LES ORGANISMES GENETIQUEMENT MODIFIES

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1 LES ORGANISMES GENETIQUEMENT MODIFIES Présentation par Frédéric Debode MINISTÈRE DE LA RÉGION WALLONNE Département Qualité des Productions agricoles Laboratoire de biologie moléculaire -détection des OGM- Chaussée de Namur, 24 B-5030 Gembloux Tél. 081/ Fax 081/ Un OGM, qu est-ce que c est? Un OGM (ou organisme transgénique) est un organisme vivant auquel on a transféré, par les techniques du génie génétique, un gène d intérêt, identifié sur un organisme donneur. Le gène transféré confère à la plante un nouveau caractère ou une nouvelle propriété qui se transmet à sa descendance. 2

2 Sélection classique génome 1 génome 2 résultat gène d interêt Rétro-croisements Génie génétique 3 4

3 5 6

4 7 8

5 9 10

6 Les techniques de transfert de gène: a) l utilisation d un vecteur biologique 11 Agrobacterium 12

7 13 b) La transformation directe Canon à particules Biolistique: technique de transfert direct d ADN porté par des microbilles de tungstène ou d or, projetées par un canon à particules dans la cellule 14

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9 Le génie génétique et les plantes: les grandes étapes 1973: Identification du plasmide Ti dans la bactérie Agrobacterium Tumefaciens 1983: première plante transgénique (tabac) 1985: première plante transgénique résistante à un insecte 1987: première plante transgénique résistante à un herbicide total 1988: première plante «pharmacienne» première céréale transgénique 1994: premier légume transgénique commercialisé (USA) 1997: premier tabac producteur d hémoglobine 17 PLANTES TRANSGENIQUES DEVELOPPEES 1ère génération: propriétés intéressantes pour l agriculteur (résistance aux herbicides, insectes, virus; caractère mâle-stérile) 2ème génération: propriétés intéressantes pour le transformateur (composition en huiles, amidons, ) 3ème génération: propriétés intéressantes pour le consommateur (saveur, qualité nutritive) 18

10 SUPERFICIES CULTIVEES AVEC DES PLANTES TRANSGENIQUES millions d hectares dans le monde (1996 à 2007) Total Pays industrialisés Pays en voie de développement Augmentation de 12%, soit 12,3 millions d ha, entre 2006et Les 5 principales catégories de gènes «sensibles» au point de vue acceptation de la population 1. la résistance aux insectes 2. résistance à certains herbicides 3. les gènes de résistance aux antibiotiques 4. les gènes entraînant la stérilité mâle 5. les gènes qui servent à réduire d autres gènes au silence 20

11 Seuils au dessus desquels l étiquetage est requis Avec les nouveaux règlements "Traçabilité et étiquetage" et "GM Food and Feed" 0,9% pour les OGM autorisés et leurs dérivés 21 ETIQUETAGE But : Portée : donner aux consommateur une information claire,honnête et neutre sur l origine des produits. - OGM vivant - OGM transformé - produit comprenant des ingrédients dérivés d OGM Conséquence : il faut pouvoir disposer de moyens analytiques de contrôle 22

12 Construction transgénique Exemple pratique : soja Roundup ready promoteur région codante terminateur CaMV35S forme E CTP1 de CP4 EPSPS l EPSPS de Pétunia NOS 3 23 Moyens de détection Détection de protéines : par des techniques immunologique (ELISA) Détection de segments précis d ADN : par des techniques d amplification génique (PCR) 24

13 DETECTION DE PROTEINES: TEST ELISA EN SANDWICH (1) 100µl d extrait dilué 300x Incuber 1h à 37 C Puits «précoaté» 25 TEST ELISA EN SANDWICH (2) Lavage Ajout de l anticorps conjugué à une enzyme + incuber 1h 26

14 TEST ELISA EN SANDWICH (3) Lavage + ajout du substrat de l enzyme substrat incolore enzyme produit coloré 27 PLAQUE ELISA APRES REVELATION IMMUNO-ENZYMATIQUE 28

15 DETECTION DE SEGMENTS TRANSGENIQUES D ADN la mise en évidence de la présence d un segment bien précis d ADN (transgénique ou non) peut se faire par amplification génique, la technique d amplification génique la plus courante est la PCR (Polymerase Chain Reaction) 29 PCR = amplification exponentielle de l ADN 30

16 95 C 72 C 60 C 31 Conception et validation d amorces Exemple pratique : soja Roundup ready terminateur promoteur région codante screening identification (construction) identification (lignée) nested PCR 32

17 Exemples : produits à base de soja Produits PCR : amorces spécifiques (soja) Fève transgénique 2 Fève «classique» 3 Farine + graisse 4 Tourteau 5 Boisson de soja 6 «Crème» de soja 7 Pas d échantillon 8 Marqueur 8 8 Marqueur échelle 100 bp w600 pb w100 pb 33 Exemples : produits à base de soja Produits PCR : amorces transgéniques Fève transgénique 2 Fève «classique» 3 Farine + graisse 4 Tourteau 5 Boisson de soja 6 «Crème» de soja 7 Pas d échantillon 8 Marqueur 8 8 Marqueur échelle 100 bp w600 pb w100 pb 34

