire ni tertiaire. (D) Cortex d ovaires FecX L /FecX L avec des follicules primordiaux (p) et de nombreuses structures folliculaires anormales (a). (E) Nombreux ovocytes adjacents organisés en cluster. (F) Présence de structures folliculaires dépourvues d ovocytes (of) et de nombreux follicules primaires anormaux (a) montrant de larges ovocytes avec une zone pellucide épaisse entourée de couches de cellules de granulosa désorganisées. 32

46 follicules ovariens à dépasser le stade primaire du développement folliculaire [130, 131]. Cet arrêt dans la folliculogenèse s observe également chez les brebis Lacaune FecX L /FecX L [52] (Figure 13), Aragonaise FecX R /FecX R [36, 37] ou encore Belclare FecX B /FecX B ou FecX G /FecX G [38]. Ce phénotype ovarien est à l origine de niveaux d œstradiol et d inhibine indétectables [132], qui se répercutent au niveau hypophysaire par des niveaux circulants de FSH et de LH anormalement élevés chez les brebis homozygotes Inverdale, similaires à ceux de brebis ovariectomisées. Les brebis FecX H, FecX R, FecX G et FecX L portent des mutations dans BMP15 qui empêchent toute production de la protéine [36-38, 46, 52, 55, 76, 133, 134]. Ainsi le blocage au stade primaire de la folliculogenèse des brebis stériles indique que BMP15 est indispensable à la transition vers la formation des follicules secondaires. A l inverse des brebis homozygotes, les brebis hétérozygotes FecX I /FecX +, qui sont prolifiques, ont des ovaires semblables à ceux observés chez les brebis Booroola, avec un nombre plus élevé de follicules à antrum, plus petits et matures plus précocement. Pour autant, les sécrétions plasmatiques ovariennes (œstradiol, inhibine, progestérone) ne sont pas différentes de celles des brebis non mutées [132]. Au niveau hypophysaire, les taux plasmatiques de LH et de FSH sont également similaires entre les deux génotypes. A l état hétérozygote, la mutation FecX I, à l image de la mutation Booroola FecB B, montre un phénotype strictement ovarien, sans altération des sécrétions d hormones ovariennes et hypothalamo-hypophysaires. A l échelle cellulaire, BMP15 (ARNm et protéine) est exprimé très préférentiellement dans les ovocytes des follicules en croissance avec un optimum d expression entre les stades de follicules primaires et pré-ovulatoires [55, 135, 136]. L utilisation in vitro de BMP15 recombinante sur des cellules de granulosa a mis en évidence son rôle potentialisateur sur la prolifération des cellules de granulosa [135, 137], son rôle inhibiteur sur la sensibilité à FSH [8, 138], et son rôle potentialisateur dans le dialogue ovocyte-granulosa via l expression du Kit ligand, un facteur nécessaire à la croissance de l ovocyte dans les follicules au stade préantral [139]. BMP15 exerce donc un rôle important sur la stimulation de la prolifération et l inhibition de la différenciation/maturation des cellules de granulosa en diminuant leur sensibilité aux effets des gonadotropines au cours de la folliculogenèse [132, 140]. Dans le cas des brebis hétérozygotes FecX mutées, la perte de fonction partielle de BMP15 (une demi-dose) est responsable, «tout comme» celle de BMPR1B, d une inhibition de la prolifération des 32

47 cellules de la granulosa (follicules plus petits) mais d une avance à la maturation folliculaire terminale, les follicules étant prêts à ovuler plus tôt. En conclusion, les phénotypes FecX/BMP15 mutés mettent en évidence le rôle crucial de BMP15 dans le développement des follicules du stade primaire au stade secondaire [139], la différenciation des follicules à antrum [141] et dans la sélection des follicules ovulatoires. 3. FecG/GDF9 Au niveau ovarien, les brebis homozygotes stériles Belclare FecG H /FecG H [137] et Icelandic FecG T /FecG T [50] présentent une hypoplasie ovarienne qui se caractérise par un développement folliculaire altéré, arrêté à un stade de follicule secondaire (2 à 4 couches de cellules de granulosa pour FecG T ), ou qui peut se poursuivre, dans quelques rares cas, jusqu au stade de formation de l antrum (FecG H ) [38, 142]. Chez les brebis Icelandic homozygotes FecG T, les conséquences endocriniennes sont similaires à celles observées chez les brebis homozygotes mutées FecX. Les niveaux d œstradiol et d inhibine très bas se répercutent au niveau hypophysaire par des niveaux circulants de FSH et de LH anormalement élevés [50]. Contrairement aux mutations dans FecX/BMP15, aucune donnée physiologique n est disponible pour les brebis prolifiques hétérozygotes pour les mutations dans FecG/GDF9. Cependant, le phénotype des brebis stériles avec un arrêt de la folliculogenèse aux stades précoces indique que GDF9 est essentiel à la croissance folliculaire et que les mutations FecG H /GDF9 S385F et FecG T /GDF9 S427R sont certainement perte de fonction. A l échelle cellulaire, GDF9 est également un facteur d expression essentiellement ovocytaire [143, 144]. L utilisation de GDF9 recombinante sur des cellules de granulosa in vitro a permis de caractériser, comme pour BMP15, son rôle activateur de la prolifération cellulaire [137, 145], inhibiteur sur la synthèse des récepteurs à LH [146] et des effets positifs de la FSH sur la synthèse de progestérone et d œstradiol [8, 145]. Elle induit l expansion du cumulus et en ce qui concerne son rôle dans le dialogue ovocyte-granulosa, contrairement à BMP15, elle inhibe l expression de Kit Ligand [146]. Ainsi, GDF9, à l image de BMP15, joue donc un rôle important sur la stimulation de la prolifération des cellules de granulosa et représenterait également un frein à la maturation folliculaire. En conclusion, les phénotypes FecG/GDF9 mutés mettent en évidence le rôle crucial de GDF9 dans le développement des follicules à des stades précoces [142]. 33

48 Figure 14. Conséquences des mutations des gènes de prolificité sur la folliculogenèse et le nombre d ovulations chez la brebis- Modèle physiologique (Fabre et al., 2006). Chez les brebis porteuses de mutations dans les gènes de prolificité BMP15, GDF9 ou BMPR1B, l activité réduite du système de signalisation des BMPs diminue l action des BMPs sur la prolifération et la sensibilité des cellules de la granulosa à la FSH. Les follicules à antrum sont par conséquent de plus petite taille, avec moins de cellules de la granulosa, mais présentent une sensibilité accrue à FSH. Ceci permet donc d avancer la maturation des follicules. Ces follicules plus petits produisent moins d inhibine et d œstradiol, mais ensemble, ils en produisent autant que le follicule pré-ovulatoire des brebis non mutées. In fine, il s établit le même dialogue endocrinien entre l ovaire et l axe hypothalamo-hypophysaire dans les deux génotypes. En conclusion, cette régulation aboutit à la sélection et à l ovulation de plusieurs follicules de plus petite taille chez les brebis porteuses des mutations dans les gènes de prolificité. GC : cellules de la granulosa, E2 : œstradiol, INH : inhibine. 34

49 4. Modèles de contrôle du nombre d ovulations chez la brebis a) Le modèle physiologique Les mutations identifiées chez la brebis ont mis en lumière trois principaux gènes Fec que sont BMP15, GDF9 et BMPR1B. Les données obtenues des études physiologiques et fonctionnelles mènent à deux conclusions communes sur le rôle de ces 3 gènes Fec: - ils agissent en stimulant la prolifération des cellules de granulosa dès les premiers stades de la croissance folliculaire et inhibent ensuite la maturation des follicules au cours des stades plus tardifs dépendants des hormones gonadotropes, - l augmentation de la prolificité est liée à une perte de fonction de ces gènes, qui se fait soit par une diminution des niveaux de protéines matures, soit par une altération de la liaison entre les ligands et les récepteurs au niveau des cellules de granulosa et des cellules du cumulus [55, 76, 134]. Des expériences d immunisation passive et active contre BMP15 et/ou GDF9 ont permis de valider cette notion de perte de fonction puisqu elles provoquent soit une stérilité (caractérisée par des comportements d œstrus anormaux, et un développement folliculaire altéré ou un arrêt de ce développement), soit une hyperprolificité (via l augmentation du taux d ovulation) de façon dose dépendante, reproduisant ainsi les effets des mutations [ ]. Sur cette base, Fabre et al. en 2006 [8] ont proposé un schéma explicatif des variations du nombre d ovulations observées sous l influence des mutations dans les gènes Fec (Figure 14). Dans le cas d ovaires mutés pour un gène Fec, l activité de signalisation du système BMP est réduite. Les conséquences en sont une diminution de l action positive des BMP sur la prolifération des cellules de la granulosa et une levée de leur action inhibitrice sur la sensibilité à la FSH. L ovaire présente ainsi de plus petits follicules à antrum avec un nombre réduit de cellules de la granulosa qui ont une sensibilité plus élevée aux gonadotropines. La maturation folliculaire est avancée comme en atteste l expression plus précoce des récepteurs à LH. Au cours de la maturation dépendante de la FSH, ces plus petits follicules vont produire individuellement des quantités réduites d œstradiol et d inhibine, mais ensemble, ils en produisent autant que le follicule pré-ovulatoire de brebis non mutées. In fine, le dialogue endocrinien entre l ovaire et l axe hypothalamo-hypophysaire reste le même entre les deux génotypes et la maturité précoce des follicules chez les brebis porteuses d un gène Fec entraîne la sélection puis l ovulation de follicules plus petits, mais surtout plus nombreux. 34

50 Figure 15. Relations fonctionnelles entre BMP15, GDF9 et BMPR1B Figure 16. Modèle moléculaire du contrôle du nombre d ovulations en cas de mono-ovulation (Demars et al., 2013) Le quota ovulatoire dans un cas de mono-ovulation serait rigoureusement contrôlé par la triple activité de 1) l homodimère BMP15 et sa signalisation via BMPR1B/BMPR2/SMAD1, 5, 8 (bleu), 2) l hétérodimère BMP15/GDF9 et sa signalisation via TGFβR1/BMPR2/SMAD2, 3 (rose), et 3) l homodimère GDF9 et sa signalisation via TGFβR1/ BMPR2/SMAD2, 3 (violet). 35

51 b) Le modèle moléculaire A l échelle moléculaire, comme indiqué précédemment, ces trois gènes BMP15, GDF9 et BMPR1B appartiennent au même système de signalisation. BMP15 (FecX) et GDF9 (FecG) ont la capacité de former des hétérodimères et ainsi coopérer pour agir sur les cellules de granulosa (Figure 15) [76, 133, 150]. Cette synergie d action est d autant plus marquée par le fait qu à la fois les homodimères BMP15 et GDF9 et les hétérodimères GDF9/BMP15 utilisent les mêmes récepteurs de type 2 BMPR2 [76, 133, 151], alors que les récepteurs de type 1 sont différents pour ces deux facteurs. BMP15 se lie avec une grande affinité au récepteurs BMPR1B (ALK6, codé par FecB) [152] alors que l homodimère GDF9 et l hétérodimère BMP15/GDF9 utilisent le récepteur de type 1 du TGFβ, TGFBR1 (ALK5) [151]. L appartenance de ces 3 gènes Fec à un même système de signalisation est en partie confirmée in vivo. Les travaux de Davis et al. ont montré que les brebis porteuses de mutations à la fois dans BMP15 et BMPR1B avaient un taux d ovulation bien supérieur à celui des brebis mutées BMPR1B ou hétérozygotes mutées BMP15. Cette observation met donc en évidence une interaction de BMP15 avec BMPR1B. Ce plus fort taux d ovulation ne s apparentant pas à un effet additif des deux mutations, les auteurs en ont donc conclu un effet epistatique des deux locus [153]. En race Cambridge et Belcare, les brebis doubles hétérozygotes mutées FecX B /BMP15 S367I (ou FecX G /BMP15 Q239X ) et FecG H /GFD9 S395F présentent un taux d ovulation supérieur à celui des hétérozygotes mutées pour l un ou l autre des deux gènes [38]. L effet des mutations à l état hétérozygote est ainsi additif. Cette observation soutiendrait donc le fait que les effets de BMP15 et GDF9 sur la fonction ovarienne sont distincts [154]. Sur la base des connaissances fonctionnelles et des phénotypes pour toutes les mutations connues, Demars et al. [46] proposent, en 2013, un modèle explicatif du contrôle du nombre d ovulations à l échelle moléculaire. Dans ce modèle, ce nombre semble être rigoureusement contrôlé par la triple activité de 1) l homodimère BMP15 et sa signalisation via BMPR1B/BMPR2/SMAD1,5,8 [152], 2) l hétérodimère BMP15/GDF9 et sa signalisation via TGFBR1/BMPR2/SMAD2,3 [150], et 3) l homodimère GDF9 et sa signalisation via TGFBR1/BMPR2/SMAD2,3 (Figure 16). L équilibre entre ces trois activités donne un niveau global «normal» d activité dont la conséquence est la mono-ovulation. L atteinte d au moins une de ces trois voies est à l origine d une réduction du niveau global d activité et les 35

52 Figure 17. Modèle moléculaire du contrôle du nombre d ovulations par les mutations Fec. (Demars et al., 2013) (A) La mono-ovulation est contrôlée par la triple activité de l homodimère BMP15, l hétérodimère BMP15/GDF9 et l homodimère GDF9 (Figure 16), (B) Augmentation du nombre d ovulations (taux d ovulation, TO) sous l effet des mutations FecX (phénotype hyperprolifique dépendant des formes de BMP15). A l état homo- ou hétérozygote, elles altèrent soit la voie de signalisation de l homodimère BMP15, celle de l hétérodimère BMP15/GDF9, soit les deux, alors que la voie de GDF9/GDF9 est inchangée (C). Augmentation du TO sous l effet des mutations FecG (phénotype hyperprolifique dépendant des formes de GDF9). A l état homo- ou hétérozygote, elles altèrent soit la voie de signalisation de l homodimère GDF9, celle de l hétérodimère GDF9/BMP15, soit les deux, alors que la voie de BMP15/BMP15 est inchangée. (D) Effet dose de chaque mutation FecX et FecG sur chacune des voies de signalisation. Sur la base des données des tests fonctionnels in vitro, une dose (0, 1 ou 2) est attribuée à chaque voie en vue d expliquer le phénotype de prolificité observé. Quand le TO est normal, deux doses sont attribuées aux homodimères BMP15 (bleu), deux doses à l homodimère GDF9 (violet) et deux doses à l hétérodimère BMP15/GDF9 (rose), soit, une dose de 6 pour la situation WT, OR=1. Prenons l exemple de FecX R, G, H ou L, dans ces cas de mutations homozygotes pertes de fonction dans BMP15 qui conduit à la stérilité, il ne reste que la voie de l homodimère GDF9 totalement active, mais qui ne suffit pas à soutenir une folliculogèse complète. Dans le cas de mutation hétérozygote hyperprolifique, les voies homodimère BMP15 et hétérodimère sont réduites, mais associées à la voie homodimère GDF9, l intégration du signal permet de passer le seuil de stérilité sans atteindre le seuil de monoovulation. 36

53 conséquences en sont soit une anovulation (stérilité), soit une poly-ovulation (hyperprolificité) (Figure 17). En dessous d un seuil critique, le système BMP15/GDF9/BMPR1B bloque précocement la folliculogenèse et conduit à un phénotype stérile. C est ce qui est observé sous l effet des mutations FecX L, H, G, R. L absence de production de BMP15 biologiquement actif [36-38, 52, 55] réduit notablement les voies de signalisation passant par l homodimère BMP15 et l hétérodimère BMP15/GDF9. Pour les mutations FecG H et FecG T, l hypothèse est faite qu une perte de fonction de GDF9 (qui reste à démontrer) puisse altérer à la fois les voies de signalisation des homodimères GDF9 et des hétérodimères GDF9/BMP15. Entre le seuil critique de stérilité et l activité globale dite normale, le taux d ovulation et la taille de portée sont augmentés selon le modèle physiologique précédent [8, 10]. Dans ce cas, les mutations Fec altèrent soit entièrement les voies de signalisation des homodimères BMP15 ou GDF9, soit partiellement les voies des homodimères et des hétérodimères BMP15/GDF9 (Figure 17B et C). Les brebis hétérozygotes sont donc hyperprolifiques et non pas stériles. Les mutations FecX Gr, FecX O et FecG E illustrent parfaitement cette situation, si ce n est que la mutation FecX O semble avoir un effet uniquement sur la voie de signalisation de l hétérodimère, alors que FecX Gr affecte clairement la voie de l homodimère BMP15 ou peut-être même sa liaison au récepteur (Figure 17D). Cette hypothèse est aussi valable avec le phénotype homozygote hyperprolifique de la mutation Booroola. La perte de fonction affecte le récepteur BMPR1B [155] suggérant ainsi que la voie de signalisation de l homodimère BMP15 seule est affectée. Au vu de ces observations, il semblerait clair que l ensemble des mutations découvertes à ce jour dans le système BMP puisse n affecter qu une seule et même voie de signalisation. Or, dans le cas de la mutation FecX Gr, la voie SMAD 1, 5, 8 est abolie et pourtant l homozygote FecX Gr /FecX Gr n est pas stérile [46]. Ceci suppose donc qu une autre voie de signalisation de BMP15 reste fonctionnelle, comme celle passant par TAK1, maintenant ainsi l activité BMP15 et in fine, rehaussant le niveau d activité global au-dessus du seuil de stérilité [150]. D. Implication des gènes de prolificité ovins chez la souris et l homme 1. Chez la souris De façon intéressante en termes de biologie comparée, les trois gènes Bmp15, Gdf9 et Bmpr1b ont été invalidés chez la souris et présentent des phénotypes pas toujours en 36

54 Tableau 2. Comparaison des effets des mutations naturelles ovines (m) et des inactivations de gènes de la souris (KO) sur le taux d ovulation des femelles. (Mulsant P. 2005) +1 : taux d ovulation augmenté d une unité par rapport aux témoins, = : pas d effet, - : taux d ovulation diminué, 0 : pas d ovulation, * : femelles à taux d ovulation normal, mais quasistériles pour d autres raisons. 37

55 concordance avec ceux de la brebis. En effet, les souris homozygotes Bmp15 -/- sont fertiles avec un taux d ovulation légèrement réduit, quelques défauts histopathologiques, mais ne présentent aucun blocage de la folliculogenèse. Quant aux souris Bmp15 +/-, elles sont normales et ne montrent aucune augmentation du taux d ovulation [156]. Par contre, l invalidation de Gdf9 bloque la folliculogenèse au stade primaire [157] et le phénotype observé s apparente plus à celui des brebis homozygotes mutées pour FecX/BMP15 que celui associé aux mutations FecG/GDF9. Mais là encore, les souris hétérozygotes Gdf9 +/- ne montrent jamais d augmentation du nombre d ovulations. Cela laisse à penser que Gdf9 chez la souris et BMP15 chez la brebis jouent le même rôle crucial de facteurs mitogènes au cours de la transition des follicules du stade primaire à secondaire [8]. Chez la souris, Bmp15 serait accessoire alors que Gdf9 est indispensable au bon déroulement de la folliculogenèse jusqu à l ovulation. Chez la brebis au contraire, GDF9 comme BMP15 sont essentiels comme en attestent les phénotypes stériles des brebis homozygotes mutées FecX et FecG ainsi que ceux des brebis sauvages immunisées contre GDF9 et BMP15 [147, 148]. Enfin de façon surprenante, les souris Bmpr1b-/- invalidées pour le récepteur Bmpr1b sont stériles [158], alors que les brebis mutées pour FecB/BMPR1B sont hyperprolifiques. La cause de cette stérilité réside dans un défaut d expansion du cumulus autour de l ovocyte empêchant la fécondation, alors que contrairement aux brebis Booroola mutées FecB B, le recrutement et la maturation des follicules ovariens ne sont pas altérés. L ensemble de ces observations est résumé dans le Tableau 2. L ensemble de ces incohérences pourrait être lié au caractère ovulatoire différent entre l espèce murine (poly-ovulante) et ovine (mono-ovulante) [55, 159] et/ou à la nature même des mutations (ponctuelle vs délétion). Il n en reste pas moins qu aucune des invalidations dans Gdf9, Bmp15 ou encore Bmpr1b, que ce soit à l état hétérozygote comme homozygote, n est à l origine d une augmentation du taux d ovulation comme chez la brebis. 2. Chez l Homme Après la mise en évidence de l influence des gènes BMP15 et GDF9 sur la folliculogenèse chez la brebis, plusieurs études se sont intéressées à la présence des mutations dans ces gènes chez la femme, associées soit aux pathologies ovariennes, comme l insuffisance ovarienne précoce (IOP ou ménopause précoce), le syndrome des ovaires polykystiques (PCOS), ou le syndrome d hyperstimulation ovarienne (OHSS), soit à la gémellité dizygotique [160]. En effet, à l heure actuelle, une vingtaine de polymorphismes 37

56 Figure 18. Illustration schématique des différents polymorphismes connus dans BMP15 détectés dans des cas d Insuffisance Ovarienne Précoce (IOP) (Persani et al., 2010). Les électrophoregrammes spécifiques de chaque polymorphisme identifié sont représentés. Les différents rectangles de couleur montrent les potentiels mécanismes biologiques résultant des polymorphismes «perte de fonction» testés in vitro par Di Pasquale et al., 2004 [161] et Rossetti et al., 2009 [162]. Les deux polymorphismes non encadrés ne sont pas impliqués dans une perte de fonction in vitro et doivent être considérés comme des polymorphismes faux sens avec un effet biologique superficiel voire absent [162]. L effet biologique de la première mutation identifiée dans le peptide mature n est à ce jour pas connu. 38

57 causant des mutations dans BMP15 et GDF9 ont déjà été associés à des altérations de la fonction ovarienne chez la femme [ ]. La majorité d entre eux se situe dans BMP15 et est associé à une IOP, certains résultant dans les formes les plus sévères d une dysgénésie de l ovaire (Figure 18). Trois autres polymorphismes de BMP15 sont la cause d OHHS, associés à une plus forte production de follicules chez des femmes soumises à une stimulation ovarienne à la FSH [172]. Enfin, l expression anormale de GDF9 dans les ovocytes a pu être associée à des PCOS [173] et certains autres polymorphismes dans ce gène, à des naissances dizygotiques [174, 175]. Toutefois, aucune des mutations identifiées chez la femme dans BMP15 ou GDF9 n a d équivalent chez la brebis. Sur la base d études fonctionnelles, la causalité des mutations dans le gène BMP15 humain dans l apparition de ces pathologies ovariennes a pu être associée à une perte de fonction, comme c est le cas chez la brebis (Figure 18) [161, 162, 164]. Pour GDF9, ce travail fonctionnel reste encore à réaliser. Ainsi, chez la femme aussi, des mutations dans les gènes BMP15 et GDF9 à l état hétérozygote sont associées à un dysfonctionnement ovarien plutôt qu à une augmentation de la prolificité. Même si les gènes Fec mis en évidence chez l ovin ne contrôlent pas directement la prolificité dans l espèce humaine, il est clair qu ils y jouent un rôle prépondérant dans le fonctionnement ovarien. La recherche et l identification de nouveaux gènes Fec chez les ovins restent donc d un grand intérêt pour approfondir les connaissances sur la fonction ovarienne et le rôle de ces gènes dans le contrôle du nombre d ovulations, mais également pour comprendre le mécanisme de certaines pathologies ovariennes humaines. Ainsi, d un point de vue plus finalisé, les résultats obtenus pourraient avoir des retombées cliniques avec le développement de nouvelles thérapies contre les pathologies ovariennes observées chez la femme. 38

58 SITUATION DU SUJET ET OBJECTIFS DE LA THESE 39

59 Figure 19. Schéma expérimental familial Lacaune (d après la thèse de L. Drouilhet). Les effectifs représentés sont les effectifs totaux des animaux produits, l encadré jaune représente le dispositif utilisé lors du génome scan. Les effectifs sélectionnés pour les expériences de cartographie génétique sont indiqués entre crochets verts. LL : animaux porteurs de la mutation FecL L à l état homozygote FecL L /FecL L ; L+ : animaux porteurs de la mutation FecL L à l état hétérozygote FecL L /FecL + ; ++ : animaux homozygotes sauvages FecL + /FecL + ; BC : croisement backcross. 40

60 I. Le gène de prolificité FecL en race ovine Lacaune Nous avons vu tout au long de cette partie introductive que le mouton était un excellent modèle pour l étude du contrôle de la fonction ovarienne et de la prolificité. A l heure actuelle, les mutations qui affectent le nombre d ovulations et la prolificité impliquent 3 gènes majeurs, BMP15, GDF9 et BMPR1B. Tous appartiennent au système des BMP qui joue ainsi un rôle crucial pour le déroulement de la folliculogenèse et la régulation du taux d ovulation. Nous avons vu cependant qu il reste encore à identifier certaines mutations causales dans les races où ségrège un gène à effet majeur sur la prolificité. C est notamment le cas en race Lacaune, avec la ségrégation d une mutation dans le gène FecL qui devrait aboutir à l identification d un nouveau gène, puisqu il n est pas localisé sur le même chromosome que FecB, FecX ou FecG. Avec un effectif de 1,2 millions de brebis, la race ovine Lacaune est la principale race en France puisqu elle représente environ 20% du cheptel français. Cette race a la particularité de posséder des qualités zootechniques distinctes selon la lignée considérée. En effet, la race Lacaune comporte aussi bien des lignées dédiées à la production laitière (filière «lait», avec des critères de sélection axés sur la quantité et la composition du lait) qu à l élevage d agneaux sous la mère (filière «viande»), avec des critères de sélection sur le taux de croissance, la taille de portée, la conformation et le poids de carcasse. En 1975, une coopérative d insémination artificielle localisée en Aveyron (OVITEST) a mis en place un schéma de sélection d une filière «viande» visant à améliorer la prolificité des brebis. Les résultats issus de la sélection tant sur sa rapidité, sur le caractère de prolificité que sur les fortes disparités de la variance des tailles de portée intra-familles et inter-familles, laissaient penser à la ségrégation d une mutation à fort effet. A. Création des familles expérimentales et mise en évidence du gène FecL Afin de confirmer l existence du gène majeur, l INRA a créé une population expérimentale élevée à l unité expérimentale de Langlade, près de Toulouse (Figure 19). Pour former le noyau expérimental, trois mâles appartenant au schéma de sélection d OVITEST ont été choisis selon leur index génétique pour la taille de portée élevée et la variance élevée des performances de leurs filles pour ce même caractère, suggérant ainsi qu ils soient porteurs hétérozygotes de l allèle muté au gène majeur putatif. Un testage sur descendance a ensuite été entrepris à partir de ces 3 grands-pères et 12 de leurs petits fils, en les croisant avec des 40

61 Figure 20. Théorie de l existence d un gène majeur Des mâles présumés porteurs (fils de brebis ayant des TO extrêmes) sont croisés avec des femelles présumées non porteuses +/+ (TO bas). Leurs fils sont testés sur descendance, c est-à-dire croisés avec des femelles peu prolifiques. Lors de la ségrégation d un gène majeur, la répartition des performances des filles est soit unimodale (père supposé +/+), soit bimodale (père supposé M/+). TO : taux d ovulation, n : effectif, M : allèle muté Figure 21. Création des familles expérimentales Une partie des animaux du protocole est sélectionnée afin de créer les familles expérimentales. Pour cela, seuls les fils hétérozygotes (M/+) sont conservés, ainsi que leur filles dont la performance est située aux deux extrémités de la distribution, ayant donc des phénotypes extrêmes soit bas (classées +/+ avec un risque faible d erreur) soit haut (classées M/+). TO : taux d ovulation, n : effectif, M : allèle muté 41

62 femelles Lacaune laitières présumées non porteuses de la mutation (croisement backcross). Le fait de tester les mâles sur descendance, et non les femelles, permet d obtenir une descendance nombreuse en une seule génération (croisement d un mâle avec de nombreuses femelles). Les analyses des croisements backcross ont mis en évidence des distributions bimodales du taux d ovulation des filles (selon l allèle reçu, les performances sont très différentes) (Figure 20) pour 7 des 12 mâles testés et ont donc confirmé l existence d un gène majeur influençant la taille de portée [59]. Selon la nomenclature antérieure donnée aux gènes majeurs de fécondité, ce gène est dès lors appelé FecL (gène Fec, L pour Lacaune) et l allèle muté FecL L. Pour des raisons de simplicité, les génotypes à la mutation seront écrits L/L, L/+ et +/+, représentant les génotypes FecL L /FecL L, FecL L /FecL + et FecL + / FecL + respectivement. De nouveaux croisements ont ensuite été réalisés afin d augmenter l effectif des familles et d obtenir des animaux des trois génotypes L/L, L/+ et +/+ pour la suite des études. Cette fois, 7 pères hétérozygotes ont été sélectionnés et croisés à des femelles laitières (croisement backcross) d une part, et aux femelles backcross (L/+ ou +/+) d autre part (Figure 19). L attribution des génotypes à la mutation des femelles s est basée sur leurs propres performances, et ceux des mâles sur les performances de leurs filles. In fine, les brebis classées L/L, L/+ et +/+ avaient en moyenne des taux d ovulation mesurés par endoscopie de 4,6, 3,0 et 1,4 respectivement [176], faisant de la mutation FecL L une mutation codominante. Les femelles dont la paternité ou le génotype était incertain ont été écartées de l étude. Enfin, l absence des mutations FecX L dans BMP15 et FecB B dans BMPR1B dans le protocole de clonage positionnel du locus FecL a été vérifiée ultérieurement. B. Localisation du locus FecL (thèses F. Lecerf et L. Drouilhet) Afin d étudier la localisation du gène majeur et sa mutation, les études ont porté sur les familles dites «informatives» constituées à partir des fils supposés hétérozygotes pour la mutation et des femelles aux performances extrêmes issues du testage sur descendance (Figure 21). Cette première étape est basée sur une analyse de liaison classique entre un marqueur et la mutation. Ainsi, grâce au criblage complet du génome (genome scan) de l ensemble de ces animaux à partir d un panel de marqueurs microsatellites, il a été possible d identifier une liaison significative de marqueurs localisés sur le chromosome 11 ovin (OAR11) [177] avec le locus FecL [53, 60]. 41

63 Figure 22. Utilisation de méioses recombinantes en cartographie fine (d après la thèse de L. Drouilhet). Représentation de la ségrégation d une paire de chromosome (bâtons) homologues de parents A et B chez leurs descendants C à H. La région de localisation de la mutation M est colorée en orange lorsque l haplotype est muté et en jaune lorsqu il est sauvage. Le mâle A hétérozygote est croisé avec une femelle homozygote sauvage. Le mâle pourra produire des gamètes recombinés ou non et transmettre à sa descendance des haplotypes entiers (animaux C, E, F et H) ou recombinés (animaux D et G). Les animaux qui ont reçu un haplotype entier ne sont pas informatifs pour réduire la zone de localisation de M, contrairement aux animaux D et G. En effet, D a un génotype à la mutation M/+, M se trouve donc dans la région orange de son chromosome paternel. A l inverse, G a un génotype à la mutation +/+, M se trouve donc dans la région jaune de son chromosome paternel. En recoupant les informations des deux individus, il est possible d obtenir une zone de localisation réduite pour la mutation M. Figure 23. Notion de partage allélique (d après la thèse de L. Drouilhet). Les bâtons représentent les chromosomes d individus différents. La région de localisation de la mutation M est colorée en orange lorsque l haplotype est muté, en jaune lorsqu il est sauvage. A et B sont les allèles du marqueur bleu, C et D ceux du rouge, E et F ceux du vert. Pour le marqueur bleu, l allèle associé à l haplotype muté est le A, ce même allèle est retrouvé chez des 6 haplotypes sauvages testés, le partage allélique de ce marqueur est donc d environ 66%. Puisque l allèle associé à l haplotype mutant est souvent retrouvé chez les chromosomes sauvages, le partage allélique de ce marqueur est donc élevé, la probabilité qu il soit informatif est faible. A l inverse, pour le marqueur vert, l allèle associé à l haplotype muté est le E, aucun des 6 haplotypes sauvages testés ne porte cet allèle, ce marqueur est donc non partagé sur la sélection testée et a une grande probabilité d être informatif. La disponibilité de marqueurs peu partagés est essentielle dans une étude de population. 42

