Thèse de Doctorat de l'université Paris XI Faculté de médecine de Paris-Sud

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1 Thèse de Doctorat de l'université Paris XI Faculté de médecine de Paris-Sud FR Année : 1997 Spécialité : Imagerie Médicale Présentée par Cécile BRILLAULT-SALVAT pour obtenir le titre de Docteur de l'université Paris XI APPROCHE INTEGREE DU MÉTABOLISME ET DE LA PERFUSION MUSCULAIRE EN IMAGERIE ET SPECTROSCOPIE PAR RÉSONANCE MAGNÉTIQUE NUCLÉAIRE Soutenue le 16 Décembre 1997 devant le jury composé de : MM. J. Bittoun Président F. Brunotte.. Rapporteur Y. Guezennec Rapporteur p D. Duboc A. Volk P. Carlier

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3 .. p. X I Thèse de Doctorat de l'université Pans XI Faculté de médecine de Paris-Sud FR Année : 1997 Spécialité : Imagerie Médicale Présentée par Cécile BRILLAULT-SALVAT pour obtenir le titre de Docteur de l'université Paris XI APPROCHE INTÉGRÉE DU MÉTABOLISME ET DE LA PERFUSMUSCULAIRE EN.MAGERIE ET SPECTROSCOP.E LA P ERFU par RÉS0NANCE MAGNÉTIQUE NUCLEAIRE Soutenue le 16 Décembre 1997 devant le jury composé de : MM. J. Bittoun F.Brunotte.. Y.Guezennec Président ri Rapporteur Rapporteur D. Duboc A.Volk P. Carlier

4 Thèse de Doctorat de l'université Paris XI Faculté de médecine de Paris-Sud 3 8 &<=> o U 2, Année : 1997 Spécialité : Imagerie Médicale Présentée par Cécile BRILLAULT-SALVAT pour obtenir le titre de Docteur de l'université Paris XI APPROCHE INTÉGRÉE DU METABOLISME ET DE LA PERFUSION MUSCULAIRE EN IMAGERIE ET SPECTROSCOPIE PAR RÉSONANCE MAGNÉTIQUE NUCLÉAIRE Soutenue le 16 Décembre 1997 devant le jury composé de : MM. J. Bittoun Président F. Brunotte Rapporteur Y. Guezennec Rapporteur D. Duboc A.Volk P. Carlier

5 "La vertu, le courage, le talent, l'esprit, l'imagination, toutes ces qualités ou ces facultés ne seraient-elles donc qu'une question d'oxygène?" Jules Verne A Clémence, Christelle, et Olivier

6 REMERCIEMENTS Ce travail de thèse a été financé en partie par une allocation de recherche délivrée par le Ministère de la Recherche et de l'enseignement Supérieur. La bourse octroyée par l'associaton Française contre les Myopathies et les moyens mis à ma disposition m'ont permis de terminer ce travail dans de bonnes conditions. L'ensemble des travaux a été réalisé au Service Hospitalier Frédéric Joliot du département de recherche médicale du CEA. Je remercie MM. les Professeurs Syrota et Matière de m'avoir accueillie dans leur service. Ce travail a été réalisé sous la direction du Dr. Pierre Carlier. Je lui suis très reconnaissante de m'avoir proposé un sujet d'étude aussi passionnant et de m'avoir fait part de ses multiples idées aussi riches que pertinentes. Je tiens à remercier M. le Professeur Bittoun de m'avoir soutenue tout au long de ces trois années de travail et d'avoir accepté de présider mon jury de thèse. M. le Professeur Brunotte et M. le Professeur Guezennec m'ont fait l'honneur d'être les rapporteurs scientifiques de ce travail. Je les en remercie très sincèrement, et apprécie l'attention et le temps qu'ils ont portés à l'évaluation de ce travail. L'expression de ma très vive reconnaissance s'adresse à M. le Professeur Duboc et à M. le Docteur Volks qui ont accepté déjuger ce travail. Je remercie infiniment Eric Giacomini qui a contribué, avec beaucoup de compétence et de gentillesse, à la réalisation de l'interface électronique et des sondes. Ses conseils avisés et son assistance technique m'ont été précieux. Je n'oublie pas le soutien du Dr. Gilles Bloch au cours de ces années. Je le remercie de s'être investi dans chacune des étapes de ce travail et d'avoir contribué au redémarrage de "Ventrelaçage". Le Dr. Anne Leroy-willing m'a initiée à la RMN. Je lui suis également profondément reconnaissante pour tout le temps consacré à la rédaction de ce mémoire. Un grand merci à toute l'équipe RMN et au groupe informatique du SHFJ, sans oublier l'équipe RMN de l'afm. Les petits coups de main tout comme les grandes discussions ont été fort appréciés. Je souhaite remercier le Dr. Claire Wary pour l'aide qu'elle m'a appportée tout au long de mon séjour au SHFJ, en particulier lors des périodes de rédaction de communications et de publications.

7 Je tiens à exprimer mes sincères remerciements aux personnes avec qui j'ai été amenée à travailler, et auprès desquelles j'ai beaucoup appris. Que Vincent Lebon, Laurence Jouvensal et Jean-François Toussaint soient ici chaleureusement remerciés pour leur soutien scientifique et moral ainsi que pour le temps qu'ils m'ont consacré, sans compter, tout au long de ces trois années. Que ma famille et mes amis trouvent ici le témoignage de ma reconnaissance pour l'ensemble de leur contribution, à la fois intellectuelle, morale et matérielle. Et enfin, Olivier, sans qui ce travail n'aurait jamais abouti. Merci.

8 TABLE DES MATIERES INTRODUCTION A. L'OXYGENE DANS L'ORGANISME 8 B. INTERET DE LA RMN IN VIVO DANS CE CONTEXTE. 13 C. PLAN DE LA THESE 14 CHAPITRE I : PHYSIOLOGIE ET EXPLORATIONS MUSCULAIRES 15 A. METABOLISME ENERGETIQUE MUSCULAIRE ET COMPOSES PHOSPHORYLES Structure et composition des fibres musculaires Sources d'énergie à l'effort 17 a) Rôle de l'atp 17 b) Métabolisme aérobie : les oxydations phosphorylantes 19 c) Métabolisme anaérobie alactique 22 d) Métabolisme anaérobie lactique : la glycose anaérobie Techniques d'évaluation du métabolisme énergétique 24 a) Biopsies et analyses enzymatiques 24 b) Spectroscopie RMN du phosphore c) Fluorimétrie laser du NADH 28 B. CIRCULATION SANGUINE MUSCULAIRE Anatomie et histologie des vaisseaux sanguins dans le muscle 32 a) Artères et artérioles 32 b) Capillaires 33 c) Veines Vasomotricité circulatoire Prise en charge de l'oxygène par le sang Adaptation circulatoire 38 a) Débit cardiaque et ses facteurs 38 b) Adaptation de l'hémodynamique périphérique 39 c) Comment tester la réactivité vasculaire? 40 (1) Ischémie et hyperémie réactionnelle 40 (2) Exercice et hyperémie fonctionnelle Méthodes de mesure de la perfusion musculaire chez l'homme 44 a) La pléthysmographie 45 (1) La pléthysmographie volumétrique 45 (2) Les jauges de contraintes 46 (3) La pléthysmographie par impédance 47 b) La débitmétrie électromagnétique 47 c) Utilisation de traceurs intravasculaires 48 (1) Indicateurs colorés 49 (2) La thermodilution 50 d) Utilisation de traceurs librement diffusibles : 133 Xe et H 15 2 O 51 (1) La détection de l'émission y du 133 Xe 52 (2) La tomographie par émission de positons (TEP) avec l'h 15 2 O 53 e) La résonance magnétique nucléaire 54 (1) Détection de traceurs exogènes (D 2 O ou emulsions perfluorocarbonées) 54 (2) Imagerie vélocimétrique et estimation du flux 55 (3) Marquage des spins de l'eau artérielle (méthode du Tl apparent) 55 f) Comparaisons des résultats entre les différentes techniques 57

9 C. OXYGENATION MUSCULAIRE Distribution de l'oxygène aux tissus : le rôle de la myoglobine Le modèle de Krogh Méthodes permettant d'évaluer la consommation d'oxygène globale et régionale 67 a) Calorimétrie directe 67 b) Calorimétrie indirecte 69 c) Prélèvements sanguins : application du principe de Fick 69 d) La tomographie par émission de positons (TEP) Méthodes permettant d'évaluer l'oxygénation musculaire et capillaire 72 a) Mesure directe de la Po 2 tissulaire par électrodes 72 b) La spectroscopie proche infrarouge (MRS) 74 c) La résonance magnétique nucléaire (RMN) 78 (1) La spectroscopie du proton ('H) de la myoglobine 78 (2) Mesure de la relaxation transversale de l'eau La consommation maximale d'oxygène 81 D. CALCUL DE L'EXTRACTION MUSCULAIRE D'OXYGENE 83 CHAPITRE II : DEVELOPPEMENTS METHODOLOGIQUES ET DESCRIPTION DES DIFFERENTS SUPPORTS TECHNIQUES 87 A. PREAMBULE : PRESENTATION DE NOTRE SYSTEME 87 B. INTRODUCTION 87 C. NOUVEAUX OUTILS RMN MIS EN OEUVRE AU SEIN DES SEQUENCES Principe de la mesure de perfusion par pléthysmographie RMN La spectroscopie proton de la myoglobine 90 a) Principe 90 b) Mise en évidence 90 c) Mesure du T2* et du Tl de la myoglobine du muscle squelettique à 3 T 91 d) Mobilité et visibilité de la myoglobine 94 e) Interférences 95 f) Mesure de la saturation en oxygène de la myoglobine 97 g) Calcul de la Po 2 intracellulaire musculaire 98 D. MISE EN OEUVRE DES MODULES DES SEQUENCES ENTRELACEES Historique de l'entrelaçage Définitions Modules élémentaires insérés dans les séquences entrelacées 103 a) Evaluation de la perfusion post-ischémique par pléthysmographie RMN 103 (1) Mise en oeuvre d'une séquence d'imagerie rapide 103 (2) Brouillage par la phase (RF spoiling) 105 (3) Interventions sur le système 106 (4) Les paramètres de la séquence d'imagerie 106 b) Détermination simultanée du T2*, et de la perfusion par la méthode du Tl apparent, grâce à la séquence d'échos de gradient multiples 107 c) La spectroscopie proton de la myoglobine 110 d) La spectroscopie proton du lactate 111 e) La spectroscopie du phosphore-31 : spécificité de nos conditions d'expérimentation 113

10 4. Contraintes et compromis des séquences entrelacées 114 a) Gestion des bandes passantes et des tailles variables des vecteurs d'acquisition 115 b) Gestion du filtre électronique 116 c) Gestion de la mémoire du système 119 d) Relations entre les paramètres appelés par les séquences Validation des différentes séquences entrelacées 121 a) Optimisation des séquences sur fantôme 121 (1) Les séquences homonucléaires 121 (2) Les séquences hétéronucléaires 121 b) Calcul du dépôt de chaleur en RMN 122 E. RAPPORT SIGNAL SUR BRUIT ET SONDES RMN Le rapport signal sur bruit en RMN 125 a) Le signal RMN 125 b) Le bruit 125 c) Le rapport signal sur bruit Développement d'une sonde de type Helmholtz 127 a) Principe 127 b) Caractéristique de notre sonde Mise au point d'une sonde de surface phosphore à accord inductif 128 a) Généralités 128 b) Caractéristiques de notre sonde Construction d'une sonde de surface proton réceptive découplée passivement 130 a) Introduction 130 b) Réalisation de la sonde proton en réception seule 130 c) Principe de fonctionnement du découplage passif 131 F. CONCEPTION DE L'INTERFACE ELECTRONIQUE Structure de notre spectromètre/imageur Définition du cahier des charges de l'interface ELECTRONIQUE Réalisation de l'interface 139 a) Les commandes binaires ul2 et ul3 140 b) Isolation des masses entre l'informatique et l'électronique de réception 142 c) Installation d'un commutateur pour alterner les détecteurs en proton Validation de l'interface électronique 144 G. MATERIEL NECESSAIRE A LA REALISATION DES PROTOCOLES L'ergomètre Construction d'un support de sondes en plâtre Réalisation de gradients de surface Le dispositif de gonflage et dégonflage rapide du brassard 148 H. METHODOLOGIE DE TRAITEMENT DES DONNEES RMN Introduction Développement d'algorithmes dédiés à la redistribution des données entrelacées Traitement des images de pléthysmographie Analyse des signaux de myoglobine, calcul de TMyo Calcul du ph intracellulaire Quantification des metabolites phosphorylés et détermination de xpcr Détermination de la production et de l'élimination du lactate musculaire Statistiques 162

11 CHAPITRE III : MISE EN OEUVRE DE PROTOCOLES D'EXPLORATIONS PHYSIOLOGIQUES, APPLICATION 163 A. ETAPES COMMUNES AUX DIVERS PROTOCOLES Installation du sujet Tests des brassards Familiarisation du sujet au travail dynamique sur l'ergomètre ^ Mesure de la force maximale volontaire de contraction Réglages préliminaires à l'étude rmn Acquisition d'une image de repérage à haute résolution spatiale Mesure de la force maximale volontaire de contraction Corrélation entre fmv et section musculaire 169 B. EXPLORATIONS PRELIMINAIRES La perfusion de repos par pléthysmographie rmn La perfusion en hyperémie réactionnelle par pléthysmographie rmn La cinétique de désaturation de la myoglobine pendant l'ischémie Application à la mesure de la concentration de la myoglobine musculaire L'évolution des concentrations des metabolites phosphorylés sur un muscle contraint à différents niveaux de stress 182 C. INFLUENCE DE LA RESTRICTION DE PERFUSION SUR LA REOXYGENATION MUSCULAIRE CHEZ LE SUJET SAIN (SEQUENCE PERFMYO) Objectif La séquence «PerfMyo» Redistribution des données Protocole Résultats et discussion 190 a) Détermination simultanée du pic de perfusion en hyperémie réactionnelle et de la réoxygénation des territoires musculaires 190 b) Corrélation entre le pic de perfusion post-ischémique et le taux de resaturation de la myoglobine _ 191 c) Influence du débit sanguin régional sur la réoxygénation musculaire de la jambe 192 d) Calcul du taux maximum d'extraction en oxygène du muscle squelettique à partir des données individuelles 193 e) Originalité et pertinence de l'approche IRM-SRM 197 f) Comparaison de nos valeurs de perfusion musculaire avec les autres techniques Conclusion et perspectives 198 D. L'OXYGENATION TISSULAIRE ET VASCULAIRE AU COURS D'UNE EPREUVE D'ISCHEMIE-RECUPERATION CHEZ LE SUJET SAIN (SEQUENCE T2MYO) Objectif La séquence «T2Myo» Réorganisation des données Protocole 202