18 Visualisation des fragments sur gel Marqueur de poids moléculaire Marqueur de poids moléculaire 600 pb 300 pb 100 pb 35 La PCR en temps réel Principe 36

19 Thermocycleur «classique» Source de lumière + caméra CCD Traitement des données GeneAmp9600 (Applied Biosytems) ABI5700 (Applied Biosytems) 37 Schéma optique du ABI 7000 Lampe Miroir Filtre d exitation Lentille de frensel capuchons des plaques Miroir dichroïque lentille Caméra CCD Plaque 96 puits Carrousel avec filtres 38

20 Mesure de la fluorescence dans les 96 puits d une plaque PCR 39 Sur le ABI 7000, on peut suivre la construction des courbes «online» 40

21 41 42

22 Réalité versus Théorie L amplification est exponentielle mais l accroissement exponentiel est limité théorie La PCR en temps réel nous permet de «voir» la phase exponentielle et ainsi nous pouvons calculer la quantité de cible initiale Log ADN cible Réalité # de cycles 43 Avantages de la PCR en temps réel Suivi de la réaction et non plus un résultat endpoint plus d informations concernant la réaction possibilité d effectuer des analyses quantitatives électrophorèse manipulation des produits PCR 44

23 Formats de PCR en temps réel SYBR Green Sondes d hybridation - Sondes Taqman - Sondes FRET - MGB, Molecular Beacons, Scorpions, Eclipse, 45 Format de PCR en SYBR Green Le SYBR Green est un colorant fluorescent dont la fluorescence est fortement accrue lorsqu il se fixe à l ADN double brin. a b c d La totalité de l ADN repasse à l état simple brin après dénaturation, le SYBR Green ne s y lie plus et le niveau de fluorescence est bas. Lors de la phase d hybridation, les amorces s accrochent à la séquence cible, ce qui conduit à la formation d une petite quantité d ADN double brin à laquelle le SYBR Green peut se lier, augmentant ainsi l intensité de la fluorescence. Au cours de la phase d élongation, la nouvelle chaîne d ADN est synthétisée, plus de SYBR Green peut donc se lier. A la fin de l étape d élongation (étape où l on mesure la fluorescence), tout l ADN est devenu 46 double brin et une quantité maximale de SYBR Green est insérée

24 Format de PCR avec sondes Taqman Polymérisation 3 Forward Primer R Sonde TaqMan Q Reverse Primer 3 3 Forward Primer R Q Déplacement Reverse Primer 3 47 Principe des sondes Taqman Clivage R 3 Q 3 R Q Élongation terminée 48

25 SYBR Green ou sondes Taqman? PCR classique directement transférable en SYBR Green nécessité de commander des sondes marche mieux avec des petits amplicons tous les ADN doubles brins sont détectés problème des dimères d amorces moins sensible les dimères d amorce de sont pas détectés plus spécifique 49 Détection et quantification des OGM par PCR en temps réel 50

26 Stratégies de détection par PCR promoteur région codante terminateur screening identification (construction) identification (lignée) 51 Détection des OGM par PCR Détection qualitative PCR classique PCR en temps réel Détection quantitative PCR compétitive PCR en temps réel calibrations sur base: - de farines de référence - de plasmides (en développement) 52

27 Calibrations basées sur les farines de référence - farines à teneurs certifiées en OGM - parfaitement homogènes - produites par l IRMM 53 Courbes d amplification obtenues à partir de farines de soja à teneurs certifiées en OGM (5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% RR) 1. Ct Lect-RR 5% 2. Ct Lect-RR 2% 3. Ct Lect-RR 1% 4. Ct Lect-RR 0,5% 5. Ct Lect-RR 0,1% 54

28 Quantification des OGM sur base du Ct Ct calibration soja RR 14 y = -1,5076Ln(x) + 8, R 2 = 0, , %OGM Ct Calibration maïs MON810 y = Ln(x) R 2 = % OGM 55 Calibrations basées sur des dilutions de plasmides 5,39E+7 copies 5,39E+6 copies 5,39E+5 copies 5,39E+4 copies 5,39E+3 copies 5,39E+2 copies 56

29 vecteur plasmidique fragment d ADN à cloner - insertion enzymatique du fragment d ADN dans le plasmide plasmide Plasmide recombinant - insertion dans des bactéries (E.Coli) - mise en culture sur milieu nutritif avec ampicilline les E. Coli transformés survivent les cellules qui n ont pas intégré le plasmide ne survivent pas réplication indépendante des plasmides multiplication des cellules 57 Calibration à l aide de constructions plasmidiques pour la quantification du maïs MON810 Moy Ct Calibration IVR y = Ln(x) R 2 = E E E E E E+13 Nbre de copies Moy Ct Calibration MON810 y = Ln(x) R 2 = E E E E E E+12 Nbre de copies 58