64 Une seconde étape de cartographie fine associée à une approche de cartographie comparée du locus a permis de réduire progressivement l intervalle critique contenant le gène. La cartographie fine consiste à situer un locus entre deux marqueurs. Elle dépend principalement de 2 facteurs : - la disponibilité d animaux recombinants, puisque ce sont eux qui aident à borner la région de localisation de la mutation. En effet pour une mutation M étudiée, à chaque méiose, le fragment de chromosome qui la contient peut être transmis intégralement à la génération suivante, ou bien être recombiné (processus de crossing-over entre un chromosome muté et sauvage) et donc transmis seulement en partie à la génération suivante. Ce fragment de chromosome qui contient la mutation est constitué par un ensemble de marqueurs dont les allèles ségrègent ensemble lors des méioses et qui représentent un haplotype. Lorsque l haplotype entier est transmis, les animaux qui le portent ne sont pas informatifs pour réduire la zone de localisation de la mutation M, alors que lorsqu il est transmis en partie seulement, il est possible d obtenir une zone de localisation réduite pour la mutation. La Figure 22 illustre le raisonnement effectué afin de réduire la région de localisation. - la densité de marqueurs disponibles, puisqu ils permettent de préciser au mieux les points de recombinaison des animaux recombinants. Plus la densité de marqueurs est forte, meilleure est la résolution de l intervalle de localisation. A cette densité de marqueurs s ajoute également la notion de marqueurs informatifs ou peu partagés. En effet, à une position précise de l intervalle, il est nécessaire de pouvoir évaluer si un animal recombinant a reçu une fraction d haplotype muté ou sauvage. La probabilité qu un marqueur soit informatif est inversement proportionnelle au partage allélique de ce dernier au sein des populations. Ainsi, moins un marqueur est partagé sur le nombre d animaux testés et plus sa probabilité d être informatif est grande. La Figure 23 illustre la notion de partage allélique. La cartographie comparée permet quant à elle, d utiliser les informations existantes dans des espèces bien étudiées et séquencées (localisation de marqueurs par exemple) et de les transposer à une espèce non séquencée pour, in fine, par transposition de ces marqueurs orthologues dont l ordre est conservé entre les deux espèces apparentées (bloc de synténie), pouvoir délimiter le locus d intérêt. 42

65 Figure 24. Représentation de la réduction de la zone de localisation du locus FecL Typage des marqueurs issus du séquençage 454 d un animal L/+, sur les animaux recombinants (d après la thèse de L. Drouilhet). Les gènes de la zone sont en bleus, leur position et leur taille sont représentées par des rectangles bleus sur OAR11. Les marqueurs mis en évidence lors du séquençage 454 sont représentés par des ronds accompagnés soit de leur nom, soit du numéro de contig dans lequel ils sont localisés. Les chromosomes recombinés des animaux recombinants sont représentés par les rectangles horizontaux. Les zones d incertitude sont en gris, les haplotypes sauvage et muté sont en jaune et en orange respectivement. Les zones hachurées représentant les zones exclues par le génotype à la mutation, des animaux recombinants (noté à côté des chromosomes, au-dessus du nom de l animal). La double flèche orange représente la zone de localisation du locus FecL. La taille de la région de localisation est donnée par rapport à la séquence ovine v3.1. Figure 25. Position des deux SNP non partagés issus du séquençage Roche 454 (d après la thèse de L. Drouilhet). L orientation 5-3 des gènes est donnée par les flèches, les SNP sont représentés par une étoile. Les gènes GNGT2 et B4GALNT2 sont agrandis de manière à faire apparaître la structure des gènes décrite dans l espèce bovine, le gène B4GALNT2 est une séquence prédite. 43

66 L utilisation de ces outils de cartographie fine et comparée a permis de réduire dans un premier temps l intervalle de localisation de FecL aux marqueurs BM17132 et FAM117A, qui correspondait à un bloc de synténie de 1,1Mb sur le chromosome 17 humain (HSA17) contenant 20 gènes annotés [53]. Le développement de nouveaux marqueurs informatifs a permis de typer l ensemble des animaux des familles (189 animaux) afin de détecter d éventuels nouveaux animaux intéressants mais surtout de préciser les points de recombinaison des animaux recombinants afin de réduire la zone de localisation de FecL. Ainsi, dans un second temps, l intervalle de localisation a pu être réduit à 488kb, encadré par les marqueurs GNGT2-M2 et Ms162 du chromosome 11 ovin, qui correspondait à un bloc de synténie de 479kb sur le chromosome 19 bovin (BTA19). Avec l émergence de nouvelles technologies de séquençage à haut débit, une stratégie de séquençage systématique de la zone de localisation de FecL a été préférée, pour à la fois répondre à la problématique de développement de nouveaux marqueurs et pouvoir mettre en évidence la mutation causale directement. Pour ce faire, il était nécessaire de séquencer un chromosome L et un chromosome +. Néanmoins il fallait que le nombre de polymorphismes soit raisonnable. Le choix du chromosome + à séquencer devait donc favoriser sa ressemblance avec l haplotype muté, c est pourquoi le séquençage de la brebis hétérozygote L/+ n présentant une grande zone d homozygotie a été entrepris. Le séquençage Roche 454 de cet animal L/+, réalisé sur de longs fragments de PCR couvrant les 1,1Mb contenant FecL (en se focalisant sur la zone minimale de 479kb), a permis de mettre en évidence 2 polymorphismes de type SNP, et , en total déséquilibre de liaison avec la mutation FecL L dans les familles expérimentales (étude de partage allélique sur 424 chromosomes + testés) et en association complète avec la présence de l haplotype muté dans les populations (étude de partage allélique sur 90 chromosomes + testés de plusieurs races différentes). Par ailleurs, les marqueurs informatifs développés à partir de ce séquençage, ont également été testés sur les animaux recombinants. Ce travail a finalement permis de réduire l intervalle de localisation du locus FecL à 250kb (Figure 24 et Figure 25), entre les marqueurs et , ne comprenant plus que 5 gènes ABI3 (Abscisic acid insensitive 3), PHOSPHO1 (Phosphatase Orphan 1), GNGT2 (Guanine Nucleotide Binding Protein Gamma Transducing Activity Polypeptide 2), B4GALNT2 (β-1,4-n-acetyl- Galactosaminyl Transferase 2) et IGF2BP1 (Insulin-Like Growth Factor 2 MRNA Binding Protein 1). De plus, les 2 SNP non partagés, chacun susceptible d être la mutation causale candidate, s avèrent être présents dans cette zone, dans les gènes GNGT2 et B4GALNT2. 43

67 Figure 26. Expression des gènes situés dans le locus minimal de FecL (Figure 2 et Figure S1, Drouilhet-Mansanet et al., 2013) L ARN total de cellules de granulosa (GC) de petits follicules (SF, 1-3mm), de cellules de granulosa et de la thèque (TC) de gros follicules (LF, 6mm), d hypophyse (PG), d hypothalamus (HPT), a été rétrotranscrit et soumis à une amplification en temps réel (qpcr) afin de quantifier les 5 gènes localisés dans l intervalle minimal de 250kb, PHOSPHO1, ABI3, GNGT2, B4GALNT2 et IGF2BP1, et ceux jouxtant l intervalle, SNF8, UBE2Z, ATP5G1 et CALCOCO2. De l ARN total d intestin a également été rétrotranscrit et soumis à une amplification en temps réel pour l étude de l expression des gènes GIP et B4GALNT2. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM de l expression relative du gène de référence RPL19, sur une échelle logarithmique. Les astérisques indiquent une différence significative entre les moyennes (n=5) des brebis non porteuses (+/+) et porteuses (L/L) de la mutation FecL L, *** : p< 0,

68 C. Etude de l expression des gènes candidats positionnels (thèse L. Drouilhet) Afin de proposer un éventuel candidat expressionnel parmi les 5 candidats positionnels de locus FecL, une étude de leur expression par PCR en temps réel a été réalisée sur les tissus de l axe hypothalamo-hypophyso-ovarien. Sur les 5 gènes présents dans l intervalle minimal, seuls B4GALNT2 et IGF2BP1 sont plus exprimés dans les cellules ovariennes de brebis mutées que celles de brebis témoins (Figure 26). En effet, l expression de B4GALNT2 est de 800 à 1000 fois plus élevée dans les cellules de la granulosa et de la thèque des brebis L/L par rapport aux brebis +/+. Par contre, cette différence d expression n est pas retrouvée au niveau central dans l hypophyse et l hypothalamus, ni même au niveau intestinal. Le gène IGF2BP1 quant à lui est 6 fois plus exprimé uniquement dans les cellules de la granulosa des brebis L/L. Pour s assurer que cette surexpression liée au génotype ne concerne que ces deux gènes du locus, l expression des gènes jouxtant l intervalle minimal, i.e. GIP, SNF8, UBE2Z, ATP5G1 et CALCOCO2 a aussi été étudiée. Aucun d eux ne présente d expression modifiée dans les différents tissus L/L par rapport aux +/+. Ainsi, B4GALNT2 et IGF2BP1, qui étaient déjà des candidats positionnels pour le gène FecL, deviennent de surcroît des candidats expressionnels. D. Caractérisation du phénotype L/L (thèse L. Drouilhet) Pour aider à comprendre l effet de la mutation FecL L sur le taux d ovulation, une étude de physiologie comparée entre les brebis homozygotes mutées L/L et non mutées +/+ a été menée. Cette étude visait à mieux caractériser le phénotype ovarien (dénombrement et caractérisation moléculaire des follicules) mais aussi les profils endocriniens des principales hormones régulant l axe reproductif (FSH, LH, œstradiol et progestérone) pour les deux génotypes. Nous avons vu précédemment que l effet de la mutation autosomale FecL L sur le taux d ovulation était additif, puisqu une copie augmente le taux d ovulation d environ 1,5 et deux copies d environ 3,0 [53, 59]. Les travaux de Drouilhet et al. en 2010 [178] ont également permis de mettre en évidence l influence du locus FecL sur l activité ovarienne et les profils endocriniens. En effet, l augmentation du taux d ovulation chez les brebis homozygotes L/L est associée à une augmentation du nombre de follicules à antrum (dépendants des gonadotropines) d un diamètre supérieur à 3 mm ainsi qu à une réduction de la taille des follicules préovulatoires, plus petits d 1 mm (Tableau 3). Cette réduction du diamètre des 44

69 Tableau 3. Dénombrement folliculaire après dissection d ovaires Lacaune homozygotes L/L et sauvages +/+ (Drouilhet et al., 2010) Les données sont exprimées en moyenne ± SEM par animal. Les différences sont significatives avec p<0,05*, p<0,01**, p<0,001***. Tableau 4. Concentrations plasmatiques d oestradiol, LH, FSH et progestérone au cours d un cycle œstrien synchronisé chez des brebis homozygotes mutées L/L et sauvages +/+ (Drouilhet et al., 2010). Les temps sont donnés en heures après le retrait de l éponge intravaginale de progestagène. Les données sont indiquées en moyenne ± SEM. Les différences sont significatives avec p<0,05*, p<0,01**, p<0,001***. 45

70 follicules ovulatoires est à rapprocher d observations similaires pour les mutations dans FecB et FecX [8, 118, 141, 179]. Dans les follicules L/L, l augmentation de l activité aromatase (évaluée par le rapport des concentrations œstradiol/testostérone) et l augmentation de l expression du récepteur à la FSH dans les cellules de la granulosa laissent penser à une maturation plus précoce et une meilleure sensibilité à l action de la FSH. Cependant, cette maturation plus précoce est moins marquée que pour les brebis Booroola (FecB B ) ou Inverdale (FecX I ). Les autres marqueurs de la maturation des follicules ovariens (gènes de la stéroïdogénèse CYP19A1, CYP11A1 et CYP17A1, le gène du récepteur à la LH, LHCGR, et la sous-unité α de l inhibine INHA) ne sont pas différents entre les deux génotypes. Les concentrations plasmatiques d œstradiol mesurées au cours d un cycle oestrien sont plus importantes (en moyenne 2 fois plus) en phase folliculaire chez les brebis L/L (Tableau 4), conduisant à une augmentation de la fréquence des pulses de LH et in fine à un pic préovulatoire de LH plus précoce. En phase lutéale, les taux de progestérones ont également augmentés par rapport aux brebis non mutées. Seule la concentration circulante de FSH reste inchangée entre les deux génotypes au cours du cycle. Ces profils endocriniens différents entre les brebis +/+ et L/L sont un phénotype qui n avait pas été observé chez les brebis prolifiques Booroola et Inverdale. Enfin, au niveau hypothalamo-hypophysaire, le génotype n affecte pas l expression des marqueurs testés (les sous-unités des gonadotropines FSHB et LHB, le récepteur au GnRH, GnRHR, des marqueurs hypothalamiques comme GNRH, KISS1, ). L ensemble de ces observations suggère que l influence de FecL L serait ovarienne. En conclusion de ces études, la grande variabilité de la prolificité en race ovine Lacaune s explique par la ségrégation d une mutation dans le gène FecL situé sur le chromosome 11 dans une région de 250kb. Deux gènes sont des candidats positionnels et expressionnels pour FecL, IGF2BP1 qui code une protéine de liaison aux ARN et B4GALNT2 qui code une enzyme de glycosylation permettant le transfert de résidus GalNac. Aucun de ces deux gènes n appartient au système BMP, et le phénotype physiologique de la prolificité des brebis L/L est différent de celui des brebis mutées dans FecX/BMP15, FecG/GDF9 et FecB/BMPRIB. Nous sommes donc face à un nouveau gène majeur de prolificité et donc potentiellement, face à la découverte d un nouveau mécanisme de régulation du taux d ovulation. 45

71 II. Objectifs de la thèse Dans ce contexte de connaissances génétiques et physiologiques, ma thèse avait donc deux objectifs : poursuivre l étude génétique du locus afin d identifier le gène FecL et dans l idéal, la mutation causale FecL L, mais également caractériser les conséquences moléculaires et phénotypiques de la mutation FecL L sur la fonction ovarienne. La zone de localisation de FecL issue du séquençage haut débit Roche 454 de l animal hétérozygote L/+ contenait encore des zones sans information de séquences. Il était donc nécessaire de séquencer des animaux supplémentaires dans la zone minimale afin de compléter ces séquences manquantes et d identifier de nouveaux polymorphismes, permettant une nouvelle densification des marqueurs. L information de séquence complète du locus et ces nouveaux marqueurs doivent permettre de préciser les points de recombinaison pour in fine, réduire la zone de localisation de FecL au maximum et également isoler à coup sûr la mutation causale. Pour cela, nous avons choisi de séquencer le locus minimal de 250kb chez une brebis +/+ et une brebis L/L par la stratégie de longs fragments PCR (10kb) couvrant la zone couplée à l analyse Roche 454. Une fois le polymorphisme causal mis en évidence, il faut comprendre par quel mécanisme moléculaire il régule l expression de(s) gène(s) candidat(s) pour FecL (IGF2BP1 et/ou B4GALNT2), par la mise en place d analyses fonctionnelles. Le type d analyses à mettre en place dépend bien sûr de la nature et de la localisation du polymorphisme. Dans le but d établir un lien fonctionnel entre l altération d expression de(s) ce(s) gène(s) avec la poly-ovulation et l hyperprolificité, une étude comparative plus approfondie des conséquences de leur surexpression dans l ovaire est envisagée. Il s agit de déterminer les protéines cibles glycosylées par B4GALNT2 et les ARNs cibles de IGF2BP1. Cette étude menée en parallèle de l analyse génétique permettra d aider à l identification du gène FecL. En fonction de la nature du gène FecL et des cibles identifiées, les analyses adéquates seront mises en place pour expliquer la régulation du nombre d ovulations chez les brebis Lacaune mutées. III. Principaux résultats acquis D un point de vue génétique, j ai pu réduire l intervalle de localisation du locus FecL de 250kb (5 gènes) à 194,6kb, ne comprenant plus que les deux gènes candidats expressionnels B4GALNT2 et IGF2BP1. J ai également pu identifier deux SNPs dans des 46

72 régions non codantes en total déséquilibre de liaison avec la mutation, chacun susceptible d être la mutation causale. A l heure actuelle, je n ai ni identifié le mode d action de la mutation causale sur la surexpression des gènes du locus, ni même pu discriminer fonctionnellement les deux SNPs. D un point de vue des mécanismes physiologiques, seule la surexpression des ARNs de B4GALNT2 est associée à la présence de la protéine et à une activité de glycosylation atypique uniquement dans les cellules de granulosa L/L. Cette activité ectopique de B4GALNT2 dans les ovaires L/L aurait pour conséquence la glycosylation atypique de l inhibine A. Cette glycosylation entraîne des changements qualitatifs et quantitatifs de l inhibine A ovarienne et circulante que l on imagine être à l origine de l augmentation du nombre d ovulations. L ensemble de ce travail désigne le gène B4GALNT2 comme étant le gène FecL et la mutation FecL L est représentée par 1 ou 2 SNP augmentant drastiquement son expression ovarienne. In fine, via l inhibine A, le système TGFβ/BMP semble encore une fois au cœur de la régulation du taux d ovulation chez la brebis, contrairement aux hypothèses de départ. Une grande partie des résultats de mon travail de thèse a contribué à la publication d un seul article (placé à la fin du manuscrit). Nous avons fait ce choix afin de valoriser la stratégie pluridisciplinaire utilisée, alliant génétique et physiologie, pour à la fois identifier et caractériser le gène FecL ségrégant en race ovine Lacaune. Cela permettait de proposer un travail relativement complet et original sur l identification d un nouveau gène majeur de prolificité. Certaines données, génétiques et physiologiques, ne figurent pas dans cet article. Dans un souci de clarté, j ai choisi de replacer le contenu de cet article avec l ensemble des données non publiées en une seule et unique partie de résultats. De cette façon, il m était possible de préserver l originalité de la stratégie déployée allant de l identification du gène FecL et sa mutation causale associée jusqu à la caractérisation du rôle fonctionnel du gène FecL dans le contrôle du taux d ovulation. De la même façon, j ai choisi de simplifier la lecture de mon manuscrit en intégrant la démarche expérimentale entreprise aux résultats obtenus. Les techniques utilisées feront renvoi à des fiches de procédures expérimentales (PE) placées en annexe. Enfin je tenais à préciser que mon travail de thèse avait été réalisé entre les laboratoires LGC (Laboratoire de Génétique Cellulaire) et PRC (Physiologie de la Reproduction et des Comportements) de l INRA de Toulouse et de Tours respectivement.. 47

73 RESULTATS 48

74 48

75 Figure 27. Schéma récapitulatif de la stratégie utilisée pour réduire l intervalle de FecL et pour identifier la mutation causale. 49

76 Figure 28. Représentation de la zone de localisation de FecL après le séquençage Roche 454 des animaux L/L et +/+ (capture d écran du logiciel de visualisation Apollo) Cette figure représente la zone de localisation de 194,6 Kb. Les gènes sont en violet (les exons correspondent aux rectangles, les introns aux lignes), les amorces utilisées pour amplifier les grands fragments PCR sont en blanc (liées par un segment), les contigs créés à partir de notre séquençage sont représentés par les rectangles de 3 couleurs selon qu ils sont issus des animaux L/+, L/L et +/+, les doubles flèches rouges indiquent les zones non comblées par le séquençage

77 I. Réduction de l intervalle FecL et identification de la mutation causale : Analyse du séquençage 454 : Pour cette approche, je suis partie de l intervalle de 250kb issue du séquençage partiel de l animal hétérozygote L/+, borné à chaque extrémité par au moins deux animaux recombinants (60718 et 6139) ayant un génotype et un phénotype à la mutation bien établis. Les objectifs de cette étude étaient de pouvoir séquencer en totalité cette zone pour à la fois, développer de nouveaux marqueurs informatifs afin de réduire la zone d étude, et mettre en évidence des marqueurs non partagés qui répondent aux critères de mutation causale potentielle. La stratégie adoptée est récapitulée dans la Figure 27. Pour mettre en évidence ces polymorphismes, les séquençages indépendants d un animal L/L et d un animal +/+ ont été préférés au séquençage d un autre animal hétérozygote. D une part, cela permet de s affranchir des biais affectant la représentation allélique comme l amplification majoritaire d un allèle plutôt que de l autre lors de la PCR, et d autre part d obtenir une analyse aisée des polymorphismes en comparant «simplement» les deux séquences entre elles. Ainsi, j ai choisi la femelle L/L n au hasard, puisqu il n existe qu un seul haplotype L dans la population étudiée, et la femelle +/+ n puisqu elle était supposée homozygote sur la totalité du locus (L. Drouilhet, communication personnelle). L ADN génomique de ces deux brebis a servi de matrice pour des amplifications PCR de longs fragments (taille moyenne de 10kb) couvrant la totalité de l intervalle de 250kb pour le locus FecL (PE 1, p.115). Pour les deux animaux indépendamment, chaque produit d amplification a été dosé pour être mélangé aux autres en quantité équivalente. Ces mélanges de produits PCR représentent le matériel génétique de départ pour constituer les banques de séquençage haut débit Roche 454 (PE 2, p. 116) réalisées sur la plateforme génomique de Toulouse (GeT-PlaGe) (PE 3, p. 118). Le séquençage complet du locus minimal de 250kb sur les brebis +/+ et L/L choisies a généré séquences d une longueur moyenne de 366pb. En collaboration avec l équipe bio-informatique SIGENAE ( ces données ont ensuite été assemblées en les alignant sur le génome ovin de référence. Ces nouvelles séquences ont ainsi permis de confirmer les données obtenues de l animal L/+ et d améliorer l information de séquence. Cependant, cela n a pas permis d obtenir l intégralité de la séquence du locus et des «trous» dans la séquence demeuraient encore (Figure 28). 49

78 Figure 29. Récapitulatif de la réduction de la zone de localisation de FecL après le séquençage Roche 454 des brebis +/+ et L/L Les gènes de la zone sont en bleu, leur position et leur taille sont représentées par des rectangles bleus sur OAR11. Les marqueurs mis en évidence lors du séquençage 454 sont représentés par des ronds accompagnés soit de leur nom, soit du numéro de contig dans lequel ils sont localisés. Les chromosomes recombinés des animaux recombinants sont représentés par les rectangles horizontaux. Les zones d incertitude sont en gris, les haplotypes sauvage et muté sont en jaune et en orange respectivement. Les zones hachurées représentent les zones exclues par le génotype à la mutation des animaux recombinants (noté à côté des chromosomes, audessus du nom de l animal). La double flèche orange représente la zone de localisation du locus FecL. Les tailles des régions de localisation sont données par rapport à la séquence ovine v3.1. 1) Etat de la zone avant et 2) après le séquençage Roche 454 des femelles +/+ et L/L 50

79 A. Réduction de l intervalle FecL Bien qu incomplète, la comparaison des séquences partielles L/L, +/+ et anciennement L/+ obtenues a permis d identifier dans cette région une centaine de polymorphismes de type Microsatellite (Ms), Single Nucleotide Polymorphism (SNP) ou insertion/délétion (In/Del). Sur cette centaine de marqueurs développés, une sous-sélection appropriée (dépendant de leur position dans le locus) a été testée sur des animaux recombinants afin de réduire les zones d incertitude sur leurs chromosomes recombinés. En considérant les zones d incertitudes des femelles , 6139 et 60718, le typage a permis de réduire la zone de localisation de FecL à 197kb (sur la base du génome ovin de référence OARv3.1), avec deux nouvelles bornes aux marqueurs OAR11 g t>c (femelle recombinante ; position sur OAR11 et SNP de type T>C sur les séquences +/+ vs L/L respectivement) et g g>c (femelle recombinante 60718) (Figure 29, PE 4, p.119). Ces nouvelles bornes génétiques éliminent les 3 gènes GNGT2, ABI3 et PHOSPOH1 du locus FecL, ainsi que le SNP (contig 49) non partagé dans GNGT2 mis en évidence par L. Drouilhet comme mutation potentielle pour FecL L. L intervalle ainsi réduit, la suite de nos analyses s est focalisée uniquement sur la comparaison des séquences +/+ et L/L dans ce nouvel intervalle estimée à 197kb. Comme indiqué précédemment, l information de séquence qui a été générée avec la technologie 454 est incomplète sur cet intervalle. En effet, l information de séquence est contenue dans 13 et 17 contigs indépendants chez l animal L/L et +/+ respectivement (Figure 28). Par conséquent, pour pouvoir comparer les séquences complètes +/+ et L/L entre elles, il a d abord fallu relier les contigs entre eux. L information de séquence manquante entre les contigs (de quelques paires de bases à plusieurs kb) a été obtenue par un séquençage Sanger avec une stratégie de marche sur le chromosome (amplification PCR des zones manquantes et progression à partir des séquences connues) (PE 5, p. 121). B. Annotation bioinformatique du locus FecL Ainsi réalisé, le séquençage complet du locus minimal à partir de l animal L/L et l animal +/+ qui était estimé à 197kb sur la base du génome ovin de référence OARv3.1, indique en réalité un intervalle final de 194,6kb. Cette séquence a été déposée dans la base de données GenBank sous le numéro d accession KC La différence de taille entre les deux informations de séquence vient du fait que des segments de bases inconnues (ensemble de N) demeurent dans la séquence de référence et que des régions répétées sont mal 50

80 assemblées. L ensemble des informations de séquence récolté a ainsi permis de corriger et de compléter la séquence du génome ovin de référence dans cette région. L analyse bio-informatique de la séquence par homologie de séquence (algorithme BLASTN, et les informations d annotation du génome ovin m ont permis de positionner des annotations pour des séquences codant des protéines prédites sur le génome ovin. La présence de la séquence entière des gènes B4GALNT2 et IGF2BP1 a pu être confirmée dans l intervalle minimal, sur la base de l alignement avec l ARNm prédit de B4GALNT2 bovin (GenBank : XM_584835, 13 exons) et de l ARNm d IGF2BP1 bovin (GenBank : NM_ , 14 exons). Leur localisation sur OAR11 s est également avérée être cohérente avec celle sur BTA19 chez le bovin et HSA17 chez l homme (synténie respectée). Cependant, nous avons observé un problème d homologie de séquence 5 de B4GALNT2 prédit bovin avec B4GALNT2 humain rendant flou la localisation du début du gène B4GALNT2 ovin (13 exons avec la séquence bovine, 11 exons avec la séquence humaine). Pour résoudre ce problème, nous avons produit notre propre séquence de l ARNm de B4GALNT2 ovin par RT-PCR et 5 RACE à partir d ARN totaux issus de cellules de granulosa de brebis Lacaune L/L. Cette séquence est référencée dans Genbank sous le numéro d accession KC et permet de localiser parfaitement le gène B4GALNT2 ovin qui comprend en réalité 11 exons. Contrairement à la synténie avec BTA19 et HSA17, il apparaît une troisième annotation sur OAR11 entre les gènes B4GALNT2 et IGF2BP1. Il s agit de EZR (ezrine) déterminé sur la base de l alignement avec EZR bovin (GenBank : NM_174217). Cependant, dans les génomes bovin (UMD3.1) et humain (GRCh37), EZR est localisé sur BTA9 et HSA6 respectivement ( dans des régions qui ne sont pas synténiques de FecL sur OAR11. Lorsque que l on aligne la séquence d ADNc EZR bovine sur le génome ovin (BLASTN, OARV3.1, les résultats indiquent des alignements significatifs avec le contig_ de la race Texel, et les chromosomes OAR11 et OAR8. Seulement, seules les séquences alignées sur OAR8 présentent une structure exon/intron retrouvée dans une région synténique avec BTA9 et HSA6, et représenteraient donc le gène ovin EZR. Malgré tout, l alignement de la séquence de l ADNc EZR bovin avec OAR11 issu du génome ovin de référence et notre propre séquence du locus FecL, présente un fort pourcentage d identité (95%) et de recouvrement (98%) sans présence d intron. De surcroît, la séquence prédite d EZR sur OAR11 dans le locus FecL porte un codon stop prématuré, réduisant la protéine à 223 acides aminés au lieu de 581. In fine, l ensemble de ces Tableau 5. 51

81 Polymorphismes identifiés dans le locus minimal FecL locus et leur partage allélique (Tableau 1, Drouilhet-Mansanet et al., 2013) La position des polymorphismes est donnée sur la base d OAR11 v3.1 et du locus FecL (Genbank acc. KC352617). Les polymorphismes SNP (Single Nucleotide Polymorphism), Microsatellite (Ms) ou Insertion/Délétion (in/del) sont notés selon le type de séquence +/+ vs. L/L. Le partage allélique est indiqué par un nombre de chromosomes (+) portant l allèle (L) en fonction du nombre total de chromosomes (+) testés. a Ce SNP correspond à une borne de l intervalle et a donc été exclu du locus minimal. b Cet allele se comporte comme la mutation FecL L. c Marqueurs Ms genotypés par SSCP fluorescente, aucune information sur la variation de la répétition du dinucleotide n est disponible. NA, coordonnée non disponible sur OARv3.1 52

82 éléments laisse penser que nous avons mis évidence la présence d un pseudo-gène épissé de EZR dans le locus FecL. Dans la suite du manuscrit, nous l appellerons pseudo-ezr. C. Annotation fonctionnelle du locus FecL Afin de confirmer les analyses bioinformatiques, j ai souhaité tirer parti des séquençages d ARN ovin à haut-débit (RNAseq) réalisés au sein du LGC de Toulouse dans le cadre de la thèse d A. Bonnet pour proposer une annotation fonctionnelle et peut-être identifier des transcrits inconnus au sein du locus FecL. L étude d A. Bonnet [180] avait pour objectif de décrire les profils d expression distincts des ovocytes et des cellules de granulosa, isolés par microdissection par capture laser (LCM), au cours des premiers stades de la folliculogenèse chez la brebis. J ai pu ainsi obtenir les données de séquençage du transcriptome des cellules de granulosa et d ovocytes du stade de follicule primordial au stade de follicule pré-antral ainsi que des données multi-tissus provenant de brebis Lacaune +/+. L alignement de la totalité des séquences des transcrits ovins détectés par RNAseq à chacun des stades étudiés, sur les données génomiques issues de notre séquençage du locus n a pas permis d identifier de transcrits autres que ceux de B4GALNT2 et IGF2BP1 dans le locus FecL. En conclusion, le nombre de gènes candidats positionnels pour FecL dans le locus est de deux, B4GALNT2 et IGF2BP1. D. Identification des polymorphismes et étude du partage allélique La comparaison des séquences complètes +/+ et L/L issues des séquençages Roche 454 et Sanger dans la zone de 194,6kb a permis d identifier 49 polymorphismes dont 43 SNP, 4 Ms et 2 In/Del (Tableau 5). Chacun des polymorphismes a été testé sur les animaux recombinants, mais aucun d eux n a permis de réduire les zones d incertitude sur leurs chromosomes recombinés et donc de réduire l intervalle minimal (PE 4, p. 119). Afin de déterminer le polymorphisme causal FecL L, chaque marqueur a été testé pour l étude du partage allélique sur une brebis L/L, une brebis L/+ et un petit nombre de brebis +/+ (2 à 6). Lorsque l allèle associé à l haplotype muté n était pas retrouvé dans ces chromosomes + testés, alors l étude a été élargie à d autres ensembles de chromosomes + issus de populations Lacaune et d autres races ovines non prolifiques. Parmi ces polymorphismes, seuls trois SNP ne sont pas partagés. Un de ces polymorphismes est la borne génétique en aval de B4GALNT2, g t>c, mais il ne peut pas être la mutation causale car il est éliminé par la brebis recombinante Il reste alors les deux SNPs, 52