12 5. Résultats et discussion 202 a) Consistance chronologique des événements physiologiques mesurés 205 (1) Ajustement des courbes 205 (2) Interprétation de la chronologie des paramètres mesurés 206 b) Modélisation et confrontation avec les données expérimentales 208 (1) Modélisation 208 (2) Confrontation des expériences et de la simulation 211 c) Effet BOLD et dépendance du champ B o 213 (1) Effet BOLD dans le muscle ^ 213 (2) Dépendance du champ B o 214 d) Comparaison du signal pondéré T2* avec le signal MRS Conclusion et perspectives 216 E. OXYGENATION VASCULAIRE ET TISSULAIRE, PERFUSION ET METABOLISME AU COURS D'UNE EPREUVE D'ISCHEMIE-RECUPERATION CHEZ LE SUJET NORMAL (SEQUENCE PERFT2MP) Objectif La séquence «PerfT2MP» Redistribution des données brutes Protocole Résultats 221 a) Pendant l'interruption de la circulation 221 b) A la reperfusion Discussion Conclusion 225 F. EVOLUTION DES DIVERS METABOLITES AU COURS DE L'EXERCICE ISCHEMIQUE CHEZ LE SUJET SAIN (SEQUENCE MYOPHOS) Objectif La séquence «MyoPhos» Protocole Résultats et discussion Conclusion 231 G. RECUPERATION A L'ISSUE D'UNE EPREUVE D'EXERCICE ISCHEMIQUE CHEZ LE SUJET SAIN : MESURE DE LA PERFUSION, DE L'OXYGENATION TISSULAIRE ET DU METABOLISME ENERGETIQUE, DETERMINATION DE L'EXTRACTION D'OXYGENE (SEQUENCE PERFMYOPHOS) Objectif La séquence «PerfMyoPhos» Redistribution et traitement des données Protocole Résultats 237 a) Introduction 237 b) Résultats des mesures 238 c) Calcul de la consommation maximale apparente d'oxygène de la consommation mitochondriale d'oxygène et de l'extraction musculaire d'oxygène 240 d) Etude des corrélations suite au protocole d'exercice ischémique : 242

13 6. Discussion 245 a) Validation in vivo de la séquence entrelacée 245 (1) Reproductibilité de la séquence 245 (2) Confrontation des mesures avec les travaux antérieurs 247 b) Corrélation entre les différents paramètres physiologiques 251 c) VO2inax a pp, VO 2 mit0 et Extraction Conclusion 257 H. EXPLORATIONS DES METABOLISMES OXYDATIF ET GLYCOLYTIQUE AU COURS D'UN EXERCICE ANAEROBIE CHEZ LE SUJET SAIN (SEQUENCE MYOPHOSLAC) Objectif La séquence «MyoPhosLac» Redistribution des données brutes Protocole Résultats Discussion Conclusion et perspectives 269 I. EXPLORATIONS DE L'OXYGENATION MUSCULAIRE, DE LA PERFUSION ET DU METABOLISME OXYDATIF CHEZ DES PATIENTS ATTEINTS PAR LA MYOPATHIE DE BECKER Position du problème Objectif Protocole Résultats et discussion 276 a) Chez les sujets sains 276 b) Chez les patients du type Becker 277 c) Comparaison des résultats avec les protocoles antérieurs 279 d) Relations de dépendance Conclusion 281 CONCLUSION 283 BIBLIOGRAPHIE 287 LISTE D'ABREVIATIONS ET DE CONVENTIONS 313 ANNEXE 315

14 INTRODUCTION Objet de notre démarche L'oxygène est indispensable à la vie tissulaire. Toutes les étapes allant de son transport du milieu ambiant jusqu'à sa consommation par les cellules sont essentielles au bon fonctionnement de l'organisme. Les phénomènes impliqués sont complexes et mettent simultanément en oeuvre un nombre significatif de mécanismes différents. Afin de mieux en appréhender le fonctionnement, nous avons cherché à développer, par imagerie et spectroscopie RMN, une méthode atraumatique, non-irradiante et quantitative qui permette de mesurer en même temps plusieurs déterminants de l'oxygénation tissulaire. Notre approche s'est dirigée vers un tissu périphérique essentiel qui représente 40 % du poids d'un individu : le muscle strié squelettique. Au cours d'un exercice musculaire, il est le siège des variations les plus brutales et les plus soudaines du métabolisme énergétique ; la cinétique des mécanismes impliqués requiert une acquisition dynamique à haute résolution temporelle. L'abondance des données sur ce tissu périphérique provenant des méthodes utilisées jusqu'alors, offre la possibilité de valider l'approche méthodologique développée. Enfin, beaucoup de maladies affectent le muscle squelettique, qu'elles soient plan primitives ou secondaires. La place de ces altérations musculaires n'est pas toujours reconnue bien qu'elles aient des répercussions majeures sur l'autonomie et la qualité de vie des sujets. Au cours de ce travail, nous avons donc tenté de définir, de mettre au point et d'appliquer des protocoles permettant d'étudier les couplages entre la perfusion, l'oxygénation et le métabolisme énergétique du muscle squelettique, sur des sujets sains et des patients, lors d'épreuves dynamiques.

15 A. L'OXYGENE DANS L'ORGANISME Le système cardio-vasculaire fonctionne en harmonie pour adapter l'apport en énergie aux besoins des tissus périphériques. Une cellule requiert de l'énergie pour maintenir son intégrité et pour effectuer ses tâches physiologiques. L'énergie nécessaire au fonctionnement de chaque cellule provient essentiellement de l'hydrolyse de l'adénosine triphosphate (ATP) produit au cours des oxydations phosphorylantes (Stryer, 1988). L'organisme accepte une grande variété de réducteurs alors que l'oxygène est le seul oxydant biologique primaire. Chez les mammifères, une soixantaine de réactions impliquant un rôle direct de l'oxygène a été décrite (Vanderkooi et al, 1991). Toutes ces réactions peuvent être affectées par des variations de concentration de ce gaz. La survie tissulaire en l'absence d'oxygène est limitée à quelques minutes, l'organisme ne disposant que de réserves très limitées. La démonstration chez des patients admis en réanimation d'une corrélation entre la mortalité et l'existence d'une dette globale en oxygène souligne toute l'importance d'une évaluation correcte de l'oxygénation tissulaire (Bihari et al, 1987; Vincent et De Backer, 1989). Sans aller si loin, tout travail musculaire soutenu ne peut se prolonger si l'adéquation entre apport et demande en oxygène n'est pas satisfaite (Jammes et al, 1992). C'est pourquoi il est important de connaître la concentration en oxygène en tout point d'un tissu et de savoir si cette concentration peut limiter les vitesses des réactions l'utilisant. Le processus de transfert de l'oxygène de l'air ambiant jusqu'aux tissus périphériques nécessite une longue chaîne d'événements couplés. Ils peuvent se résumer comme suit : 1) la diffusion depuis les alvéoles des poumons jusqu'aux érythrocytes avec la liaison de l'oxygène à l'hémoglobine, 2) le transport du sang oxygéné depuis les poumons jusqu'à la microcirculation périphérique par convection, 3) la dissociation de l'oxygène de l'hémoglobine et sa diffusion vers le milieu cellulaire 4) le transfert de l'oxygène à la myoglobine et diffusion de l'oxygène vers l'intérieur de la mitochondrie, siège de son utilisation.

16 Le transport, la diffusion et la consommation de l'oxygène sont déjà des processus individuellement complexes auxquels sont associés de nombreux mécanismes régulateurs élaborés. En physiologie de l'exercice ou même au repos dans certaines pathologies, les couplages entre ces différentes étapes fondamentales restent encore à élucider. Par exemple, une réduction de l'apport d'oxygène peut être provoquée par une baisse du débit sanguin mais aussi par une diminution du contenu artériel en oxygène (CaÛ2). Cette réduction peut être la conséquence des phénomènes imbriqués qui sont soit une modification du rapport ventilation alvéolaire sur perfusion, soit une augmentation de l'extraction périphérique. Difficultés spécifiques à l'étude du couplage entre les variables de l'oxygénation En clinique, les services de réanimation disposent de moyens techniques limités pour surveiller l'adéquation entre la demande et l'apport en O2 au patient. L'appareillage médical permet le monitorage de la saturation artérielle en oxygène (SaC>2), de la pression partielle veineuse en oxygène (pvû2) et parfois de la consommation d'oxygène (Vo 2 ). Comme les autres paramètres du processus de transport de l'oxygène ne sont pas mesurés, les moyens techniques actuels ne peuvent que difficilement indiquer si les évolutions relevées sont une réponse physiologique et adaptée ou, au contraire, pathologique et nécessitant une intervention thérapeutique. De la même façon, une valeur constante ne peut être en soi une garantie d'un état physiologique stable, les variations des paramètres de l'oxygénation pouvant se compenser. Une évaluation de la pvc«2 est ambiguë car s'agit-il d'un débit cardiaque bas, d'une pû2 tissulaire faible, d'une demande accrue en oxygène ou encore d'une augmentation du niveau d'extraction d'c>2? Les travaux axés sur la physiologie de l'effort s'attachent principalement à l'étude du métabolisme énergétique en mesurant le volume d'air expiré et ses proportions respectives en oxygène et gaz carbonique qui sont à la base du calcul de la consommation d'oxygène et de la dépense énergétique (Astrand et Saltin, 1961; Whipp et Wasserman, 1972; DiPrampero et ai, 1986). Certains auteurs rapportent en complément des paramètres comme la fréquence cardiaque ou la concentration sanguine d'acide lactique (Astrand et al., 1963; Karlsson et Jacobs, 1982). De nombreux aspects de la physiologie de l'exercice musculaire restent à

17 éclaircir, notamment la fatigue musculaire pour laquelle la situation de déséquilibre entre les divers facteurs liés à l'oxygène est discutée (Sahlin, 1986; Sapega et al, 1987; Wilson et al, 1988). La détermination des interdépendances entre le transport, l'utilisation, l'extraction de l'oxygène et les performances du sujet bénéficierait à la physiologie de l'exercice. L'insuffisance cardiaque, le choc septique et les myopathies sont, entre autres, des pathologies pour lesquelles serait appréciée une meilleure compréhension de l'importance relative et du degré d'intrication des perturbations métaboliques et circulatoires. Grâce à une approche combinée, cette connaissance permettrait en effet de pouvoir établir un diagnostic, adopter une stratégie thérapeutique ou surveiller les populations à risque. Le choc septique constitue une cause majeure de mortalité dans les unités de réanimation. La caractéristique principale au plan de l'oxygénation tissulaire est une inadéquation entre l'offre et la demande en oxygène et cela pour deux raisons principales qui sont un hypermétabolisme systémique et des anomalies de l'extraction périphérique de l'oxygène (Vermeij et al, 1990; Matuschak et Martinez, 1992). La première manifestation hémodynamique en réponse à l'agression tissulaire par les bactéries se caractérise par une hypotension et une importante vasodilatation artérielle, à l'origine d'une dysfonction des organes (Dhainaut et al, 1987; Rackow et Astiz, 1991) et d'une altération de la perfusion microvasculaire (Astiz et al, 1989; Lam et al, 1994). Un facteur caractéristique de cette pathologie (Gutierrez, 1986; Astiz et al, 1987; Rackow et al, 1988), d'ailleurs retrouvé dans de nombreux travaux expérimentaux utilisant l'endotoxine chez l'animal (Samsel et al, 1988; D'Orio et al, 1991; Curtis et al, 1992), concerne la dépendance entre la consommation et l'apport en oxygène. L'atteinte hétérogène de la réactivité vasculaire (Parratt, 1989), responsable des modifications des débits régionaux, peut expliquer en partie cette liaison anormale (Siegel et al, 1967; Astiz et al, 1991; Payen, 1993). H en résulte un effondrement de la consommation d'oxygène malgré une demande très élevée (Morisaki et al, 1996). Une hypoxie tissulaire et une hyperlactatémie surviennent dans un second temps en dépit de l'augmentation du débit cardiaque et de l'apport artériel en O2 (Hotchkiss et Karl, 1992; Hurtado et al, 1992; Gilles et al, 1996). Le monitorage du débit cardiaque et de la pvû2, couplé à la mesure des lactates sanguins peut aider à caractériser l'état métabolique et hémodynamique. L'étude du couplage entre des variables locales de l'oxygénation constitue une approche plus pertinente que des mesures globales et séparées. 10

18 De son côté, l'insuffisance cardiaque est définie par l'incapacité du coeur à assurer un débit systémique suffisant pour répondre aux besoins métaboliques et fonctionnels des différents organes (Braunwald, 1988). Dans cette pathologie, la tolérance à l'effort est généralement réduite (Wilson et Ferraaro, 1983; Massie, 1988a; Drexler, 1996). Le désordre primaire de l'insuffisance cardiaque est une réduction de l'apport en oxygène (DO2) dû à un débit cardiaque abaissé, alors que les capacités d'extraction périphériques de l'oxygène sont maintenues (Wilson et al, 1984; Snell et Calvin, 1993). La circulation périphérique est, probablement au moins autant que le coeur, le facteur limitant de la DO2 à l'effort (LeJemtel et al, 1986; Wahl et al, 1994). L'amplitude de la baisse de la DO 2, estimée à environ 50% (Richard et al, 1989; Teboul et al, 1992; Wilson et al, 1993), est en fait assez peu documentée dans la littérature en raison de la pratique habituelle des unités de cardiologie de ne prendre en compte que le débit cardiaque. Les mécanismes de régulation de l'extraction d'oxygène mis en jeu peuvent en partie s'expliquer par une redistribution des débits régionaux (Zelis et al, 1988; Drexler et al, 1992) et dans certains cas extrêmes par une diminution de l'affinité de l'oxygène pour l'hémoglobine (Daniel et al, 1978; Bersin et al, 1993; Perego et al, 1996). Au cours d'un exercice, le métabolisme anaérobie semble également intervenir précocement dans l'insuffisance cardiaque (Weber et Janicki, 1985; Zhang et al, 1993; Kemp et al, 1996) et avec une ampleur disproportionnée par rapport à la réduction de l'oxygène aux cellules musculaires (Brooks, 1985; Cohen-Solal, 1988). L'explication peut résider dans l'existence d'anomalies du métabolisme oxydatif mitochondrial (Kariman et al, 1983; Wilson et al, 1985; Mancini et al, 1988; Rajagopalan et al, 1988). Des altérations profondes, tant au plan biochimique qu'histologique, ont été relevées dans le muscle squelettique de patients insuffisants cardiaques chroniques (Sullivan et al, 1990; Drexler et al, 1992). Dans l'insuffisance cardiaque, tout se passe comme si la cellule musculaire périphérique ne savait pas utiliser l'oxygène (Cohen-Solal et al, 1995). Massie et al. (1988a) n'ont toutefois pas établi de corrélation entre ces altérations métaboliques et le débit sanguin musculaire. De nombreuses études s'accordent pour souligner l'amélioration des performances des patients suite à un programme d'entraînement (Minotti et al, 1990; Adamopoulos et al, 1993; Brunotte et al, 1995; Hiatt et al, 1996). Les relations liant les divers paramètres d'oxygénation de cette pathologie méritent également d'être approfondies. 11

19 Les maladies musculaires héréditaires, couramment nommées myopathies, regroupent les dystrophies musculaires (Duchenne, Becker,...), les myopathies congénitales et les myopathies métaboliques. Le symptôme le plus caractéristique est le déficit musculaire, d'ordre moteur le plus fréquemment. La faiblesse musculaire est le plus souvent associée à la fatigue, à l'intolérance à l'effort, à des douleurs et à des crampes. Les explorations musculaires périphériques dédiées à l'étude du transport et de la diffusion de l'oxygène chez les myopathes n'ont suscité que peu d'intérêt jusqu'à maintenant (Haller et al, 1983). Certains auteurs ont pourtant attiré l'attention, il y a déjà plusieurs décennies, sur l'existence de dysrégulation du débit sanguin musculaire (Dreyfus et Schapira, 1962; Démos et al, 1970a) et d'altérations de la microcirculation musculaire (Jerusalem et al, 1974). Toutefois, les mesures de perfusion musculaire dans la myopathie de Duchenne font l'objet d'une controverse car d'autres équipes avec la même technique (Emery et Schelling, 1965) ou avec une autre méthode (Paulson et al, 1974) n'ont pas retrouvé les anomalies rapportées à plusieurs reprises par Démos (1968a) et par Sockolov (1977) chez des enfants. La quantification simultanée du capital musculaire à travers l'étude du métabolisme énergétique est un élément du suivi des myopathies, dont l'importance apparaît avec la perspective de nouvelles thérapies destinées à améliorer la fonction musculaire. 12

20 B. INTERET DE LA RMN IN VIVO DANS CE CONTEXTE En dépit de l'abondante et récente littérature sur le thème de l'oxygénation, peu d'études mentionnent l'acquisition concomitante de plusieurs variables physiologiques au niveau des muscles squelettiques. Cette carence relative est principalement due à la difficulté de mettre en oeuvre les méthodologies nécessaires. En effet, un nombre restreint de techniques permettent d'appréhender ces paramètres physiologiques in vivo et peu de systèmes médicaux actuels sont adaptés à des mesures simultanées. La RMN est une technique atraumatique d'investigation hémodynamique et métabolique. Son innocuité autorise de surcroît des mesures répétées permettant le suivi du sujet. Les deux modalités de la RMN sont l'imagerie et la spectroscopie. Le proton ('H), le phosphore ( 31 P) et le carbone ( 13 C) sont les noyaux les plus fréquemment utilisés pour les explorations fonctionnelles et métaboliques in vivo. Grâce aux développements récents, il est ainsi possible de suivre in vivo, dans les conditions physiologiques et de façon continue, non seulement la vélocité du flux sanguin, la perfusion régionale et l'oxygénation du sang et des tissus mais aussi la distribution des phosphores à haute énergie, la production de lactate, le ph intracellulaire, l'activité du cycle de Krebs et les oxydations phosphorylantes mitochondriales. L'approche RMN que nous envisageons adopte une stratégie «pseudo-simultanée» qui consiste à entrelacer les acquisitions de manière à mesurer en un seul examen, la perfusion, l'oxygénation musculaire et le métabolisme énergétique. Notre imageur/spectromètre corps entier se prête très bien aux explorations musculaires des membres inférieurs. L'aimant, doté d'un tunnel à large ouverture (72 cm) autorise, pendant les acquisitions, le déroulement de protocoles d'exercices musculaires réalisés sur un ergomètre amagnétique qui contrôle et quantifie le travail. Le rapport signal sur bruit fourni par un champ magnétique élevé (3 Tesla) est un atout majeur quand il s'agit de quantifier des metabolites de faibles concentrations. Cet aspect contribue de manière significative à améliorer la résolution temporelle lors d'enregistrement des phénomènes dynamiques. 13

21 C.PLANDELATHESE La fonction musculaire regroupe cinq volets qui sont d'ordre mécanique, électrique, métabolique et circulatoire. Le cinquième volet, l'oxygène, constitue le comburant essentiel à l'intégrité du muscle. Dans le premier chapitre, nous abordons les trois derniers volets en traitant en parallèle la physiologie et les différentes techniques d'exploration de la perfusion et de l'oxygénation musculaire chez l'homme. Le second chapitre concerne les développements méthodologiques et les outils que nous avons mis en oeuvre en vue de la réalisation des protocoles physiologiques. Les développements décrits dans cette partie se situent tant sur le plan électronique avec des constructions de sondes RMN dédiées à des applications précises et la réalisation d'une interface électronique en vue d'acquisitions multifréquentielles entrelacées, que sur le plan informatique avec la définition des modules RMN qui sont utilisés dans les séquences hétéronucléaires entrelacées ou encore l'écriture d'automations spécifiques pour le traitement des données. Enfin ce chapitre aborde également les étapes de validation in vitro de cette nouvelle approche. Dans le troisième chapitre, nous rapportons d'abord les résultats des investigations préliminaires sur volontaires avant de présenter les différents protocoles. Dans un souci de clarté, pour les différentes explorations physiologiques des sujets sains et des patients atteints de myopathie (dystrophie de Becker), nous décrivons à chaque fois en parallèle le protocole et la séquence entrelacée qui lui est spécifique. Nous nous intéressons plus particulièrement à des protocoles d'ischémie simple, d'exercice ischémique ou aérobie, suivis de leur phase de récupération. Nous examinons les relations de dépendance entre différentes variables parmi lesquelles se trouvent la perfusion musculaire, la diffusion intracellulaire de l'oxygène, l'oxygénation capillaire, l'oxygénation tissulaire, le métabolisme énergétique, la glycolyse anaérobie et la capacité oxydative mitochondriale maximale des territoires musculaires. 14

22 CHAPITRE I : PHYSIOLOGIE ET EXPLORATIONS MUSCULAIRES A. METABOLISME ENERGETIQUE MUSCULAIRE ET COMPOSES PHOSPHORYLES 1. STRUCTURE ET COMPOSITION DES FIBRES MUSCULAIRES Les myofibrilles sont les éléments contractiles de la fibre musculaire dont ils occupent 80 % du volume. Chaque myofibrille se compose d'une succession de sarcomères, constitués de deux types de filaments formés de protéines contractiles qui sont la myosine pour les filaments épais et l'actine pour les filaments minces (figure 1). Les ponts transversaux comblent l'espace compris entre les filaments épais et les filaments minces. Ces ponts sont les sites producteurs de force dans les cellules musculaires.! HZ -~-A^_ I zone line bandtsant) SjÊÏBtSïËMïÈM Myofilaments Figure 1 : Organisation microscopique du muscle squelettique. Le muscle est composé de fibres qui sont elles mêmes formées de myofibrilles regroupant des filaments d'actine et de myosine. La cellule musculaire (figure 2) est délimitée par une membrane appelée sarcolemme qui entre en contact avec la terminaison nerveuse et constitue la plaque motrice. C'est à ce niveau que naît le potentiel propagé, responsable et témoin de 1'activation de la fibre nerveuse. 15

23 tubule transverse sarcotubules myofibrilles ligne Z Figure 2 : Détail d'un sarcomère d'une fibre musculaire squelettique humaine rapide. Représentation tridimensionnelle des tubules transverses et du reticulum sarcoplasmique. Le cytoplasme joue un rôle nutritif capital. Ce milieu cellulaire renferme divers substrats du métabolisme énergétique comme le glycogène, la phosphocréatine (PCr) et l'adénosine-triphosphate (ATP) mais également des protéines libres. H contient par ailleurs de très nombreuses mitochondries disposées le long des myofibrilles et de la myoglobine qui constituent une petite réserve intracellulaire d'oxygène disponible précocement dès le début d'une activité musculaire. Les noyaux des cellules musculaires très nombreux, sont allongés dans le sens de la fibre et répartis sur toute sa longueur. Le reticulum endoplasmique favorise la circulation des divers substrats à l'intérieur de celle-ci. Il est plaqué contre les myofibrilles en regard de chaque sarcomère et est en contact étroit avec le système tubulaire transversal (système T). Cette structure est d'une grande importance pour la contraction et la relaxation des fibres musculaires. Le potentiel propagé se déplace non seulement le long de la surface de la fibre musculaire mais également en suivant le système T, à la jonction entre deux sarcomères. Ce dispositif est responsable de l'activation quasi-simultanée de l'ensemble des sarcomères de chaque myofibrille de chaque fibre. Les mitochondries de forme ovoïde sont regroupées en petits amas. Leur longueur peut atteindre 7 im et leur largeur varie de 0,5 à 1 (im. Les muscles rouges et blancs se distinguent par le nombre et la taille des mitochondries. La matrice constitue l'espace intra-mitochondrial. La membrane externe est librement perméable aux molécules ayant un poids moléculaire inférieur à daltons. Les enzymes du cycle de Krebs et de la chaîne respiratoire (entités définies par la suite) sont essentiellement localisées dans la matrice. Les réactions d'oxydation du glucose permettant la formation d'atp ont lieu dans la membrane interne de la mitochondrie. 16

24 Les oxydations phosphorylantes (Stryer, 1988; Balaban, 1990) sont le processus au cours duquel les atomes d'hydrogène provenant du catabolisme des molécules de combustible sont transférés, par l'intermédiaire de coenzymes, sous forme d'électrons et d'ions hydrogènes aux cytochromes de la chaîne respiratoire. Ces cytochromes appartiennent à une famille de molécules hémoprotéiques comprenant un noyau porphyrine et du fer comme le pigment de l'hémoglobine des hématies. Es sont spectrophotométriquement différenciables les uns des autres (a, a3, b, c, cl). Chaque cytochrome contient sous sa forme oxydée, un atome de fer ferrique (Fe 3+ ) qui peut accepter un électron et être réduit en état ferreux (Fe 2+ ), puis être réoxydé en état ferrique lorsqu'il transmet cet électron à l'accepteur suivant. Les deux derniers accepteurs de cette chaîne respiratoire sont étroitement imbriqués (cytochrome a-a3) et sont décrits sous le nom commun de cytochrome-oxidase. Le cytochrome a3 donne directement ses électrons à l'oxygène moléculaire aboutissant par libération d'énergie à la formation d'atp et à la synthèse d'eau. Cette chaîne est strictement aérobie et fortement consommatrice d'oxygène. Les trois différents types de fibres sont : - Les fibres lentes oxydatives (type I) : faible capacité de myosine ATPase, capacité oxydative élevée, aptitude développée à oxyder l'acide lactique, capacité de résister à la fatigue. - Les fibres rapides oxydatives (type Ha) : capacité élevée de myosine ATPase, capacité oxydative élevée, plus résistantes à la fatigue que les lib. - Les fibres rapides glycolytiques (type lib) : capacité élevée de myosine ATPase, capacité glycolytique élevée, consommation d'atp par mg de fibres et par unité de temps plus grande que les fibres de type I, faible résistance à la fatigue. 2. SOURCES D'ÉNERGIE A L'EFFORT a) Rôle del'atp Le principal facteur de la survie de la cellule est la production d'énergie cellulaire, stockée essentiellement sous la forme d'atp. Afin d'explorer le métabolisme énergétique cellulaire on peut, en première approche, examiner les paramètres à la base de la formation 17

25 d'atp que sont l'oxydant (l'oxygène) et les substrats énergétiques tels que le NADH (nicotinamide-adénine-nucléotide) et le FADH2 (flavine-adénine-dinucléotide). Ces entités énergétiques sont dirigées vers la matrice mitochondriale. En réalité, c'est le potentiel rédox du NADH et FADH2 (énergie d'oxydo-réduction formée lors des réactions de déshydrogénation au cours du cycle de Krebs), qui est utilisé conjointement avec l'oxygène pour participer à la synthèse d'atp. L'énergie chimique stockée au sein des liaisons phosphates de l'atp sera transformée en énergie mécanique nécessaire lors de la contraction musculaire. Comme schématisé sur la figure 3, deux mécanismes permettent d'assurer un apport suffisant en ATP, l'un aérobie, l'autre anaérobie. Le premier concerne la production d'atp à partir de l'hydrolyse complète de différents substrats énergétiques en présence d'oxygène. Le second comprend la fourniture d'atp à partir des réserves locales en phosphocréatine (PCr) et l'hydrolyse anaérobie du glycogène. Acides Amines Aliments Glucides *pas d'oxygène utilisé Acides Gras Cytoplasme 3ATP- 3ATP-^ 3ATP-^~ 3ATP-^ Oxydations phosphorylantes -2e--^ 2H Chaîne de transport des électrons Figure 3 : Représentation schématique des différentes étapes aérobie et anaérobie de la dégradation des composés organiques (glucides, acides aminés, acides gras) permettant d'aboutir à la synthèse de molécules d'atp. Ces composés contenant du carbone et de l'hydrogène peuvent être complètement brûlés par l'oxygène en produisant du CO2 et de l'h 2 O. 18

26 On peut ainsi prétendre étudier le métabolisme énergétique en mesurant directement les concentrations des metabolites phosphorylés à liaisons à haute énergie tels que l'atp ou même l'adp, le Pi et la PCr qui interviennent dans la production d'atp. La concentration en ATP musculaire est faible : 4 à 5 mmol/kg de poids frais, ce qui correspond à l'énergie nécessaire pour une contraction de quelques fractions à quelques secondes. Lors d'un exercice, l'atp ne diminue guère au dessous de 80 % de sa concentration de repos. Au repos le débit moyen nécessaire est d'environ 1 mmole d'atp à hydrolyser par gramme de muscle et par minute. Lors d'un effort intense, le taux d'utilisation de l'atp peut être 1000 fois supérieur au taux de base. b) Métabolisme aérobie : les oxydations phosphorylantes Au repos ou sous effort modéré, toute l'énergie indispensable à l'organisme provient du métabolisme aérobie dont les étapes sont schématisées en trait plein sur la figure 4. Ce processus utilise comme substrat le glucose provenant du glycogène musculaire ou hépatique, les acides gras d'origine musculaire ou mobilisés à partir des réserves lipidiques de l'organisme, et les acides aminés issus des protéines. Lors de la glycolyse, le glucose est transformé au cours d'une série de réactions en pyruvate, formant 2 molécules d'atp à partir d'une molécule de glucose. En présence d'oxygène, le pyruvate va pénétrer dans la mitochondrie grâce à l'action de l'enzyme pyruvate déshydrogénase (PDH). Ce système catalyse une «décarboxylation oxydative» dans laquelle la nicotine-adénine-dinucléotine (NAD) intervient comme accepteur d'hydrogène, et qui après libération du CO2, fixe le reste de la molécule de pyruvate sur le coenzyme A pour former l'acétyl-coenzyme A (Acétyl- CoA). Ce dernier est un intermédiaire qui est commun aux trois grandes voies métaboliques (acides aminés, glycolyse, acides gras). A ce niveau, les différents substrats entrent en compétition pour la fourniture d'énergie. L'acétyl-CoA se combine avec l'oxalo-acétate pour former le citrate qui va ensuite rentrer dans le cycle de l'acide tricarboxylique, connu sous le nom de cycle de Krebs. Le cycle de Krebs est une voie métabolique particulière qui permet l'oxydation très complète de l'acétyl-coa libérant du CO2 et des atomes d'hydrogène lors d'une suite cyclique de réactions d'oxydo-réduction (perte et gain d'électrons) catalysées par un ensemble d'enzymes. A ce stade, le CO2 éliminé est formé par les atomes de carbone et les 19

27 molécules d'c>2 ingérées dans l'alimentation. Le cycle de Krebs est considéré comme «le moteur» de la cellule, il est situé en amont de la chaîne respiratoire et fournit les substrats énergétiques à partir des nutriments sous forme d'énergie d'oxydo-réduction. L'énergie ainsi libérée est «récupérée» par un transporteur (dans nos cellules principalement le couple NADH/NAD + ) qui transfert l'énergie sous forme de potentiel rédox (NADH ou FADH2 respectivement nicotinamide ou flavine-adénine-dinucléotide) qui va présenter le véritable «carburant» de la chaîne respiratoire. La chaîne respiratoire ou chaîne des transporteurs d'électrons de l'hydrogène : La membrane interne de la cellule étant imperméable, un système de transport (navettes) des ions H + est nécessaire (figure 4). Ces navettes permettent de maintenir un potentiel différent dans le cytosol et la mitochondrie. Les ions H + et les électrons libérés au cours des réactions précédentes sont acheminés par étapes le long d'une chaîne d'enzymes transporteurs nommés cytochromes (voir oxydations phosphorylantes). Les électrons passent au travers d'une séquence de différents cytochromes libérant en cascade de l'énergie par chacune des chutes de potentiel. En effet, chaque membre de la chaîne respiratoire possède une quantité d'énergie supérieure à celui qui le suit. L'énergie libérée à chaque palier va permettre la synthèse d'atp. Dans cette chaîne respiratoire, rappelons que seul le dernier cytochrome (a3), le cytochrome oxydase est auto-oxydable et capable de céder ses électrons à l'c>2 moléculaire 1. Ce dernier réagit à son tour avec les ions hydrogènes libérés en début de séquence lors d'une réaction d'oxydation du NADH ou FADH2, pour former de l'eau. L'ensemble se traduit par la réaction : -O î _ 2 +-H NADH& 3 ATP + H NAD + [1] 2 L'ATP formé ne franchit pas la membrane mitochondriale, il doit emprunter un transporteur : la translocase qui l'échange contre l'adp. L'oxydation complète d'une molécule de glucose en CO2 et H2O permet la synthèse de 36 molécules d'atp avec une consommation associée de 12 atomes d'oxygène (rapport P/C>2= 6), soit 18 fois plus que la dégradation lactique anaérobie. H faut également retenir que la consommation d'oxygène lors des oxydations phosphorylantes mitochondriales compte pour la quasi-totalité de l'oxygène utilisé par l'organisme. 'Wittenberg et al. (1970) ont mis en évidence la relation entre la concentration de myoglobine et l'activité du cytochrome oxidase pour différents animaux. 20