83 Figure 30. Carte du locus FecL sur le chromosome 11 ovin (Figure 1, Drouilhet-Mansanet et al., 2013) Les gènes et les marqueurs sont indiqués par des rectangles et des ronds, respectivement. Le locus FecL (197kb sur OARv3.1 ou 194,6kb, issus de notre séquençage) est borné par les deux animaux recombinants les plus proches g t>c et g g>c. Le rectangle blanc représente une zone sans animal recombinant, les rectangles gris et noirs sont respectivement les zones qui contiennent un recombinant ou au moins deux avec FecL L. N : aucun partage allélique entre les animaux sauvages et ceux porteurs de l allèle FecL L. 53

84 g t>a et g a>g, localisés respectivement dans l intron 7 de B4GALNT2 et dans la séquence intergénique séparant B4GALNT2 de pseudo-ezr, à environ 10,4kb en amont de pseudo-ezr (Figure 30). Ces deux SNP sont localisés dans deux régions noncodantes du locus. Les résultats de l alignement du transcriptome issu du RNAseq confirment qu aucune lecture ne se retrouve sous les deux SNPs. Au bilan de cette étude, la stratégie de séquençage du locus FecL dans son intégralité m a permis de développer des marqueurs génétiques qui ont servi à réduire l intervalle de localisation de la mutation FecL L à 194,6kb entre les marqueurs g t>c et g g>c sur OAR11. Ce locus minimal comprend deux gènes candidats positionnels pour FecL, B4GALNT2 et IGF2BP1, ainsi que deux SNP non-codants en total déséquilibre de liaison avec FecL L, chacun susceptible d être la mutation causale candidate. 53

85 Figure 31. Analyse par EMSA des interactions protéine-adn au niveau des SNPs candidats Deux sondes double-brins biotinylées pour chacun des SNPs g t>a et g a>g ont été construites de sorte à représenter à la fois les allèles (L) en orange et (+) en noir. Elles ont ensuite été incubées en présence (+) ou non (-) de protéines nucléaires de cellules de granulosa ovines (EN) d origine +/+ en violet. Les complexes ADN/protéines (shift) sont séparés de la sonde libre par une électrophorèse en gel de polyacrilamide. EBNA représente la sonde «contrôle négatif» Epstein-Barr nuclear antigen mis en présence d extraits protéiques EN +/+. 54

86 II. Mécanisme d action moléculaire de la mutation FecL L Les données génétiques précédentes indiquent la ségrégation de deux SNP candidats potentiels pour la mutation causale, l un situé dans la région intergénique séparant B4GALNT2 et pseudo-ezr et l autre dans l intron 7 de B4GALNT2. Cette information est à mettre en relation avec la surexpression de 1000 fois et 6 fois des gènes B4GALNT2 et IGF2BP1 respectivement, dans les cellules de la granulosa des ovaires L/L en comparaison des ovaires +/+ (présentée dans la partie introductive). Mon objectif était donc à la fois de comprendre par quel mécanisme moléculaire le(s) polymorphisme(s) causal (causaux) régule(nt) l expression de ces gènes candidats positionnels et expressionnels et de discriminer FecL L entre les deux SNP selon les résultats obtenus. La régulation de l expression des gènes IGF2BP1 et B4GALNT2 passe à priori par la modulation de leur niveau de transcription comme en attestent les expériences de PCR en temps-réel. Cette régulation pourrait être la résultante d effets combinés de l organisation structurale et fonctionnelle de l ADN par interaction avec des facteurs de transcription et/ou la méthylation des dinucléotides CpG. A. Hypothèse 1 : Altération de sites de fixations des facteurs transcriptionnels Lorsque l on s intéresse à la modulation de la transcription par les facteurs de transcription, il est maintenant bien établi que leur activité de régulation s étend bien en deçà et au-delà du site d initiation de la transcription, parfois même à plusieurs kilobases de ce dernier. Leur activité se fait par leur fixation à de courtes séquences d ADN de 6 à 30 nucléotides de long (cis-régulatrices), au cœur de l orchestration de la transcription des gènes. La littérature, riche à ce sujet, montre que la mutation (perte ou gain de fonction) de ces sites de fixation affecte l activité ou l accessibilité des facteurs de transcription. Ces modifications in fine se répercutent sur l expression des gènes associés [181]. Sur cette base, il est possible que les deux SNP causaux (ou l un des deux) identifiés dans le locus FecL puissent être responsables d une perte ou d un gain de fixation de facteurs protéiques régulant la transcription des gènes IGF2BP1 et B4GALNT2 du locus FecL. Pour répondre à cette hypothèse, j ai utilisé la technique EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays) ou retard sur gel (PE 6, p. 122) permettant l étude de liaison des protéines aux acides nucléiques. Pour cela, j ai incubé des extraits de protéines nucléaires (EN) de cellules de granulosa +/+ avec des sondes biotinylées de 60 nucléotides pour chaque SNP et portant soit l allèle prolifique, soit l allèle sauvage (Figure 31). Le contrôle négatif est 54

87 constitué d une sonde biotinylée fixant la protéine EBNA (Epstein-Barr nuclear antigen). En comparaison aux sondes seules, l incubation avec les extraits nucléaires de granulosa fait apparaître un retard de migration pour les sondes des deux SNP. Malheureusement, certaines bandes retardées ne sont pas spécifiques des sondes SNP, et celles qui le sont ne montrent pas de différence entre les allèles. Des expériences complémentaires avec des sondes plus courtes (20pb), des conditions d incubations différentes ou encore des extraits nucléaires de granulosa L/L n ont pas permis de visualiser des profils différentiels entre les deux génotypes. B. Hypothèse 2 : Altération des marques épigénétiques par méthylation Sur l aspect de l organisation structurale de l ADN, les marques épigénétiques régulent le statut «ouvert» ou «fermé» de régions du génome et contrôlent ainsi le statut transcriptionnellement actif ou inactif des gènes. Chez les mammifères, la méthylation de l ADN, un des trois processus épigénétique, se fait sur des cytosines adjacentes à des guanines que l on nomme des sites CpG, principalement localisés dans les régions régulatrices des gènes. Il est maintenant bien établi que la méthylation de l ADN est associée à l inhibition ou l extinction de l expression des gènes [182, 183]. Ses rôles ont été montrés dans la répression de l expression des gènes suppresseurs de tumeurs dans les cas de cancers [184], l inactivation du chromosome X [185], dans l empreinte parentale [186, 187] mais aussi pour des gènes essentiels au développement [188]. De façon intéressante, des études sur le cancer gastro-intestinal ont montré que l expression de B4GALNT2 dans les cellules intestinales était dépendante du profil de méthylation de son promoteur [189]. Le locus FecL pourrait donc être soumis à la méthylation. J ai alors émis l hypothèse que la surexpression des gènes candidats observée dans les ovaires des brebis L/L résulterait d une modification du profil de méthylation des promoteurs sous influence des SNP causaux. 1. A l échelle globale : Hypométhylation du génome La corrélation entre la perte de méthylation dans des régions spécifiques de l ADN et l activation de l expression des gènes associés est étudiée en induisant une hypométhylation in vitro du génome, au moyen d analogues chimiques de la cytosine tel que la 5-Aza-2 - Déoxycytidine (AZDC ou Decitabine). Dans le but de savoir au préalable si la méthylation pouvait être un moteur de la régulation du locus FecL, j ai traité in vitro des cellules de granulosa +/+ avec des doses 55

88 Figure 32. Effet de différent degrés d hypométhylation sur l expression des gènes du locus (B4GALNT2 et IGF2BP1) et avoisinant le locus (GNGT2, ABI3 et PHOSPHO1) FecL L ARN total de cellules de granulosa de petits et moyens follicules (<3mm et 3-5mm), préalablement mises en culture in vitro en présence d un gradient d AZDC (0, 10, 30 et 100µM) pendant 48h, a été rétrotranscrit et soumis à une amplification en temps réel afin de quantifier l expression des gènes dans le locus FecL, B4GALNT2 et IGF2BP1, et avoisinant PHOSPHO1, ABI3, GNGT2. Les données sont exprimées en expression relative moyenne du gène de référence RPL19 à partir de 6 cultures indépendantes. 56

89 croissantes d AZDC (0 à 100µM). L impact du traitement sur l expression des gènes candidats du locus (B4GALNT2 et IGF2BP1) et avoisinant le locus (GNGT2, ABI3 et PHOSPHO1) a été mesuré par PCR en temps réel (PE 7, p. 123). Sous l effet de l AZDC et donc de l hypométhylation (Figure 32), il est possible d observer une altération de l expression des cinq gènes testés. Sauf pour ABI3, le traitement AZDC semble jouer un rôle potentialisateur sur l expression des gènes testés. Néanmoins, sur l ensemble des 6 expériences de culture in vitro réalisées, les résultats ne sont pas parfaitement reproductibles. Seule l expression de B4GALNT2 semble augmenter de façon dose dépendante, pouvant aller jusqu à 3 fois sous 100µM de AZDC par rapport au contrôle. 2. Ilots CpG : Séquençage Bisulfite et Digestion enzymatique méthyl-sensible Sur la base de ces observations, j ai choisi de répondre à l hypothèse de départ en me concentrant sur les séquences susceptibles d être méthylées, à savoir les îlots CpG (régions enrichies en dinucléotides CpG), souvent présents dans les régions régulatrices des gènes. Pour rechercher ces îlots, j ai soumis la totalité de la séquence du locus FecL pour analyse par l algorithme CpG plot ( La Figure 33 indique la position d îlots CpG bordant les deux gènes du locus. Etant donné que B4GALNT2 semble le plus sûrement affecté par le traitement AZDC, je me suis focalisée sur l étude des îlots CpG présents à proximité de l exon 1 de B4GALNT2 (Figure 34). L analyse de l état de méthylation de ces deux îlots est réalisée par un séquençage de la zone après un traitement de l ADN au bisulfite (PE 8, p.124), une méthode chimique qui transforme les cytosines non méthylées en uraciles. A la lecture des séquences obtenues à partir d ADN de cellules de granulosa +/+ et L/L, il apparaît que ces îlots ne sont pas méthylés et cela ne m a pas permis d observer de différence de conversion entre les deux génotypes. Une seconde approche par des digestions enzymatiques par les enzymes de restriction MspI et HpaI, respectivement insensible et sensible à la méthylation (PE 9, p. 125) (Figure 35) a confirmé ces résultats. Il semblerait donc qu il n y ait pas d action différentielle de la méthylation sur ces îlots CpG en amont de B4GALNT2 associée à son différentiel d expression entre les cellules de granulosa +/+ et L/L. En conclusion de ces études, quelle que soit l hypothèse de régulation proposée, aucune des expérimentations menées jusqu à présent ne m a permis d identifier le mode d action de la mutation causale sur la surexpression des gènes du locus, ni même de discriminer un des deux SNPs. 56

90 SNP g t>a SNP g a>g Figure 33. Représentation de la position des îlots CpG dans le locus FecL La représentation graphique est une capture d écran du logiciel de visualisation CpGplot. Les barres noires indiquent la position des îlots CpG identifiés. La structure intron/exon des gènes B4GALNT2 (rouge) et IGF2BP1 (bleu) est indiquée (les exons 5 sont à droite), ainsi que la position des deux SNP causaux. Figure 34. Représentation de la position des îlots CpG au niveau des séquences régulatrices en amont de B4GALNT2 La représentation graphique est une capture d écran du logiciel de visualisation CpGplot. Les rectangles indiquent la position des îlots CpG identifiés au niveau des séquences régulatrices en amont de B4GALNT2. Les îlots ont été repositionnés en fonction du gène B4GALNT2. Le rectangle rouge correspond à l exon 1 de B4GALNT2, La flèche, au +1 d initiation de la transcription. 56

91 Figure 35. Profils d amplification des îlots CpG putatifs en amont de B4GALNT2, après digestion enzymatique méthyl-sensible L ADN génomique extrait de cellules de granulosa +/+ et L/L a été soumis ou non (ND) à une digestion enzymatique au moyen des enzymes isoschizomères Msp1 et HpaI, respectivement insensible et sensible à la méthylation. Les échantillons ont ensuite été amplifiés par PCR grâce à des amorces encadrant les deux îlots CpG (îlots 1 et 2) putatifs au niveau des régions régulatrices en amont de B4GALNT2. Les produits d amplification ont ensuite été séparés par une migration éléctrophorétique sur gel d agarose. Les bandes représentent les fragments d ADN amplifiés. 56

92 RECAPITULATIF «GENETIQUE» Au terme de l étude génétique, la stratégie de séquençage complet du locus chez une brebis L/L et une brebis +/+ a permis de réduire l intervalle de localisation de la mutation prolifique FecL L de 250kb contenant 5 gènes à 194,6Kb ne contenant plus que 2 gènes candidats positionnels et expressionnels B4GALNT2 et IGF2BP1, ainsi que 2 SNPs g a>g et g t>a susceptibles d être la mutation causale. Ni les travaux de cartographie fine (animaux recombinants) ni les expérimentations menées sur le mécanisme d action de FecL L n ont permis de désigner un des deux gènes comme étant le gène majeur de prolificité FecL, et un des deux SNPs comme étant la mutation causale associée. Nous parlerons alors d haplotype causal FecL L. 57

93 Figure 36. Voie de synthèse du carbohydrate Sd(a) (d après Dohi et Kawamura, 2008) Figure 37. Immunomarquage d IGF2BP1 et de B4GALNT2 dans les ovaires de brebis Lacaune (Figure 3, Drouilhet-Mansanet et al., 2013) Micro-photographies de coupes d ovaires +/+ et L/L marquées avec un anticorps polyclonal de lapin, anti- IGF2BP1 (dilution au 1:5000) et de chèvre, anti-b4galnt2 (dilution 1:50). Les coupes ont été contrecolorées avec de l hématoxyline. Le segment noir indique l échelle de grossissement. GC : cellules de granulosa, TC : cellules de la thèque, Ant : antrum. 58

94 III. Choix du gène candidat Afin d aider à la découverte de FecL, une autre approche a été menée en parallèle de la stratégie génétique. Cette approche plus physiologique et fonctionnelle repose sur la caractérisation des protéines codées par chacun des gènes candidats du locus et leur activité comparée au sein d ovaires +/+ et L/L. Pour que l analyse comparée des génotypes soit facilitée, tous les résultats suivants ont été obtenus dans les mêmes conditions physiologiques, à savoir en phase folliculaire, 36h après le retrait d une éponge de progestagène permettant la synchronisation des cycles œstriens entre les animaux (PE 10, p. 126). Le recours à cette stratégie avait pour but de pouvoir orienter le choix d un des deux gènes sur la pertinence des résultats obtenus. Au départ de cette étude, la sélection des outils utilisés pour la caractérisation s est basée sur les informations disponibles dans la littérature. Le gène B4GALNT2 (beta-1,4 N acetylgalactosaminyltransferase 2) code une enzyme de la glycosylation permettant le transfert d un résidu N-acetylgalactosamine (GalNac) sur le galactose sub-terminal d une chaîne sucrée portée par un polypeptide ou un lipide. Cette protéine est connue pour catalyser la dernière étape de la biosynthèse des antigènes humains Sd a et Cad présents notamment sur les érythrocytes et la muqueuse du colon [190] (Figure 36). Le gène IGF2BP1 (Insulin-like Growth Factor 2 mrna Binding Protein 1) code un membre de la famille des protéines de liaison des ARNm de l IGF2 [191]. Par sa propriété de liaison aux ARNm, IGF2BP1 régule notamment la traduction des ARNm de la β-actine (ACTB) [192] et la stabilité des ARNm de C-MYC [193]. A. Localisation ovarienne d IGF2BP1 et de B4GALNT2 Les études de PCR en temps réel précédentes ont montré que les ARNm d IFG2BP1 et de B4GALNT2 sont présents dans les cellules ovariennes chez la brebis Lacaune et que leur accumulation est plus importante chez les brebis porteuses de FecL L. De façon à savoir si cette régulation au niveau ARN est suivie d une régulation au niveau protéique, j ai cherché à localiser IGF2BP1 et B4GALNT2 sur des coupes d ovaires +/+ et L/L par immunohistochimie à l aide d anticorps spécifiques anti-igf2bp1 et anti-b4galnt2 (IHC, PE 11, p. 127). La Figure 37 montre qu IGF2BP1 est présente de façon ubiquiste dans les ovaires de brebis, sans profil différentiel entre les deux génotypes en particulier au niveau des cellules de granulosa et de la thèque. Par contre, pour B4GALNT2 il apparaît un marquage plus intense dans les cellules de la granulosa des ovaires L/L en comparaison des ovaires +/+. 58

95 Figure 38. Expression des gènes cibles d IGF2BP1 dans les cellules de granulosa des brebis Lacaune (Figure S2, Drouilhet-Mansanet et al., 2013) A) Un µg d ARN total issus de cellules de granulosa (GC) de petits (SF, 1-3mm) et de gros (LF, 6mm) follicules a été retro-transcrit et soumis à une qpcr en temps réel pour la quantification de l expression du gène C-MYC. Les données sont sous la forme de moyenne ± SEM relative à l expression du gène de référence RPL19 présentée sur une échelle logarithmique. L astérisque indique une différence significative entre les moyennes (n=5) des gros et petits follicules d un même génotype, *** : p< Aucune différence n a été trouvée entre les génotypes +/+ et L/L. B) 25µg d extrait de protéines de cellules de granulosa issus de gros follicules ont été séparés par SDS-PAGE puis transférés sur une membrane de nitrocellulose pour être révélés par western-blotting à l aide d un anticorps polyclonal de lapin anti-β-actine (1/1000). Aucune différence n a été retrouvée entre les génotypes +/+ et L/L. 59

96 Pour valider ces résultats, j ai également réalisé une analyse complémentaire en western-blot. Cependant, les anticorps utilisés en immunohistochimie ne se sont pas avérés efficaces pour cette technique. B. Caractérisation des activités biologiques ovariennes d IGF2BP1 et de B4GALNT2 IGF2BP1, par sa capacité de liaison aux ARNm, est capable de contrôler la stabilité de l ARNm de C-MYC et la traduction de la β-actine. Par conséquent j ai étudié l expression de l ARNm de C-MYC et l accumulation de la protéine ACTB dans les cellules de granulosa +/+ et L/L avec l hypothèse qu elles puissent varier sous l influence de la surexpression d IGF2BP1 chez les brebis porteuses de la mutation. L analyse des données de qpcr (Figure 38A; PE 12, p. 129) met en évidence une forte diminution de 18 fois de l expression de C- MYC dans les gros follicules par rapport aux petits (p<0,001). Toutefois, aucune variation associée à la surexpression d IGF2BP1 n a été constatée dans les cellules de granulosa L/L par rapport aux cellules +/+. De la même façon, l accumulation de l ACTB (Figure 38B) appréciée par western-blot (PE 13, p. 130), n est pas altérée par le génotype L/L. En ce qui concerne l activité de B4GALNT2, les informations disponibles dans la littérature indiquent qu elle repose sur le transfert d un résidu GalNac sur un galactose en position β1,4 d une chaîne sucrée α2,3 sialylée [190]. Deux outils permettent d identifier spécifiquement ce motif et donc l activité de glycosylation de B4GALNT2 : l anticorps KM694 reconnaissant l antigène Sd(a), et la lectine Dolichos Biflorus Agglutinin (DBA) reconnaissant le résidu GalNac. J ai utilisé ces deux outils en immuno- et lectine-histochimie (PE 11, p. 127) sur des coupes d ovaires de brebis +/+ et L/L (Figure 39). Avec ces deux approches, il apparaît très clairement une localisation des cibles de B4GALNT2 uniquement dans les cellules de granulosa et les liquides folliculaires des follicules ovariens L/L. L activité transférase de B4GALNT2, suivie par lectine DBA-histochimie au cours de la croissance folliculaire des brebis Lacaune L/L (Figure 40), s initie précocement au stade de follicule secondaire dans quelques cellules de granulosa proches de l ovocyte. Cette observation suggère que certaines cibles de son activité sont déjà présentes à ces stades du développement folliculaire. Elle s étend ensuite dans la couche de granulosa au cours de la croissance folliculaire jusqu au stade de follicule pré-ovulatoire. Le marquage DBA se maintient également dans les gros follicules en atrésie. Ce profil d activité est partiellement confirmé par les résultats obtenus en immunohistochimie avec l anticorps KM694 (Figure 41). Le marquage le plus précoce se situe également dans les follicules secondaires. 59

97 Figure 39. Activité transférase de B4GALNT2 révélée à l aide d un marquage par la lectine DBA et l anticorps KM694 (Figure 4, Drouilhet-Mansanet et al., 2013) Micro-photographies de coupes d ovaires +/+ et L/L marquées soit par la lectine DBA biotinylée (500ng/mL), soit par l anticorps monoclonal de souris KM694 (dilution 1/1000). Un traitement avec le résidu GalNac (200µM) a été utilisé en compétition pour vérifier la spécificité du marquage DBA. Les coupes ont été contre-colorées avec de l hématoxyline. Le segment noir indique l échelle de grossissement. GC : cellules de granulosa, TC : cellules de la thèque, Ant : antrum. 59

98 Figure 40. Profil de l activité transférase de B4GALNT2 au cours de la croissance folliculaire dans des ovaires de brebis Lacaune L/L Micro-photographies de coupes d ovaires L/L marquées par la lectine DBA biotinylée (500ng/mL). Les coupes ont été contre-colorées avec de l hématoxyline. Le segment noir indique l échelle de grossissement. I: follicule primaire, II : follicule secondaire, An : follicule à antrum, At : follicule en atrésie. Figure 41. Comparaison des profils de l activité de B4GALNT2 obtenus par Lectine- /Immuno-Histochimie, au cours de la croissance folliculaire dans des ovaires de brebis L/L Micro-photographies de coupes d ovaires L/L marquées par l anticorps KM694 (1:1000). Les coupes ont été contre-colorées avec de l hématoxyline. Le segment noir indique l échelle de grossissement. Les colonnes indiquent le stade des follicules et les lignes, le type de marquage utilité (DBA ou KM694). Les flèches indiquent les follicules atrétiques. GC: cellules de granulosa, TC: cellules de la thèque, Ant: antrum. 59

99 Figure 42. Activité transférase de B4GALNT2 révélée à l aide d un marquage par la lectine DBA après la surexpression in vitro de B4GALNT2 dans des cellules de granulosa ovines (Figure 5, Drouilhet-Mansanet et al., 2013) Des cellules de granulosa ovines +/+ issues de petits follicules à antrum (<3mm) ont été transfectées in vitro soit par le plasmide pcdna-hb4galnt2 exprimant la forme humaine de B4GALNT2, soit par le plasmide vide pcdna h post-transfection, les cellules ont été marquées par la lectine DBA biotinylée (500ng/mL). Les flèches indiquent le marquage positif par la DBA des cellules uniquement transfectées avec B4GALNT2. Les cellules ont été contre-colorées à l hématoxyline. Le segment noir indique l échelle de grossissement 60

100 Dans la granulosa des follicules antraux L/L, le marquage KM694 présente un aspect mosaïque, toutes les cellules de granulosa n étant pas marquées contrairement au marquage DBA. Dans les follicules atrétiques aucun marquage KM694 n est détecté alors que ces follicules restent marqués par la lectine DBA. Les profils de localisation différents entre KM694 et DBA indiquent certainement une spécificité de reconnaissance différente des cibles de B4GALNT2 entre les deux outils. Enfin, pour valider ces observations et ainsi confirmer que l activité de glycosylation observée était bien associée à la surexpression de B4GALNT2, des transfections transitoires de cellules de granulosa +/+ avec une construction exprimant l enzyme ont été réalisées (Figure 42; PE 14, p. 131). Le marquage par la lectine DBA observé uniquement dans les cellules de granulosa +/+ transfectées avec le vecteur d expression de B4GALNT2, atteste que la surexpression du gène B4GALNT2 est directement associée à l apparition du marquage DBA. En conclusion de cette stratégie utilisée pour aider à déterminer FecL parmi les deux gènes du locus : - je n ai pas pu démontrer que la surexpression d IGF2BP1 au niveau ARNm était associée à la surexpression de la protéine dans les ovaires de brebis L/L, ni même à la modification de son niveau d activité de liaison aux ARNs par analyse de l expression de deux de ses cibles connues ; - à l inverse, la surexpression des ARNm de B4GALNT2 est à la fois associée à la présence de l enzyme et à une activité de glycosylation uniquement dans les cellules de granulosa L/L. Avec la présence du SNP g t>a susceptible d être la mutation causale dans son intron 7 et l effet d augmentation de l expression de 1000 fois de ses ARNm, ces dernières observations sont des arguments supplémentaires pour faire le choix du gène B4GALNT2 en tant que gène FecL. Ainsi, sur la base de ces éléments, j ai pris le parti de poursuivre mes investigations sur B4GALNT2 et son activité dans les ovaires des brebis FecL L, avec l hypothèse que les conséquences de sa surexpression ectopique dans l ovaire soient à l origine du mécanisme responsable de l augmentation du taux d ovulation qui caractérise les brebis Lacaune FecL L. 60

101 Figure 43. Analyse par Western Immunoblotting de l activité transférase de B4GALNT2 dans les cellules de granulosa et les liquides folliculaires de brebis Lacaune (Figure 6, Drouilhet- Mansanet et al., 2013) Des extraits protéiques de cellules de granulosa (50µg) et de liquide folliculaire (200µg) de gros follicules à antrum ont été précipités (P) par la lectine DBA couplée à des billes d agarose ou par l anticorps monoclonal KM694 couplé à la protéine A-sépharose. Les glycoprotéines purifiées obtenues ont été séparées par SDS-PAGE, transférées sur des membranes de nitrocellulose pour être révélées après un marquage (blotting, B) à l aide de la lectine DBA biotinylée ou de l anticorps monoclonal KM

102 IV. Conséquences cellulaires de l activité de glycosylation par B4GALNT2 Suite à ces premières observations, j ai engagé une étude plus approfondie des conséquences liées à la présence ectopique de B4GALNT2 dans les ovaires des brebis FecL L. Cette étude passe par l identification de la (des) protéine(s) cible(s) glycosylée(s) spécifiquement par B4GALNT2 et la recherche de son (leurs) rôle(s) possible(s) dans le développement folliculaire et l ovulation. A. Profils des cibles protéiques de l activité transférase Dans un premier temps, il fallait déterminer si le nombre de cibles affectées par B4GALNT2 était important ou réduit. Pour cela, j ai réalisé des précipitations d extraits protéiques, issus de cellules de granulosa et de liquides folliculaire +/+ et L/L en phase folliculaire du cycle, par la lectine DBA ou l anticorps KM694. L analyse de ces précipitations est réalisée par Western-blot (Figure 43; PE 15, p. 132). Ces expériences confirment la présence prépondérante de l activité de B4GALNT2 dans les extraits protéiques des brebis porteuses de la mutation FecL L. Que ce soit dans les cellules de granulosa ou les liquides folliculaires, au moins 7 formes de glycoprotéines, de poids moléculaires hétérogènes allant de 40 à plus de 250 kda, ont été retenues par la précipitation à la lectine DBA chez les brebis L/L et sont absentes des brebis non porteuses de la mutation. Il est possible de constater que l immuno-précipitation avec l anticorps KM694 des protéines contenues dans les liquides folliculaires des brebis L/L ne révèle qu une partie de ces glycoprotéines, avec les poids moléculaires les plus élevés. Cette observation confirme les résultats en histochimie qui laissaient penser à un profil de révélation différent entre la lectine DBA et l anticorps KM694. B. Purification et identification des glycoprotéines cibles de B4GALNT2 Etant donné que la lectine DBA donne un spectre plus large de reconnaissance des cibles et qu il est facilement possible de dissocier la lectine de ses cibles par simple addition de GalNac exogène, j ai choisi la lectine DBA comme moyen de purifier les cibles de B4GALNT2 dans les ovaires L/L, pour une identification ultérieure par spectrométrie de masse. Ainsi, à partir d un mélange de liquides folliculaires provenant de follicules préovulatoires issus d ovaires de plusieurs brebis +/+ ou L/L, j ai réalisé deux expériences indépendantes de purification par précipitation à la lectine DBA. Une fois précipitées, les glycoprotéines cibles sont éluées par addition de 200mM de GalNac. Après une courte séparation sur gel d acrylamide, les glycoprotéines éluées sont extraites du gel puis digérées 61

103 Tableau 6. Protéines purifiées par la lectine DBA dans les liquides folliculaires, identifiées par spectrométrie de masse (Tableau 2, Drouilhet-Mansanet et al., 2013) Identified proteins HUGO UniProt Theoretical Molecular gene symbol Acc.Number Weight (kda) Hemicentin-1 HMCN1 Q96RW7 613 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 LRP1 Q Versican VCAN P Coagulation factor V F5 Q Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 ITIH1 Q0VCM5 101 Heparan-sulfate 6-O-sulfotransferase 2 H6ST2 Q96MM7 69 Clusterin CLU P Inhibin, beta A INHBA P Glia-derived nexin (serpin peptidase inhibitor, clade E, member 2) SERPINE2 P Inhibin, alpha INHA P

104 par la trypsine. Les produits de digestion sont purifiés et séparés par nano-hplc et identifiés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution (MS/MS, Orbitrap, PE 16, p. 133). Ce travail d identification a été réalisé par la plateforme d'analyse Intégrative des Biomolécules du laboratoire PRC de Nouzilly. Pour l identification, nous avons choisi des critères très sélectifs, à savoir au moins 4 peptides indépendants identifiés par protéine et un seuil de probabilité élevé >95%. Ceci nous a permis d identifier, sur les deux répétitions de l expérimentation, 10 glycoprotéines uniquement présentes dans les liquides folliculaires FecL L, ainsi présumées comme les principaux substrats de l activité de B4GALNT2 (Tableau 6). Ces protéines identifiées ont des poids moléculaires variés, allant de 39 à 613 kda. Un certain nombre d entre elles fait partie de la matrice extracellulaire, comme le versican (VCAN), l inter-α trypsin inhibitor (heavy chain H1, ITIH1) et l hémicentine (HMNCN1). D autres participent au transport du cholestérol et son contrôle, comme le récepteur LRP1 et la clusterin (CLU). D autres encore, jouent un rôle dans l angiogénèse et la coagulation comme le facteur F5, l inhibiteur de sérine protéase SERPIN2 et la sulfotransferase HS6ST2. Enfin, INHA et INHBA sont les deux sousunités de l inhibine A, une hormone importante de la fonction de reproduction. En conclusion de cette étude, l activité ectopique de B4GALNT2 a pour conséquence cellulaire la glycosylation de protéines cibles de poids moléculaires variés dans les cellules de granulosa des brebis FecL L, qui s accumulent ensuite dans le liquide folliculaire. Avec l objectif d approfondir le rôle de B4GALNT2 dans les ovaires FecL L, j ai pu identifier par spectrométrie de masse les protéines cibles atypiques de son activité transférase, reconnues par la lectine DBA. Toutes peuvent intervenir dans la fonction du follicule ovarien (leur rôle est approfondi dans la partie discussion du manuscrit) que ce soit par le contrôle de l activité intra-folliculaire des hormones ou des facteurs de croissance et/ou par leur passage hors du follicule dans la circulation générale. Néanmoins, deux semblent particulièrement pertinentes: les sous-unités α (INHA) et βa (INHBA) de l inhibine, qui conduisent à la formation et à la production de l Activine A et de l Inhibine A [78], deux hormones importantes pour la régulation paracrine et endocrine de la fonction ovarienne et membres de la super-famille du TGFβ. J ai donc choisi ces deux sous-unités pour poursuivre l étude des conséquences liées à la présence ectopique de B4GALNT2 dans les ovaires des brebis FecL L. 62