28 Creatine* Cr Kinase I X Cr C ADP; + C P i Cytosol ATP-ase* H + f ^Acétyl CoA NAD + NADH C J Mitochondrie * complexes enzymatiques NADH NAD H Figure 4 : Représentation schématique de la synthèse d'atp au niveau du cytosol lors de la réaction avec la créatine kinase et au niveau de la mitochondrie lors des oxydations phosphorylantes. Les translocases sont des navettes permettant le transport des metabolites à travers la membrane séparant le cytosol et la mitochondrie. Au cours de ce processus, 40 % de l'énergie totale libérée le long de la chaîne des cytochromes est transférée à l'atp, les 60 % restants sont dissipés sous forme de chaleur. A son tour, la synthèse d'atp pennet d'obtenir un certain niveau d'énergie dans la cellule que l'on peut définir par le potentiel phosphate [ATP/(ADPxPi)]. Lorsque la vitesse de synthèse de l'atp est égale à l'utilisation, ce rapport est constant, ce qui est généralement le cas in vivo. Le principal facteur de régulation de la vitesse de la respiration cellulaire, et donc de la synthèse d'atp, est classiquement le niveau de ce potentiel phosphate. En d'autres termes, lorsque le niveau de ce rapport diminue, par l'utilisation de l'atp converti en ADP, la synthèse d'atp est facilitée avec une augmentation parallèle de la consommation d'oxygène. Cette conception est juste, comme en témoigne la constatation expérimentale de l'augmentation de la respiration consécutive à la réduction du rapport ATP/ADP, mais peut être un peu simple pour la compréhension des déficits énergétiques tissulaires. 21

29 Le délai de mise en jeu du métabolisme aérobie s'explique par l'inertie des mécanismes de régulation des fonctions ventilatoires et cardio-vasculaires. Les oxydations commencent dès le début de l'exercice en faisant appel à l'oxygène fixé sur la myoglobine et à l'oxygène sanguin. c) Métabolisme anaérobie alactique Ce mécanisme de resynthèse de l'atp, assuré par la PCr au niveau du cytosol, permet la production rapide d'atp pour la contraction musculaire. H y a 3 à 4 fois plus de PCr que d'atp dans le muscle soit environ 14 à 18 mmol/kg. Le groupement phosphate, riche en énergie est transféré à l'adp lors de la réaction enzymatique impliquant la créatine phosphokinase (CK) (figure 4) : PCr + ADP + H + &Cr+ ATP La PCr est une réserve d'énergie qui participe à la resynthèse d'atp dès le début d'un exercice. Elle ne nécessite pas la présence d'oxygène et ne s'accompagne pas de formation d'acide lactique (source anaérobie alactique). Toutefois cette réserve est faible et ne permet la poursuite d'un exercice, même peu intense, que pendant une dizaine de secondes. Au cours de l'exercice maximal bref, presque 88 % de la PCr est dépensé en 5 s. Après la fin de l'exercice, les réserves de PCr sont reconstituées via une augmentation de la consommation d'oxygène. Cette phase de paiement de la dette d'oxygène alactique a une cinétique exponentielle. Elle s'effectue en fonction du type d'exercice (dynamique ou statique) pour la moitié en 20 à 25 s, pour la totalité en 2-3 minutes. L'apport d'oxygène par le sang joue un rôle essentiel : le blocage de la circulation stoppe la resynthèse de PCr. 22

30 d) Métabolisme anaérobie lactique : la glycose anaérobie Son délai de mise en route est bref, mais non instantané. Le contenu de PCr musculaire doit diminuer suffisamment pour que la glycolyse anaérobie soit opérationnelle. Cette glycolyse anaérobie, qui a lieu dans le cytoplasme, met en jeu la dégradation du glycogène en acide lactique. Dès le début de l'exercice, cette réaction est favorisée par la présence de catabolites (ADP, AMP) qui active les enzymes du catabolisme du glycogène et du glucose. La poursuite de la glycolyse implique la régénération du NAD + à partir du NADH formé. En l'absence d'oxygène, cette régénération s'effectue par un transfert d'hydrogène du NADH à l'acide pyruvique (pyruvate) avec formation d'acide lactique sous le contrôle de l'enzyme lactate déshydrogénase (figure 3). Le NAD + redevient disponible. Cette dégradation anaérobie s'accompagne de la synthèse de 2 molécules d'atp par molécule de glucose au prix d'une production de lactate provoquant une diminution du ph sanguin et musculaire. Glucose + 2 Pi+ 2 ADP -» 2 Lactate + 2 ATP + 2H 2 O + H + L'acide lactique est en fait produit au début d'un exercice lorsque la source aérobie est encore incapable à elle seule de subvenir au besoin d'énergie (Harris et al., 1977; Sahlin, 1978). Le processus anaérobie lactique se déclenche généralement, en fonction de l'intensité de l'effort, après une période allant de 20 s à 2 min d'exercice. Pour des exercices sousmaximaux anaérobies lactiques, la quantité d'énergie maximale est difficile à évaluer. Ce n'est pas le taux de glycogène musculaire qui est le facteur limitant mais plutôt le ph intramusculaire. Sa diminution s'accompagne de celles des activités des enzymes de la glycolyse (phosphorylase et phosphofructokinase) et des propriétés contractiles du muscle. Le ph dépend de la quantité de lactate produit, du pouvoir tampon musculaire et du débit sanguin local. Une fois formé dans le muscle, l'acide lactique (lactate) diffuse rapidement mais de façon hétérogène vers les liquides extracellulaires et le secteur plasmatique et s'éloigne de la zone de muscle actif. L'équilibre met 3 à 10 minutes pour s'établir. En présence d'oxygène, lors de la récupération par exemple, une partie du lactate est métabolisée sur place dans le muscle. En effet, les atomes d'hydrogène retenus sur l'acide lactique sont repris par le NAD + 23

31 puis oxydés. L'acide lactique se transforme alors en acide pyruvique, source d'énergie. A l'issue de l'exercice, la lactacidémie diminue de façon exponentielle ; le délai de demiélimination du secteur plasmatique est de l'ordre de 15 à 20 minutes. L'acide lactique est utilisé comme substrat dans les muscles actifs, pour remplacer en partie le glycogène, le glucose et les acides gras (Gleeson, 1996). Les concentrations maximales observées dans le sang sont nettement inférieures à celles du muscle qui peuvent atteindre 25 mmol/kg (Karlsson, 1971; Pan et al, 1991) voire 30 mmol/kg (Medbo et Tabata, 1993). La concentration d'acide lactique dans le sang chez un individu pratiquant des niveaux différents d'exercice donne une idée de l'intensité du travail fourni. Jacobs et al. (1982), n'ont pas trouvé de différence de concentration de lactate entre les fibres de type I et les fibres de typeu En cours d'exercice, une évaluation atraumatique du lactate musculaire semble donc intéressante pour apprécier le métabolisme énergétique. 3. TECHNIQUES D'ÉVALUATION DU MÉTABOLISME ÉNERGÉTIQUE a) Biopsies et analyses enzymatiques Des fragments de muscles de 20 à 70 mg peuvent être prélevés chez l'homme afin de déterminer les concentrations absolues des metabolites. Les biopsies sont effectuées à l'aide d'aiguilles de 3,5 à 5 mm après anesthésie locale et incision de la peau. Dans certaines recherches expérimentales, les prélèvements peuvent être réitérés à plusieurs reprises (Haljamae et Enger, 1975). Us doivent être immédiatement congelés dans de l'azote liquide afin de stopper toute réaction pouvant faire évoluer les concentrations des metabolites à quantifier et ainsi retenir autant que possible l'état original du tissu. Les activités enzymatiques, spécifiques à chaque metabolite, sont le plus fréquemment estimées par des techniques histologiques. Il est possible de déterminer les concentrations d'atp, ADP, PCr, Pi, NADH, glucose, lactate, pyruvate, le plus souvent sur un muscle au repos. Karlsson et al. (1971) ont examiné la reproductibilite de la concentration de lactate musculaire prélevé à différents endroits du quadriceps de volontaires au repos et en cours d'exercice. Le coefficient de variation des mesures dupliquées ne dépasse pas les 15 %. La procédure nécessitant une biopsie est désormais rarement employée dans le domaine de la physiologie de l'exercice 24

32 puisque des techniques, notamment la RMN, à la fois atraumatiques, reproductibles et également quantitatives sont disponibles. Les biopsies musculaires sont maintenant réservées au diagnostic histologique et génétique de certaines pathologies, telles les myopathies. b) Spectroscopie RMN du phosphore-31 Préambule : Les positions des différentes résonances des spectres RMN sont exprimées en écart par rapport à une fréquence de référence, l'unité est alors le millionième de la fréquence de référence, ou partie par million (ppm). L'intérêt de la spectroscopie RMN dérive du rôle clé des molécules phosphorylées dans le métabolisme énergétique. La spectroscopie RMN du 31 P, introduite depuis quelques années en physiologie musculaire, est un outil puissant d'exploration atraumatique du métabolisme énergétique in vivo. Wilson s'est longuement attaché à démontrer in vitro la dépendance du métabolisme énergétique cellulaire vis-à-vis de l'oxygène (Wilson et al., 1977; Wilson et al, 1979). Le phosphore-31 est l'isotope naturel du phosphore. H est facilement détectable par RMN du fait de sa sensibilité (1/15 de celle du proton), de son abondance naturelle (100 %) et de la relative simplicité des spectres due au nombre limité d'atomes de phosphore dans les molécules biologiques. L'importance du 31 P dérive en partie de la relation intime qui lie les metabolites phosphorylés et la fonction musculaire puisque le muscle transforme l'énergie chimique en énergie mécanique. La RMN du 31 P détecte et, après calibration appropriée, quantifie les principaux metabolites impliqués dans les processus biologiques clés du métabolisme énergétique cellulaire. Le spectre 31 P s'étend sur 30 ppm (soit environ 2000 Hz à 3 Tesla) avec 5 résonances principales qui correspondent aux concentrations des phosphates inorganiques (Pi), de la phosphocréatine (PCr) et des trois phosphates de F ATP (a, P, y). L'analyse des spectres est faite en prenant comme référence la résonance de la PCr. L'ATP et la PCr sont considérées comme la première et la deuxième source d'énergie chimique pour la réalisation de la contraction musculaire. D'autres composés sont normalement présents en quantités plus faibles. Ce sont les phosphomonoesters (PME) et les phosphodiesters (PDE). 25

33 Le rapport Pi/PCr est important en physiologie de l'exercice car il a été constaté, lors d'un effort modéré, que ce rapport était proportionnel à la charge de travail imposée et à la dépense énergétique correspondante. La RMN du 31 P a été mise en oeuvre pour étudier les relations entre le travail musculaire (anaérobie, aérobie), la récupération associée et les oxydations phosphorylantes chez des sujets sains en physiologie de l'exercice et dans différentes pathologies (Chance et al, 1981; Taylor et al, 1986; Miller et al, 1988; Payen et al, 1991; Bendahan et al, 1992; Kemp et Radda, 1994). Pour un même effort, le niveau et le type d'entraînement (Laurent et al, 1993) ainsi que l'âge (Coggan et al, 1993) des sujets sains semblent également intervenir sur le rapport Pi/PCr. La position du pic de Pi par rapport à celui de la PCr permet le calcul du ph intracellulaire. Le décalage fréquentiel du pic de Pi est lié aux différentes concentrations des deux formes mono (HPO4 2 ") et diprotonées (H2PO4") du Pi qui sont en échange rapide avec les protons selon la réaction : H,PO 4 ' -» HPO/ + H + En échange rapide, on observe un seul pic : 5obs pi _ pcr = _^2 s H2P0 ; x [HPO*-]+[H 2 PO;] [H 2 PO; \H 2 POT] >,-,,, avec K H - L ir J, on déduit la relation : Ï5 \ HPO. ph = pk H + \og \ ^ avec pk H = 6,75 où S Hpoi. = - 5,69 ppm et 5 H^po _= - 3,27 ppm D'où l'équation reliant le ph au déplacement chimique du Pi : -3,27 +8 ph = 6,75 + log. -ô+ 5,69. La concentration d'adp libre est un paramètre de première importance en physiologie puisque l'adp exerce un contrôle fin de l'activité des oxydations phosphorylantes des 26

34 mitochondries. Or, la concentration d'adp est trop faible pour être directement mesurée par RMN ([ADP]< 10 fim au repos) in vivo dans du tissu sain. En revanche, cette concentration peut être déterminée à partir de la réaction à l'équilibre de la créatine-kinase avec Kéq=l, /mol (Gyulai et al, 1985; Kemp et al, 1993) qui permet d'obtenir l'équation [2]. Cette relation souligne l'importance du rapport Pi/PCr. -L-}\ K éq [PCr][H + ] [2] Calcul de la respiration mitochondriale (Vo 2 mito) à partir des données RMN en 31 P La spectroscopie RMN du phosphore-31 permet en outre de calculer la consommation mitochondriale d'oxygène. En effet, le calcul repose sur la relation [3] établie par Chance, liant la concentration d'adp libre ou le rapport Pi/PCr au taux de synthèse mitochondrial oxydatif d'atp. g max g max g = v [3] ou encore g = [4] Km Km Z l + [ÂDP] l + ~PT PCr où Q représente le taux de synthèse oxydatif de l'atp, Qmax reflète la capacité oxydative maximale apparente des mitochondries. Les données RMN en phosphore acquises en fin d'exercice ischémique nous permettent de calculer le rapport Pi/PCr. On fait ensuite l'hypothèse, chez l'homme, d'une valeur de Km de 30 jimol/1 (Kemp et Radda, 1994) ou du produit Km.Z de 0,8 (Chance et al, 1995). H reste alors à calculer Qmax. Ce taux oxydatif maximal apparent de synthèse de l'atp, exprimé par l'équation [5], peut être estimé à partir du rapport entre la concentration de la PCr de repos et la constante de temps de récupération exponentielle de la PCr (xpcr). TPCR est, lors de la récupération, le temps nécessaire pour la reformation de 63 % du niveau de PCr de base. En remplaçant l'équation [5] proposée par Kemp (1994) dans l'équation [4], on peut ainsi déterminer le taux oxydatif de synthèse de l'atp (Q). max 1 zpcr 27