105 Figure 44. Sous-unités α (INHA) et βa (INHBA) de l Inhibine précipitées par la DBA à partir des liquides folliculaires +/+ et L/L A et B) Représentation schématique des sous-unités α et βa respectivement. Les structures en branches représentent les sites de N-glycosylation. Après dimérisation des sous-unités (α-βa ou βa-βa), les formes matures (αc et βa) seront clivées du précurseur (pro-αn-αc et pro-βa) et formeront ainsi de l Inhibine A non glycosylée, mono-/di-/tri-glycosylées ou de l Activine A non-/mono-glycosylée. C) Les protéines issues de la précipitation DBA à partir de liquides folliculaires +/+ et L/L ont été analysées par western-blot à l aide d un anticorps anti-inha ou anti-inhba. * : bande indéterminée ; P : précipitation ; B : western-blot. 63

106 V. Conséquences physiologiques de FecL L : sur la piste de l Inhibine A/Activine A L inhibine A et l activine A sont produites par les cellules de la granulosa et sont accumulées à de fortes concentrations dans le liquide folliculaire. L Activine A est décrite pour agir principalement sur les cellules de granulosa et de la thèque via une signalisation auto/paracrine, alors que l inhibine A agit principalement sur la régulation de la sécrétion de la FSH par un rétro-contrôle négatif endocrine [78]. De surcroît, l Inhibine A exerce aussi une action bloquante sur l Activine A et sur les autres membres de la famille du TGFβ capables de réguler la stéroïdogenèse et la prolifération cellulaire dans l ovaire. Enfin, une immunisation contre l inhibine est à l origine d une augmentation du taux d ovulation et de la prolificité via la stimulation du développement folliculaire chez la brebis [ ], la chèvre [197, 198], la vache [199, 200] et la bufflonne [201]. Ces protéines représentent donc des candidates physiologiques évidentes pour expliquer l augmentation de la prolificité dans la population ovine Lacaune porteuse de la mutation FecL L. La première étape de cette étude était donc de confirmer les résultats de l identification par spectrométrie de masse par lectine-précipitation et western-blot. Ensuite, pour comprendre comment le système Inhibine A/Activine A pouvait être impliqué dans le mécanisme responsable de l augmentation du taux d ovulation qui caractérise les brebis Lacaune FecL L, j ai tenté de déterminer les conséquences de l activité transférase sur les profils qualitatifs et quantitatifs de l expression de l Inhibine A et de l Activine A au sein des ovaires L/L. A. Confirmation des sous-unités de l inhibine A comme cibles de B4GALNT2 J ai réitéré la précipitation par la lectine DBA à partir de liquides folliculaires +/+ et L/L pour réaliser une identification spécifique des sous-unités matures de l inhibine à l aide d anticorps par western-blot (PE 15, p. 132 et PE 13, p. 115). La Figure 44 confirme la détection des sous-unités α et βa de l inhibine comme cibles glycosylées de B4GALNT2 uniquement dans les liquides folliculaires des brebis FecL L. La sous-unité α détectée est présente à la fois sous la forme mature (αc ~ 19 kda) et précurseur (pro-αn-αc ~ 49, 52 kda) avec la présence d une bande inexpliquée à ~130 kda. La sous-unité βa n est observée que sous la forme précurseur (pro-βa) avec une forme majoritaire à ~ 54 kda. Les différences de poids moléculaires observées pour une même forme mature ou précurseur seraient dépendantes du statut de glycosylation sur les sites de N-glycosylation [202]. De la même 63

107 Figure 45. Expression des sous-unités α (INHA) et βa (INHBA) de l inhibine dans les cellules de granulosa de brebis Lacaune Les extraits protéiques issus de cellules de granulosa (CG) de gros follicules (LF) sains +/+ et L/L ont été analysés par western-blot à l aide des anticorps anti-inha (1:150) et anti-inhba (1:250). Pro-αN-αC et Pro-βa : formes précurseurs, αc et βa : formes matures des sous-unités. Figure 46. Etude de l expression des gènes codant les sous-unités de l inhibine A et B L ARN total de cellules de granulosa (GC) issu de petits (SF, 1-3mm) et de gros follicules (LF, 6mm) a été rétro-transcrit puis soumis à une amplification PCR en temps réel pour la quantification de l expression des gènes A) INHA, B) INHBA, C) INHBB. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM relative à l expression du gène de référence RPL19. L astérisque indique une différence significative entre les moyennes des brebis porteuses (+/+, n=11) et non porteuses (L/L= 9) homozygotes pour la mutation FecL L, avec ** : p<0,01 ; *** : p<0,

108 façon, l absence de site de N-glycosylation sur la forme mature ßa pourrait expliquer l absence de visualisation de cette forme après précipitation par la lectine DBA. B. Influence de FecL L sur l expression des gènes du système inhibine/activine La précipitation DBA a permis de révéler les sous-unités de l inhibine A glycosylées de façon atypique par B4GALNT2 dans les ovaires L/L. Cependant, ces sous-unités doivent être également exprimées dans les ovaires +/+. Afin de vérifier cette expression et observer un éventuel effet de FecL L sur l expression de ces sous-unités, j ai comparé les profils protéiques des sous-unités de l inhibine A par western-blot à partir de cellules de granulosa issues de follicules préovulatoires +/+ et L/L (PE 13, p. 130). La Figure 45 montre effectivement que les sous-unités α et βa sont exprimées par les granulosa +/+. Aucune différence d accumulation des proformes pro-αn-αc majoritaires de la sous-unité α n est observée entre les deux génotypes. Par contre, il apparaît une accumulation plus importante de la forme mature αc dans les granulosa L/L au détriment de la proforme α minoritaire d environ 52 kda. La forme précurseur pro-βa d environ 54 kda, quant à elle, apparaît plus surexprimée dans les granulosa L/L. In fine, il semblerait que le génotype FecL L affecte d une part la quantité de sous-unité βa et d autre part la qualité de la sous-unité α en favorisant l accumulation de la forme mature dans les cellules de granulosa. De façon à compléter l étude d expression, je me suis intéressée aux niveaux d ARNm des gènes INHA et INHBA codant les sous-unités α et βa de l inhibine A mais également aux autres gènes du système de signalisation activine/inhibine, à savoir : INHBB codant la sousunité βb de l inhibine à l origine de la formation d inhibine B et d activine B, et les récepteurs membranaires de type 1 (AVCR1), de type 2 (ACVR2) et de type 3 (TGFBR3). Cette analyse a été faite par PCR en temps réel à partir d ARN issus de cellules de granulosa des brebis +/+ et L/L (PE 12, p. 129). Comme attendu (Figure 46), les niveaux d expression des trois gènes codant les sous-unités de l inhibine A ou B augmentent significativement entre les petits et gros follicules au cours de la croissance folliculaire terminale (INHA et INHB : p< , INHBB : p<0,01). Aucune différence d expression n a été observée entre les deux génotypes pour les gènes INHA et INHBB, alors que l expression d INHBA semblerait (p=0,16) être plus importante dans les gros follicules FecL L par rapport aux brebis non porteuses de la mutation. Cette observation pourrait peut-être expliquer l accumulation plus importante de la sous-unité protéique INHBA dans les granulosa L/L (Figure 45). 64

109 Figure 47. Etude de l expression des gènes codant les récepteurs membranaires du système Inhibine/Activine L ARN total de cellules de granulosa (GC) issu de petits (SF, 1-3mm) et de gros follicules (LF, 6mm) a été rétro-transcrit puis soumis à une amplification PCR en temps réel pour la quantification de l expression des gènes A) ACVR1, B) ACVR2, C) TGFBR3. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM relative à l expression du gène de référence RPL19. L astérisque indique une différence significative entre les moyennes des brebis porteuses (+/+, n=11) et non porteuses (L/L= 9) homozygotes pour la mutation FecL L, avec * : p<0,05. 65

110 Concernant les récepteurs (Figure 47), l expression de ACVR1 n est affectée ni par le stade de développement terminal des follicules, ni par le génotype. Pour l expression de ACVR2, son niveau d expression tend à augmenter au cours de la croissance folliculaire chez les brebis +/+ (p= 0,16). Cependant, aucune différence entre les deux génotypes n est observée. Enfin, alors que le niveau d expression de TGFBR3 augmente significativement des petits aux gros follicules (p<0.05) chez les brebis +/+, il reste constant chez les brebis L/L et s avère être 3 fois moins important (p<0.05) dans les gros follicules L/L par rapport aux +/+. TGFBR3 est un co-récepteur de l inhibine et son expression réduite dans les follicules préovulatoires L/L pourrait donc moduler l activité biologique de l inhibine. C. Concentrations intra-folliculaire et plasmatique d inhibine A et d activine A L augmentation de l accumulation de INHBA et de la forme mature d INHA chez les brebis FecL L indique la possibilité d une production d inhibine A et/ou d activine A altérée chez les brebis mutées. Pour répondre à cette hypothèse, les concentrations d inhibine A et d activine A ont été déterminées dans les liquides folliculaires et le plasma par un dosage ELISA (PE 17, p. 135). Sur des échantillons prélevés en phase folliculaire du cycle œstrien chez des brebis +/+ et L/L, on observe une augmentation significative de la concentration d inhibine A intrafolliculaire au cours de la croissance folliculaire pour chacun des génotypes (p<0,0001, Figure 48). Cependant, cette concentration intra-folliculaire d inhibine A est 2 fois plus élevée (p<0,05) dans les petits follicules L/L par rapport aux +/+. Cette différence tend à se maintenir (p=0,14) dans les gros follicules. La concentration intra-folliculaire d activine A est aussi 2 fois plus élevée (p<0,05) dans les petits follicules L/L par rapport aux +/+. Mais alors que la concentration intra-folliculaire d activine A augmente des petits follicules aux follicules pré-ovulatoires +/+ (p<0,01), elle reste stable chez les brebis L/L et surtout tend à être inférieure (p=0,12) à la concentration trouvée dans les follicules +/+. De façon étonnante, les résultats du dosage plasmatique (Figure 49) mettent en évidence des concentrations d inhibine A circulante trois fois moins importantes (p<0,05) chez les brebis L/L par rapport aux brebis +/+, alors que les concentrations d Activine A circulantes sont similaires entre les deux génotypes. Dans le but de savoir si ces résultats observés en phase folliculaire, 36h après le retrait de l éponge de progestagène, sont également observés 65

111 Figure 48. Concentration intra-folliculaire d Inhibine A et d Activine A en phase folliculaire, 36h après le retrait de l éponge de progestagène, chez des brebis Lacaune Les liquides folliculaires collectés à partir des petits (+/+, n=30 ; L/L, n=28) et des gros follicules (+/+, n=13 ; L/L, n=20) 36h après le retrait de l éponge de FGA, ont été dosés par ELISA. Les données représentent les moyennes ± SEM. Les astérisques indiquent une différence significative, avec * : p<0,05 ; ** : p<0,01 ; **** : p<0,0001. Figure 49. Concentrations plasmatiques d inhibine A et d Activine A en phase folliculaire, 36h après le retrait de l éponge de progestagène, chez des brebis Lacaune Les plasmas des brebis Lacaune +/+ (n=5) et L/L (n=5), 36h après le retrait de l éponge de FGA, ont été dosés par ELISA. Les données représentent les moyennes ± SEM. L astérisque indique une différence significative entre les moyennes des brebis non porteuses (+/+) et porteuses homozygotes (L/L) de la mutation FecL L, avec * : p<0,05. 65

112 Figure 50. Evolution des concentrations plasmatiques d E2, LH, FSH, P4 et Inhibine A au cours d un cycle oestrien synchronisé chez des brebis Lacaune +/+ et L/L 66

113 tout au long du cycle, j ai analysé les échantillons sanguins collectés au cours de la thèse de L. Drouilhet. Ces échantillons avaient permis d établir les profils endocriniens de Progestérone (P4), d Œstradiol (E2), de FSH et de LH mesurés au cours d un cycle oestrien chez des brebis Lacaune +/+ et L/L [178]. De façon à faciliter l interprétation des profils, j ai présenté les résultats de dosages plasmatiques de l inhibine A (Figure 50) en regard des autres profils hormonaux (P4, E2, FSH et LH) calés sur le moment du pic de LH. Les résultats des dosages plasmatiques d activine A sont en cours d analyse. Ainsi, chez les brebis +/+, les concentrations plasmatiques d inhibine A sont constantes en phase folliculaire et présentent ensuite un pic lors de la décharge ovulante de LH. A 28h après le pic de LH, en début de phase lutéale, les concentrations d inhibine A augmentent alors significativement (p<0,05) jusqu à 60h pour enfin retrouver leurs niveaux initiaux la deuxième moitié de la phase lutéale. Chez les brebis L/L les concentrations d inhibine sont similaires tout au long du cycle oestrien et restent significativement 3 fois moins importantes que celles des brebis +/+ (p<0.05). Etonnamment, la concentration circulante 3 fois moins importante d inhibine A chez les brebis L/L n a aucun impact sur les profils endocriniens de l axe reproductif, notamment sur ceux de FSH (Figure 50). Pourtant le rôle de régulateur négatif de l inhibine sur cette gonadotropine est bien établi et l on pourrait donc s attendre à une concentration circulante de FSH plus élevée chez les brebis L/L. RECAPITULATIF «APPROCHES FONCTIONNELLES ET PHYSIOLOGIQUES» Par la stratégie d étude des protéines codées par les deux gènes candidats du locus FecL et de leurs effets, j ai pu montrer que l expression ectopique des ARNm de B4GALNT2 dans les ovaires de brebis L/L s accompagnait d une surexpression de la protéine et de l apparition d une activité de glycosylation spécifique. Au contraire, pour IGF2BP1, je n ai pas pu prouver que la surexpression des ARNm était suivie de conséquences fonctionnelles dans les ovaires L/L. Ainsi, il apparaît raisonnable de penser que B4GALNT2 puisse être le gène FecL et que sa surexpression sous influence de FecL L soit à l origine du mécanisme conduisant à la polyovulation. Dans le but de décortiquer ce mécanisme physiologique conduisant à la polyovulation, j ai identifié les protéines susceptibles d être les cibles de la glycosylation atypique par B4GALNT2. Parmi ces cibles, j ai choisi les sous-unités de l inhibine A comme les meilleures candidates physiologiques. Il apparaît que la glycosylation par B4GALNT2 puisse 66

114 être à l origine d une production favorisée du peptide mature de la sous-unité INHA et du propeptide INHBA. Ceci aurait pour conséquence une augmentation des concentrations intrafolliculaires d inhibine A et d activine A dans les petits follicules, qui se poursuit dans les follicules pré-ovulatoires pour l inhibine A mais pas pour l activine A. Trente-six heures après le retrait de l éponge de progestagènes, la production ovarienne d activine A plus élevée chez les brebis L/L ne se répercute pas au niveau plasmatique, où les concentrations circulantes d activine A sont similaires à celles des brebis +/+. De façon étonnante, l augmentation de production ovarienne de l inhibine A chez les brebis L/L ne se retrouve pas au niveau plasmatique, et au contraire les concentrations circulantes d inhibine A sont 3 fois plus faibles que celles des brebis +/+ tout au long du cycle œstrien. Ceci n ayant pas de répercussion sur les concentrations circulantes de FSH, j imagine que la glycosylation atypique de l inhibine A altère sa biodisponibilité (rétention dans les liquides folliculaires) et /ou sa bioactivité, modifiant son rôle paracrine ou endocrine. En conclusion de ces résultats, j ai réuni plusieurs arguments en faveur de l implication du système Inhibine/Activine A dans le mécanisme responsable de l augmentation du taux d ovulation qui caractérise les brebis Lacaune FecL L. De façon surprenante par rapport aux conclusions de l analyse génétique, le système TGFβ/BMP semble encore une fois au cœur de la régulation du taux d ovulation 67

115 DISCUSSION 68

116 I. Caractérisation du locus FecL Afin de réduire la zone de localisation de FecL au maximum et isoler à coup sûr la mutation causale, nous avons développé un séquençage systématique à haut débit du locus avec la technologie de pyroséquençage Roche 454 sur des animaux précautionneusement choisis. Associée au recouvrement complet du locus par le chevauchement de longs fragments PCR (environ 10kb), cette méthode a déjà permis de détecter avec succès les variations dans le locus renfermant les gènes suppresseurs de tumeurs BRCA1/BRCA2 dans le cas de cancer du sein et /ou de l ovaire chez l humain [203]. Dans le cadre de sa thèse, L. Drouilhet avait été confrontée à des biais de détection des polymorphismes, notamment des SNPs, lors du séquençage de l animal L/+. En théorie, le séquençage 454 permet la mise en évidence de polymorphismes par la représentation allélique dans la profondeur de lecture. En séquençant un animal L/+, la représentation allélique attendue était de 50/50 dans une profondeur théorique de 80 lectures pour le même nucléotide. Or dans ce cas, la représentation allélique de certains polymorphismes était biaisée par des lectures non-indépendantes (commençant à la même base) et des problèmes d amplification majoritaire d un allèle au détriment de l autre lors de la PCR. Les lectures non-indépendantes sont un biais maintenant connu du séquençage 454 [204]. Les déséquilibres alléliques lors de la PCR ont été attribués à la présence de polymorphismes dans les zones d hybridation des amorces. Nous nous sommes donc affranchis de ces biais en utilisant des séquences L/L et +/+ indépendantes. Le séquençage 454 de ces deux animaux homozygotes au locus n a pas été complétement efficace puisqu il n a pas permis à lui seul d obtenir la totalité de la séquence du locus de 250kb. En effet des «trous» subsistaient dans la séquence. Pour la plupart, ces trous de séquence correspondaient d ailleurs à ceux observés avec le séquençage de l animal L/+. L explication pourrait venir du fait de certains fragments de PCR pas assez représentés dans la banque de séquençage et/ou d un problème d assemblage de novo des séquences par rapport à la séquence de référence ovine, en particulier si elles sont constituées de zones répétées. Par conséquent, nous avons dû réaliser un séquençage Sanger de ces trous pour compléter en totalité la séquence du locus. Une fois le séquençage complété, l étude comparative des deux séquences a permis d identifier une centaine de polymorphismes dans le locus de 250kb. Certains de ces polymorphismes avaient déjà été détectés par le séquençage de la brebis L/+, mais j ai pu en détecter des nouveaux par le fait que les chromosomes + de la brebis +/+ étaient différents du chromosome + de la brebis L/+, et par les compléments de séquence apportés. Dans un 69

117 premier temps, afin de réduire le locus, j ai réalisé le génotypage de brebis dites «recombinantes» présentant des chromosomes + et L recombinés dans le locus. A l aide d une sous-sélection appropriée des polymorphismes détectés dans les zones d incertitude (préalablement établies par L. Drouilhet) des animaux recombinants j ai pu réduire la zone de localisation de FecL sur OAR11 entre les SNP g t>c et g g>c, soit un intervalle de 197,4kb d après les coordonnées de la dernière version disponible de l assemblage du génome ovin (OARv3.1). Cependant, grâce à notre séquençage complet, nous savons qu en réalité cet intervalle ne fait que 194,6kb. Par rapport à la séquence de référence nous avons complété des zones indéterminées (remplacées par des N) et résolu en particulier l architecture des zones répétées qui étaient faussement assemblées avec des répétitions en tandem. Dans cet intervalle de localisation minimal pour FecL, la version 3.1 du génome de référence ovin indique seulement 3 gènes susceptibles de coder des protéines : B4GALNT2 (β- 1,4-N-acetyl galactosaminyl transferase 2), IGF2BP1 (Insuline Like Growth Factor 2 mrna binding protein 1) et EZR (Ezrine). Nos analyses de séquence et d expression indiquent que seuls IGF2BP1 et B4GALNT2 peuvent être considérés comme les gènes candidats positionnels pour FecL. En effet, il apparaît que l annotation EZR sur OAR11 correspond à un pseudogène épissé à partir du vrai gène EZR situé sur OAR8. Toutefois, afin d être totalement affirmatif, il faudrait confirmer cela par un test d expression de pseudo-ezr dans le fond génétique FecL L et vérifier que celui-ci ne subit pas la surexpression observée au sein du locus minimal FecL pour IGF2BP1 et B4GALNT2. L analyse du locus FecL de 194,6kb indique la présence de 49 polymorphismes. Comme j ai obtenu la séquence complète du locus, la mutation FecL L est forcément l un de ces polymorphismes. Pour le déterminer, nous avons réalisé l étude du partage allélique des polymorphismes localisés dans cet intervalle et nous avons identifié 2 SNPs, g t>a et g a>g, en total déséquilibre de liaison avec la mutation FecL L. Le SNP g t>a est localisé dans l intron 7 de B4GALNT2. Il correspond au SNP mis en évidence par L. Drouilhet au cours de sa thèse. Le second SNP g a>g se situe dans la séquence intergénique séparant B4GALNT2 et IGF2BP1, enrichie d éléments répétés LINEs (Long Interspersed Elements) et SINEs (Short Interspersed Elements), sans qu il se retrouve pour autant dans l un de ces éléments. Il a été découvert par séquençage Sanger dans un de ces trous de séquence non résolu par le séquençage 454 à cause de ses séquences répétées. Sur l ensemble des animaux génotypés pour le partage allélique, les 70

118 allèles prolifiques ou non prolifiques de ces deux SNP ségrègent toujours ensemble, ils constituent donc tous les deux l haplotype causal FecL L. D un point de vue purement génétique, le travail de localisation et d identification de FecL L est arrivé à son terme avec le dispositif expérimental Lacaune. En effet, nous connaissons tous les polymorphismes dont les SNPs causaux et la réduction de l intervalle n est plus possible compte-tenu des animaux recombinants du dispositif que nous connaissons dans cette zone. Pour espérer aller plus loin, il faudrait disposer de nouveaux animaux dont le chromosome L recombine dans l intervalle et en particulier entre les deux SNPs distants de seulement 96kb. La probabilité de trouver de tels animaux est estimée à 1/1000, ce qui nécessiterait de génotyper un grand nombre d animaux prélevés dans de nombreux élevages en France. Cependant, avec l haplotype causal, nous avons les outils génétiques parfaits pour la sélection génétique assistée par marqueurs de la prolificité en race Lacaune. Nous avons développé en particulier un test de génotypage rapide sur le SNP g t>a de l intron 7 de B4GALNT2. Ce test est en cours de diffusion aux professionnels de la filière Lacaune- Viande en remplacement du marqueur DLX3:c.*803A>G actuellement utilisé [53]. Les résultats du génotypage futur nous permettront peut-être d identifier des animaux intéressants. Très récemment, nous avons également mis en évidence la ségrégation de FecL L associée à la prolificité dans d autres populations ovines, Noire du Velay en France, Sakiz et Karya en Turquie. Il semble que ces populations soient porteuses d un haplotype FecL différent et offrent des opportunités de recombinaisons supplémentaires dans le locus pour tenter de le réduire et peut-être de discriminer entre les deux SNP. II. Mécanisme d action moléculaire de la mutation FecL L L identification de ces deux SNPs candidats à la mutation causale dans des régions noncodantes constitue un résultat original, différent de ce qui a pu être décrit pour les autres mutations influençant le nombre d ovulations. En effet, comme nous avons pu le voir dans la partie introductive, toutes les mutations identifiées altèrent la séquence codante des gènes BMP15, GDF9 et BMPR1B et sont à l origine d une perte de fonction de la protéine associée [10]. Dans le cas de FecL L, les conséquences de sa présence sont une altération de l expression génique. En effet, l analyse d expression par PCR en temps réel des deux gènes candidats positionnels pour FecL a mis en évidence qu à la fois IGF2BP1 et B4GALNT2 étaient significativement altérés par FecL L de manière spécifique dans les cellules ovariennes, suggérant en conséquence une régulation tissu-spécifique par la mutation. Cette régulation est 71

119 Figure 51. Représentation schématique des constructions nécessaires à l essai rapporteur luciférase Les fragments d une centaine de paires de base comportant soit le SNP g (rectangle rouge) soit g (rectangle violet), sous la forme sauvage (+) ou prolifique (L) sont placés en amont de la zone promotrice efficace de B4GALNT2 ou d IGF2BP1 (rectangle rouge clair). Les inserts produits sont ensuite clonés dans un vecteur leur permettant de contrôler l expression du gène de la luciférase (rectangle vert). 72

120 spécifique de ces deux gènes, puisqu aucune différence d expression n a été observée pour les gènes jouxtant le locus minimal, confortant ainsi les résultats de cartographie fine obtenus. Pour comprendre par quel(s) mécanisme(s) moléculaire(s) les polymorphismes causaux régulent l expression de ces gènes candidats positionnels et expressionnels et accessoirement pour discriminer entre les deux par des approches fonctionnelles, j ai émis deux hypothèses basées soit sur une action de facteurs transcriptionnels, soit sur une action des mécanismes de méthylation. Sous l hypothèse que les deux SNP causaux (ou l un des deux) identifiés dans le locus FecL puissent être responsables d une perte ou d un gain de fixation de facteurs protéiques régulant la transcription des gènes IGF2BP1 et B4GALNT2 du locus FecL, j ai recherché in silico si des facteurs de transcription étaient capables de fixer les sites sur lesquels se positionnaient les SNPs. Néanmoins, dans aucune des banques de données interrogées nous n avons pu identifier de séquence consensus de liaison à des facteurs de transcription connus au niveau de ces sites. D un point de vue fonctionnel, les retards sur gels effectués à partir d extraits nucléaires de cellules de granulosa +/+ ont seulement permis de mettre en évidence des fixations non spécifiques aux sondes SNP sans différentiel entre les génotypes. En conclusion, je n ai pas obtenu de réponse permettant de vérifier cette hypothèse. Toutefois, il est encore possible d optimiser les conditions de liaison des protéines à l ADN dans le protocole d EMSA. A titre d exemple, l ajout de fortes concentrations de protéines aspécifiques comme l albumine de sérum bovin (BSA), est décrite pour promouvoir de 5 à 20 fois la formation de complexes ADN-protéines [205, 206]. Une alternative serait de mettre en place un test de fonctionnalité in vitro reposant sur la comparaison des effets liés à la présence des SNPs sur l activité promotrice de B4GALNT2 et/ou d IGF2BP1 pilotant le gène rapporteur de la luciférase (Figure 51). Les différentes combinaisons de vecteurs produits seraient ensuite transfectées dans des cellules de granulosa +/+ pour contrôler et comparer leur fonctionnalité par mesure de l activité luciférase. L expression du gène B4GALNT2 est soumise à différents modes de régulation passant par des modifications en région 5 du gène [189, 207]. De façon intéressante, des études sur le cancer gastro-intestinal chez l homme ont montré que l expression de B4GALNT2 dans les cellules intestinales était dépendante du profil de méthylation de son promoteur [189, 208]. Le locus FecL pourrait donc être soumis à la méthylation. Ainsi, dans le but de savoir au préalable si la méthylation pouvait être un moteur de la régulation du locus FecL, j ai d abord induit une hypométhylation in vitro du génome des cellules de granulosa +/+ au moyen de 72

121 l AZDC. L analyse de l expression des gènes candidats du locus (B4GALNT2 et IGF2BP1) et avoisinant le locus (GNGT2, ABI3 et PHOSPHO1) par PCR en temps réel a mis en évidence que seule l expression de B4GALNT2 augmente de façon AZDC dose dépendante. Cependant, cette faible induction de B4GALNT2 observée in vitro est sans rapport avec la surexpression in vivo de 1000 fois observée dans les ovaires de brebis L/L par rapport aux +/+. J ai quand même choisi de cibler les séquences susceptibles d être méthylées, à savoir les îlots CpG, souvent présents dans les régions régulatrices des gènes. Je me suis plus particulièrement focalisée sur l étude des deux îlots CpG présents à proximité de l exon 1 de B4GALNT2. Au moyen d une première approche de «séquençage Bisulfite» de la zone à partir d ADN de cellules de granulosa +/+ et L/L, il apparaît que ces îlots ne sont pas méthylés, ni dans un génotype ni dans l autre. Une seconde approche par «Digestion enzymatique méthylsensible» a confirmé ces résultats. En conclusion, il semblerait que le différentiel d expression de B4GALNT2 entre les cellules de granulosa +/+ et L/L ne soit pas en relation avec une altération des profils de méthylation au niveau des îlots CpG en amont de son premier exon. Toutefois ces résultats ne suffisent pas à conclure sur l implication de la méthylation dans la régulation du locus FecL puisqu il existe encore d autres îlots et sites CpG putatifs à étudier dans cet intervalle. Une perspective pourrait être une étude globale du méthylome de l ADN génomique issu de cellules de granulosa +/+ et L/L préalablement converti au Bisulfite puis analysé par séquençage à haut débit au moyen de la technologie Illumina HiSeq Après la reconstruction des séquences pour chacun des génotypes, il serait possible de cibler le locus FecL et d observer les différences de conversion entre les deux génotypes dans cet intervalle. Enfin, d après un certain nombre d études, la suppression ou l ajout d un dinucléotide CpG, cible préférentielle de la méthylation de l ADN, pourrait être un mécanisme potentiel par lequel des SNPs peuvent affecter la fonction des gènes [209, 210]. Ling et al. par exemple, ont montré que le SNP proche du gène NDUFB6 impliqué dans la phosphorylation oxydative dans les muscles, introduisait un site CpG. L introduction de ce CpG-SNP est associée à une augmentation de la méthylation de l ADN, une diminution de l expression de NDUFB6 et, au niveau phénotypique, à une résistance à l insuline et l apparition de diabètes de type 2 chez certains individus âgés [211]. Enfin, les travaux de Taqi et al. suggèrent que l introduction de CpG-SNPs peut affecter l expression de gènes cibles en modulant leur liaison avec certaines protéines. Dans notre étude, seul le SNP g serait susceptible 73

122 de créer un site CpG puisqu il convertit une adénine en guanine (A>G) en amont d une cytosine. J ai souhaité savoir si ce SNP coïncidait avec des marques épigénétiques à l aide de la base de données ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements, Cependant, il se trouve dans une région hautement répétée (LINEs, SINEs) dont la séquence n est conservée chez aucune autre espèce de mammifères, et de ce fait, rend impossible l utilisation de l outil ENCODE. Néanmoins, si la surexpression des gènes du locus dans les ovaires de brebis L/L est en relation avec ce CpG- SNP putatif, et disposant d ADN +/+ et L/L traités au bisulfite, nous pourrions vérifier son état de méthylation par séquençage d un fragment PCR dans lequel il est situé. Au cours de la thèse de L. Drouilhet, deux autres hypothèses avaient été posées. Elles concernaient toutes les deux le SNP g t>a localisé dans l intron 7 de B4GALNT2. La première reposait sur la base des travaux de Montiel et al. en 2003, montrant l existence de transcrits alternatifs du gène B4GALNT2 dans différents tissus humains [190]. La position intronique du SNP g t>a affecterait un épissage alternatif du gène et générerait ainsi une forme d ARNm de B4GALNT2 plus abondante chez les brebis L/L. Toutefois, au cours de sa thèse, L. Drouilhet n a mis en évidence aucun épissage alternatif des exons 7, 8, 9 ou 10 entre les ARNm L/L et +/+. La seconde hypothèse provenait d une analyse bioinformatique de recherche de sites d interaction de microarn par le logiciel PATROCLE ( [212, 213]. Pour le phénotype d hypermuscularité observé en race ovine Texel [214], la mutation causale dans la partie 3 UTR du gène GDF8 (qui code la myostatine) crée un site de fixation pour les microarn Mir1 et Mir206, dont la conséquence directe est une altération de l expression de GDF8. L hypothèse sous-jacente était donc que les SNPs candidats puissent moduler l expression des gènes du locus en altérant l interaction avec des microarn. Ainsi, L. Drouilhet a montré in silico que le SNP g t>a crée un motif GTGTGAGA chez les animaux FecL L qui correspond à un site de fixation pour le microarn Mir342, conservé entre humain (HSA14) et bovin (BTA21). Néanmoins, nous n avons aucune preuve que Mir342 soit présent dans les cellules ovariennes ovines, si ce n est l expression du transcrit pré-miarn du gène hôte EVL1 (similar to Enah/Vasp-like isoform 1) déterminée par une étude transciptomique (données non publiées, Gwenola Tosser-Klopp). Une RT-PCR en temps réel à partir d une préparation spécifique de petits ARN issus de cellules de granulosa +/+ et L/L permettrait de détecter sa présence. Cependant, l action des microarn est décrite pour conduire au silencing des gènes en se liant aux régions 3 UTR non traduites des ARNm 74

123 matures cibles et en s associant par la suite avec différents complexes de protéines cytoplasmiques qui conduisent soit à la dégradation du transcrit cible, soit à la répression de sa traduction [215, 216]. Or, dans le cas du gène FecL, le site créé est intronique et le taux de transcrit est augmenté. Ainsi, si l hypothèse de la fixation d un microarn est correcte, le mode de fonctionnement et l interaction entre le microarn et l ARNm de B4GALNT2 reste à découvrir et à démontrer. Une perspective serait de réaliser un knock-down, ou perte de fonction, pour tester les effets de Mir342 sur l expression de B4GALNT2. Cette technique a déjà fait ses preuves in vitro pour déterminer le rôle du miarn 21 dans l apoptose des cellules de granulosa murine [217, 218] et celui du miarn26b dans l atrésie des cellules de granulosa porcine [219]. Malgré le travail réalisé au cours de cette thèse, le statut causal des SNPs g t>a et/ou g a>g ainsi que leur capacité à réguler à distance l expression des ARNm de B4GALNT2 et d IGF2BP1 spécifiquement dans les cellules ovariennes restent encore à déterminer. Ni les travaux de cartographie fine (animaux recombinants) ni les expérimentations menées sur le mécanisme d action de FecL L n ont permis de désigner un des deux gènes comme étant le gène majeur de prolificité FecL et un des deux SNPs comme étant la mutation causale associée. III. Les gènes candidats pour FecL L allèle prolifique FecL L a été clairement associé à la surexpression ectopique de l ARNm de B4GALNT2 dans les cellules de la granulosa et de la thèque des follicules à antrum et dans une moindre mesure à la surexpression de l ARNm d IGF2BP1 dans les cellules de granulosa. Alors que l expression d IGF2BP1 est cohérente avec celle observée dans les ovaires murin et humain [220], l expression de B4GALNT2 n avait jamais été démontrée dans les ovaires jusqu à présent. Par contre la surexpression ectopique de B4GALNT2 dans un tissu qui n est pas censé l exprimer est la base moléculaire du mécanisme d action du locus Mvwf, qui affecte la clairance plasmatique du facteur von Willebrand (VWF), créant ainsi des troubles de la coagulation chez les souris RIII/J [221]. Dans ce modèle, l expression du gène B4galnt2 est permutée des cellules de l épithélium intestinal aux cellules de l endothélium vasculaire. Cette expression ectopique dans l endothélium conduit à la glycosylation atypique du VWF et une diminution de près de 20% de son niveau dans le plasma des souris RIIIS/J, une caractéristique du phénotype de la pathologie humaine de Von Willebrand de type 1. La 75

124 région génomique responsable du changement de régulation du locus Mvwf se situe dans un intervalle de 30 kb en amont du gène B4galnt2. Or, dans notre étude, le SNP causal g a>g se situe à 42 kb en amont de B4GALNT2, mais dans une région non conservée entre la souris et l ovin [222]. Pour les deux gènes IGF2BP1 et B4GALNT2, la différence d expression est spécifique du locus, puisqu aucune différence d expression n a été observée pour les gènes jouxtant le locus minimal, confortant ainsi les résultats de cartographie fine obtenus. Cette différence d expression observée entre follicules +/+ et L/L d une même classe de taille ne peut pas être attribuée à l existence d une différence de maturité des follicules, comme il a déjà été décrit pour le phénotype d hyperporlificité associé à la mutation Booroola [223]. En effet, les niveaux d expression de B4GALNT2 et d IGF2BP1 dans les cellules de granulosa ne sont pas différents entre les petits et les gros follicules à antrum, qui pourtant se trouvent à des degrés de maturité différents comme en atteste l expression des marqueurs LHCGR, INHA, CYP19A1, CYP11A1, étudiés au cours de la thèse de L. Drouilhet [178], ou encore C-MYC dans mon étude. Afin d orienter le choix d un des deux gènes et ainsi aider à la découverte de FecL, une approche reposant sur la caractérisation des protéines codées par chacun des gènes candidats du locus et de leur activité au sein d ovaires +/+ et L/L a été menée en parallèle de la stratégie génétique. A. IGF2BP1 peut-il être le gène FecL? Pour savoir si la régulation au niveau ARN est suivie d une régulation au niveau protéique, j ai cherché à localiser IGF2BP1 sur des coupes d ovaires +/+ et L/L par immunohistochimie. J ai ainsi pu mettre en évidence qu IGF2BP1 était présente de façon ubiquiste dans les ovaires de brebis, sans profil différentiel entre les deux génotypes en particulier au niveau des cellules de granulosa et de la thèque. Bien qu IGF2BP1 soit retrouvée, dans une moindre mesure, dans les cellules de granulosa des follicules en croissance chez la souris et l homme, les travaux de Hammer et al., en 2005 montrent qu IGF2BP1 est également localisée dans le cytoplasme des ovocytes quiescents et en croissance [220]. Cette observation n est pas surprenante au vu des études menées au laboratoire LGC de Toulouse par A. Bonnet sur le transcriptome des cellules de granulosa et des ovocytes chez l ovin [180] qui révèlent qu IGF2BP1 serait un marqueur des ovocytes primordiaux chez l agnelle. Cependant, je n ai jamais observé de marquage lié à l expression d IGF2BP1 dans les ovocytes des follicules 76

125 présents sur les coupes d ovaire adulte. Pour mettre en évidence un possible différentiel d expression entre les génotypes +/+ et L/L, j ai également réalisé une analyse par westernblot. Cependant, l anticorps utilisé en immunohistochimie reconnaissant les protéines natives ne s est pas avéré efficace pour cette technique basée sur la reconnaissance de protéines dénaturées. D un point de vue fonctionnel, la surexpression d IGF2BP1 est plus généralement associée à des dérégulations de la prolifération cellulaire dépendants de l expression de MYC [224] et est observée en particulier dans le cas de carcinomes ovariens [225]. Grâce à des motifs de reconnaissance et de liaison aux ARNs, IGF2BP1 régule la traduction de MYC en stabilisant ses ARNm [226], mais il promeut également la traduction des nombreux autres gènes tels qu IGF2 et β-actine (ACTB) en se liant à leur ARNm [227]. De façon intéressante, ces cibles connues d IGF2BP1 jouent un rôle important dans la fonction ovarienne. IGF2 est exprimée dans les cellules de la thèque [228, 229] et se retrouve présente dans les liquides folliculaires [230]. Elle participe à la maturation des follicules [231] en stimulant la prolifération et la différenciation des cellules de la granulosa ainsi que la stéroïdogénèse [232, 233]. De façon intéressante, dans des cas pathologiques où la réserve ovarienne est fortement diminuée, une insuffisance intraovarienne d IGF2 contribue à une plus faible stéroïdogénèse et une diminution des capacités de reproduction [234]. Par ailleurs, l actine (ACTB) est associée aux changements morphologiques des cellules de la granulosa tout au long de la croissance folliculaire des petits aux gros follicules à antrum [235], ce qui par conséquent affecte la synthèse des stéroïdes et la prolifération des cellules [236]. Enfin, MYC participe au contrôle de la prolifération des cellules de la granulosa en réponse aux gonadotropines et à l insuline [ ]. Néanmoins, nos études menées sur l ARNm de MYC ou sur l accumulation de l ACTB mettent en évidence que la surexpression d environ 6 fois d IGF2BP1 n est pas associée à une altération de l expression de ces cibles connues dans les cellules de granulosa des ovaires L/L. Cette observation n est pas surprenante puisque la surexpression d IGF2BP1 ne semble pas s être répercutée sur l accumulation de la protéine correspondante. Cependant, il est possible que la différence observée entre le niveau d expression de l ARNm et celui de la protéine puisse s expliquer par la forte sensibilité qu offre la PCR en temps réel par rapport à une immunohistochimie. D autre part, je n ai observé que deux cibles de l action d IGF2BP1, d autres sont peut-être à étudier, en particulier dans l ovocyte. Néanmoins, nous n avons pas de preuve biologique que la surexpression d IGF2BP1 puisse jouer un rôle quelconque dans l ovaire des brebis FecL L. 77

126 Figure 52. Principe de la stratégie d identification des carbohydrates synthétisés par B4GALNT2, par spectrométrie de masse. 78

127 Ainsi, sur la base des résultats acquis au cours cette thèse, bien qu IGF2BP1 soit un candidat génétique pour FecL, il ne semble pas représenter pas un candidat fonctionnel. B. B4GALNT2, le nouveau gène de prolificité FecL 1. Les arguments expérimentaux De la même façon que pour IGF2BP1, j ai cherché à localiser la protéine B4GALNT2 dans les ovaires de brebis +/+ et L/L. Mais à l inverse, la forte surexpression de l ARNm de B4GALNT2 observée dans les ovaires L/L se répercute au niveau protéique et ce, principalement dans les cellules de la granulosa comme le montrent les expériences d immunohistochimies. Mais là non plus, je n ai pas pu valider les résultats par une analyse complémentaire en western-blot qui aurait permis une meilleure quantification de la surexpression. B4GALNT2 est impliquée dans la synthèse de l antigène Sd(a) sur des protéines cibles variées [241] grâce au transfert d un résidu GalNAc terminal, spécifiquement reconnu par la lectine DBA [221] et l anticorps KM694 [208, 242]. Ainsi, après vérification que la surexpression in vitro de B4GALNT2 était responsable du marquage par la lectine DBA, nous avons pu mettre en évidence par lectine-/immuno-histochimie et western-blot, que l activité GalNac transferase se retrouvait exclusivement dans les cellules de granulosa des ovaires FecL L et que les cibles glycosylées par B4GALNT2 pouvaient être sécrétées dans les liquides folliculaires des brebis mutantes. Ce résultat est crucial, puisqu il démontre la présence d une activité spécifique de B4GALNT2 uniquement chez les brebis prolifiques FecL L. Cependant, que ce soit en histochimie ou en western-blot, il y a une discordance des profils des cibles révélés par la lectine DBA et l anticorps KM694 qui pourrait être expliquée par la spécificité de reconnaissance stricte de l antigène Sd(a) par l anticorps KM694 et d un plus large spectre de résidu GalNac terminaux par la lectine DBA. Cette observation me conduit à penser que B4GALNT2, dans notre modèle, créerait d autres épitopes différents de l antigène Sd(a). Pour vérifier cette hypothèse, des études de glycobiologie doivent être engagées. Après une précipitation par la lectine DBA des glycoprotéines issues de liquide folliculaire L/L, une digestion enzymatique au moyen de la Peptide -N-Glycosidase F (PNGase F) permettrait de libérer les chaines sucrées N-liées des glycoprotéines qui les portent (Figure 52). L ajout en excès de GalNAc permettrait par compétition de libérer les chaines sucrées qui pourraient être analysées par spectrométrie de masse [ ]. 78

128 Au regard de mes résultats, je soutiens que B4GALNT2 est le gène FecL et que la glycosylation atypique des protéines dans les cellules de granulosa des brebis FecL L est ainsi à la base du mécanisme conduisant à l augmentation du taux d ovulation qui caractérise les brebis Lacaune FecL L. Cette hypothèse est étayée par des études réalisées sur des modèles de souris transgéniques qui soulignent l importance de la glycosylation dans le contrôle de la fonction ovarienne. Williams et al. ont notamment mis en évidence qu une invalidation de la N-acetylglucosaminyltransferase-1 (GlcNAcT-1) conduit à une folliculogenèse anormale et une diminution du taux d ovulation [246]. Au contraire, l invalidation de la beta1,3- galactosyltransferase se traduit par une augmentation de la prolificité via la maturation et l ovulation d un plus grand nombre de follicules (30 à 50%) [247]. Quant aux femelles invalidées pour ces deux transférases, elles présentent en premier lieu une fertilité normale, puis une fonction ovarienne qui décline rapidement dès l âge de 3 mois avec l absence de développement folliculaire, des concentrations sanguines de testostérone et d inhibine A très réduites et de FSH très élevées caractéristiques d une insuffisance ovarienne précoce [248]. 2. Les protéines cibles de B4GALNT2 Pour tenter d aller plus loin dans mon affirmation, j ai choisi la lectine DBA comme moyen de purifier les cibles de B4GALNT2 dans les ovaires L/L et de les identifier par spectrométrie de masse. J ai ainsi pu mettre en évidence 10 glycoprotéines uniquement présentes dans les liquides folliculaires FecL L, ainsi présumées comme les principaux substrats de l activité de B4GALNT2. Les protéines identifiées ont des poids moléculaires variés, allant de 39 à 613 kda (ce qui confirme les observations en western-blot) et sont pour la plupart, connues pour intervenir dans la fonction ovarienne : - Le versican (VCAN) et l inter-α trypsin inhibitor (heavy chain H1, ITIH1) sont des protéines de la matrice extracellulaire impliquées dans de nombreux processus du développement folliculaire, tels que la formation de l antrum, du liquide folliculaire et du gradient osmotique, l expansion du cumulus, l ovulation, la régulation des facteurs de croissance et le remaniement structural des follicules au cours de la folliculogenèse [ ]. Une étude récente a notamment mis en évidence que la surexpression et l état de glycosylation de VCAN pouvaient être associés à des cas de cancers ovariens [ ]. - Le facteur de coagulation F5, l inhibiteur de sérine protéase SERPIN2 et la sulfotransferase HS6ST2 sont d importants régulateurs de l angiogenèse, la réponse immunitaire, la coagulation et la fibrinolyse. Ils contrôlent l activité de l antithrombine, le 79

129 plasminogène ou encore le fibrinogène présents dans le liquide folliculaire [ ]. Certaines études ont notamment mis en évidence que les serine protéases et leurs inhibiteurs pouvaient moduler la maturation ovocytaire, l ovulation ainsi que la production de facteurs paracrines et autocrines [265]. - La clusterine (CLU) est une glycoprotéine sulfatée exprimée par les cellules de la granulosa des follicules atrétiques en particulier [266, 267]. Son rôle est de protéger les cellules de granulosa de l apoptose au cours de l atrésie folliculaire. Or il est maintenant bien établi qu une réduction de l atrésie folliculaire peut-être associée à une augmentation du taux d ovulation [267], cependant l expression de CLU n est pas affectée par la mutation Booroola FecB B [268]. CLU est une protéine chaperonne capable de se lier à un certain nombre de protéines, dont le récepteur de surface LRP2. En fixant LRP2, CLU permet l accumulation ou la dégradation des protéines chaperonnes [269] et peut également participer à la distribution du cholesterol dans les cellules stéroïdogènes, et donc à la croissance folliculaire, comme le fait LRP8 dans les cellules de granulosa bovines [270]. Il n est donc pas impossible que LRP1 identifié dans les liquides folliculaires L/L puisse avoir cette même fonction dans la distribution du cholestérol chez l ovin. Par ailleurs, LRP1 s avère avoir une structure identique à celle du récepteur TβR5, impliqué dans l inhibition de la prolifération cellulaire induite notemment par les TGFβ, et participe de ce fait à sa régulation dans des cellules ovariennes [ ]. - L hémicentine (HMNCN1) est une protéine de la matrice extracellulaire impliquée dans le contact, l adhésion et la migration cellulaire [274]. Toutefois, aucun rôle direct de HMNCN1 n a été décrit dans la fonction ovarienne. HMNCN1 porte un domaine N-terminal Von Willebrand A qui pourrait expliquer sa glycosylation par B4GALNT2 [ ]. Il est décrit que les hémicentines interagissent avec les fibulines, qui sont également des protéines de la matrice extracellulaire. La Fibulin1 notamment est régulée par les oestrogènes et se retrouve surexprimée dans les cellules ovariennes cancéreuses [278, 279]. - Les sous-unités α (INHA) et βa (INHBA) de l inhibine conduisent à la formation et à la production de l Activine A et de l Inhibine A [77], toutes deux membres de la super-famille des TGFβ. Ces deux sous-unités sont produites par les cellules de la granulosa et sont accumulées à de fortes concentrations dans les liquides folliculaires du stade de petit follicule à antrum au stade préovulatoire [280]. L Activine A est décrite comme agissant via une signalisation auto/paracrine dans les cellules de la granulosa et de la thèque [78], alors que l inhibine A agit principalement par une régulation endocrine négative sur la sécrétion 80

130 hypophysaire de FSH. Elle est de surcroît connue pour exercer une action inhibitrice sur l activine A et les autres membres des TGFβ impliqués dans la régulation de la stéroïdogenèse et de la prolifération [78, 88]. De façon très intéressante, une immunisation contre l inhibine est à l origine d une augmentation du taux d ovulation et de la prolificité via la stimulation du développement folliculaire chez de nombreuses espèces dont la brebis [ ], la chèvre [197, 198], la vache [199, 200] et la bufflonne [201]. Au final, quasiment toutes les cibles de B4GALNT2 mises en évidence par l approche de purification par la lectine DBA peuvent jouer un rôle important dans le contrôle de la fonction ovarienne. Ces observations sont autant d éléments pour penser que la surexpression de B4GALNT2 et son activité transférase sont au cœur du mécanisme d action de FecL L pour le contrôle du nombre d ovulations chez les brebis Lacaune. Cependant, il reste à déterminer si toutes ces cibles sont des cibles directes ou indirectes. En effet, des protéines identifiées dans notre approche pourraient ne pas être des cibles directes du transfert de GalNac mais avoir été co-précipitées par interaction avec une glycoprotéine cible. Le meilleur exemple est l inhibine A, constituée d un héterodimère INHA/INHBA. Les deux protéines sont présentes dans la purification par DBA, mais les résultats de western-blot ne montrent un effet qualitatif de B4GALNT2 que sur la maturation de INHA, mais pas de INHBA, suggérant que INHBA puisse ne pas être une cible directe. Des expériences in vitro de co-expressions indépendantes des deux sous-unités de l inhibine A (ou des autres protéines) avec B4GALNT2 pourraient permettre de conclure. C. B4GALNT2/Inhibine A, siège de la régulation de la prolificité? 1. Expression et activité des sous-unités de l inhibine A dans l ovaire Sur la base des connaissances actuelles sur la folliculogenèse ovarienne et leur appartenance au système TGFß/BMP, largement impliqué dans le contrôle de la prolificité chez les ovins, les sous-unités α et βa de l inhibine constituent des candidates privilégiées pour expliquer l augmentation du taux d ovulation qui caractérise les brebis Lacaune FecL L. J ai pu confirmer les résultats d identification par spectrométrie de masse grâce aux anticorps spécifiques anti-inha et INHBA après lectine-précipitation et western-blot. On retrouve bien ces deux sous-unités reconnues uniquement dans les liquides folliculaires des brebis FecL L. Par lectine-histochimie, j ai montré chez la brebis adulte, que l activité B4GALNT2 s initiait précocement sur des cibles déjà présentes au stade de follicule secondaire et qu elle se développait au cours de la croissance folliculaire pour se maintenir ou non (selon 81

131 Figure 53. Résumé des différents stades de développement des follicules et du corps jaune au cours desquels les différents constituants de la voie de signalisation de l inhibine/activine ont été identifiés, au niveau ARN et/ou protéique (Knight et al., 2012). En exposant figurent les principaux types cellulaires ( GC : granulosa, TC : thèque, Oo : ovocyte) dans lesquels sont exprimés les différents constituants de la voie de signalisation. Les flèches indiquent si l expression se poursuit (ligne pleine) ou diminue (ligne en pointillés) au stade suivant. CL : Corps jaune. 82

132 l outil d histochimie utilisé) dans les gros follicules en atrésie. Le profil d expression des sous-unités INHA et INHBA est cohérent avec ce profil d activité de B4GALNT2 au cours du développement folliculaire. En effet, INHBA est exprimée dès les stades précoces du développement, par les cellules de la granulosa des follicules primaires et secondaires (Figure 53). Son expression se poursuit ensuite jusqu au stade de follicule pré-antral et à un moindre degré aux stades suivants. INHA quant à elle est surtout exprimée à des stades plus avancés du développement folliculaire, au niveau des cellules de la granulosa des follicules à antrum et pré-ovulatoires [78, ]. Ceci explique que l activine A est essentiellement produite jusqu au stade préantral, alors que la production d inhibine A est plus tardive. Enfin, il est possible d observer l expression de la sous-unité α et, plus faiblement, de βa dans les follicules en début d atrésie [ ]. Ces observations suggèrent que l effet de la mutation FecL L commencerait bien plus précocement que ne le proposait l hypothèse d action sur le phénomène de sélection préalablement avancée par L. Drouilhet [178]. Au niveau folliculaire, l ensemble des analyses réalisées au niveau ARNm et protéique est en faveur d une production d inhibine A augmentée chez les brebis mutées. En effet, les follicules ovariens des brebis L/L montrent une production favorisée du peptide mature de la sous-unité INHA (sans altération du niveau d expression) et une augmentation de l expression de la sous-unité INHBA. Par dosage ELISA, ceci se traduit par une accumulation 2 fois plus importante d inhibine A et d activine A dans l antrum des petits follicules en croissance. Mais, alors que la concentration folliculaire d inhibine A augmente dans les follicules préovulatoires, la concentration d activine A reste stable et surtout inférieure à la concentration trouvée dans les follicules +/+. Pour tenter d expliquer cela, les travaux d Antenos et al. ont mis en évidence que l association des sous-unités α-βa ou βa-βa pour former respectivement l inhibine A ou l activine A est dépendante des événements de N-glycosylation [202]. Il est donc possible que la glycosylation atypique d INHA et INHBA par B4GALNT2 ait altéré l hétéro-/homo-dimérisation des sous-unités et ainsi changé le ratio InhibineA/Activine A dans les follicules FecL L, qui seraient par ce mécanisme plus riches en inhibine A que les follicules +/+. L inhibine A exerçant une action inhibitrice sur l activité biologique de l activine A [78, 88], des concentrations intra-folliculaires d inhibine A 2 fois plus élevées pourraient induire une diminution de l activité intrafolliculaire d activine A dans les ovaires FecL L. L inhibition de l activité anti-lutéinisante de l activine A (stimulation de la production d oestradiol, inhibition de la production de progestérone) par l inhibine A dans la phase de folliculogenèse terminale des brebis FecL L serait à rapprocher de l inhibition des effets anti- 82

133 lutéinisants des BMPs par les mutations dans FecB, FecX et FecG pour expliquer l augmentation de prolificité [8]. Cependant, la concentration d activine A augmente aussi dans les petits follicules et l expression de TGFBR3 nécessaire à l effet antagoniste de l inhibine A [ ] diminue dans les cellules des follicules pré-ovulatoires FecL L, ces deux mécanismes étaient susceptibles de contrebalancer les effets de l augmentation de la concentration d inhibine A dans les ovaires FecL L. Il est également possible que l inhibine A ou l activine A modifiées par le transfert de GalNac via B4GALNT2 puissent avoir des activités biologiques modifiées. En effet, Makanji et al. ont mis en évidence que le degré de glycosylation d INHA module l activité biologique de l inhibine A produite [89] et cette modulation de la glycosylation pourrait interférer dans la liaison de l inhibine avec TGFBR3 [89]. 2. Sécrétion ovarienne d inhibine A et d activine A Au niveau endocrinien, la concentration plasmatique d activine A est similaire entre les deux génotypes, mais la concentration d inhibine A est 3 fois plus faible dans la circulation des brebis L/L en comparaison des brebis +/+, alors que les concentrations folliculaires sont 2 fois plus élevées. Par un calcul simple, j ai estimé la production ovarienne en inhibine A dans les deux génotypes. Cette estimation est basée sur le nombre total moyen de follicules par classe (1-3mm et 5mm) et par animal +/+ ou L/L (d après les données obtenues par L. Drouilhet [178]), le volume moyen d un follicule de la classe, considéré comme une sphère (V= 4/3π rayon 3 ), et la concentration en inhibine A intrafolliculaire pour les différentes classes ([InhA]). Ainsi, pour une classe de follicule, le calcul de la quantité d inhibine A (Q inha ) contenue dans les deux ovaires d un animal se calcule selon la formule : Q inha = V*[InhA]. La somme des quantités moyennes d inhibine A contenues dans toutes les classes permet ensuite d obtenir une quantité ovarienne d inhibine A. Ainsi, l effet de FecL L sur l augmentation de la concentration intrafolliculaire d inhibine A se répercute sur la quantité moyenne ovarienne d inhibine A par animal. Elle est estimée à 0,7mg chez les brebis L/L, soit 3 fois plus importante que pour les brebis +/+ (0,2mg). Mais étonnamment, cette plus forte production d inhibine A ovarienne ne se retrouve pas au niveau plasmatique. Bien au contraire, les concentrations circulantes d inhibine A sont 3 fois moins importantes tout au long du cycle œstrien chez les brebis L/L. Il semblerait donc que chez les brebis FecL L, la glycosylation atypique de l inhibine A puisse altèrer sa biodisponibilité endocrine. Pour expliquer ce différentiel entre les ovaires et le plasma chez les brebis L/L, deux mécanismes 83

134 influençant la biodisponibilité peuvent être explorés : la rétention dans les follicules ovariens avec un rôle prépondérant de la matrice extra-cellulaire (MEC) et/ou une clairance plus accrue dans le plasma. La MEC joue un rôle important dans la folliculogenèse, notamment dans la régulation de la survie, la prolifération et la différentiation cellulaire, ainsi que dans la régulation de la stéroïdogenèse et du transport de molécules vers ou en dehors du follicule [ , 256, 293, 294]. Parmi les composants de la MEC, les protéoglycanes composés d une ou plusieurs chaînes de glycosaminoglycanes, sont capables d interagir avec des facteurs de croissance ou leurs protéines de liaison, et ainsi de moduler leur biodiponibilité et leur activité [ ]. Cela suggère peut-être un effet de la glycosylation atypique de l inhibine A sur sa rétention par des glycosaminoglycanes de la MEC. De façon très intéressante, notre analyse par spectrométrie de masse a identifié au moins 4 glycoprotéines composantes de la MEC, ellesmêmes cibles de B4GALNT2 dans les follicules L/L, versican, inter-α trypsin inhibitor, hémicentine et fibuline. Parmi ces 4 protéines, Versican est particulièrement intéressante. Elle est exprimée principalement par les cellules de la granulosa [257] tout au long de la croissance folliculaire et elle s accumule dans le liquide folliculaire [298]. Elle joue un rôle majeur dans la structure de la MEC et in fine dans la fertilité notamment via la régulation des facteurs de croissance et des hormones qui traversent obligatoirement la MEC pour atteindre les cellules cibles ou même passer dans la circulation générale [253, 256]. Une étude récente a notamment mis en évidence que sa surexpression, mais aussi son état de glycosylation peuvent être associés à des cas de cancers ovariens [ ]. Une question serait de savoir s il existe une relation directe entre Versican et Inhibine A et si cette relation est modulée par les transferts de GalNac via B4GALNT2. Des éléments de réponse pourraient être apportés par immuno-précipitation du Versican, suivie d un western-blotting au moyen des anticorps anti-inha/inhba. Jusqu à présent, l absence d anticorps anti-versican fonctionnel chez la brebis ne m a pas permis d apporter d élément de réponse. De façon à évaluer le caractère spécifique de la rétention intra-folliculaire d inhibine A, j ai réalisé des dosages de l Hormone Anti-Müllérienne (AMH). Chez la femelle, cette hormone est exprimée de façon spécifique par les cellules de granulosa des follicules préantraux et des petits follicules à antrum. L AMH joue un rôle clé dans la fonction ovarienne en inhibant le recrutement des follicules primordiaux dans le pool des follicules en croissance et en réduisant la sensibilité des follicules en croissance à la FSH [ ]. Il était donc intéressant de caractériser son profil intra-folliculaire et endocrine chez les brebis 84

135 Figure 54. Evolution des concentrations plasmatiques d AMH au cours d un cycle oestrien synchronisé chez des brebis Lacaune Les plasmas de brebis Lacaune +/+ (n=6) et L/L (n=6) collectés au cours d un cycle œstrien synchronisé, ont été dosés par ELISA pour déterminer les profils de l Hormone Anti-Mullërienne (AMH). Les données représentent les moyennes ± SEM. Le profil endocrinien moyen des animaux +/+ et L/L a été calé sur le moment du pic de LH (ligne en pointillés). Le temps est donné en heures relatives à la survenue du pic de LH. Les lettres a et b indiquent des différences significatives pour le profil de l inhibine A au cours du cycle oestien d une brebis +/+, avec p<0,05. 85

136 prolifiques L/L. De façon assez similaire à l inhibine A, la concentration plasmatique d AMH chez les brebis L/L est environ 1,5 fois inférieure en comparaison aux brebis +/+ tout au long du cycle oestrien (Figure 54). Pourtant, le calcul de production d AMH ovarienne est en faveur des brebis L/L. Il semblerait donc que l AMH subisse également un phénomène de rétention dans les ovaires L/L. Pourtant, l AMH n a pas été identifiée comme une cible directe de B4GALNT2, ni par spectrométrie de masse, ni par lectine-précipitation et westernblot. Ceci suggère donc que la biodisponibilité de l AMH subisse indirectement les conséquences de la surexpression de B4GALNT2 dans les ovaires FecL L, et constitue un argument supplémentaire en faveur d un mécanisme indirect pour expliquer la rétention de l inhibine A dans l ovaire. L origine et les conséquences de cette réduction des niveaux plasmatiques de l AMH chez les brebis L/L sont à approfondir dans le mécanisme conduisant à la poly-ovulation. Une autre hypothèse pour expliquer une concentration circulante d inhibine A plus faible chez les brebis L/L serait un changement de demi-vie de l hormone suite à sa glycosylation. D après la littérature, l expression ectopique de B4GALNT2 observée dans le syndrome de Von Willebrand est à l origine de la glycosylation atypique du VWF qui conduit à l augmentation de sa clairance dans le plasma [221, 277, 302]. Afin d orienter notre étude sur un de ces deux mécanismes, rétention dans l ovaire vs demi-vie plus courte dans le plasma, je propose de doser l inhibine A à la sortie de l ovaire, dans la veine ovarienne des brebis L/L. En effet, selon que la concentration d inhibine mesurée à la sortie de l ovaire se rapproche du niveau d inhibine A plasmatique ou intrafolliculaire, alors la piste de la rétention ou de la clairance sera approfondie. Etonnamment, la concentration circulante 3 fois moins importante d inhibine A chez les brebis L/L n a pas de répercussion sur les profils endocriniens de l axe reproductif, notamment sur les concentrations circulantes de FSH qui restent identiques à celles des brebis +/+ [178]. Pourtant le rôle de régulateur négatif de l inhibine sur cette gonadotropine est bien établi et l on pourrait donc s attendre à une concentration circulante de FSH plus élevée chez les brebis L/L. Mais, d après les données de L. Drouilhet, il est possible que les concentrations d E2 plus élevées chez les brebis L/L maintiennent le rétro-contrôle négatif sur la FSH, compensant ainsi le manque d inhibine A [178]. Cependant, comme hypothèse alternative je propose que la glycosylation atypique de l inhibine A puisse moduler sa bioactivité comme suggéré par les travaux de Makanji et al. [89], pour tenter d expliquer que 85

137 Figure 55. Représentation schématique des sites de N-glycosylation sur INHA et INHBA et les lignées stables CHO-Flp productrices des glycomutants INHA et INHBA. (d après Antenos et al., 2007). A et B. Les chiffres au-dessus des motifs en branches représentent la position des sites de N-glycosylation (numéro de l acide aminé). Table 1. Indique les différentes lignées cellulaires CHO créées afin de produire des glycomutants pour chaque site de N- glycosylation ; α : sous-unité INHA; β : sous-unité INHBA ; représente la position des sites de glycosylation mutés. 86