35 D'après la littérature, on peut prendre comme hypothèse raisonnable, une concentration moyenne de PCr de repos de 15 mmol/kg de poids frais dans une population d'individus sains (McArdle et al, 1988). De plus, il est possible d'obtenir la consommation mitochondriale d'oxygène à partir du taux de synthèse oxydatif de l'atp qui vient d'être calculé. En effet, le rapport mitochondrial P/O2 lie directement la consommation mitochondriale d'oxygène au taux de synthèse oxydatif de l'atp. Ce rapport correspond au nombre d'atomes de P passant d'ions phosphates à l'atp par molécules d'oxygène consommées (cf. équation [1]). On fait l'hypothèse d'un rapport mitochondrial de 6, la valeur mesurée sur du muscle de rat et de mouton étant de 6,07 (Boska, 1991) et de 5,4 (Portman et al, 1995) respectivement. On suppose cette valeur constante pour tous les volontaires sains. De la même façon, on peut déterminer la consommation mitochondriale maximale apparente d'oxygène (V02max app ) à partir du taux maximal oxydatif de synthèse d'atp (Qmax). On peut alors exprimer les relations : Qmax. Q VO 2 max app =Z~- [6] et VO = mito =f [7] 6 Ainsi, à l'instant précis du relâchement du brassard, à partir des spectres individuels en phosphore et pour chaque individu et chaque session, nous allons pouvoir mesurer le rapport Pi/PCr et le temps de normalisation de la PCr (xpcr) pour en déduire Vo 2 mito et VO2max ap p. La spectroscopie RMN du phosphore-31 sera amplement mise à contribution dans la plupart de nos travaux. c) Fluorimétrie laser du NADH Rappel sur le principe de la fluorescence (figure 5) : Lorsqu'un élément, atome ou molécule absorbe une radiation électromagnétique (A), un électron peut passer de son état fondamental de repos (EO) à un état excité d'énergie supérieure (El). Cette radiation est située dans l'ultraviolet car l'écart entre les deux premiers niveaux quantiques est important et nécessite une grande énergie. Ainsi élevé très rapidement (10" 15 s) à divers niveaux de vibration d'un état excité, la durée de vie de l'élément dans cet état est très brève (1 à 10 ns). 28

36 Une partie de l'énergie absorbée (A) est transférée aux molécules environnantes (T). La molécule se retrouve au plus bas niveau de vibration de l'état excité. C'est à partir de ce niveau que la molécule retourne à son état fondamental (l'électron retombe sur une couche d'énergie inférieure) avec émission d'une radiation de fluorescence (F) d'énergie inférieure, donc de longueur d'onde supérieure à la radiation incidente. Eo Figure 5 : Représentation schématique des différents niveaux d'énergie après excitation de molécules (A) puis retour à l'état fondamental par un rayonnement fluorescent (F) après avoir cédé une partie de l'énergie aux molécules de solvant environnantes (T). Les substrats énergétiques NADH et FADH 2 sont fournis par le cycle de Krebs sous forme d'énergie d'oxydo-réduction et sont dirigés vers la matrice mitochondriale pour libérer leur énergie (potentiel redox) permettant la synthèse d'atp. Les travaux de Chance et Williams et al. (1955) font état, sur des mitochondries isolées, d'une corrélation entre leur niveau de consommation d'oxygène et le pourcentage de réduction des cytochromes, des flavoprotéines et du NADH. Le niveau mitochondrial de NADH est donc un paramètre sensible du métabolisme énergétique cellulaire. Le potentiel redox est souvent assimilé au rapport NADH/NAD + dont la mesure permet l'étude du fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale à son entrée même puisque le NAD est le premier des coenzymes de cette chaîne. En effet, les variations dans l'émission cellulaire de fluorescence par le NADH peuvent être utilisées pour apprécier des changements dans l'équilibre apportutilisation de l'oxygène. Le principe de la fluorimétrie laser du NADH repose sur les propriétés optiques du NAD(H) qui absorbe la lumière ultraviolette quand il est sous forme réduite (NADH) et non quand il est sous forme oxydée (NAD + ). L'appareillage, illustré sur la figure 6, comprend 29

37 deux sources de lumière laser, des sondes à fibres optiques uniques et très fines, et un traitement numérique des données. Les sources lasers fournissent des impulsions synchrones, de 5 ns de durée, cinquante fois par seconde, à deux longueurs d'onde 337 nm (excitation du NADH) et 586 nm (signal de référence). Les deux faisceaux lumineux sont conduits par une fibre optique jusqu'au muscle. L'absorption due au NADH est suivie d'une émission fluorescente à 480 nm d'intensité Fo et d'une rétrodiffusion à 586 nm. Ces signaux sont conduits par le module optique jusqu'aux photomultiplicateurs, où ils sont transformés en signaux électriques. La moyenne des mesures permet d'améliorer le rapport signal/bruit. Fo est fonction de la concentration intracellulaire en NADH, selon la relation : F 0 = k[nadh] + f où k et f sont des constantes déterminées expérimentalement. LASER A C OL ORANT -HD PM tlqftrr à PKO SS6nn a Figure 6 : Fluorimètre à laser. Un laser à azote émet un faisceau de lumière ultraviolette (337 nm), dont l'intensité est mesurée par une photodiode (PhD) et qui est dirigé vers la fibre optique. Le laser à colorant émet une lumière de référence (586 nm), également dirigée vers la fibre optique. L'intensité de la lumière fluorescente (480 nm) et celle de la lumière réfléchie sont analysées par des photomultiplicateurs (PM). Une seule fibre optique conduit la lumière au tissu et collecte le signal de fluorescence issu du muscle. Le principal mérite de cette technique est sa sensibilité. La relation entre l'intensité de fluorescence et la concentration correspond à une gaussienne. La fluorescence laser du NADH est tout à fait adaptée à la mesure de très faibles concentrations du fait de l'augmentation du nombre de collisions entre les molécules qui dissipent l'énergie reçue ; il y a auto-inhibition de la fluorescence aux fortes concentrations. Les propriétés optiques du NADH ont été visualisées pour la première fois au niveau musculaire par Chance et al. (1959) puis par Jobsis et al. (1968) qui ont détecté des variations de NADH au cours de contractions musculaires. 30

38 Des dosages biochimiques sur coeur isolé perfusé ont confirmé que l'augmentation de fluorescence était bien corrélée avec une augmentation du contenu intracellulaire en NADH (Chance et al, 1965). H s'agit d'une technique utilisable in vivo, dont l'application a été essentiellement tournée vers l'appréciation du métabolisme énergétique et de l'état d'oxydation du muscle strié squelettique, et du myocarde, chez l'homme et chez l'animal (Sahlin, 1983; Renault et al, 1987; Toussaint et al, 1988; Guezennec et al, 1991). En effet, cette méthode ne peut être appliquée qu'aux tissus dont le NADH est essentiellement mitochondrial, la fraction cytosolique étant négligeable (Noutinen, 1984). Elle a été utilisée pour appréhender le diagnostic de certaines myopathies telles que la maladie de McArdle (Duboc et al, 1987). Cette même équipe a mis en évidence, par le biais de cette technique, les différences de capacité oxydative entre les fibres rapides et lentes (Duboc et al, 1988). Certains travaux laissent penser que les variations du NADH peuvent être considérées comme un index sensible de la sévérité d'une ischémie et/ou d'une hypoxie cellulaire myocardique (Harken et al, 1981; Duboc et al, 1986). Nous n'avons pas trouvé dans les articles de la littérature la profondeur d'exploration de cette méthode. Elle semble cependant locale puisque les auteurs précisent qu'une incision est nécessaire pour introduire l'extrémité de la fibre optique au contact direct avec le muscle à explorer. Cette précision souligne le caractère invasif de cette technique, (les ultraviolets sont très absorbés par les tissus contrairement aux infra rouges). 31

39 B. CIRCULATION SANGUINE MUSCULAIRE 1. ANATOMIE ET HISTOLOGIE DES VAISSEAUX SANGUINS DANS LE MUSCLE a) Artères et artérioles Le rôle fondamental de la circulation artérielle est d'apporter aux organes les nutriments et l'oxygène nécessaires. La distribution du sang aux organes et tissus doit être adaptée selon les besoins qui varient au cours du temps. Les artères interviennent comme amortisseurs des fortes pulsations engendrées par l'activité ventriculaire après la période d'éjection. Dans les grosses artères, la résistance à l'écoulement est très faible, et la vélocité du sang est élevée. Au niveau des artérioles, la résistance à l'écoulement est élevée, ce qui induit une importante chute de pression. La vélocité y reste importante. Les cellules musculaires lisses, présents au niveau des parois des artérioles (figure 7), se contractent et se relâchent pour transformer un écoulement intermittent en un écoulement continu au niveau de la microcirculation et ainsi régulariser le débit sanguin périphérique par rétrécissement de la lumière vasculaire, phénomène connu sous le nom de vasoconstriction. L'aptitude de ces «vaisseaux résistifs» à modifier leur calibre constitue un excellent mécanisme rapide de régulation du débit sanguin dans le circuit vasculaire. Cette fonction de redistribution est importante au cours de l'exercice car elle permet de priver temporairement certaines régions corporelles au profit des muscles actifs. L'extraction de l'oxygène à partir du sang artériel ne peut varier que dans de faibles proportions, l'augmentation de l'apport en ce gaz ne peut se faire que par une augmentation corrélative du débit sanguin. Artériole inule musculeuse Figure 7 : Représentation schématique des différentes structures du lit capillaire. La disposition des muscles lisses est indiquée sur les parois des vaisseaux. 32

40 b) Capillaires Les artérioles se subdivisent en plus petits vaisseaux, moins musculaires, appelés métartérioles d'où naissent les capillaires. Le site où un capillaire sort d'une métartériole est protégé par un anneau de muscle lisse, le sphincter précapillaire, qui s'ouvre et se ferme continuellement, de telle sorte que le débit dans un capillaire donné est en général intermittent. Le sphincter précapillaire régule le débit d'entrée. Les capillaires n'ont pas de vasomotricité propre ; ce sont des structures rigides dont le diamètre est fixe. Pour accroître la perfusion sanguine capillaire une augmentation de la vélocité sanguine et/ou du nombre de capillaires perfuses est nécessaire. Certains auteurs ont montré, grâce à des modèles expérimentaux, que l'exercice accroît le nombre de capillaires perfuses d'un facteur compris entre 1,5 et 3 (Honig et al, 1980). Une équipe conteste cette théorie de recrutement capillaire, n'ayant pas observé l'accroissement du nombre de capillaires perfuses au cours d'un exercice (Oude Vrielink et al, 1987). La structure des capillaires est adaptée à leur fonction fondamentale qui est de permettre les échanges de substances entre le sang et les tissus. Les capillaires s'organisent en réseaux de dispositions différentes selon le tissu, mais on retrouve constamment des circuits parallèles le long des fibres musculaires (figure 8), dont l'irrigation est intermittente en fonction des régulations locales (recrutement capillaire). Figure 8 : Représentation schématique de la vascularisation des muscles squelettiques. Les capillaires cheminent parallèlement aux myofibrilles. Les parois de ce réseau de vaisseaux sanguins microscopiques sont constituées d'une seule couche de cellules endothéliales sans aucune enveloppe de muscle lisse ou de tissu élastique. Le volume de sang présent dans les capillaires systémiques représente 5 % du volume sanguin total. La densité capillaire des muscles squelettiques est souvent comprise entre 200 et 2000 capillaires par mm 2. Le réseau capillaire représenterait 2 % de la surface de 33

41 section totale du muscle. On peut estimer le nombre de capillaires par unité de poids de tissu à 1, capillaires/g. Le nombre moyen calculé de capillaires par unité de volume est dépendant du type de muscle. H est de 300 à 400 capillaires par mm 3 dans le muscle squelettique rapide, de 900 à 1200 capillaires par mm 3 dans les muscles de contraction lente. La conséquence immédiate de cette densité élevée est l'existence d'une distance intercapillaire faible (aucune cellule n'est distante de plus de 15 u.m d'un capillaire) et d'une surface d'échanges entre le sang et le tissu très importante, comprise entre 0,5 et 2,4 m 2 /100 cm 3 de tissu. Par conséquent, les distances de diffusion sont très petites et les échanges très efficaces. On estime la longueur totale des capillaires chez l'adulte à km. La longueur des capillaires est très variable, on estime la longueur moyenne à 1 mm avec un diamètre moyen se situant entre 5 à 6 pn (dans une gamme allant de 3 à 20 im). Le diamètre est en effet plus important du côté veineux que du côté artériel. L'écoulement du sang dans les capillaires est conditionné par la taille des vaisseaux. Certains capillaires sont si étroits que les globules ne peuvent passer qu'isolément (le globule rouge est un disque circulaire biconcave de diamètre moyen 7,2 [im avec une épaisseur de 1 u.m dans la région centrale et 2,4 (im à la périphérie) et doivent parfois s'étirer sur eux-mêmes. Au dessous d'un certain diamètre, le capillaire ne laisse passer que du plasma. Au repos, la vélocité globulaire dans les capillaires varie selon le muscle considéré. Elle est de l'ordre de 0,3 à 1 mm/seconde (Heliums, 1977). Durant l'effort musculaire, on note un accroissement important de l'hétérogénéité de répartition du sang dans le muscle (Laughlin, 1988; Walley, 1996) déjà constatée au repos (Damon et Duling, 1985; Iversen et Nicolaysen, 1995). Une à trois secondes sont environ nécessaires à un globule rouge pour traverser un capillaire (Saltin, 1985) permettant les échanges de nutriments et de produits métaboliques entre le sang et les tissus. Les échanges métaboliques entre le plasma et le milieu interstitiel dans lequel baignent les cellules, s'effectuent au niveau des capillaires. Les substances nutritives et l'oxygène sortent des capillaires pour pénétrer dans les cellules et les déchets cellulaires (CO2, chaleur,...) rejoignent le compartiment vasculaire. Les transferts dans les deux sens se font par gradient de pression, de concentration ou par des transporteurs membranaires. Les transferts d'o2 dans un sens et de CO2 en sens inverse dépendent des différences des pressions partielles respectives. A l'entrée des capillaires, la P02 est proche de celle des artères (100 torr). Elle est 34

42 en revanche basse dans le milieu interstitiel du fait de la captation continuelle de l'oxygène par les cellules. La diffusion de l'oxygène des capillaires vers les cellules est donc rapide au début de la circulation capillaire et décroît tout au long du capillaire au fur et à mesure que le sang capillaire s'appauvrit en O2 (figure 9). A la sortie des capillaires, la P02 est d'autant plus faible que le métabolisme de l'organe est élevé. La P02 du sang veineux mêlé est en moyenne de l'ordre de 40 torr. Le processus s'inverse dans le cas du CO2 produit par le métabolisme cellulaire. Les gradients de pression le long du capillaire dépendent du métabolisme. co 2 Figure 9 : Distribution des pressions d'o 2 et de CO2 (chiffres entourés) en torr dans le sang de la circulation pulmonaire et de la circulation systémique. c) Veines Le système veineux contient 65 % du volume sanguin total. Les résistances veineuses sont très inférieures aux résistances artérielles ; la vitesse d'écoulement du sang y est plus basse. Comme la pression du sang veineux est faible, les veines se compriment facilement sous l'action de faibles contractions musculaires. La contraction et la relaxation des muscles lisses sous le contrôle des nerfs et d'hormones affectent le diamètre des veines et par conséquent le contenu sanguin du réseau veineux. 35