138 3 fois moins d inhibine A chez les brebis L/L présente la même activité biologique sur l hypophyse que des concentrations «normales» chez les brebis +/+. 3. Perspectives Finalement, au regard des résultats obtenus sur le système Inhibine/Activine, il nous manque des résultats cruciaux pour pouvoir évaluer les conséquences fonctionnelles du transfert de GalNac atypique sur ces deux protéines, afin de conclure définitivement sur un effet direct/indirect, une altération de l homo/hétérodimérisation, une régulation de la rétention/demi-vie ou encore une activité biologique altérée. Les perspectives immédiates sont donc de répondre à ces questions et pour cela j ai construit et collecté un certain nombre d outils. J ai mis en place une collaboration avec le Dr. T.K. Woodruff (Health Research Institute, Chicago, Etat-Unis), m offrant la possibilité de travailler sur des lignées cellulaires CHO (Chinese Hamster Ovary) exprimant de façon stable les sous-unités humaines INHA et INHBA, normales ou mutées pour chacun des sites de N-glycosylation (Figure 55). INHA possède 3 sites de glycosylation, dont 2 sur le domaine mature αc et INHBA possède un seul site de glycosylation sur son pro-domaine. Au passage, cette observation de l absence de site de N-glycosylation sur la forme mature ßa pourrait peut-être expliquer l absence de visualisation de cette forme après précipitation par la lectine DBA. Grâce aux mutants de ces sites [202], nous pourrions déterminer le(s) site(s) qui porte(nt) les chaines sucrées et qui accueillent le transfert de GalNac par B4GALNT2. Toutefois, je n ai pas pu exploiter ces outils puisque ces lignées CHO présentent une activité endogène β1,4-nacetylgalactosaminyl-transferase révélée par la lectine DBA, ce qui empêche de visualiser l effet de la surexpression de B4GALNT2. Devant les difficultés rencontrées avec ce système, il faut que je développe mes propres tests avec des cellules dépourvues d activité GalNactransférase endogène. Les vecteurs d expression des sous-unités INHA et INHBA ovines sont prêts et je dispose de la construction exprimant B4GALNT2. Avec ces outils et par une approche de transfection transitoire in vitro, je pourrais sur-exprimer individuellement chaque sous-unité de l inhibine ovine en présence ou non de B4GALNT2, et vérifier par lectineprécipitation et western-blot si les sous-unités sont détectées directement ou non. Pour tester l activité biologique, je pourrais également analyser par un test luciférase la co-transfection des sous-unités INHBA et INHA avec un vecteur rapporteur de la signalisation Activine A tel que pcaga-luciferase [303, 304] et tester l impact de l expression de B4GALNT2. Ces approches de transfection donnent également accès à des milieux conditionnés qui peuvent 86

139 être testés sur des cultures primaires de cellules hypophysaires ovines ou des cellules gonadotropes de souris LßT2 en comparant les concentrations de FSH produites par ces cellules sous influence de l inhibine A ou de l activine A. Cette même expérience pourrait aussi être réalisée à l aide de liquides folliculaires +/+ et L/L. Les milieux conditionnés pourraient également permettre de tester l hypothèse de modification de la demi-vie de l inhibine A suite à sa glycosylation. Après centrifugation et concentration des surnageants de culture, l inhibine A modifiée ou non par B4GALNT2 serait injectée à un temps To par voie veineuse à des souris (petit modèle approprié pour cette étude). Il s agirait ensuite d effectuer plusieurs prélèvements sanguins successifs au niveau du plexus retro-orbital à des temps prédéterminés. Les plasmas seraient ensuite centrifugés et l inhibine A glycosylée serait ensuite dosée par ELISA pour en déterminer sa demi-vie par rapport à celle non glycosylée [221]. L obtention des résultats issus de ces expériences permettra de savoir si la modulation du système inhibine/activine par la surexpression de B4GALNT2 est impliquée dans le mécanisme physiologique responsable de l augmentation du nombre d ovulations chez les brebis Lacaune hyperprolifiques. 4. Hypothèses de contrôle du nombre d ovulations par B4GALNT2 Avec les résultats obtenus sur le système inhibine/activine et le constat que l action de FecL L est essentiellement ovarienne, comment expliquer la sélection d un plus grand nombre de follicules chez les brebis L/L? Si l on se replace dans le contexte endocrinien de la régulation de la folliculogenèse, dans les ovaires FecL L, la différence dans le dialogue hypothalamo-hypophyso-gonadique réside dans la précocité des événements endocriniens en phase terminale de la folliculogénèse [178]. La concentration circulante d œstradiol augmente de façon plus rapide et plus intense et induit son rétro-contrôle positif au niveau hypothalamique plus précocement. Cette précocité s expliquerait par le plus grand nombre de follicules sélectionnables (3mm) chez les brebis L/L (6 vs 2 chez les +/+). Ces follicules sélectionnables L/L se trouvant à des degrés de maturité similaires aux follicules +/+, comme en atteste l expression des marqueurs LHCGR, CYP19A1 et CYP11A1 étudiés au cours de la thèse de L. Drouilhet, ou encore C-MYC dans mon étude. Il en résulte le développement de 3 fois plus de follicules pré-ovulatoires œstrogéniques et donc une quantité plus importante d œstradiol sécrétée par les ovaires L/L. Du fait que les follicules L/L ne présentent pas de différence de maturation avec les follicules +/+, cela suggère que le mécanisme d action permettant la sélection d un plus grand nombre de follicules chez les brebis L/L intervient 87

140 Figure 56. Effets des membres de la super-famille des TGFβ au cours de la folliculogenèse et fenêtre d action des mutations prolifiques FecX/BMP15, FecG/GDF9 et FecL/B4GALNT2 La figure représente les fenêtres d action des effets de BMP15, GDF9 et de l Activine selon qu ils soient essentiels (rectangle vert), stimulateurs (rectangle bleu) et inhibiteurs (rectangle rouge) au cours de la folliculogenèse. Les rectangles oranges indiquent les fenêtres d action des mutations prolifiques dans FecX/BMP15, FecG/GDF9 et FecL/B4GALNT2. 88

141 dans une fenêtre de temps plus tardive que ce qui est observé dans les mutations FecX/BMP15, FecG/GDF9 et FecB/BMPR1B (Figure 56). En effet, dans ces modèles, le mécanisme d action touche des évènements précoces du développement folliculaire, en particulier la prolifération des granulosa des follicules en début de croissance, même s il se poursuit plus tardivement en affectant la sensibilité aux hormones gonadotropes et conduisant alors à une maturation folliculaire avancée et l ovulation de follicules plus petits et plus nombreux [8, 22]. Dans le modèle FecL L, j imagine plutôt un mécanisme d action touchant des évènements plus tardifs du développement folliculaire (Figure 56). Les concentrations d activine A supérieures dans les follicules à antrum sélectionnables pourraient limiter l atrésie de ces follicules [288, ], une hypothèse déjà suggérée par L. Drouilhet via le rapport des stéroides intrafolliculaires P4/E2 [178]. Ceci favoriserait donc un accroissement de leur nombre dans les ovaires L/L. Au cours de la vague folliculaire terminale pendant laquelle s opère le phénomène de sélection, la production d inhibine A, glycosylée de façon atypique par B4GALNT2, est favorisée chez les brebis L/L. La meilleure hypothèse reste la levée des effets anti-lutéinisants de l activine A sur les cellules de granulosa des follicules en développement terminal, comme ce qui est proposé pour l action des BMP dans les autres modèles de brebis hyperprolifiques [8]. Pour récapituler ma vision du modèle FecL, je propose un modèle explicatif de la régulation de la prolificité observée sous l influence de FecL L en Figure 57. Il reste toutefois assez difficile de s avancer sur le mécanisme précis responsable de l augmentation du taux d ovulation caractéristique des brebis FecL L. Avec l hypothèse que le mécanisme d action de FecL L affecte le phénomène d atrésie/survie cellulaire, il serait indispensable de réaliser la caractérisation fine du phénotype sur des échantillons cellulaires de follicules individuels, atrétiques ou sains, de taille bien définie. 88

142 Figure 57. Modèle intégratif des conséquences de la mutation du gène de prolificité FecL sur la folliculogenèse et le nombre d ovulations en race ovine Lacaune Ce modèle tient compte des données acquises au cours de cette thèse et de celle de L. Drouilhet (Drouilhet et al., 2010). Les brebis hyperprolifiques porteuses de la mutation FecL L présentent une activité ectopique ovarienne du gène FecL/B4GALNT2 à partir du stade follicule secondaire. Cette activité est associée directement ou indirectement à une augmentation des concentrations intrafolliculaires d Activine A des follicules dépendant de la FSH. Ceci aurait pour conséquence de favoriser la survie de ces follicules et la prolifération de leurs cellules de la granulosa, conduisant à un plus grand nombre de follicules à antrum sélectionnables (>3mm). Au cours de la maturation folliculaire terminale initiée par le phénomène de sélection, la production d inhibine A, glycosylée de façon atypique par B4GALNT2, est favorisée chez les brebis mutées. Ceci aurait pour conséquence la levée des effets anti-lutéinisants et inhibiteurs sur la différenciation terminale de l Activine A sur les cellules de granulosa, conduisant ainsi au maintien et à l ovulation d un plus grand nombre de follicules pré-ovulatoires. Au niveau endocrine chez les brebis mutées, la concentration circulante d Inhibine A est 3 fois plus faibles, mais la concentration d oestradiol est 3 fois plus élevée en phase folliculaire du cycle. Cependant, l intégration au niveau hypophysaire de ces signaux ovariens perturbés conduit à une production et une libération de la FSH qui restent identiques aux brebis non-mutées. Ainsi, la régulation du nombre d ovulations chez les brebis Lacaune porteuses de la mutation FecL L serait la conséquence d un mécanisme strictement ovarien initié par la surexpression ovarienne du gène B4GALNT2. ACT : Activine A ; INH : Inhibine A ; E2 : Oestradiol ; FSH: Hormone Folliculo-Stimulante 88

143 CONCLUSION 89

144 Les objectifs de ma thèse étaient d une part de poursuivre l étude génétique du locus FecL afin d identifier le gène FecL et la mutation causale FecL L et d autre part, de caractériser les conséquences moléculaires de la mutation FecL L sur la fonction ovarienne. Pour répondre à ces différents objectifs j ai dû associer de multiples approches de génétique, de biologie fonctionnelle et de physiologie qui m ont permis de placer ce travail de thèse au cœur de la biologie intégrative. D un point de vue purement génétique, la stratégie de séquençage exhaustif du locus par une approche haut-débit complétée par une approche classique a été payante puisque j ai pu réduire le locus de 250 à 194,6 kb, passant de 5 gènes à 2 gènes candidats pour FecL, IGF2BP1 et B4GANT2. De plus cette approche a permis d identifier de façon certaine deux SNPs constituant l haplotype causal FecL L. Cependant, limitée par les animaux dont les chromosomes recombinent dans le locus et la nature non codante des 2 SNPs, je n ai pas pu discriminer un seul gène comme étant FecL et un seul SNP comme étant FecL L par la génétique. Par contre, l information génétique acquise est suffisante pour une perspective finalisée de ce travail avec le développement à grande échelle d un nouveau test ADN pour le génotypage des animaux Lacaune au sein des entreprises de sélection de la race (OVI-TEST et GEBRO). Il sera ainsi possible de mieux contrôler la diffusion du gène Lacaune FecL dans les populations sélectionnées sur la prolificité. La force de la biologie intégrative est de pouvoir allier l information biologique issue de différents niveaux d études. Si l étude du niveau génétique, n a pas abouti à l identification stricte de FecL, les études cellulaires d expression et d activité biologique m ont permis d apporter des arguments solides en faveur de B4GALNT2. Cependant, il est vrai que la seule façon de s assurer de la causalité de la surexpression du gène B4GALNT2 sur la régulation de la prolificité serait le recours aux techniques de transgenèse chez la brebis. Ainsi la surexpression ectopique du gène B4GALNT2 pourrait être reproduite par transgénèse additionnelle chez des brebis peu prolifiques à l aide d un vecteur d expression sous le contrôle du promoteur de l AMH par exemple. L utilisation de la mutagénèse dirigée in vivo par des nucléases sites-spécifiques telles que les TALENs (Transcription activator-like effector nucleases) serait également un moyen pour faire la discrimination entre les deux SNPs [308]. L identification de B4GALNT2 comme étant le gène majeur FecL contrôlant la prolificité en race Lacaune a été un défi pour moi, puisque cela m a conduit à développer des stratégies conceptuelles et techniques autour de la glycobiologie assez peu répandues pour l étude de la 90

145 fonction ovarienne. Mais là encore, l association gagnante des outils lectine et spectrométrie de masse a conduit à l identification des protéines cibles de la glycosylation atypique par B4GALNT2. Bien que de nombreuses pistes restent à explorer, j ai apporté un certain nombre d arguments en faveur de l implication du système biologique lié à l activité de l inhibine A et de l activine A dans le mécanisme physiologique responsable de l augmentation du nombre d ovulations qui caractérise les brebis Lacaune FecL L. En conclusion, par ce travail de thèse qui a atteint ses objectifs, j ai déterminé qu un haplotype de 2 SNPs sur le chromosome 11 ovin induit une surexpression ectopique du gène B4GALNT2 dans les cellules ovariennes, dont une des conséquences est le transfert atypique d un sucre GalNac sur les hormones ovariennes inhibine/activine A, modifiant leur rôle biologique normal et conduisant à l augmentation du nombre d ovulations chez les brebis Lacaune. De façon paradoxale par rapport aux conclusions de l analyse génétique, le système TGFβ/BMP semble encore une fois au cœur de la régulation du taux d ovulation chez les ovins L implication des glycosylations est assez bien documentée dans le cas des cancers ovariens chez la femme [ ]. A l image de ce que les modèles ovins ont apporté à la clinique humaine avec BMP15 et GDF9, ce travail chez la brebis Lacaune devrait amener à s interesser également aux glycosylations atypiques qui pourraient accompagner les disfonctionnements ovariens comme les insuffisances ovariennes précoces ou encore les syndromes d ovaires polykystiques. 91

146 BIBLIOGRAPHIE 92

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168 ANNEXES: PROCEDURES EXPERIMENTALES (PE) 114

169 PE 1. Amplification des longs fragments PCR L ADN génomique a été extrait à partir d échantillons de sang des animaux +/+ et L/L étudiés selon la méthode décrite par Montgoméry et al., 1990 [312]. Les amorces pour l amplification ont été choisies de sorte à pouvoir amplifier de longs fragments en PCR de taille moyenne de 10kb. L amplification de ces longs fragments a été réalisée sur un amplificateur ABI 9700 (Applied Biosystems) en utilisant un mélange d enzyme «Long PCR» (Fermentas). Au total après purification, nous avons couvert l intervalle de 250kb par 25 longs fragments PCR. Ces différents fragments ont ensuite été dosés individuellement en fluorescence grâce à l intercalant PicoGreen (Quant-iT PicoGreen, Invitrogen). De sorte à optimiser la représentation de chaque base, pour chacun des génotypes, un mélange équimolaire de l ensemble des produits d amplification a été réalisé en tenant compte de la longueur des fragments et de leur concentration. 115

170 Figure 58. Principe du pyroséquençage 116

171 PE 2. Principales étapes du séquençage Roche 454 Le séquençage 454 est un système de pyroséquençage à grande échelle, capable de séquencer 400 à 600 mégabases en 10h. Cette technologie produit des lectures d une longueur moyenne de 450pb. La première étape du protocole 454 (Figure 58-1) permet la création d une banque d ADN : - L échantillon d ADN à séquencer est nébulisé grâce à un bain d azote en fragments de taille comprise entre 300 et 800pb. Les fractions inférieures à 300pb sont éliminées par une purification sur colonne. - Les extrémités des fragments sont ensuite digérées afin de créer des bouts francs pour y fixer deux types d adaptateurs A et B. L adaptateur A contient le site d amorçage du séquençage, l adaptateur B est biotinylé en 5 (ces derniers auront la capacité de fixer les particules de streptavidine exposées à la surface de billes de capture). Trois types de fragments sont générés à cette étape : A-B, B-B et A-A. - Afin de sélectionner les fragments qui ont fixé les deux types d adaptateurs A-B, les fragments sont mélangés à des billes de capture. Ceux qui ont au moins une fois l adaptateur B se fixent aux billes de capture (B-B ou A-B) alors que les fragments A-A sont éliminés. Ensuite, une ADN-polymérase produit un double brin de pleine longueur. Le tri des fragments A-B et B-B se fait par dénaturation, les simples brins A-B se détachent des billes, alors que les fragments B-B, qui ont les deux extrémités fixées à la bille, restent. A la fin de cette étape, (Figure 58-2) notre banque est composée de fragments compris entre 300 et 800pb, ayant les adaptateurs A et B fixés à chaque extrémité. La seconde partie du protocole 454 (Figure 58-3) consiste en l amplification par PCR de la banque : - Une fraction de la banque est mélangée à des billes de capture, avec une proportion calculée et optimisée afin d obtenir au maximum une molécule d ADN par bille. Le mélange des billes, de la fraction de la banque d ADN, du mélange réactionnel d amplification et de l huile va être agité vigoureusement de façon mécanique. L émulsion va créer une multitude de microréacteurs chimiques contenant une bille, un fragment d ADN et du mélange réactionnel nécessaire à la PCR. L huile isole chaque bille de ses voisines. 116

172 - L amplification consiste en une PCR sur chaque bille, dans chaque réacteur chimique, de manière à multiplier les copies clonales de la molécule d ADN. A la fin de l amplification, chaque bille contient entre 10 et 50 millions de copies (Figure 58-4). Les billes sont ensuite récupérées en cassant l émulsion grâce à des lavages successifs. - Les nombreuses billes vides qui subsistent dans la préparation sont éliminées afin de ne conserver que les billes qui ont effectivement fixé et amplifié un fragment d ADN. Pour cela, on dénature les billes de capture afin d obtenir de l ADN simple brin, et des amorces couplées à de la biotine sont ajoutées et liguées. Des billes magnétiques d enrichissement qui ont la particularité de se fixer sur les amorces biotinylées sont ensuite ajoutées à la solution, elles forment donc des complexes billes de capture ADN billes magnétiques d enrichissement. Grâce à un portoir magnétique, les complexes sont culottés et les billes de capture vides, non retenues par les billes magnétiques, sont éliminées. Les billes magnétiques d enrichissement sont ensuite récupérées par dénaturation des complexes. - Les amorces de séquences sont ensuite hybridées sur les adaptateurs A. Et enfin, les billes sont chargées sur une plaque appelée puce à fibre optique (puits d environ 29µm- PicoTiterPlate) avec un mélange d ADN polymérase, d ATP, sulfurylase et de luciférase. Le séquençage peut alors débuter. Le pyroséquençage (Figure 58-5) repose sur l incorporation de chaque base A, T,G ou C par plusieurs centaines de cycles successifs. A chaque cycle, un seul type de nucléotide est introduit, suivi de l addition du substrat (luciférine, adénosine 5 phosphosulfate) pour conduire à l émission de lumière dans les puits où la polymérase a incorporé ce nucléotide. Cette étape est suivie par un lavage apyrase pour éliminer les nucléotides non incorporés. Le signal lumineux est enregistré à chaque cycle (Figure 58-6), de manière à reconstituer la séquence de chacun des puits. Différents logiciels vont par la suite permettre d analyser les données. 117

173 PE 3. Séquençage 454 : application aux génotypes étudiés Les échantillons issus de la banque sont séquencés en utilisant le séquenceur Roche 454 Life Science Genome FLX (454 Life Science, Roche), sur la plateforme génomique de Toulouse (PlaGe, Pour cela 2 banques d ADN ont d abord été préparées à partir d 1µg des mélanges de produits de PCR des 2 génotypes étudiés, grâce au kit Titanium General Library. Ces banques ont ensuite été nébulisées en de multiples fragments en bain d azote, puis purifiées pour enfin recevoir des adaptateurs sur chacune de leurs extrémités. Les fragments possédant les bons adaptateurs, un pour l amorçage du séquençage et l autre pour se fixer à une bille, ont été purifiés et amplifiés à l aide du kit GS FLX Titanium LV empcr dans des réacteurs chimiques (une bille, un réacteur) de manière à multiplier les copies clonales du fragment d ADN fixé à chaque bille. Les amorces de séquences ont alors été hybridées sur les adaptateurs et les billes ont été chargées sur une puce à fibre optique (PicoTiterPlate). Dès l ajout du mélange d ADN polymérase, d ATP sulfurylase et de luciférase dans les puits (kit GS FLX Sequencing, Titanium Reagents XLR70) le séquençage a pu débuter. En collaboration avec le laboratoire SIGENAE, les informations de séquences générées ont pu être ensuite assemblées grâce à leur alignement sur le génome ovin (OAR v1.0 puis v2.0 disponible en mars 2011 projet du génome de référence ovin) à l aide du logiciel bwa (algorithme bwasw [313] qui donne une profondeur de lecture moyenne de 103 réduisant ainsi les risques d erreur de séquençage). Les données issues de cet alignement sont alors sous format SAM (Sequence Alignment/Map), un format d'alignement générique pour le stockage des alignements lus contre des séquences de référence produites par les plates-formes de séquençage, pour être ensuite analysées à l aide de différentes fonctions disponibles (visualisation, tri et fusion) dans l outil SAMtools (hébergé sur SourceForge.net) [314]. 118

174 Figure 59. Principe des typages microsatellites et SNP par SSCP (Thèse L. Drouilhet). Le typage des microsatellites débute par l amplification de la zone polymorphe avec des amorces marquées d un fluorochrome. Le produit PCR est ensuite mis à migrer sur un séquenceur avec un polymère séparant les fragments en fonction de leur taille (polymorphisme de longueur). Les microsatellites présentent en général plusieurs pics pour un allèle (écho du pic le plus à droite). Le typage des SNP par SSCP peut également se réaliser à l aide d amorces marquées (SSCP fluorescente) mais également sans fluorochrome (SSCP manuelle). Dans les deux cas, les produits PCR migrent en fonction de leur conformation. La différence d une seule base permet de séparer les allèles correspondants. 119

175 PE 4. Identification des polymorphismes, Génotypage et Cartographie fine Le criblage des polymorphismes a été directement réalisé sur les séquences issues des séquençages 454 et Sanger (sur tout le locus afin de s assurer d aucun oubli de polymorphismes), à l aide du logiciel de visualisation IGV (Integrative Genomic Viewer). La position de tous les polymorphismes décrits dans ce manuscrit est donnée en accord avec la dernière mise à jour du génome ovin (OAR v3.1 disponible en Octobre 2012 Génome de référence ovin [315]). Chacun des polymorphismes identifié a ensuite été testé sur au moins 2 à 6 brebis Lacaune +/+, une L/L et une L/+ pour d une part vérifier s ils étaient «vrais» et non dû à une erreur lors du séquençage ou lors de l analyse (profondeur de lecture insuffisante, zone répétée ) et d autre part pour évaluer leur partage allélique. L objectif de cette étape était de pouvoir identifier un polymorphisme causal. Pour ce faire, les zones polymorphes ont été amplifiées par PCR à partir des ADN génomiques des brebis sélectionnées. En fonction de la nature du polymorphisme, trois sortes de typages étaient possibles. Le génotypage des microsatellites et de certains SNPs a été réalisé par SSCP (Single Strand Polymorphism Conformation) à partir d amorces fluorescentes sur un séquenceur ABI 3100 (Applied Biosystems Publication 116AP01-02) (Figure 59), et pour d autres SNP, par SSCP manuelle ou par séquençage Sanger classique en utilisant le kit ABI Prism BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing sur ce même séquenceur ABI Dans le cas du typage SSCP manuel, l amplification a été suivie d une étape de dénaturation puis de dépôt des simples brins sur gel polyacrilamide. Le principe est que chacun des simples brins va adopter une conformation spatiale caractéristique (qui dépend notamment de sa séquence nucléotidique) au cours la migration électrophorétique. En ce qui concerne la lecture des polymorphismes, elle a été faite à partir d une coloration argentique en SSCP manuelle, ou directement à l aide du logiciel IGV pour les techniques de Sanger et de SSCP fluorescente. A la fin de cette étape, les «faux» polymorphismes, à savoir ceux qui ne sont ni retrouvés sur l animal L/L ni sur l animal L/+ du typage, sont éliminés de l étude. Lorsque les «vrais» polymorphismes/marqueurs n ont pas été retrouvés sur les différents chromosomes + testés lors du typage, alors l étude du partage allélique a été élargie successivement sur davantage de chromosomes sauvages provenant des animaux Lacaune des familles expérimentales (n=103), des populations Lacaune laitière GEBRO (n=173) et Blanche du Massif Central (n=148) et de 9 races différentes (n=180) que sont les Limousine, 119

176 Bizet, Rava, Suffolk, Causse du Lot, Charmoise, Préalpes du Sud, Berrichon du Cher et la Noire du Velay. Parallèlement, un certain nombre des polymorphismes identifiés a été testé sur des animaux recombinants (familles et population OVITEST) pour lesquels des points de recombinaison renfermaient encore des zones d incertitude quant à la nature de l allèle reçu. 120

177 PE 5. Séquençage Sanger en marche sur le chromosome Les zones sans informations de séquence ont été comblées en utilisant un séquençage Sanger en marche sur le chromosome. Le principe de ce séquençage repose sur un séquençage Sanger classique. Des amorces ont d abord été choisies à partir des longs fragments PCR encadrant ces zones. Après une réaction d amplification, les produits de PCR (entre 3-12µL selon la concentration) ont été purifiés par une réaction enzymatique de 45 min à 37 C au moyen de l exonucléase I (80 U, M8201, Ozyme) et de la Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP, 250 U, MO293L, Promega), qui permettent respectivement d éliminer les fragments d ADN simple brin (amorces) et les dntp restants. La réaction est ensuite arrêtée par inactivation des enzymes 30 min à 80 C. Au moyen du kit Prism AmpliTaq FS Big Dye Terminators dichlororhodamine V3.1 (Applied Biosystems) il a ensuite été possible de séquencer des zones de 800 à 900 paires de bases. Les produits de séquences ont ensuite été purifiés sur des plaques multiscreen (Millipore), puis séparés par le séquenceur ABI3730 (Applied Biosystems ; Plateforme génomique du laboratoire INRA de Toulouse). La récupération des données sous format ZIP se fait via l'interface du site intranet de la plateforme ( Les séquences ou chromatogrammes sont ensuite analysés à l aide du logiciel Sequencing Analysis v3.7 (logiciel ABI) disponible sur la plateforme. Au fil des séquençages, l apport d information de séquence a permis de choisir de nouvelles amorces, qui petit à petit, ont contribué à compléter ces zones manquantes. 121

178 Figure 60. Principe du retard sur gel (D après la fiche technique ThermoScientific, La technique de gel retard est constituée de trois grandes étapes : (1) les réactions de liaison protéine-adn, pour laquelle l ordre de l ajout des différents composants est très souvent critique, (2) l'électrophorèse, qu il est préconisé de réaliser aussitôt les complexes, labiles, créés afin d optimiser leur visualisation lors de l étape (3) la détection de la sonde. Sur ce schéma il est possible de voir 1) la migration d un fragment d ADN libre, 2) le retard de migration de ce même fragment lorsqu il est lié à une protéine, 3) l élimination complète de ce shift lorsqu un compétiteur spécifique est ajouté, il s agit donc là d un contrôle de spécificité de liaison, 4) le contrôle négatif avec l ajout d un compétiteur non spécifique et 5) un super-shift lors de l ajout d un anticorps dirigé contre la protéine du complexe. Enfin, lors de la présence de la protéine du complexe, du compétiteur spécifique et de l anticorps spécifique, il est possible d observer, non pas la disparition complète des bandes d ADN «libre», mais une diminution de leur intensité. Tableau 7. Séquences des sondes double-brins biotinylées (EMSA) SNP Couples d oligonucléotides Sens (S) et Antisens (AS) biotynilés en 5 g (+) (S) CAAACTCCTACATGCAAGAAGCTGCGTGTGTGAGGGGCTGGCTGTTCAAGCGGGACAAGGC (AS) GCCTTGTCCCGCTTGAACAGCCAGCCCCTCACACACGCAGCTTCTTGCATGTAGGAGTTTG g (L) (S) (AS) g (+) (S) (AS) g (L) (S) (AS) CAAACTCCTACATGCAAGAAGCTGCGTGTGAGAGGGGCTGGCTGTTCAAGCGGGACAAGGC GCCTTGTCCCGCTTGAACAGCCAGCCCCTCTCACACGCAGCTTCTTGCATGTAGGAGTTTG CCCCTTTTAGCCTTTTGCCCCGGGGTGCTTACCCTTTCGGTTCCGTCGAGCCCCGCGTTGG CCAACGCGGGGCTCGACGGAACCGAAAGGGTAAGCACCCCGGGGCAAAAGGCTAAAAGGGG CCCCTTTTAGCCTTTTGCCCCGGGGTGCTTGCCCTTTCGGTTCCGTCGAGCCCCGCGTTGG CCAACGCGGGGCTCGACGGAACCGAAAGGGCAAGCACCCCGGGGCAAAAGGCTAAAAGGGG Deux couples d oligonucléotides sens (S) et anti-sens (AS) biotynilés en 5 de soixante nucléotides chacun ont été créés autour de chaque SNP g t>a et g a>g de sorte à représenter à la fois les allèles (L) en orange et (+) en noir. 122

179 PE 6. Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) La technique EMSA repose sur l aptitude des fragments d ADN purifiés à migrer à travers un gel polyacrilamide non-dénaturant à une vitesse inversement proportionnelle à leur poids moléculaire (Figure 60). Ainsi, si des protéines sont capables d interagir avec ces fragments d ADN et ainsi former un complexe, elles peuvent en altérer la vitesse de migration au cours de l électrophorèse. Grâce à l utilisation de sondes (séquences d ADN d intérêt) marquées (marquage chaud ou froid), il est possible d observer facilement le retard de migration et donc de juger très rapidement si une séquence d intérêt a été reconnue et liée par une protéine. La première étape consiste à «designer» les fragments d ADN contenant le polymorphisme d intérêt. Ces fragments d ADN sont des oligonucléotides qui ont été construits sur la base de la séquence du locus. Ainsi, autour de chacun des SNPs, deux couples d oligonucléotides sens et anti-sens biotynilés en 5 de soixante nucléotides chacun ont été créés (Sigma) (Tableau 7). Les couples d oligonucléotides complémentaires sont mélangés de façon équimolaire (1pmol/µl) dans un milieu 10 mm Tris, 1 mm EDTA, 50 mm NaCl (ph 8.0) et hybridés pour former une sonde double-brin selon un cycle de dénaturation à 95 C (5 minutes) et d hybridation par diminution progressive de la température jusqu à 4 C (1 C/min) dans un thermocycler PE9700 (Perkin Elmer). En parallèle, des protéines nucléaires et cytoplasmiques ont été extraites à partir de cellules de granulosa isolées de follicules ovariens +/+ et L/L en utilisant le kit NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (Thermo Scientific Pierce). L étape suivante consiste en la liaison des protéines nucléaires ou cytoplasmiques avec les quatre sondes biotinylées (20fmol) en respectant les conditions de liaison préconisées de base dans le kit LightShift Chemiluminescent EMSA (Thermo Scientific Pierce) en présence de 1µg de compétiteur polydi/dc. Les complexes sont séparés sur mini-gel de polyacrilamide 5% (Bio-Rad), puis transférés sur membranes de nylon Hybond N+ (GE Healthcare Lifescience) et immédiatement fixés par une exposition aux ultra-violets (120mJ/cm2) pendant une minute (Stratalinker, Stratagene). Les complexes sont révélés par chemiluminescence suite à l incubation avec la streptavidine couplée à une HRP (horseradish peroxidase) et l acquisition a ensuite été réalisée par une camera basse lumière G:Box (BioImaging Systems). 122

180 PE 7. Hypométhylation Test 5-Aza-2 -deoxycytidine La corrélation entre la perte de méthylation dans des régions spécifiques de l ADN et l activation de l expression des gènes associés est avérée et bien souvent étudiée en induisant une hypométhylation in vitro du génome, au moyen de molécules chimiques que sont la 5- Azacytidine (5ac), la 5-Aza-2 -Déoxycytidine (AZDC ou Décitabine) ou encore la Zebularine. Ces trois molécules constituent des analogues chimiques du nucléoside cytidine et sont connues pour s incorporer dans l ADN des cellules en division. En permettant la fixation des DNA méthyltransférases (DNMT) à l ADN, elles inhibent l activité des DNMT solubles et permettent une réplication de l ADN sous forme déméthylé, à l origine d une réactivation de l expression de gènes [316]. Il est ensuite aisé de suivre les niveaux d expression des gènes d intérêt par PCR en temps réel en comparant les conditions méthylées, des hypométhylées. Cet outil permet ainsi d avoir une vision globale (sans information de séquence) de l implication de la régulation par la méthylation sur l expression des gènes candidats étudiés. Pour ce faire, des cultures in vitro de cellules de granulosa, à raison de 2 millions de cellules/puits, de petits et moyens follicules (<3mm et 3-5mm respectivement) isolés d ovaires de brebis +/+, ont été incubées en présence d un gradient d AZDC (0,10, 30 et 100µM ; Sigma) pendant 48h. Chaque condition a été testée en double pour chaque culture indépendante. Au terme de ce temps de traitement, les cellules ont été lysées afin d en extraire l ARN total utilisés ultérieurement pour l analyses par PCR en temps réel de l expression des gènes B4GALNT2, IGF2BP1, GNGT2, ABI3 et PHOSPHO1 (PE 12, p. 129). 123

181 Figure 61. Principe de l effet du traitement au Bisulfite de Sodium (Sengenes, 2012) Réactions de sulphonation, désamination et désulfonation provoquées par le traitement au Bisulfite de Sodium. Le groupement méthyle d une 5-méthylcytosine la protège de la sulphonation et la réaction n a pas lieu. Figure 62. Principales étapes du séquençage Bisulfite Devenir des différents nucléotides d un double brin d ADN suite au traitement par le Bisulfite (selon le kit Qiagen), suivi d une amplification par PCR avec des amorces spécifiques à chacun des deux brins d ADN transformé. 124

182 PE 8. Séquençage Bisulfite/ Conversion par le Bisulfite Le traitement Bisulfite est une méthode chimique qui va permettre de «fixer» l information sur l état de méthylation de l ADN en provoquant une désamination des cytosines non méthylées en uracile, que la polymérase remplacera alors par des thymines au cours de la réaction PCR. Les cytosines méthylées quant à elles, ne seront pas transformées (Figure 61). Ainsi la modification épigénétique qui était non analysable dans sa forme brute devient un polymorphisme C/T dont l analyse est facilement abordable. Les différentes étapes du traitement au bisulfite ont été réalisées avec le kit Epitect Bisulfite (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur (Figure 62). La première étape du protocole permet la conversion des cytosines non méthylées en uraciles. Brièvement, la réaction a été réalisée à partir de 2µg d ADN génomique extrait de cellules de granulosa d animaux +/+ et L/L (extraction à base de sel d après Montgomery et al [312]) dans un mix bisulphite et ce, par des cycles de dénaturation à 99 C (5 minutes) et de conversion à 60 C (de 25 à 175 minutes). Les échantillons sous forme de simples brins ont ensuite été déposés sur colonne Epitect, lavés, puis soumis à la dernière étape de la conversion, la désulfonation. Après un dernier lavage, les échantillons ont été élués et enfin prêts pour l étape d amplification par PCR. Cette deuxième étape a nécessité l utilisation de deux couples d amorces (un pour chaque brin amplifié) choisis spécifiquement pour s hybrider à ce type de séquence transformée (logiciel Bisearch En effet les amorces doivent être préférées 1) plus longues que les amorces classiques, 20 à 27 nucléotides contre environ 18, pour pouvoir s hybrider puisque les fréquences de cystéine et de guanine sont réduites dans les sens 5-3 et 3-5 respectivement, 2) sans îlots CpG afin de s affranchir de biais au cours de l amplification, mais 3) avec des positions de cytosine «non CpG» pour s assurer de l amplification de séquences transformées au bisulfite. Les produits de PCR obtenus sont analysés par séquençage Sanger (Kit Prism AmpliTaq FS Big Dye Terminators dichlororhodamine V3.1, Applied Biosystems). 124

183 Figure 63. Endonucléases de restriction majoritairement utilisées (d après Sengenes, 2012) Figure 64. Principe de la technique MSRE pour l étude de l état de méthylation des sites CpG. (à partir de Sengenes, 2012) La digestion enzymatique par des enzymes sensibles à la méthylation (droite) permet le clivage de l ADN uniquement sur les sites de restriction ne présentant pas de 5-méthylcytidine. A l inverse, lorsque la digestion est réalisée par des enzymes non sensibles à la méthylation (gauche), chaque site de restriction indépendamment de son état de méthylation va pouvoir être clivé. La comparaison des profils d amplification permet d avoir une représentation de l état de méthylation de la zone considérée : les fragments amplifiés, issus de la digestion par l enzyme insensible à la méthylation, qui ne sont pas retrouvés dans le profil d amplification des fragments issus de la digestion par l isoschizomère sensible, sont considérés comme méthylés. 125

184 PE 9. Digestion enzymatique méthyl-sensible (MSRE, Methylation-Sensitive Restriction enzyme) Le principe de cette technique simple et rapide repose sur la capacité de certaines enzymes de restriction à digérer ou non l'adn selon l'état de méthylation du site de restriction (Figure 63). En règle générale, les enzymes qui sont sensibles à la méthylation ne coupent l'adn que lorsqu il est déméthylé. Ainsi lorsque la cystosine du site CpG est méthylée, l enzyme ne peut pas cliver son site de restriction et la séquence d ADN reste intacte (Figure 64, réadaptée de [317]). Le choix d amorces encadrant le site d intérêt rend ensuite possible la détermination de la présence ou non de méthylation, par la présence ou l absence de bande d amplification PCR sur gel d agarose. C est une technique très appropriée à l étude des promoteurs, néanmoins elle présente certaines précautions relatives au choix 1) des enzymes de restriction, puisque toutes ne sont pas disponibles pour un site CpG d intérêt, et 2) des amorces, qui ne doivent pas contenir de site CpG [318]. Une alternative à l utilisation d enzyme MSRE comme présentée ci-dessus, est d utiliser en parallèle un isoschizomère (une enzyme qui reconnait le même site de restriction) insensible à la méthylation (Figure 64). La comparaison des profils d amplification permet alors d avoir une meilleure représentation de l état de méthylation de la zone considérée puisque les fragments amplifiés, issus de la digestion par l enzyme insensible à la méthylation, qui ne sont pas retrouvés dans le profil d amplification des fragments issus de la digestion par l isoschizomère sensible sont considérés comme méthylés. Pour ce faire, 1µg d ADN génomique extrait de cellules de granulosa d animaux +/+ et L/L selon la procédure décrite par Montgomery et al [312] ont ainsi été digérés ou non avec 1µL (10 unités) des enzymes isoschizomères MspI ou HpaI (New England Biolabs). Après une réaction enzymatique d une nuit à 37 C, les échantillons ont été soumis à une amplification par PCR à l aide d une GoTaq polymérase (Promega) et au choix rigoureux d amorces encadrant chacun des deux îlots dans un thermocycleur PE9700 (Perkin Elmer). La localisation des îlots CpG sur les séquences régulatrices en amont de B4GALNT2 a préalablement été réalisée à l aide du logiciel CgGplot, Les produits d amplification ont ensuite suivi une migration éléctrophorétique sur gel d agarose afin de visualiser et comparer les profils obtenus pour les deux génotypes. 125

185 PE 10. Animaux L ensemble des procédures a été approuvé par la Direction Départementale des Services Vétérinaire de haute Garonne (n C ) et mis en œuvre en accord avec le Guide des soins et de l utilisation des animaux d élevage dans la recherche et l enseignement. L ensemble des expérimentations a été mené sur des brebis Lacaune homozygotes mutées (L/L, n=6 à 14) ou sauvages (+/+, n=6 à 13) adultes nullipares dont le cycle oestrien a été synchronisé par la pose d éponge intravaginale de progestagènes (FGA, acétate de fluorogestone, 40mg, Intervet) pendant 14 jours. Au retrait de l éponge, mimant la régression du corps jaune, un nouveau cycle s engage en commençant par une phase folliculaire de croissance terminale des follicules ovariens. Ce n est que 36h après le retrait de l éponge, en fin de phase folliculaire, que les ovaires sont collectés. Certains ont été directement placés dans une solution de fixation de Bouin puis inclus en paraffine pour des études histologiques ultérieures. D autres ont été finement disséqués afin d individualiser tous les follicules à antrum >1mm. Une fois les follicules isolés, ils ont été classés selon leur diamètre, des petits (1-3mm) aux gros ( 6mm) follicules en considérant le génotype, mais indépendamment de l état d atrésie. Les cellules de granulosa et les liquides folliculaires de chaque catégorie de follicule ont été récupérés selon la procédure décrite par Monniaux et al. en 1992 [319] et regroupés en lots par animal pour être ensuite stockés à -80 C jusqu à leur utilisation pour des extractions d ARN ou de protéines. Pour établir le profil endocrinien de l inhibine A plasmatique au cours d un cycle oestrien, 5 brebis +/+ et L/L synchronisées ont été utilisées. Le sang veineux des jugulaires de ces animaux a été prélevé au cours de la thèse de L. Drouilhet, afin d établir les profils endocriniens de l oestradiol, de la LH, de la FSH et de la progestérone dans le plasma. Pour ce faire, les prélèvements de sang ont débuté au moment du retrait de l éponge et ont été répétés toutes les 6h sur une période de 36h. Au cours des 36h suivantes, les prélèvements ont été effectués toutes les 4h (pour détecter le pic de LH) pour enfin être réalisés deux fois par jours pendant 11 jours de la phase lutéale. Les échantillons de sang ont été collectés dans des tubes héparinés et centrifugés 20 minutes à 400 g pour être stockés à -20 C jusqu à leur utilisation. 126

186 PE 11. Histochimie La localisation des protéines d intérêt par immunohistochimie (IHC) a été réalisée à partir de coupes sériées de 7µm d ovaires de brebis Lacaune +/+ et L/L, fixés au bouin et inclus en paraffine. Après une étape de déparaffinage, les coupes ont été incubées en présence d une solution de démasquage des épitopes antigèniques (Vector Laboratories) portée à ébullition pendant 3 minutes. Les lames ont ensuite été lavées deux fois 5 minutes en PBS- Saponine 0,1%, pour être soumises à une étape de suppression de l activité peroxydase endogène grâce à 0,3% d H en PBS-Saponine 0,1% pendant 30 minutes. Entre deux lavages, les coupes ont été incubées 30 minutes avec du sérum de jument non immun dilué au 1:15 afin de saturer tous les sites aspécifiques de liaison à l anticorps secondaire. Puis les coupes ont été incubées à 4 sur toute la nuit avec les anticorps primaires anti-b4galnt2 (polyclonal de chèvre, sc , Santa Cruz Biotechnology) dilué au 1:50 ou anti-igf2bp1 (polyclonal de lapin, gracieusement envoyé par Nielsen Finn, Copenhague, Danemark.) dilué au 1:5000 en présence de 0,1% de BSA PBS-Saponine 0,1%. Après trois lavages de 5 minutes, les coupes ont été incubées pendant 2h à température ambiante avec l anticorps secondaire biotinylé (jument anti-chèvre, Santa Cruz Biotechnology ; jument anti-lapin, Jackson ImmunoResearch Laboratories) dilué au 1:800 en PBS-Saponine 0,1% BSA 0,1%. A la fin du temps d incubation, les coupes ont été à nouveau lavées. L étape de révélation a été réalisée en incubant d abord les coupes en présence d un système amplificateur, le complexe avidine-biotine couplé à la peroxydase du kit ABC Vectastain Elite (Vector Laboraotories) pendant 30 minutes et ont ensuite été mises en présence du substrat de la peroxydase, le DAB à 0,4 mg/ml (3,3 diaminobenzidine tetrahydrochloride dehydrate, Sigma) dans 50mM Tris-HCL (ph 7,8) et 0,012% d H pendant 1 à 5 minutes à température ambiante. Les contrôles négatifs des marquages ont été réalisés par l omission de l anticorps primaire au cours du protocole. La localisation des protéines glycosylées par B4GALNT2 a été réalisée au moyen de deux outils : un anticorps primaire reconnaissant la chaine sucrée et le résidu GalNac en position β1,4, et une lectine reconnaissant spécifiquement le résidu GalNac. L IHC a été réalisée selon la procédure décrite ci-dessus en utilisant un anticorps primaire anti-sd a ou KM690 (monoclonal de souris, gracieusement envoyé par Shigeyuki Yamano, Kyowa Hakkok Kirin Co., Japon) et un anticorps secondaire de jument anti-souris biotinylé 127

187 (Jackson ImmunoResearch Laboratories) dilués respectivement au 1:1000 et au 1:800 en PBS-Saponine 0,1% -BSA 0,1%. Pour la lectine-histochimie (LHC), le déparaffinage des coupes a été suivi d une saturation des sites de liaison aspécifiques par une solution de blocage Carbo-Free (Vector-Laboratories) pendant 30 minutes. Après un lavage de 5 minutes en PBS- Tween 20 0,05% (Sigma), les coupes ont été incubées avec la lectine DBA biotinylée (Dolichos Biflorus Agglutinin, Vector Laboratories) à 0,5µg/mL en PBS pendant 2h à température ambiante, avec ou sans 0,1M de N-Acetyl-D-Galactosamine (GalNac, Sigma) pour contrôler la spécificité du marquage. A la fin du temps d incubation, les coupes ont été à nouveau lavées. L étape de révélation a été réalisée de la même façon qu en IHC et les contrôles négatifs des marquages ont été réalisés par l omission de la lectine DBA au cours du protocole. 128

188 Tableau 8. Séquences des amorces de PCR en temps réel et leur efficacité GGene Séquences des amorces (5 3 ) Efficacité (E) ACVR1 ACVR2A C-MYC IGF2BP1 INHA INHBA INHBB RPL19 TGFBR3 B4GALNT2 GNGT2 ABI3 PHOSPHO1 CCTAACATACCCAACAGAT CTTCCTTCTTGACACCAT GATTAGTCCTGTGGGAAC GTCTTCAAGAGAGGGATG CTCTGACTCTCTGCTCTC CTTCCTCATCCTCTTGTTC CAAGAAGGGGCAGCACATTAAAC TGCAGTTTCAGGAGGAGCAATC GACCAAGATGTCTCCCAG CAGTATGGAACCACAGCT GAAGAGGAAAGAAGAGGAA GTAGTGGTTGATGACTGT GTAAACCAGTACCGCATG CCTCCACGATCATATTGG AATGCCAATGCCAACTC CCCTTTCGCTACCTATACC CTCTTTCTCCAGTGTGAG GATCATTGAGGCATCCAG AAGATTGAGGTGCTGGTGGATG TTAACGACGCCGCTGGTC AGAAGGAAGTGAAGAACCCAAGAG GGCAGGCGTTCAAGGTGAG CTGGATGTAGATGATCTGGAGCTG CAGATAACTGTGCCCTCAGAGAAG CCATCCTGAGCCCAAATACCTC AATCCTCTTGTGGTCACCGAATAG 2 2,28 1,94 1,98 2 2,08 2,12 1,95 1, ,

189 PE 12. Transcription inverse et PCR quantitative L extraction des ARN totaux a été réalisée soit à partir de cellules de granulosa Lacaune +/+ et L/L, soit à partir des cellules de granulosa +/+ issues du traitement in vitro d hypométhylation avec l AZDC, selon la procédure du kit Nucleospin RNA II (Machereynagel). Un traitement avec 0,5µg/µL de DNAse a été effectué afin d écarter tout risque de contamination par de l ADN génomique. Un µg d ARN issu des cellules de granulosa +/+ et L/L a ensuite été rétrotranscrit en utilisant la reverse transcriptase Superscript II (Invitrogen) et 2µg d ARN issus du traitement avec l AZDC l ont été à l aide de la reverse transcriptase MMLV (Promega) dans un thermocycleur PE9700 (Perkin Elmer). La PCR quantitative en temps réel qui a suivi a été réalisée à partir de 8µL des ADNc produits dilués au 1/5 ème dans un i-cycler (Bio-Rad) à l aide du fluorophore «supermix» IQ TM SYBER Green 490 (Bio-Rad) et de 3µM des amorces spécifiques, définies par Beacon Designer v7.7 (Premier Bisoft International), pour suivre l expression des gènes d intérêt (Tableau 8) et du gène de référence RPL19 codant une protéine ribosomale ubiquiste. La quantification des expressions relatives des gènes d intérêts par rapport au gène de référence a été obtenue en effectuant le ratio R = [Efficacité d amplification de RPL19 Ct RPL19 / Efficacité d amplification du gène d intérêt Ct gène d intérêt ), où le Ct correspond au cycle treshold (nombre minimal de cycles d amplification nécessaires pour accumuler une fluorescence supérieure au bruit de fond) et où l efficacité d amplification a été préalablement déterminée pour chaque couple d amorces grâce au calcul de la pente d une droite de régression obtenue en reportant les valeurs de Ct issus d une dilution sériée d ADNc, en fonction du logarithme de la dilution (efficacité = e (-1/pente) ). L ensemble des données, excepté celles relatives à l hypométylation in vitro du génome, à été mis sous la forme de moyenne ± SEM. Les effets des génotypes +/+ vs L/L sur l expression des gènes ont été analysés par un test t de Student basé sur la comparaison de deux moyennes (+/+ vs L/L). Pour toutes les analyses, une différence de p-value p>0.05 a été considérée comme non significative. Pour un problème de répétabilité des expérimentations d'hypométhylation in vitro du génome, les Ct obtenus, pour chacune des conditions d'azdc testée, ont été cumulés à partir des différentes cultures indépendantes réalisées. Il a ainsi été possible d'obtenir un ratio R représentatif de l'expression relative des gènes d'intérêt par rapport au gène de référence pour chaque condition. Cette utilisation des données explique l'absence de SEM dans la représentation graphique des résultats préliminaires obtenus. 129

190 PE 13. Analyse par Western-Blotting Les études ont été menées soit à partir de pools de 25 µg d extraits protéiques totaux (dosés à l aide du kit BCAssay, Uptima Interchim) issus de cellules de granulosa de gros follicules à antrum ( 6mm ; procédure décrite [127]) +/+ et L/L, resuspendus dans du tampon de lyse RIPA (Sigma), soit à partir des protéines précipitées (PE 15, p. 132). Les échantillons ont été repris dans du tampon Laemli (Bio-Rad) en condition dénaturante (β-mercaptoethanol, 90 C pendant 10 minutes) pour être ensuite soumis à une électrophorèse SDS-PAGE dans un gel de polyacrilamide à 10% et transférés sur des membranes de nitrocellulose. Après 3 lavages en PBS-Tween 20 0,05% (Sigma, PBST), les membranes ont été saturées soit en solution Carbo-Free (Vector Laboratories) puis incubées avec 0,5µg/mL de lectine DBA biotinylée (Vector Laboratories) en PBS pendant 1h à température ambiante, soit dans du lait en poudre écrémé (Régilait) 5% -PBS-Tween 20 0,05% pendant 30 minutes à température ambiante puis incubées avec: - l anticorps primaire anti-β-actine (polyclonal de lapin ; 1:1250 ; Bioss) en PBST-BSA 0,1% pendant une nuit à 4 C, puis 1h à température ambiante avec l anticorps secondaire anti- IgG de souris couplé à une péroxydase (HRP ; 1:2500, Jackson ImmunoResearch Laboratories), - ou, les anticorps anti-inhibine α (monoclonal de souris ; 1:150 ; Abd Serotec), anti- Inhibine βa (polyclonal de lapin ; 1:250 ; USCN) ou KM694 (monoclonal de souris ; 1 :1000) en PBST -BSA 0,1% pendant 2h à température ambiante, puis à nouveau 2h avec les anticorps secondaires anti- IgG de lapin ou IgG de souris couplés à une peroxydase (HRP ; 1 :5000 ; Jackson ImmunoResearch Laboratories) en PBST-BSA 0,1%. Après 3 lavages, les protéines précipitées et marquées par la lectine DBA ont été révélées par une réaction d amplification ABC (Vectastain, Vector Laboratories) suivie d une détection par luminescence à l aide du kit ECL Plus (GE Healthcare). Pour toutes les autres, la révélation par luminescence à été réalisée directement au moyen du kit ECL Plus detection (GE Healthcare Life Sciences). Enfin la luminesence à été capturée soit par un imageur Image Master VDS-CL (Amersham Pharmacia Biotech), soit par une exposition d 1 à 20 minutes des membranes sur des films autoradiographiques (GE Healthcare Life Sciences). 130

191 PE 14. Transfection transitoire de cellules de granulosa Des cellules de granulosa issues de petits follicules à antrum +/+, ont été mises en culture a raison de cellules viables/puits, dans un système de lame Lab-Tek 8 puits (Thermo- Scientific) pendant 48h à 37 C, 5% CO 2 dans du milieu McCoy s 5a supplémenté de 3% de sérum ovin fetal (SOF). Les cellules ont ensuite été transfectées transitoirement pendant 18h avec 1µg de vecteur pcdna3.1 vide ou pcdna-hb4galnt2 (gracieusement fourni par A.Harduin Lepers, Lille) à l aide du réactif de transfection JetPEI (Polyplus Transfection) en respectant un ratio ADN/JetPei de ½ (w/w) préconisé par le fournisseur. Par la suite, le milieu a été remplacé par du milieu McCoy s 5a - 3% de SOF frais pour encore 30h de culture. Au terme de cette période de culture, les cellules ont été fixées dans 4% de paraformaldéhyde à 10% pendant 10 minutes à 4 C. Les lames ont ensuite été lavées en PBS-Saponine 0,1% puis les cellules ont été marquées à la lectine DBA (0,5µg/µL) selon la procédure décrite précédemment (PE 11, p. 127) 131

192 Figure 65. Principe de la Lectine-/Immuno-précipitation et Western-Blotting La lectine-/immuno-précipitation des protéines potentiellement cibles de B4GALNT2 est réalisée en incubant des extraits protéiques totaux (cellules de granulosa ou liquides folliculaire) en présence de billes d agarose couplées à la lectine DBA ou de protéine A-sépharose couplée à l anticorps KM694. Après centrifugation, le surnageant, à savoir tout ce qui n a pas été reconnu soit par la lectine, soit par l anticorps est retiré. Après plusieurs lavages, les complexes protéines précipitées-bille d agarose/protéine A sépharose sont séparés par dénaturation puis centrifugés. Le surnageant contenant les protéines précipitées est ensuite séparé par électrophorèse SDS-PAGE pour être enfin transféré sur des membranes de nitrocellulose. Les membranes ont ensuité été incubées avec la lectine DBA biotinylée ou avec l anticorps primaire KM694, puis avec l anticorps secondaire couplé à une peroxydase. Enfin, les protéines précipitées ont été révélées par luminescence, elle-même capturée par un imageur. GalNac : N-Acetyl-D-galactosamine ; P : précipitation ; B : lectine-/immuno-blotting. 132

193 PE 15. Lectine/Immuno-précipitation La stratégie utilisée est présentée dans la Figure 65. La première étape a consisté en la lectine-/immuno-précipitation des protéines potentiellement cibles de B4GALNT2. Pour ce faire, des extraits protéiques totaux issus de culots de cellules de granulosa resuspendus dans du tampon de lyse RIPA (Sigma) [127], ainsi que des liquides folliculaires de gros follicules à antrum ( 6mm), tous provenant d animaux Lacaune +/+ et L/L ont été utilisés. Après une centrifugation de 20 minutes à 15000g et 4 C, la concentration des protéines des surnageants a été déterminée par un dosage colorimétrique à l aide du kit BCAssay (Uptima Interchim). Ainsi, des échantillons protéiques correspondants à 50µg de pool d extraits cellulaires ou 200µg de pool de liquides folliculaires +/+ et L/L ont été incubés avec environ 30µL de billes d agarose couplées à la lectine DBA (Vector Laboratories) dans 300µL de tampon RIPA pendant 2h à température ambiante et ce, sur une platerforme rotative. Une alternative a été d incuber 250µg de protéines issues de liquide folliculaire +/+ et L/L avec 25µL de protéine A- sépharose (Vector Laboratories) couplée à l anticorps KM694 (dilution 1:300). Les échantillons ont ensuite été brièvement centrifugés (1000g, 2 minutes) afin de retirer le surnageant, à savoir tout ce qui n a pas été reconnu soit par la lectine, soit par l anticorps, et de rincer les complexes protéines précipitées-billes d agarose/protéine A sépharose 3 fois avec 1mL de RIPA. Les complexes ont été resuspendus dans du tampon Laemli (Bio-Rad), séparés par dénaturation à 90 C pendant 10 minutes et enfin centrifugés brièvement de sorte à ne réveler ultérieurement que les protéines précipitées par western-blot (PE 13, p. 130). 132

194 Figure 66. Principe de la stratégie d identification des glycoprotéines par chromatographie en phase liquide nano-débit couplée à la spectrométrie de masse en tandem. Des protéines de pools de liquides folliculaires +/+ et L/L ont été précipitées à l aide de bille d agarose couplées à la lectine DBA. Elles ont ensuite été éluées du complexe précipité par compétition avec du N-Acetyl-D-galactosamine (GalNac) en excès. Après centrifugation, les glycoprotéines purifiées ont été soumises à un SDS-PAGE (12 minutes à 90V), et colorées par la suite au Bleu de Coomassie. Les portions de gel les renfermant ont été extraites et les protéines ont été digérées directement dans le gel (trypsine). Les mélanges de peptides pour les génotypes +/+ et L/L ainsi obtenus ont été séparés sur colonne par chromatographie en phase liquide nano-débit puis introduits dans le spectromètre de masse où ils ont été ionisés et ainsi fragmentés en phase gazeuse. Sur le principe d une spectrométrie de masse en tandem, une première analyse des ions a été réalisée en fonction du rapport masse/charge qui les caractérise. Les 20 ions les plus intenses ont été sélectionnés puis fragmentés par collision pour être enfin détectés. Les informations de masse et de quantité d ions détectés ont permis la construction de spectre d ions. Après interrogation dans une base de données les données, brutes ont été soumises à un logiciel pour l identification des peptides. 133

195 PE 16. Identification des glycoprotéines par spectrométrie de masse Pour l identification par spectrométrie de masse des protéines précipitées par la lectine DBA, 1mg de protéines issues d un pool de liquides folliculaires de petits et gros follicules Lacaune +/+ et L/L (un pool par génotype) a été incubé avec 60µL d agarose couplé à la lectine DBA dans du tampon RIPA (Lectine précipitation PE 15, p. 132). Après l étape de centrifugation, le surnageant a été collecté et placé à -20 C pour des analyses ultérieures. Les glycoprotéines purifiées ont été lavées puis éluées du complexe précipité par compétition en les incubant avec 0,2M de N-Acetyl-D-galactosamine (GalNac), le sucre spécifique de la DBA, pendant 90 minutes à température ambiante et sous agitation. Les échantillons élués ont alors été soumis à un SDS-PAGE dans un gel polyacrylamide de 10% (12 minutes à 90V) coloré par la suite au Bleu de Coomassie. Les protéines ont ensuite été digérées, toujours dans le gel, par de la trypsine (d après [320]) et chaque mélange de peptides obtenu pour les génotypes respectifs +/+ et L/L a été analysé en triplicat par chromatographie en phase liquide nano-débit couplée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Cette étape a été réalisée par la plateforme d'analyse Intégrative des Biomarqueurs (PAIB) du centre INRA de Tours à l aide d un système nanouhplc Ultimate 3000 RSLC (Dionex) couplé à un spectromètre de masse à haute résolution LTQ Velos Orbitrap ETD (Thermo Electron, US). La procédure est résumée dans la Figure 66. Brièvement, pour la première étape de chromatographie, les échantillons ont été dessalés pour les rendre compatibles aux conditions d élution puis ont été concentrés par une précolonne Acclaim PepMap100 C18 trap (Dionex), pour être ensuite séparés sur une colonne analytique phase réverse Acclaim PepMAp C18 (Dionex) par un gradient d acétonitrile de 4 à 45%. Les échantillons sont alors introduits dans le spectromètre de masse pour l acquisition des données. Pour ce faire les peptides vont être ionisés et ainsi fragmentés en phase gazeuse, pour être séparés en fonction du rapport masse/charge qui les caractérise. Selon le principe d une spectrométrie de masse MS/MS, une première analyse des ions a été effectuée à l aide de l Orbitrap et les 20 ions les plus intenses ont été sélectionnés. Ils ont alors été fragmentés par collision puis détectés par un détecteur qui a alors fourni un signal électrique proportionnel au nombre d ions détectés par un enregistreur. Grâce à la compilation de toutes les informations de masse et de quantité des ions détectés, il est possible de construire un spectre d ions. La masse des ions issus de cette analyse MS/MS a servi à interroger la base de données Uniprot_sprot (2012_07) à l aide du moteur de recherche Mascot v2.2 (Matrix Science). Les 133

196 paramètres de recherche des ions ont été établis de sorte à considérer notamment la digestion à la trypsine qui avait été réalisée en amont et avait conduit à deux clivages (arginine et lysines en C terminal), mais ils prennent également en compte les modifications posttraductionnelles variables telles que l acétylation en N-terminal des protéines et l oxydation des méthionines. Les données brutes obtenues de Mascot ont ensuite été soumises au logiciel Scaffold 3 (v 3.4.3, Proteom Software) pour l identification des peptides. L identification des peptides et des protéines a été réalisée à l aide d un algorithme (Peptide and Protein Prophet), avec une probabilité >95%. Seules les protéines représentées par 4 peptides identifiés ont été considérées pour cette analyse. Les expressions différentielles des protéines entre les deux génotypes ont été déterminées à l aide du module «spectral counting quantitative» du logiciel Scaffold 3 Q+ (v 3.4, Proteome Softaware) en quantifiant des protéines distinctes, identifiées à partir de deux répétitions biologiques. Les différences ont ensuite été analysées par un test-t, et ont été considérées significatives avec une p-value <0,05 entre les deux génotypes. 134

197 PE 17. Dosages ELISA Les dosages ont été réalisés d une part dans les liquides folliculaires des petits (<3mm, +/+, n=30 ; L/L, n=28) et des gros follicules ( 6mm, +/+, n=13 ; L/L, n=20) collectés par pool par animal et d autre part, dans les plasmas des brebis Lacaune +/+ et L/L prélevés au cours de la thèse de L. Drouilhet (+/+, n =5 ; L/L, n=5). Les plasmas ont été dosés à la fois au temps 36h après le retrait de l éponge, état dans lequel se situent les liquides folliculaires collectés, ainsi que tout au long d un cycle oestrien. L ensemble des dosages de l inhibine A a été effectué en suivant les recommandations du kit Inhibin A ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay ; DSL t, Beckman Coulter), qui permet la mesure de l inhibine A uniquement sous sa forme dimérique, avec quelques modifications afin d augmenter la sensibilité et la répétabilité du dosage. Les gammes ont été réalisées dans du sérum ovin castré (SOC) et les concentrations d inhibine A ont été déterminées à partir de 50µL de liquide folliculaire de petits et de gros follicules préalablement dilués au 1:1000 et 1:5000 respectivement, dans du SOC, ou de 100µL de plasma non dilué. Juste avant le dosage, les échantillons ont été décongelés dans un bain d eau tiède, vortexés puis centrifugés (2000 g, 4 C, 20 minutes pour les plasmas) afin de retirer les fragments de cellules qui pourraient interférer avec les réactifs du dosage. Les échantillons ont ensuite été incubés en présence d un anticorps anti-inhibine βa fixé aux microplaques, pendant 3h à 25 C sous agitation, puis une nuit à 4 C. La suite du dosage a été réalisée en respectant la procédure du kit. Après 6 lavages en solution tampon, 100µL/puits d anticorps anti-inhibine α couplé à une peroxydase HRP ont été ajoutés. Après 1h d incubation à 25 C sous agitation, les microplaques sont à nouveau lavées 6 fois en solution tampon et 100µL/puits du substrat tetramethylbenzidine (TMB) chromogènes sont mis à incuber pendant 15 minutes à 25 C. Au terme de ce temps d incubation, 100µL/puits de solution acide d arrêt de la réaction de réduction sont ajoutés. L absorbance a été ensuite lue à 450nm puis à 620nm pour déterminer le bruit de fond, à l aide d un spectrophotomètre SUNRISE et du logiciel Magellan v6.6. De la même façon, l ensemble des dosages de l activine A a été effectué en suivant les recommandations du kit Activin A Quantiquine ELISA (DAC00B, R&D Systems, France), qui permet la mesure de l activine A uniquement sous sa forme dimérique. Les concentrations d inhibine A ont été déterminées à partir de 100µL de plasma non dilué, ou 100µL de liquide folliculaire de petits et de gros follicules préalablement dilués au 1 :500, 1 :10000 et 1 :