43 2. VASOMOTRICITE CIRCULATOIRE Les fibres musculaires vasculaires sont très innervées. Cette innervation, presque exclusivement sympathique, est de type adrénergique pour la plupart des vaisseaux (elle a pour médiateur chimique la noradrénaline). Cette innervation est à la base d'une propriété fondamentale : la vasomotricite. Cette vasomotricite est plus active au niveau des artères et artérioles, riches en cellules musculaires lisses, mais est loin d'être négligeable dans le système veineux. Tous les vaisseaux dont la paroi possède des cellules musculaires lisses ont la propriété de faire varier le calibre de leur lumière, soit directement par voie neurohumorale, soit indirectement par les médiateurs libérés par les cellules endothéliales. Les variations d'activité des muscles lisses de la paroi vasculaire constituent ainsi un instrument de contrôle très efficace de la circulation sanguine. Ce sont surtout les récepteurs a qui interviennent : leur mise en jeu provoque une contraction des fibres musculaires avec pour résultat une vasoconstriction alors que leur inhibition provoque une vasodilatation passive. La paroi artérielle possède quelques récepteurs (3 dont la stimulation provoquerait une vasodilatation, dite active. Cependant, au niveau des muscles squelettiques uniquement, les vaisseaux musculaires reçoivent un riche contingent de fibres vasodilatatrices provenant du système parasympathique. Ces fibres libèrent de l'acétylcholine à leurs terminaisons (elles sont analogues aux fibres parasympathiques rencontrées ailleurs) et de ce fait sont appelées fibres cholinergiques. Au niveau de la microcirculation, la considérable surface vasculaire, représentée par le lit artériolaire, est à la base de la modulation des résistances périphériques à l'écoulement. Les modulations qualitatives et quantitatives du tonus vasomoteur permettent une adaptation très souple, nécessaire devant des exigences physiologiques telles que des variations de position. La vasomotricite microcirculatoire se situe donc à la frontière entre les régulations générales et locales. Le lieu de couplage entre ces mécanismes locaux et régionaux est constitué par l'endothélium présentant des récepteurs pour les hormones et des propriétés propres vasomodulatrices. Les cellules endothéliales développent des activités multiples vis-à-vis du flux sanguin avec lequel elles sont en contact. L'endothélium microcirculatoire libère les composantes d'un équilibre vasomoteur : l'endothéline vasoconstrictrice d'une part, et la prostacycline et le monoxyde d'azote (NO) vasodilatateurs d'autre part. 36

44 3. PRISE EN CHARGE DE L'OXYGÈNE PAR LE SANG La quasi-totalité de l'oxygène sanguin est transportée sous forme combinée à l'hémoglobine contenue dans les globules rouges ; l'oxygène dissous dans le sang artériel ne représente de 0,3 vol.%. Un sujet moyen de 70 kg dispose de 1350 ml d'oxygène à chaque instant, dont 250 ml contenus dans le sang artériel, 600 ml dans le sang capillaire et veineux et 60 ml dissous dans l'organisme. La myoglobine constitue également une réserve d'oxygène. L'hémoglobine, une hémoprotéine essentielle du globule rouge, possède quatre sites de fixation pouvant chacun se combiner à une molécule d'oxygène. La courbe de dissociation de l'hémoglobine, illustrée figure 10, traduit la transition de la forme oxygénée vers la forme désoxygénée et exprime l'affinité de l'oxygène pour cette protéine. Saturation de l'hémoglobine (%) 100 T (torr) Figure 10 : Courbe de dissociation de l'hémoglobine qui exprime la saturation en l'oxygène de l'hémoglobine (%) en fonction de la pression partielle en oxygène (en torr). La courbe de dissociation se décompose en trois segments: 1) un segment initial à faible pente (P02 <15 torr) qui traduit une faible affinité de l'hémoglobine pour l'oxygène, 2) segment intermédiaire de forte pente où l'affinité est élevée (15< P02 <40 torr), 3) et le segment final avec une partie en plateau qui traduit la saturation des sites de fixation de l'hémoglobine. L'affinité est modulée par le ph via le 2,3-diphosphoglycérate (2,3-DPG) et la température. Toute augmentation de l'acidité, de la température ou de la concentration en CO2 déplace la courbe vers la droite. Cet effet Bohr décrit la diminution de l'affinité de l'hémoglobine pour 37

45 l'oxygène, particulièrement pour une P02 située entre 20 et 50 torr, conséquence de la modification de la structure moléculaire de l'hémoglobine. On appelle P50, la P02 pour laquelle 50 % des sites sont saturés en oxygène. La P50 de l'hémoglobine vaut 26 torr chez l'homme adulte à 37 C, ph = 7,4 et à une Pco2 de 40 torr. 4. ADAPTATION CIRCULATOIRE Le transport d'û2 vers les muscles actifs en fonction des besoins, comme l'élimination du CO2 vers l'extérieur, dépend des possibilités d'adaptation du débit cardiaque et de la différence de concentration entre CO2 et O2 entre le sang artériel et le sang veineux mêlé. D relève également de mécanismes vasculaires périphériques comportant une redistribution du débit sanguin entre les territoires actifs et inactifs avec un abaissement des résistances vasculaires. a) Débit cardiaque et ses facteurs Le débit cardiaque est le premier indicateur de la capacité fonctionnelle du système cardio-vasculaire à satisfaire les besoins de l'organisme pendant l'effort. Les modifications du contenu en oxygène du sang artériel étant peu importantes entre le repos et l'exercice, le transport de l'oxygène aux tissus tient principalement aux variations du débit cardiaque. Au repos, 15 % du débit cardiaque est destiné aux muscles. Le débit cardiaque dépend de la fréquence cardiaque et de la quantité de sang éjecté. Les individus présentant une grande capacité de transport de l'oxygène, du fait de leur aptitude naturelle et/ou de l'entraînement, sont caractérisés par un volume d'éjection systolique élevé et une fréquence cardiaque basse. La position du sujet lors de l'exercice influe sur l'évolution du débit. Pour une consommation d'oxygène donnée, lors du travail des membres inférieurs, le débit cardiaque est notablement moins important en position couchée qu'en position assise. Ainsi, Folkow et al. (1971) ont montré que le débit sanguin, mesuré au niveau du mollet chez l'homme à l'occasion d'un exercice intense rythmique, pouvait lorsque celui-ci était pratiqué en position verticale, être de 50 à 60 % supérieur à celui mesuré en position horizontale. 38

46 b) Adaptation de l'hémodynamique périphérique Le débit cardiaque dépend également de conditions hémodynamiques où interviennent la pression artérielle et les résistances périphériques. Durant le passage du repos à l'effort, la tension artérielle chute pendant quelques secondes en raison d'une vasodilatation initiale généralisée à tous les muscles. Cette diminution transitoire est suivie d'une ascension régulière qui atteint son maximum proportionnellement à l'intensité de l'effort. La tension artérielle s'abaisse ensuite si l'effort est constant (Astrand et Rodahl, 1977). Au cours de l'effort, les artérioles des muscles en activité se dilatent, réduisant la résistance périphérique. Le débit sanguin musculaire peut alors atteindre 90 % du débit cardiaque, ce qui représente de 40 à 50 fois le débit musculaire de repos. Cette redistribution assure un apport suffisant aux tissus en activité et permet d'évacuer le CO2 produit. Une vasoconstriction locale entraîne une diminution des débits sanguins splanchnique, cutané, hépatique et rénal d'environ 10 à 20 %. En conséquence, les résistances à l'écoulement du sang s'abaissent au niveau des muscles actifs et augmentent dans la plupart des autres territoires vasculaires. Le débit cardiaque est dérivé vers les muscles actifs par un mécanisme nerveux et humoral (Ekblom et al, 1972). La fréquence cardiaque peut être modifiée par les influx des nerfs sympathiques et parasympathiques. L'action vasoconstrictrice est masquée par une action synergique vasodilatatrice locale plus importante des fibres sympathiques mises en jeu par des mécanismes centraux et réflexes. Ces derniers sont provoqués par 1'activation des mécanorécepteurs et des chémorécepteurs. Les centres cardio-vasculaires et l'encéphale sont avertis des variations de la longueur des muscles et des variations secondaires de la pression artérielle grâce aux mécanorécepteurs situés au niveau d'un certain nombre d'artères. Les chémorécepteurs, sensibles aux variations en K +, H +, à la baisse de la P02 au niveau du sang circulant, influencent la ventilation pulmonaire, mais aussi indirectement la circulation (Shepherd et Vanhoutte, 1979). Ainsi, le travail dynamique local détermine une vasodilatation importante, autorisant un débit musculaire élevé qui est fonction du type de muscle et de l'intensité de l'effort. Il 39

47 peut atteindre localement des valeurs de 100 à 120 ml.miif'.loog" 1 de muscle. Le blocage circulatoire dû à chaque contraction ne gêne pas l'irrigation du muscle si les contractions sont suffisamment espacées. Dans le cas de contractions isométriques continues, la pression latérale exercée par les fibres musculaires écrase les capillaires et provoque une ischémie locale responsable de l'épuisement. La force isométrique maximale mise en jeu est le facteur prédominant. c) Comment tester la réactivité vasculaire? Les tests de provocation sont le plus souvent nécessaires pour mettre en évidence dans différentes pathologies, des anomalies de perfusion et/ou de métabolisme qui ne seraient pas décelables au repos, comme c'est le cas dans l'insuffisance cardiaque notamment. L'effort musculaire n'est pas facilement utilisable comme un test d'adaptation circulatoire car il modifie beaucoup de paramètres musculaires (métabolisme, transfert des liquides,...). En revanche l'épreuve d'ischémie/ hyperemie reactionnelle est un test de provocation plus simple permettant d'explorer la microcirculation musculaire. Le stress d'ischémie, facile à mettre en oeuvre, est un moyen efficace pour distinguer la composante apport de l'oxygène de la cinétique d'utilisation de l'oxygène. (1) Ischémie et hyperemie reactionnelle L'ischémie se caractérise par une absence partielle ou totale d'apport en oxygène au tissu. Après que l'apport sanguin d'un organe ou d'un tissu ait été complètement interrompu, on note, dès que l'occlusion est levée, une augmentation transitoire mais marquée de l'apport sanguin dans ce même territoire pouvant atteindre 10 à 15 fois la valeur de repos. Cette phase est appelée hyperemie reactionnelle. Au cours de la période où il n'y a pas d'apport sanguin, les artérioles se dilatent dans l'organe ou dans le tissu affecté, en réponse aux facteurs locaux décrits par la suite, si bien que le débit sanguin à travers ces artérioles largement ouvertes est très élevé dès que disparaît l'obstacle artériel. L'hyperemie reactionnelle post-ischémique semble regrouper une composante myogénique et une composante métabolique. 40

48 (a)facteurs myogéniques Le réflexe myogénique est une réaction particulière du muscle lisse vasculaire : Les cellules musculaires lisses sont sensibles aux variations de gradient de pression transmurale auxquelles elles s'opposent (Bayliss, 1902). Lors de l'arrêt de la circulation, la pression artérielle, et probablement la pression transmurale, diminuent, entraînant une chute du tonus vasculaire (Shepherd, 1964). Les impulsions nerveuses sympathiques reçues en réponse à des variations de pression des vaisseaux activent les cellules musculaires lisses qui vont faire augmenter le calibre des vaisseaux. La vélocité des globules rouges du muscle sartorius de chat a été mesurée à la suite d'ischémies de duréea allant de 5 à 120 secondes. Les occlusions très courtes (de 10 à 15 s) induisent au niveau des globules rouges des capillaires un pic de vitesse, correspondant à 70 % de la vélocité maximale, obtenu après 120 s d'ischémie. Ce pic de vitesse élevé malgré la très courte durée de l'arrêt circulatoire suggère un mécanisme myogénique (Folkow, 1964). Cependant, au moins pour des occlusions brèves, l'augmentation graduelle du flux post-ischémique et de la durée de l'hyperémie relatives à la durée d'occlusion supposent une composante métabolique qui s'accroît avec la sévérité de l'ischémie (Johnson et al, 1976). Contrairement à l'exercice musculaire, l'innervation artériolaire ne semble pas jouer un rôle dans le processus d'hyperémie réactionnelle. (b)facteurs métaboliques La vasodilatation est liée à des facteurs locaux au niveau du tissu concerné car elle persiste après dénervation (Patterson et Shepherd, 1954). Même si la composante myogénique joue un rôle important, les substances qui s'accumulent pendant l'arrêt de la circulation ont sans aucun doute un rôle clé. L'étude de Gentry et al. (1972) a suggéré que l'on pouvait attribuer le phénomène d'hyperémie à l'environnement métabolique des artérioles puisque l'occlusion individuelle des capillaires n'avait aucune influence. De nombreux facteurs locaux sont incriminés dans la vasodilatation liée à l'ischémie (Olsson, 1981) : - l'acide lactique, le ph et le CO2 : Lorsque le flux sanguin est stoppé, simultanément à la diminution de la concentration locale d'oxygène, les concentrations de CO2, d'ions hydrogène, les déchets métaboliques et l'osmolarité augmentent car ces substances ne sont pas enlevées du sang aussi vite qu'elles 41

49 sont produites. Toutes ces substances sont des candidats pour la vasodilatation métabolique (Tominaga et al, 1973). En réalité, pris individuellement aucun de ces facteurs ne peut provoquer à lui seul une telle vasodilatation. En revanche, il est probable que tous ces facteurs agissent de concert pour créer une vasodilatation importante (Scott et al, 1970). Chez l'homme, les résultats disponibles suggèrent que le CO2 est capable de produire à lui seul une vasodilatation par une action directe sur les muscles lisses vasculaires, probablement en conséquence de la diminution du ph intracellulaire (Richardson et al, 1961; Kontos et Patterson, 1964). l'adénosine et les adénines nucléotides : L'adénosine peut causer la relaxation des vaisseaux sanguins isolés contractés par certaines substances qui excitent les cellules musculaires lisses telles que l'acétylcholine et le potassium. L'adénosine interviendrait au moins partiellement au premier instant du mécanisme de vasodilatation (Tominaga et al, 1975). Son action vasodilatatrice est toutefois discutée (Hester et al, 1982). Les adénines nucléotides (Dobson et al, 1971), en particulier l'adp, sont de puissants agents vasodilatateurs qui sont susceptibles de faire chuter la résistance des vaisseaux des muscles squelettiques et par conséquent d'augmenter le flux sanguin lors de la reperfusion. Il existe en effet des récepteurs pour F ATP et l'adp sur les cellules endothéliales. L'hypoxie induit une depletion en ATP, une dysfonction de l'atpase avec accumulation de Ca 2+. Par ailleurs, l'acidose entraîne une dépolarisation membranaire et l'ouverture des canaux calciques à l'origine d'une vasodilatation par relargage du NO. De plus, la déphosphorylation de l'atp entraîne l'apparition d'adénosine. Les cellules musculaires lisses peuvent être également sensibles aux nucléotides. Lors de l'arrêt de la circulation, l'hypoxie résultante participe à l'effet de relaxation des muscles lisses sur les résistances vasculaires. Phistamine (agoniste inflammatoire) : la production d'histamine contribue pour 50 % au processus d'hyperémie fonctionnelle à condition que la durée de l'ischémie dépasse 5 min (Duff etal, 1955;HeitzetBrody, 1975). la température du muscle semble également jouer un rôle lors de l'hyperémie réactionnelle (Klabunde et Johnson, 1980) : ce phénomène est atténué par une réduction de la température. 42

50 - la faible pression partielle en oxygène : la réduction de l'approvisionnement tissulaire en oxygène est un puissant stimulus de vasodilatation dans le muscle strié cardiaque et squelettique (Crawford et al, 1959; Ross et al, 1964; Duling, 1978). Son action semble cependant indirecte. Au cours de l'hypoxie, on observe une production de NO et une synthèse accrue de prostacycline, entraînant une vasodilatation. La baisse de P02 joue donc un rôle important, mais il très difficile dans ce contexte d'individualiser sa contribution propre puisque cette baisse de P02 s'accompagne d'une évolution des facteurs précédemment cités comme l'hyperosmolarité tissulaire, le CO2, le ph, l'adénosine... (c)quelques constatations et autres facteurs A l'échelle du capillaire, Burton et al. (1972) ont montré que l'hyperémie réactionnelle est principalement provoquée par l'augmentation du flux à travers les capillaires déjà ouverts. H semblerait que, si l'on rapporte le pic d'hyperémie à son niveau de base, il n'y ait pas de différence d'hyperperfusion entre les muscles blancs et les muscles rouges (Klabunde et Johnson, 1977). Les travaux de Gentry et al. (1972) ont permis d'étayer l'hypothèse de Burton et al. (1972) selon laquelle le flux de reperfusion au niveau des capillaires est très hétérogène. Les prostaglandines représentent un autre type de médiateur local vasoactif sécrété par l'endothélium. Deux prostaglandines : la PGE1 et la PGI2 (prostacycline) ont des effets vasodilatateurs reconnus et sont déjà utilisées en thérapeutique. Des études ont démontré que l'inhibition de la synthèse de prostaglandines par l'indométhacine réduisait le pic d'hyperémie pour de courtes durées d'obstruction du flux sanguin (Beaty et Donald, 1979). (2) Exercice et hyperémie fonctionnelle La plupart des organes et des tissus présentent une augmentation de leur débit sanguin chaque fois que leur activité métabolique est augmentée. Ainsi, jusqu'à une certaine intensité d'exercice, le débit sanguin local du muscle squelettique sous effort s'accélère proportionnellement à l'augmentation d'activité du muscle. Ce phénomène appelé hyperémie fonctionnelle ou réactionnelle est la conséquence directe de la dilatation des artérioles dans l'organe actif résultant d'une activité métabolique cellulaire accrue. L'exercice est une situation dynamique nécessitant une adaptation permanente et intégrée des circulations 43

51 périphériques locales, du système respiratoire et du système cardio-vasculaire, pour permettre un fonctionnement cellulaire optimum. Le système nerveux central perçoit la stimulation. Les muscles renferment de petites fibres nerveuses sensibles aux substances métaboliques libérées au cours de l'effort. Les contributions relatives des divers mécanismes autorégulateurs métaboliques déjà mentionnés semblent dépendre du volume musculaire impliqué, de l'intensité et de la durée de l'effort. Aux facteurs locaux responsables de la vasomotricité s'ajoute le système nerveux central, sympathique et parasympathique ainsi que les sécrétions hormonales, qui tous concourent à organiser ces adaptations pour satisfaire les besoins métaboliques en oxygène et fournir les substrats énergétiques nécessaires à la réalisation de l'effort. D'autres médiateurs tels que l'élévation de la concentration de potassium sont seulement spécifiques à l'hyperémie fonctionnelle (Skinner et Powell, 1967; Mohrman et Sparks, 1974) qui n'est par ailleurs pas influencée par la production d'histamine. 5. METHODES DE MESURE DE LA PERFUSION MUSCULAIRE CHEZ L'HOMME Le débit sanguin régional chez l'homme est un paramètre physiologique de première importance puisqu'il assure, entre autres, l'approvisionnement en oxygène des tissus. Ce débit, noté Q, s'exprime en millilitre de sang par minute. On peut également l'exprimer sous forme de débit massique en millilitre de sang par cent grammes de tissu et par minute, alors noté f. Ce débit peut être évalué au sein de l'organisme, de façon plus ou moins atraumatique, par de nombreuses méthodes. Nous restreindrons notre analyse à l'étude des techniques qui permettent la quantification du débit sanguin musculaire chez l'homme : - la pléthysmographie, - la débitmétrie électromagnétique, - l'utilisation de traceurs intravasculaires, - l'utilisation de traceurs librement diffusibles, - la résonance magnétique nucléaire. Nous expliquerons les principes qui régissent ces techniques, leurs avantages et leurs inconvénients. Dans le chapitre m, nous confronterons les résultats fournis par chacune de ces techniques avec nos mesures. 44

52 a) La pléthysmographie La pléthysmographie par occlusion veineuse a été proposée dès 1732 par Swammerdam afin de mesurer la perfusion des membres. En raison de son caractère non invasif, cette approche est fréquemment décrite comme une méthode de référence pour l'évaluation du débit sanguin musculaire chez l'homme. La plupart des données physiologiques disponibles reposent sur cette technique de réalisation simple. La pléthysmographie par occlusion veineuse mesure l'augmentation de volume d'un segment de membre consécutif au blocage sélectif de son retour veineux. Le sang artériel qui continue d'affluer s'accumule dans le réseau vasculaire capacitif du membre étudié, en amont de l'obstacle. L'augmentation du volume V du segment de membre est directement proportionnelle au débit d'apport artériel. La perfusion est la dérivée première du volume du membre par rapport au temps, à partir de l'instant de l'interruption veineuse (tangente initiale à la courbe). La présence du brassard, bloquant la circulation veineuse permet la mesure pléthysmographique mais introduit peu à peu une résistance à l'écoulement du sang (débit sanguin réduit) ; la mesure n'est valide que pendant les premières secondes suivant l'interruption veineuse. En pratique, on gonfle un brassard en amont du membre à explorer à une pression supérieure à la pression veineuse mais bien inférieure à la pression artérielle diastolique, soit dans la gamme 40 à 70 torr selon les individus. La circulation du sang dans les veines est interrompue alors que la circulation artérielle est peu affectée (10 à 20 % selon les cas) (Hiatt et al, 1989; Sundberg et Kaijser, 1992). Différentes stratégies existent pour mesurer ces modifications de volume du membre. Les approches les plus intéressantes sont celles qui permettent d'obtenir une mesure quantitative de la perfusion. (1) La pléthysmographie volumétrique Cet examen, mis au point de longue date (Whitney, 1953), estime des variations de volume du membre par déplacement de fluide typiquement de l'eau (Livingstone, 1961; Kitchin, 1963) ou de l'air (Black, 1959). Le membre plongé dans une enceinte rigide remplie 45

53 d'eau va induire lors de son augmentation de volume un déplacement du niveau d'eau dans une fine colonne. L'avantage de cette technique réside dans la simplicité du dispositif expérimental. D nécessite néanmoins une enceinte complètement étanche et l'immobilité totale du membre. Cette technique, qui a été amplement employée avant l'utilisation des jauges de contrainte, est désormais désuète. (2) Les jauges de contraintes La méthode précédente est d'application délicate, notamment au cours de l'exercice en raison des mouvements du membre étudié. Whitney et al. (1953) ont été l'un des premiers à se libérer de l'enceinte pléthysmographique. On peut en effet substituer à la mesure du volume celle de la circonférence d'une section de membre avec une jauge de contrainte d'un millimètre de diamètre remplie d'une très fine colonne de mercure. La jauge de contrainte permet de mesurer au cours de la manoeuvre pléthysmographique, la variation de circonférence dc d'un segment de membre, provoquée par la variation de volume sanguin dv sur un laps de temps dt, sachant que : dv 1 dc 1 x =2 x dt V dt C La variation de longueur de la jauge au mercure due à la variation de circonférence du membre induit un changement de résistance de cette jauge proportionnel aux modifications de longueur. De nombreux travaux font appel à cette méthode, simple à mettre en oeuvre, peu onéreuse, et qui de plus, présente un coefficient de variation allant de 11 % au repos à 13 % pour des mesures post-exercice sur une jambe (Roberts et al, 1986). Elle n'est cependant applicable qu'au repos, ou lors de l'arrêt d'un exercice rythmique, ou en hyperémie réactionnelle suite à une ischémie ayant provoqué une vasodilatation. Elle ne permet pas d'étudier sélectivement un muscle puisqu'elle intègre tout le volume du segment de membre exploré. Les valeurs au repos obtenues par pléthysmographie par jauge de contrainte sur le mollet sont de l'ordre de 1 à 5 rnl.loog' 1 min" 1 (Cowley et al, 1986; Roberts et al, 1986; Meneilly et al, 1995). Après un exercice épuisant, la perfusion peut atteindre respectivement 46

54 43 et 76 ml.loog~ I min~ 1 entre des sujets sédentaires et des sujets entraînés (Reading et al, 1993). Les mesures correspondantes obtenues par Snell et al. (1987) s'établissent à 61 et 83 ml. 100g" 1 min" 1 en hyperémie réactionnelle alors que d'autres investigateurs proposent pour ces deux populations des valeurs plus faibles 32, 37 et 48 ml.loog^min" 1 (Bonde Petersen et Siggaard-Andersen, 1969; Jondeau et al, 1993; Rueckert et Hanson,. 1995) respectivement. Lors d'exercices courts (de 1 à 3 minutes) et modérés, Roberts et al. (1986) et Taylor et al. (1989) ont publié des valeurs ne dépassant pas les 8,4 ml. 100g' 1 min" 1. La littérature est très riche en ce qui concerne cette méthodologie appliquée sur le mollet et sur l'avant-bras au décours d'exercices ou/et d'ischémies. La diversité des protocoles et des volontaires impliqués (plus ou moins jeunes et entraînés) influe sur les résultats qui diffèrent selon les travaux mais qui sont globalement du même ordre de grandeur. (3) La pléthysmographie par impédance La mesure des variations de volume sanguin par le biais des variations de résistance électrique dérive de la loi d'ohm. Le sang étant bon conducteur électrique, plus un segment de membre contient de sang, plus sa résistance (ou impédance) est faible. La mesure de la résistance au passage d'un courant électrique faible et à haute fréquence au travers d'un membre permet le calcul des variations de volume. Cette technique est la plus utilisée en routine clinique pour déterminer un indice de remplissage (proportionnel au débit artériel) et pour appréhender la capacité et l'élasticité veineuse lors d'une occlusion de 3 minutes (Wheeler, 1982). L'indice de débit veineux de vidange est calculé suite à la levée de l'occlusion. H témoigne de pathologies gênant l'écoulement veineux. Costeloe et al. (1980) ont démontré la bonne reproductibilité de cette méthode avec un coefficient de variation de 7%. b) La débitmétrie électromagnétique Le développement de la débitmétrie électromagnétique représente une étape importante dans l'exploration du flux sanguin à travers un vaisseau ou un organe. Pour la première fois, il a été possible, après calibration, de suivre le flux sanguin à tout instant et continuellement sans perturber le système. 47

55 Selon la loi de Faraday sur l'induction électromagnétique, quand un conducteur bouge dans un champ magnétique, une force électromotrice est générée dans la direction perpendiculaire à la fois au champ magnétique et à la direction du mouvement du conducteur. Le sang ayant les propriétés conductrices, un voltage est induit par le sang circulant dans l'entrefer d'un électro-aimant (pouvant atteindre 5000 Gauss) puis capté par des électrodes cutanées. Le voltage V du signal, proportionnel au flux, est décrit par la relation : (QxB) V = k D où B est la densité de flux en Gauss, Q est le débit artériel moyen en ml.min" 1 et D est le diamètre du membre. Cette technique reste non-invasive lorsqu'elle mesure le flux pulsatile au niveau de la peau. Elle a d'ailleurs pratiquement toujours été utilisée pour des mesures transcutanées. La résolution temporelle de cette mesure est de l'ordre de 5 minutes. Elle autorise des mesures répétées sans inconfort du patient et s'est montrée plus efficace que des mesures par ultrasons Doppler. Mais, pour des vaisseaux plus profonds, cette méthode requiert une dissection. L'instrumentation complexe nécessite une parfaite calibration et l'accumulation du signal acquis pendant plusieurs minutes, pour réduire le bruit issu de l'activité électrique cardiaque (Stein, 1972). Une étude comparative entre la débitmétrie et la pléthysmographie par jauge de contraintes a été rapportée pour des mesures au repos et après l'exercice. Les résultats présentés montrent une bonne corrélation entre les deux techniques sur des mesures de perfusion de l'avant-bras au niveau de l'artère fémorale (r = 0,82; Q p i e t/qéiec = 1,21) (Longhurst et al, 191 A). Une étude quantitative a été menée avec succès chez le chien dans le but d'apprécier les conséquences d'un oedème sur le flux sanguin local (Zelis et al., 1974). c) Utilisation de traceurs intravasculaires Stewart développa en 1897 l'idée élaborée par Hering en Celui-ci proposait de mesurer la vitesse du sang circulant en injectant une substance purement intravasculaire en un point précis du réseau sanguin et en déterminant le temps qui s'écoule avant de la détecter par un prélèvement de sang en un autre point. 48

56 (1) Indicateurs colorés Ce procédé a été amplement utilisé pour mesurer le débit cardiaque mais il est appliqué depuis peu au niveau des extrémités. D a été formulé par Stewart-Hamilton et repose sur le principe de conservation de la masse pour mesurer le flux sanguin Q : ~ MTT où Vd est le volume de distribution du traceur et MTT est le temps moyen de transit du traceur au sein de l'organe d'intérêt. On utilise comme traceur une substance étrangère qui est injectée sous forme d'un embol. Outre son innocuité et sa facilité de mesure, l'indicateur doit rester confiné dans le compartiment sanguin et ne subir aucune modification pendant la mesure. La distribution du colorant dans le sang doit être uniforme. Les indicateurs colorés les plus fréquemment utilisés sont le vert d'indocyanine et le bleu Evans. On injecte localement une quantité M de substance colorée qui se dilue dans le volume Vd de sang. La concentration moyenne de la substance peut se définir par Cm = M/Vd- A la sortie du système, on dévie une faible partie de ce courant sanguin vers un appareil de mesure qui évalue en continu la concentration instantanée de la substance C(t). Cette courbe de dilution, représentée figure 11, permet de calculer le débit recherché. Avec tl et t2 représentant les instants de début et de fin du passage de l'indicateur (t2-ti = MTT) et par la conservation de la matière, on peut exprimer Q sous la forme : Q = MTT Y' )C(t) 11 M dt Le quotient Vd/MTT est par définition le volume de sang passé entre ti et t2, qui s'exprime en ml/min. La courbe C(t) est perturbée par le phénomène de recirculation. Hamilton a résolu ce problème en suggérant de porter en ordonnées le logarithme de la concentration instantanée, la première partie de la portion décroissante de la courbe de dilution devient donc une droite. H est alors possible de l'extrapoler afin de déterminer le point t2 pour reconstituer la courbe de première dilution et appliquer le principe de Stewart. Avec les moyens informatiques actuels, cette courbe est extrapolée par une fonction gamma, et l'aire sous cette courbe est calculée par des algorithmes mathématiques appropriés. 49

57 20 -,-Concentration du colorant Temps (s) Figure 11 : Graphique représentatif de la courbe de dilution d'un indicateur. En pratique, l'administration du bolus intravasculaire n'est pas instantanée, ce qui va prolonger le temps de transit du traceur. Pour une détermination précise, un modèle compartimentai doit être élaboré en tenant compte, dans de nouvelles équations moins simplistes, de la fonction d'entrée d'injection. De plus, cette méthode requiert une cathétérisation artérielle pour l'injection de la substance et veineuse pour le prélèvement, ce qui rend la technique invasive. Chez un même sujet, on ne peut réitérer un grand nombre de fois, le prélèvement de sang au niveau artériel et veineux. Cette méthode est une des plus reproductibles affichant des valeurs de coefficient de variation de l'ordre de 6 % (Sundberg et Kaijser, 1992). (2) La thermodilution Fegler en 1954 a proposé d'utiliser la chaleur comme indicateur. La thermodilution utilise les propriétés du sang en tant que conducteur de chaleur pour déterminer le flux sanguin. On injecte du sérum isotonique à une température inférieure à celle du sang. On mesure en aval la température du sang, qui au passage de l'embole froid, décrit une courbe analogue à la courbe de dilution d'un colorant. Le calcul du débit se fait avec un raisonnement identique au précédent où la concentration de substance colorée est remplacée par le niveau thermique. Cette approche peut être utilisée de manière non-invasive pour des mesures à la surface de la peau. Dans les autres cas, elle nécessite un détecteur tel qu'une thermistance ou un thermocouple situé dans le cathéter et directement relié à un ordinateur qui enregistre continuellement la température. La température en tant qu'indicateur a en réalité supplanté la 50