198 Figure 67. Parallélisme des courbes de dilution des liquides folliculaires et des plasmas ovins avec la courbe standard de l Inhibine A et l Activine A des kits ELISA Le graphique représente les résultats de plusieurs dilutions de liquides folliculaires (FF), de plasmas ovins de trois brebis (E , E et E ), de l activine A recombinante humaine (racta) et de l Inhibine A bovine ou de l Activine A humaine de la courbe standard (SC) des kits ELISA. Pour les dosages d inhibine A, les dilutions des échantillons ovins ont été réalisés dans du plasma ovin castré. Pour les dosages de l activine A, les dilutions des échantillons ont été réalisés dans le tampon de dilution fourni par le kit. L absorbance (optical density), mesurée à 450 et 620 nm, est directement proportionnelle à la concentration d Inhibine A et d Activine A dans les échantillons. 136

199 La limite de détection des dosages d inhibine A et d activine A est estimée à 5,0 pg.ml -1 et 7.85 pg.ml -1 respectivement. Pour valider les dosages, des dilutions sériées de différents échantillons de liquides folliculaire et de plasma ont été analysées. Les résultats montrent que les courbes de dilutions sont linéaires et parallèles à la courbe standard de la gamme (Figure 67). Les coefficients moyens de variation intra- et inter-dosage (SEM/moyenne) sont de 4,06% et de 7,3% respectivement pour le dosage de l inhibine A et de 4,06% et 5,7% pour le dosage de l activine A. Les données obtenues ont été mises sous la forme de moyenne ± SEM. Les analyses statistiques de ces données ont été réalisées grâce au logiciel Prism v.6 (GraphPad software), par un test t de Student ou par un test ANOVA à 2 facteurs (génotype et temps du prélèvement), suivi par un test post-hoc Tukey de comparaisons multiples pour la comparaison entre deux ou plusieurs moyennes respectivement. Pour l ensemble des analyses, les différences avec une p-value > 0,05 n ont pas été considérées significatives. 136

200 ARTICLE Drouilhet-Mansanet et al,

201 The Highly Prolific Phenotype of Lacaune Sheep Is Associated with an Ectopic Expression of the B4GALNT2 Gene within the Ovary Laurence Drouilhet 1., Camille Mansanet 2., Julien Sarry 1, Kamila Tabet 1, Philippe Bardou 3, Florent Woloszyn 1,Jérome Lluch 4, Grégoire Harichaux 2,5, Catherine Viguié 6, Danielle Monniaux 2, Loys Bodin 7, Philippe Mulsant 1, Stéphane Fabre 1,2 * 1 INRA-ENVT, UMR 444, Laboratoire de Génétique Cellulaire, Castanet-Tolosan, France, 2 INRA UMR 85, CNRS UMR 7247, Université de Tours, IFCE, Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Nouzilly, France, 3 INRA, SIGENAE, Laboratoire de Génétique Cellulaire, Castanet-Tolosan, France, 4 INRA, GeT-PlaGe Genotoul, Castanet-Tolosan, France, 5 INRA, Plate-forme d Analyse Intégrative des Biomolécules, Laboratoire de Spectrométrie de Masse, Nouzilly, France, 6 UMR 1331 INRA-ENVT- EIP-INPT-UPS, Toxicologie Alimentaire, Toulouse, France, 7 INRA, UR 631, Station d Amélioration Génétique des Animaux, Castanet-Tolosan, France Abstract Prolific sheep have proven to be a valuable model to identify genes and mutations implicated in female fertility. In the Lacaune sheep breed, large variation in litter size is genetically determined by the segregation of a fecundity major gene influencing ovulation rate, named FecL and its prolific allele FecL L. Our previous work localized FecL on sheep chromosome 11 within a locus of 1.1 Mb encompassing 20 genes. With the aim to identify the FecL gene, we developed a high throughput sequencing strategy of long-range PCR fragments spanning the locus of FecL L carrier and non-carrier ewes. Resulting informative markers defined a new kb minimal interval. The reduced FecL locus contained only two genes, insulin-like growth factor 2 mrna binding protein 1 (IGF2BP1) and beta-1,4-n-acetyl-galactosaminyl transferase 2 (B4GALNT2), and we identified two SNP in complete linkage disequilibrium with FecL L. B4GALNT2 appeared as the best positional and expressional candidate for FecL, since it showed an ectopic expression in the ovarian follicles of FecL L /FecL L ewes at mrna and protein levels. In FecL L carrier ewes only, B4GALNT2 transferase activity was localized in granulosa cells and specifically glycosylated proteins were detected in granulosa cell extracts and follicular fluids. The identification of these glycoproteins by mass spectrometry revealed at least 10 proteins, including inhibin alpha and betaa subunits, as potential targets of B4GALNT2 activity. Specific ovarian protein glycosylation by B4GALNT2 is proposed as a new mechanism of ovulation rate regulation in sheep, and could contribute to open new fields of investigation to understand female infertility pathogenesis. Citation: Drouilhet L, Mansanet C, Sarry J, Tabet K, Bardou P, et al. (2013) The Highly Prolific Phenotype of Lacaune Sheep Is Associated with an Ectopic Expression of the B4GALNT2 Gene within the Ovary. PLoS Genet 9(9): e doi: /journal.pgen Editor: Tosso Leeb, University of Bern, Switzerland Received April 5, 2013; Accepted August 6, 2013; Published September 26, 2013 Copyright: ß 2013 Drouilhet et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: This work was supported by grants from the French Conseil Régional Midi-Pyrénées, Agence Nationale de la Recherche GENOVUL project (ANR-05- GANI ) and European Union contract SABRE (FOOD-CT ). LD and CM were supported in part by a grant from the Fonds d Aide à la Recherche Organon, FARO and Région Centre, respectively. The high-resolution mass spectrometer was financed (SMHART project) by the European Regional Development Fund (ERDF), the Conseil Régional du Centre, the French National Institute for Agricultural Research (INRA) and the French National Institute of Health and Medical Research (INSERM). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * stephane.fabre@tours.inra.fr. These authors contributed equally to this work. Introduction Women, cattle, goats and ewes have generally one or two offspring, whereas other mammals, such as sows, rodents and dogs are prolific and produce more than three offspring. It relies on the number of ovulations at each estrus cycle i.e. the ovulation rate (OR), for which the underlying genetic mechanism was puzzling until the identification of fecundity genes in sheep, bone morphogenetic protein-15 (BMP15), growth and differentiation factor-9 (GDF9) and BMP receptor-1b (BMPR1B) [1]. Following the discovery of sheep fecundity genes, several research groups have focused on BMP15 and GDF9 and they have found numerous mutations associated with human ovarian pathologies such as premature ovarian failure or polycystic ovary syndrome [2]. Thus, prolific sheep are now considered as valuable models for identifying genes and mutations involved in mechanisms controlling the ovarian function, for agronomical purposes such as genetic selection of prolificacy, and for clinical purposes in the case of female infertility or subfertility. In the meat strain of the Lacaune sheep breed, large variation in litter size has been observed and genetic studies explained this variation by the segregation of at least two major genes influencing OR and prolificacy, one being X-linked and named FecX, the second being autosomal and named FecL [3,4]. FecX is known as BMP15 and in the Lacaune breed, the mutant allele (FecX L ) associated with high prolificacy was identified as a pcys321tyr substitution altering the BMP15 protein function [3]. Heterozygous FecX L mutation is associated with a twofold increase in OR, PLOS Genetics 1 September 2013 Volume 9 Issue 9 e

202 B4GALNT2 as Fecundity Gene Author Summary Prolific sheep have proven to be a valuable model to identify genes and mutations implicated in ovarian function and female fertility. Indeed, fecundity genes of the Bone Morphogenetic Protein (BMP) family discovered in sheep was evidenced as genetic candidates to explain female infertility pathologies. Studying French Lacaune sheep breed, we discovered another fecundity gene named B4GALNT2, encoding a glycosylation enzyme that is not related to the BMP family. The high prolificacy of Lacaune sheep was explained by overexpression of B4GALNT2 in the ovary leading to atypical glycosylation of inhibin, an important hormone regulating ovarian function. Our findings open promising fields of investigation to better understand female fertility disorders. but homozygous FecX L /FecX L ewes are sterile, thus mimicking the phenotype observed for the other 5 mutations described in the ovine BMP15 gene [5 7]. The influence of the autosomal FecL L mutation on OR is additive with one copy increasing OR by about 1.5 and two copies by about 3.0 [4,8]. We have recently established that the FecL locus influences both the ovarian activity and the endocrine profiles [9]. Indeed, increased OR in homozygous FecL L /FecL L (thereafter named L/L) ewes is associated with an increased number of gonadotropin-dependent follicles with a diameter greater than 3 mm, an increase in plasma estradiol concentrations, and an increase in the frequency of Luteinizing Hormone (LH) pulsatility during the follicular phase, leading to a precocious LH surge. In contrast, plasma concentrations of Follicle Stimulating Hormone (FSH) were not different compared to wild-type ewes. Based on ovarian phenotype and endocrine profiles, these findings suggest that the FecL L mutation affects ovarian function in a different way compared to other known hyperprolificacy-associated mutations, all affecting genes of the bone morphogenetic protein signaling system, BMP15, GDF9 and BMPR1B [1,10]. The FecL L mutation associated with increased OR has not yet been identified. In a previous work, a full genome scan localized the FecL locus on sheep chromosome 11 (OAR11). Fine mapping reduced the interval containing FecL to markers BM17132 and FAM117A, corresponding to a synteny block of 1.1 megabases on human chromosome 17 (HSA17), which encompasses 20 genes [8]. With the aim to identify the FecL gene and its hyperprolificacyassociated mutation, we combined different approaches based on genetic fine mapping (both classical development of genetic markers and high throughput Roche 454 sequencing strategy), gene expression analysis, histochemistry and protein identification by mass spectrometry. From our results, we propose B4GALNT2, encoding the glycosylation enzyme beta-1,4-n-acetyl-galactosaminyl transferase 2, as the FecL gene. Finally, the FecL sheep model of prolificacy-associated mutation leads to the discovery of a new pathway involved in the regulation of folliculogenesis and ovulation rate. Results Fine mapping The interval of localization previously published corresponded to a synteny block of 1.1 megabases on HSA17 [8]. Genotyping additional markers further reduced it across the whole experimental Lacaune pedigree (F1, BC and F1xBC representing 189 animals). This reduced interval was comprised between markers GNGT2-M2 (OAR11: ) and Ms162 (OAR11: ) encompassing 488 kb on the ovine chromosome 11 (OAR11, ovine genome version 3.1 released October 2012) and corresponded to a block of synteny of 479 kb on bovine chromosome 19 (BTA19, bovine genome version released October 2011). This entire region was sequenced with the Roche 454 sequencing technology, using long-range PCR, in one heterozygous L/+ animal and two homozygous +/+ and L/L animals. Sixty-two polymorphisms were evidenced and an appropriate subset was genotyped on the recombinant animals allowing the reduction of the locus. This new interval of localization, comprised between two SNP markers on OAR11 g t.c (recombinant ewe nu990855) and g g.c (recombinant ewe nu60718), was estimated at 197 kb based on ovine genome OARv3.1 (Figure 1). This region encompasses 3 predicted protein-coding genes on the ovine genome, named B4GALNT2 (beta-1,4-n-acetyl-galactosaminyl transferase 2), EZR (ezrin) and IGF2BP1 (insulin-like growth factor 2 mrna binding protein 1). Screening of the polymorphisms fully associated with the FecL L mutation In order to identify all the polymorphisms contained within this 197 kb interval, we analyzed separately the sequences of the two homozygous L/L and +/+ animals. Sequence information coming from the Roche 454 sequencing technology was contained within 13 and 17 independent sequence contigs in L/L and +/+ animals, respectively. We have then completed these sequences by Sanger sequencing to link contigs with each other. By comparing the two sequences, we identified 49 polymorphisms (43 SNP, 4 microsatellites and 2 Insertion/Deletion, Table 1). None of the detected variants affected the coding sequence of the annotated genes. Polymorphisms were first tested on a set of one L/L, one L/+ and 2to6 +/+ animals for allele sharing. If the allele associated with the L-haplotype was not found on a wild chromosome, then the marker was tested on successive subsets of wild chromosomes from the Lacaune families and other sheep populations, as described in the materials and methods section. There were only two polymorphisms segregating as the FecL L mutation, i.e. fully associated with the hyperprolific phenotype: the SNP g t.a, localized in the intron 7 of B4GALNT2, and the SNP g a.g localized in the intergenic sequence between B4GALNT2 and EZR, 10.4 kb upstream of EZR (Figure 1). The sequencing of the locus indicated a real interval of kb (GenBank:KC352617) and allowed to correct and complete the ovine reference genome sequence in this region. The locus effectively contained the full sequence of the B4GALNT2 gene based on the ovine B4GALNT2 mrna (sequenced from Lacaune sheep, GenBank:KC175557), the full sequence of the IGF2BP1 gene based on the bovine IGF2BP1 mrna (Gen- Bank:NM_ ) and a BLAST hit with the bovine EZR mrna (GenBank:NM_174217) that we assumed to be a pseudogene. Indeed, the bovine EZR gene is located in a region of BTA9 that was not syntenic of the ovine FecL locus on OAR11 and the predicted sequence of this EZR annotation on OAR11 carried a premature STOP codon limiting the predicted protein to 223 amino-acids instead of 581. Consequently, only B4GALNT2 and IGF2BP1 were considered as positional candidate genes for FecL. Gene expression analysis The mrna expression of the 2 positional candidate genes within the FecL locus was checked by real-time quantitative PCR in different tissues of the reproductive axis (hypothalamus, pituitary gland and ovarian granulosa and theca cells) isolated PLOS Genetics 2 September 2013 Volume 9 Issue 9 e

203 B4GALNT2 as Fecundity Gene Figure 1. Map of the FecL locus on ovine chromosome 11. The genes are indicated above the line, markers are indicated by points under the line. The FecL locus (197 kb on OARv3.1, or kb, our own sequencing) is flanked by the two closest recombinant markers, g t.c and g g.c. Recombinants: white box, zero-recombinant zone; gray boxes, zone with one recombinant; black boxes, at least two recombinants with FecL. N: no Allele sharing between wild-type and carrier animals for the FecL L allele. doi: /journal.pgen g001 from +/+ and L/L ewes. In the hypothalamus and the pituitary gland, B4GALNT2 and IGF2BP1 mrna amounts were similar between genotypes, but they were significantly higher in the ovarian cells of the L/L, compared to +/+ ewes (Figure 2). Interestingly, B4GALNT2 exhibited a 1000-fold higher expression level in the L/L granulosa and theca cells, whereas IGF2BP1 expression was enhanced 6-fold only in granulosa cells and was found unchanged in theca cells. To check if this over-expression might concern other genes of the locus, the expression of the flanking genes within the one recombinant zone (Figure 1), i.e. PHOSPHO1, ABI3 and GNGT2 on the one side and GIP, SNF8, UBE2Z, ATP5G1 and CALCOCO2 on the other side, was also studied. None of these genes showed an altered expression in the different L/L tissues of the reproductive axis. Given that GIP was not expressed in those tissues, its expression was checked in intestine and no difference was found between genotypes (supplemental figure S1). Moreover, as IGF2BP1 is a RNA binding protein controlling the steady-state level of the MYC oncogene mrna [11] and the ß-actin (ACTB) gene translation [12] we checked for MYC mrna expression and ACTB protein accumulation in Lacaune granulosa cells as a possible consequence of IGF2BP1 overexpression (supplemental figure S2). Real-time PCR analysis showed a large decreased expression of the MYC gene in large follicles compared to small ones (18-fold, p,0.001), but no alteration associated with elevated IGF2BP1 mrna level in L/L granulosa cells. ACTB accumulation checked by western blotting was not affected by the L/L genotype either. Thus, the localization of the B4GALNT2 gene within the minimal locus, the presence of the SNP g t.a on OAR11, localized in the intron 7 of this gene as the possible causal mutation, and the presence of a very high overexpression of the gene in the ovarian cells of L/L ewes led us to further investigate B4GALNT2 ectopic expression and activity in the ovary of the FecL L carrier animals. Localization of B4GALNT2 protein and its activity in the FecL L ovary B4GALNT2 is a b1,4-n-acetylgalactosaminyltransferase which was previously shown to be involved in the synthesis of the Sd(a) antigen, a carbohydrate expressed on erythrocytes, colonic mucosa and other tissues. B4GALNT2 transfers a beta-1,4-linked GalNAc to the galactose residue of an alpha-2,3-sialylated chain found on both N- and O-linked glycans [13]. Immunohistochemistry experiments using an antibody raised against B4GALNT2 showed that the enzyme was detectable in the granulosa cells of L/L ovarian follicles only (Figure 3). The use of the Dolichos Biflorus Agglutinin (DBA) lectin and the KM694 antibody raised against the Sd(a) antigen, both specific of the glycosylation activity of B4GALNT2, clearly localized the targets of the enzyme only in the granulosa cells and the antral follicular fluid of L/L ovaries (Figure 4). To confirm the glycosylation activity of B4GALNT2, +/+ ovine granulosa cells were transiently transfected by a B4GALNT2 expressing construct. Specific staining with DBA was observed in B4GALNT2-transfected +/+ granulosa cells (Figure 5), indicating that overexpression of the B4GALNT2 gene is directly related to positive DBA staining. The presence of a B4GALNT2 activity in the granulosa cells of the FecL L carrier ewes was confirmed by the results of DBA lectin and KM694 antibody precipitation and subsequent western-blot experiments using L/L and +/+ granulosa cell extracts and follicular fluids (Figure 6). Indeed, DBA or KM694 staining revealed very different glycoprotein profiles between L/L and +/+ ewes. In both granulosa cells and follicular fluids, at least 7 glycoprotein forms of various molecular weights (ranging from 40 to over 250 kda) were retained by DBA lectin precipitation in the L/L ewes and were absent in non-carrier ewes. The KM694 immunoprecipitation of the proteins contained in the follicular fluids of the FecL L carrier ewes evidenced a subset of these glycoproteins, with a high molecular weight. Mass spectrometry identification of the glycosylated targets of B4GALNT2 We aimed at identifying the glycoproteins which are the targets of B4GALNT2 in ovary after their purification from L/L follicular fluids using DBA lectin affinity, followed by high-resolution mass spectrometry. Peptides and proteins purified from L/L and +/+ follicular fluids were identified with at least four independent peptides and a high probability threshold (.95%). This allowed identifying, on two repetitions of the experiment, 10 glycoproteins only present in FecL L follicular fluids, and then suspected to be the PLOS Genetics 3 September 2013 Volume 9 Issue 9 e

204 B4GALNT2 as Fecundity Gene Table 1. Polymorphisms within the minimal FecL locus and allele sharing. OAR11 position FecL locus position Polymorphism type (+.L) Allele sharing OAR11 position FecL Locus position Polymorphism type Allele sharing SNP T.C 0/93 a SNP A.G 10/ SNP T.C 1/ SNP T.C 10/ SNP C.T 1/ SNP C.T 6/ SNP G.A 1/ SNP G.T 6/ SNP C.T 1/ SNP T.C 3/ SNP C.T 5/ SNP A.G 5/ SNP C.T 3/ SNP A.C 6/ _2779del TT 11/ SNP G.A 6/ SNP T.A 4/ SNP T.G 6/ SNP T.C 4/ SNP G.A 6/ SNP A.G 4/ SNP G.C 8/ SNP A.G 4/ SNP T.C 8/ SNP G.A 1/ SNP A.G 8/ SNP T.G 7/ Ms ACC(10_?) 11/13 AAC(11_?) c SNP C.T 6/ Ms TG(19_20) 60/ SNP G.A 1/ SNP G.A 1/ SNP A.G 4/ SNP T.C 16/ SNP T.C 17/ SNP A.G 0/602 b SNP T.A 0/602 b NA SNP G.A 19/ SNP T.G 1/40 NA _13529 delinstgtacgagt 10/ Ms GT(13_?) c 11/ SNP G.T 17/ SNP G.A 9/ SNP T.C 9/ SNP T.C 9/ Ms AC(12_?) c 3/ SNP T.A 7/ SNP G.C 1/19 a SNP C.T 25/30 Polymorphism positions are given relative to OAR11 v3.1 and FecL locus (Genbank:KC352617). Polymorphism type, single nucleotide polymorphism (SNP), microsatellite (Ms) or insertion/deletion (ins/del) referred to +/+ vs. L/L sequence. Allele sharing indicated number of (+) chromosomes carrying the (L) allele relative to the number of (+) chromosomes tested. a SNP corresponding to the interval borders and therefore excluded from the minimal locus. b Allele segregating as the FecL L mutation. c Ms marker genotyped by fluorescent SSCP, no information on the dinucleotide repeat variation. NA, non-available coordinate on OARv3.1. doi: /journal.pgen t001 Figure 2. Expression of genes within the minimal FecL locus. Total RNA from granulosa cells (GC) from small (SF, 1 3 mm), granulosa cells and theca cells (TC) from large (LF, $6 mm) follicles, pituitary gland (PG) and hypothalamus (HPT) were reverse-transcribed and submitted to real-time PCR analysis for quantification of B4GALNT2 and IGF2BP1 gene expression. Data are means 6 SEM of relative expression to the reference gene RPL19 showed on a log scale. Asterisk indicates significant difference between means (n = 5) from non-carriers (+/+) and homozygous carriers of the FecL L mutation (L/L), **: p,0.01; ***: p, doi: /journal.pgen g002 PLOS Genetics 4 September 2013 Volume 9 Issue 9 e

205 B4GALNT2 as Fecundity Gene main substrates of B4GALNT2 activity (Table 2). Identified proteins were of a large molecular weight range (ranging from 39 to 613 kda) and most of them were extracellular matrix or membraneassociated proteins. Interestingly, the inhibin a and ba subunits, leading to the production of Activin A and Inhibin A, and the chondroitin sulfate proteoglycan Versican are well known to be directly involved in female reproductive function [14 16]. These proteins represent promising physiological candidates to understand the mechanism by which the FecLL mutation affecting B4GALNT2 expression increases the ovulation rate in Lacaune sheep population. Discussion Genetic characterization of the FecL locus The fine mapping strategy combining marker development through high-throughput sequencing and genotyping of selected recombinant animals allowed the delimitation of the FecL locus on OAR11 between SNP markers g t.c and g g.c. With the double aim to densify the locus with more informative polymorphisms and to directly identify the causal polymorphism, we developed a systematic high-throughput sequencing of the locus with the Roche 454 technology on finely chosen animals. The targeting of the locus was done by overlapping long-range PCR fragments (around 10 kb), a method successfully used to detect genomic variations in BRCA1/BRCA2 locus in human [17]. We experienced some bias in detecting polymorphisms, especially SNP, in the reads depth of the L/+ animal due nonindependent reads [18] and PCR-dependent allele disequilibrium. Nevertheless the use of the two independent sequences L/L and +/+ allowed the elimination of this latter bias. The polymorphisms evidenced were further studied for allele sharing. The different appropriate subsets of markers that were genotyped on recombinant ewes led to the reduction of the minimal interval to kb. Within this interval of localization, 2 SNPs have been found fully associated with the FecLL mutation, namely SNP g t.a and SNP g a.g. The SNP g t.a was localized in the intron 7 of B4GALNT2, in a sequence portion that was only conserved in the bovine orthologous gene, and not in other species. The SNP g a.g was localized in the intergenic sequence between B4GALNT2 and IGFBP1 in a non-conserved region enriched with LINES and SINES repetitive elements. The finding of non-coding SNPs as causal mutations contrasts with other known mutations affecting ovulation rate through alteration of the coding sequence of BMP15, GDF9 and BMPR1B genes impairing the protein function [10]. To go further in the fine mapping study, different strategies can be proposed. The first one is to find additional recombinant animals within the genetic families. A second one is to find recombinant animals at the population level, i.e. animals carriers of a shorter L-haplotype and finely phenotyped. However the probability to find such animal recombining within an interval of 195 kb is very low. If only one of these two SNP is the causal mutation, one way to prove it is to find an animal carrying a recombination between the two markers. However, the 2 SNPs are 96 kb apart and the probability to find such animal is nearly null. A third possibility is to increase the number of wild chromosomes (i.e. wild haplotypes) tested for allele sharing. Animals coming from 9 different breeds have been genotyped (representing 180 wild haplotypes) but did not allow the elimination of one or the other putative causal mutation. Figure 3. Immunostaining for B4GALNT2 in Lacaune sheep ovary. Photomicrographs of ovarian sections from +/+ and L/L ewes stained with anti-b4galnt2 rabbit polyclonal antibody (1/50 dilution). Sections were counterstained with hematoxylin. A black segment indicates the microscopy magnification scale. GC, granulosa cell layer; TC, theca cell layer; Ant, antral cavity. doi: /journal.pgen g003 Figure 4. B4GALNT2 transferase activity revealed by DBA lectin and KM694 antibody staining in Lacaune sheep ovary. Photomicrographs of ovarian sections from +/+ and L/L ewes and stained either with biotinylated-dba lectin (500 ng/ml) or KM694 mouse monoclonal antibody (1/1000 dilution). A GalNac treatment (200 mm) was used to compete for DBA staining as specificity control. Sections were counterstained with hematoxylin. A black segment indicates the microscopy magnification scale. GC, granulosa cell layer; TC, theca cell layer; Ant, antral cavity. doi: /journal.pgen g004 PLOS Genetics Expressional candidates of the FecL gene and effect of the SNPs Annotation available on the last release of the sheep genome assembly (OARv3.1) indicated that the minimal kb interval, 5 September 2013 Volume 9 Issue 9 e

206 B4GALNT2 as Fecundity Gene ( Moreover, Blastn analysis (www. livestockgenomics.csiro.au) of the bovine EZR cdna (NM_174217) indicated sequences producing significant alignments on Ovis aries breed Texel contig_127582, OAR11 and OAR8. Only matched sequences on OAR8 presented an exon/ intron structure in a syntenic region of BTA9 and HSA6, and then should correspond to the ovine EZR gene. The high identity match we found between bovine EZR cdna and both the ovine reference genome on OAR11 and our own FecL locus sequence (98% coverage, 95% identity) evidenced the presence of an EZR spliced pseudogene with a premature stop codon impairing the translation of an EZR protein. For those reasons, only IGF2BP1 and B4GALNT2 were considered as positional candidate genes for FecL in this study. Due to the absence of polymorphism in the coding sequence of IGF2BP1 and B4GALNT2 genes, we searched for an expressional candidate to discriminate between the two genes. Real-time PCR analysis showed that both IGF2BP1 and B4GALNT2 expression was significantly affected by FecLL, specifically in ovarian cells indicating a tissue-specific regulation by the FecLL mutation. Interestingly, no differential expression was observed for genes outside of the minimal locus, reinforcing the genetic fine mapping result. For follicles collected at the same size class, the differential expression observed between +/+ and L/L follicles could not be attributed to the existence of a difference in follicle maturity as already observed for the hyperprolificacy-associated Booroola mutation [19]. Indeed, IGF2BP1 and B4GALNT2 expression in granulosa cells was not different between small and large antral follicles that were at different maturity stages as attested by marker expression, such as LHR, INHA, CYP19A1 and CYP11A1 as previously shown [9] or MYC (present study). SNP g t.a, localized in the intron 7 of B4GALNT2, and SNP g A.G in the inter-genic region, were the only two polymorphisms segregating as the FecLL mutation. They were then thought to be directly the cause of the huge overexpression of B4GALNT2 and in a lesser extent of IGF2BP1 in the ovaries of FecLL carrier ewes, through a molecular mechanism that remains to be determined. In order to explain this differential expression we searched in silico for transcriptional factors able to bind these SNP locations. However, we failed to find matches with consensus sequences binding known transcriptional factors at each site. Experimentally, electromobility shift assays with ovine granulosa cell nuclear extracts failed also to discriminate between SNPs and between prolific and wild type alleles. As a second in silico approach, we also searched matches in Patrocles, the database of polymorphic microrna-target interactions ( Polymorphism in mirna target sites might be important effectors of phenotypic variation as attested by the hypermuscularity phenotype in Texel sheep [20]. Interestingly, the B4GALNT2 intronic SNP g t.a was found to create a motif GTGTGAGA in FecLL which is a recognition site for MIR342 that is conserved among bovine and human. However, we cannot reconcile this finding with the current knowledge on gene regulation by micrornas, indicating that those small noncoding RNAs usually targeted matured mrna in the 39-untranslated regions within cytoplasmic protein complexes to repress protein synthesis [21]. Another hypothesis is that the intronic location of the SNP g t.a may be associated with alternative splicing of the B4GALNT2 mrna, but analysis by RT-PCR amplification between exon 6 and terminal exon 11 failed to evidence such alternative splicing between L/L and +/+ mrna. In human gastrointestinal cancer cells the expression of B4GALNT2 is dependent on the promoter methylation status [22]. As in other species, a large CpG island is present in the vicinity of Figure 5. B4GALNT2 transferase activity revealed by DBA lectin after in vitro overexpression of B4GALNT2 in ovine granulosa cells. Primary ovine granulosa cells from +/+ small antral follicles were transiently transfected with either the pcdna-hb4galnt2 expressing the human form of B4GALNT2 or the empty pcdna3.1 vector. Twenty-four hours after transfection, cells were stained with biotinylated-dba lectin (500 ng/ml). Arrows indicated DBA positive staining only in B4GALNT2 transfected cells. Cells were counterstained with hematoxylin. A black bar indicates the microscopy magnification scale. doi: /journal.pgen g005 that we entirely sequenced, contained only 3 potential protein encoding genes, B4GALNT2, EZR and IGF2BP1. The EZR annotation is very recent (October 2012) and this gene was not considered as an expressional candidate for FecL at the beginning of the work. Moreover, if the localizations of B4GALNT2 and IGF2BP1 on OAR11 were coherent with their syntenic location on BTA19 and HSA17, the presence of the EZR gene annotation is intriguing. Indeed, in bovine (UMD3.1) and human (GRCh37) genomes, this gene is positioned on BTA9 and HSA6, respectively Figure 6. Western immunoblotting analysis of B4GALNT2 transferase activity in Lacaune sheep granulosa cells and follicular fluids. Granulosa cell protein extracts (50 mg) and follicular fluids (200 mg) from +/+ and L/L large antral follicles were precipitated (P) by agarose-dba lectin or sepharose-protein A-KM694 monoclonal antibody. The resulting purified glycoproteins were separated on SDSPAGE, transferred on nitrocellulose membrane and revealed after blotting (B) using biotinylated-dba lectin or KM694 monoclonal antibody. doi: /journal.pgen g006 PLOS Genetics 6 September 2013 Volume 9 Issue 9 e