58 méthode de l'indicateur coloré dans l'évaluation du débit sanguin musculaire. La thermodilution présente l'avantage de pouvoir réaliser les mesures de perfusion au cours de l'exercice. Elle est néanmoins restreinte à l'étude de gros vaisseaux. Les mesures de débit sanguin musculaire fournies par la technique de l'indicateur thermique ou coloré, au cours d'exercices intenses, fournissent des résultats nettement supérieurs aux autres techniques. Ce principe ne donne pas l'information sous forme de débit massique qui est plus révélateur de l'organe étudié. Pour cela, il faut connaître précisément la masse musculaire irriguée par ce débit, ce qui n'est pas toujours évident. Sous-estimer cette masse revient à surestimer le débit sanguin massique. Cet aspect pourrait partiellement expliquer les débits plus élevés obtenus par cette technique. Cependant, la plupart des études réalisées par cette approche au niveau d'une jambe lors d'un exercice rythmique sollicitant un muscle des membres inférieurs, s'accordent pour donner des valeurs de perfusion pouvant atteindre voire dépasser 200 rnl.l00g" 1 min" 1 (Savard et al, 1988; Kim et al, 1995). Une étude utilisant cette technique porte sur une quarantaine de patients, dans le but de correler leur état avec l'apport d'oxygène au tissus périphériques (Boekstefers et al, 1991). Plusieurs auteurs assurent la reproductibilité de cette méthode avec un taux de variation de 10 % pour des mesures répétées au repos (LeJemtel et al, 1986) et de 16 % pendant l'exercice (Wilson et al, 1984a). d) Utilisation de traceurs librement diffusibles : 133 Xe et H 2 15 O Les mesures de flux sanguin avec des traceurs librement diffusibles font appel au principe de Fick, qui exprime simplement la conservation de la masse. La quantité de toute substance absorbée par unité de temps par un organe à partir du sang qui le perfuse est égale à la quantité de substance fournie par le flux artériel moins la quantité éliminée par drainage veineux pendant le même temps. Cette technique porte le nom de méthode de saturationclairance d'un traceur librement diffusible (méthode de wash-in/wash-out). L'hypothèse fondamentale de ce principe est l'échange rapide de traceur entre le sang et le tissu. La concentration vasculaire Cv(t) du traceur est alors proportionnelle à la concentration tissulaire 51

59 Co(t) ; le ratio Co/Cv est appelé coefficient de partition, noté A, et exprimé en ml/g. L'équation est la suivante : où Ca est la concentration artérielle et f la perfusion définie en ml. 100 g" 1.min" 1. Connaissant la concentration artérielle à tout instant, le flux sanguin sera évalué à partir de la pente de la courbe représentant les variations de concentration du traceur en fonction du temps. (1) La détection de l'émission y du 133 Xe Un détecteur à scintillation enregistre localement le niveau de radioactivité de l'organe en fonction du temps suite à l'administration de 133 Xe radioactif, (gaz inerte), émetteur de photons y. Les premières mesures utilisant le xénon datent de 1964 (Lassen et al., 1964). Dans un premier temps, cette approche nécessitait une injection intramusculaire pour administrer du xénon au niveau musculaire (sur le jambier antérieur en général). Cette technique de «washin/wash-out» est devenue moins invasive par l'administration de xénon par inhalation (Veall et Mallett, 1965). Les progrès considérables en sensibilité réalisés par la sonde à scintillation ont permis de procéder à un balayage automatique ligne après ligne afin de collecter des images in vivo correspondant à la projection sur un plan de la perfusion de toute l'activité présente dans l'épaisseur de l'organe exploré. Le principe de la mesure par inhalation consiste à faire respirer du xénon au sujet jusqu'à obtenir un équilibre de concentration entre l'air expiré et la concentration artérielle. On stoppe alors l'inhalation et on enregistre la décroissance de l'activité radioactive au cours du temps. En extrapolant les données expérimentales à une exponentielle pendant l'élimination du traceur, il est possible d'estimer le flux sanguin f (ml. loog^.min" 1 ) par la relation : f = où À est le coefficient de partition du gaz inhalé et k est la pente des données extrapolées (en min" " 1 ) exprimées en échelle logarithmique. 52

60 Cette technique présente un coefficient de variation de l'ordre de 17 % (Clausen et Lassen, 1971). Les principales causes d'erreur sont : migration du dépôt injecté hors de l'angle de détection de la caméra, injection du xénon en dehors du muscle le long du trajet de l'aiguille. De plus, les évaluations ne peuvent être répétées sur un court laps de temps car le taux de radioactivité augmente à chaque nouvelle détermination. Une différence notable entre les résultats a été constatée suivant la procédure d'administration du traceur pour une plage de perfusion allant de 0 à 70 ml. 100g" 1 min' 1. En effet, par des mesures simultanées avec un compteur direct de débit, l'injection intra-artérielle constituait 90 % de cette évaluation directe alors que dans les mêmes conditions une injection intramusculaire ne représentait que 62 % du flux (Kjellmer et al, 1967). Le traumatisme local à l'endroit de l'injection peut compliquer les mesures du flux. Les données de Lassen et al. (1965) par la méthode xénon sont de 2,0 et 1,8 ml.100g" 'min' 1 au niveau du jambier antérieur et des jumeaux respectivement alors qu'en phase d'hyperémie les valeurs correspondantes sont 48 et 32 ml.l00g" 1 min" 1. Les mesures de perfusion de Leinonen et al. (1978) et Lindbjerg et al. (1966) sur l'ensemble du mollet s'établissent à 63 et 71 ml. 100g" 1 min" 1 respectivement lors de la récupération d'une épreuve comportant 3 minutes d'exercice intensif parmi 5 minutes d'occlusion. Cette méthode a même été utilisée en clinique afin de comparer le débit sanguin musculaire au repos chez des patients atteints de sepsis et chez des volontaires sains (Finley et al., 1975). (2) La tomographie par émission de positons (TEP) avec I'H 2 15 O La TEP réalise la détection tomographique de la distribution d'isotopes radioactifs «émetteurs de positons» ( n C, 15 0, 13 N). La rencontre entre un électron, chargé négativement, et un positon produit une émission de 2 photons gamma de même énergie, de même direction mais de sens opposé. Ce rayonnement est capté par des photomultiplicateurs. Des mesures quantitatives peuvent être fournies si une cathétérisation artérielle donne accès à la concentration artérielle du radio-isotope en cours d'acquisition (Baron et al, 1983). La TEP offre la possibilité de quantifier chez l'homme, in vivo, le débit sanguin local et l'extraction locale d'oxygène par les tissus. H permet donc le calcul de la consommation d'oxygène dans les différentes régions. L'intérêt essentiel de la TEP réside dans le fait que les radio-isotopes 53

61 qu'elle utilise sont aisément substituables dans les molécules biologiques, ce qui leur assure un métabolisme absolument identique à celui des molécules naturelles. La résolution spatiale de la technique TEP atteint 3 mm x3 mm x 3 mm. Malgré la richesse des informations que peut fournir la TEP, son utilisation demeure extrêmement restreinte en raison de contraintes financières, techniques et éthiques. H est rarement possible (radiation) de pouvoir apprécier chez le même volontaire ou patient la reproductibilité, l'effet placebo ou l'effet pharmacologique. En utilisant la technique de l'eau marquée à l'oxygène 15 (H2 15 O), Vanderthommen (1994) a évalué le débit sanguin musculaire quadricipital, au repos (4 ml. 100g" 1.min" 1 ) et à l'effort (SOml.lOOg^min" 1 ). L'inhalation de molécules d'oxygène ( 15 C>2) par le sujet à l'aide d'un masque, a ensuite permis le calcul de la consommation locale d'oxygène. Jehenson et al. (1995) ont étudié chez des sujets sains et chez des patients atteints de glycogénose musculaire le débit sanguin des muscles fléchisseurs des doigts au repos et après un travail adapté. Chez ces patients, la TEP a clairement contribué à caractériser une anomalie de perfusion pendant la phase de récupération à l'effort. L'emploi de cette technique chez l'animal, a permis d'apprécier des changements de flux sanguin et d'extraction d'oxygène dans le cas du sepsis expérimental après inoculation d'une toxine (Senda et al., 1992). e) La résonance magnétique nucléaire Plusieurs approches par RMN se développent visant à quantifier de manière noninvasive le débit sanguin. Ces techniques bénéficient en effet de l'innocuité de la technique et des résolutions spatiale et temporelle potentiellement élevées. Les applications de ces techniques sont actuellement en pleine expansion. (1) Détection de traceurs exogènes (D 2 O ou emulsions perfluorocarbonées) Ces deux traceurs exogènes ne sont guère utilisables chez l'homme. Ils n'ont été employés que sur le petit animal, à très haut champ, à cause de leur faible sensibilité. 54

62 (2) Imagerie vélocimétrique et estimation du flux Cette technique est très peu utilisée pour mesurer les débits au niveau du muscle squelettique à l'exception de Meyer et al. (1993) qui ont récemment évalué des changements modérés de flux artériel dans la loge postérieure de la jambe, suite à un exercice. L'inconvénient de cette méthode réside non seulement dans l'hémodynamique (débit relativement constant) mais également dans la sélection des gros vaisseaux et leur anatomie (direction rectiligne bien définie). Cette approche est en effet très sensible à la résolution spatiale. Pour des vaisseaux représentés sur une image par 2 à 4 pixels, les informations peuvent être totalement entachées d'erreurs car le signal est alors pondéré par des spins stationnaires et des spins en mouvement. (3) Marquage des spins de l'eau artérielle (méthode du T1 apparent) Nous allons particulièrement détailler la méthode de marquage des spins de l'eau artérielle, encore nommée méthode du Tl apparent. En effet, une nouvelle approche de mesure de la perfusion a été mise au point dans notre groupe par Vincent Lebon. Cette nouvelle technique reprend en partie le principe et les équations formulées dans le paragraphe qui suit. Afin de mesurer simultanément le flux sanguin musculaire et d'autres déterminants de l'oxygénation, nous avons inséré dans une séquence entrelacée, le module de séquence correspondant à cette approche. Dans cette méthode, proposée par Williams et al. en (1992), les spins des protons de l'eau du sang sont magnétiquement marqués par des impulsions de saturation ou d'inversion sur une coupe située en amont de la coupe observée. L'afflux de ces spins saturés ou inversés au niveau de la coupe imagée va induire une diminution du signal RMN qu'il est possible de traduire en terme de flux. 55

63 En présence d'un flux sanguin f au travers d'un organe, l'équation de Bloch décrivant la relaxation de l'aimantation longitudinale de l'eau du tissu peut être modifiée comme suit : dm M -M dt T\ fm a -fm v [8] où f M a et f M v représentent respectivement l'entrée de l'aimantation artérielle et la sortie de l'aimantation veineuse, M est l'aimantation longitudinale par gramme de tissu (M 0 en condition de relaxation complète), M a et M v représentent respectivement l'aimantation longitudinale par ml de sang artériel et veineux et A, est le coefficient de partition de l'eau entre le sang et le tissu. la relation : Lors d'échanges rapides et homogènes entre le compartiment capillaire et le tissu, on a M La modification de l'aimantation artérielle en amont est réalisée soit par saturation (M a = 0) soit par inversion (M a = - M a ), ce qui peut se généraliser par M a = (1-2 a) M a, où a est le taux d'inversion avec 0<cc<l. En l'absence de saturation, l'aimantation entrante est égale à l'aimantation sortante, conduisant à la relation : ' M 0 En remplaçant ces nouvelles relations dans l'équation [1], on obtient : dm M 0 -M M 0 M En résolvant l'équation en M, on obtient T\ X 56

64 Cette dernière équation montre que le marquage artériel des spins en continu induit une décroissance exponentielle de M avec une constante de temps Tl app (constante de temps de la relaxation longitudinale apparente) définie par :. = ± + L [9] ri ri x A l'équilibre dynamique, M atteint M^. On peut ainsi obtenir le flux f par la relation : / = 71app M" 1 Ta [10] M éq, M 0, a, A, et Tlapp sont tous mesurables ; Tl app peut être confondu avec Tl, menant au calcul de f en ml. 100g" 1 de tissu.min" 1. Ce principe permet de générer des cartes quantitatives de perfusion. Les premières mesures ont eu pour but d'évaluer le débit sanguin cérébral au niveau de la microcirculation (Detre et al, 1992). Au niveau musculaire (Toussaint et al, 1996), une approche analogue a été utilisée pour déterminer la perfusion dans différents muscles au décours d'une occlusion artérielle. Toussaint a obtenu une mesure d'environ 100 ml. 100g" 1.min" 1 pendant la première minute d'hyperémie réactionnelle. La technique utilise des variations de signal très faibles. Le principe n'est pas applicable pour des mesures de débit musculaire au repos puisque les modifications de signal seraient indécelables. f) Comparaisons des résultats entre les différentes techniques La pléthysmographie a été la méthode la plus utilisée en recherche comme en routine clinique. Les différentes approches pléthysmographiques ont été comparées. Costeloe et al. (1980) ont démontré une très bonne relation entre des mesures pléthysmographiques par jauge de contrainte et par impédance (r = 0,98) réalisée chez des enfants. Young et al. (1967) ont montré une corrélation positive entre l'approche par l'impédance électrique et la débitmétrie électromagnétique au niveau de l'artère fémorale chez le chien (r = 0,98) sur une large gamme de flux sanguin. Au niveau de la jambe, la technique du xénon a souvent été comparée à la 57

65 pléthysmographie d'occlusion veineuse par jauge de contrainte. Au repos, une de ces études (Adiseshiah et al, 1984) a fourni des résultats remarquablement concordants (3,3 pour la pléthysmographie vs 3,5 ml.l00g" 1 min" 1 au niveau du jambier antérieur pour le * 3 Xe ; r = 0,88) avec une pente de corrélation égale à l'unité. Ces mêmes travaux ont mis en évidence une grande concordance des mesures à l'effort issues des deux techniques. Lassen et al. (1964) avaient déjà estimé des débits très proches par 133 Xe (44 ml. 100g" 1 min" 1 ) et par pléthysmographie (53 ml.l00g" 1 min" 1 ) après 2 minutes d'exercice ischémique au niveau du mollet. En revanche, plusieurs équipes (Andersen et Saltin, 1985; Rowell et al, 1986; Savard et al, 1987) utilisant des indicateurs colorés ou thermiques affirment que la pléthysmographie et le xénon sous-estiment largement le flux sanguin musculaire. Es mentionnent des valeurs de débit sanguin musculaire pouvant dépasser 200ml.l00g" 1 min" 1. Or, la limite du débit cardiaque approche les 25 1/min. Les auteurs qui proposent des valeurs de 200 ml. 100g" 1 min" 1, argumentent leur résultat en expliquant que ce débit si élevé n'est soutenable que pour des exercices impliquant un volume actif de muscle de l'ordre de 2 à 3 kg puisque 1'activation des 30 kg de muscle correspondrait à un débit cardiaque de 60 litres, ce qui est impossible. Sorlie et al. (1977) ont démontré chez le chien une très bonne relation entre les mesures de perfusion obtenues au niveau de la veine fémorale par thermodilution et simultanément par débitmetrie électromagnétique au niveau de l'artère fémorale (r = 0,99; Qther/Qéiec= 1,037). Ces tendances associées aux diverses techniques se retrouvent dans les travaux de Cerretelli et al. (1984) qui ont étudié différents muscles de chien sur une large gamme de valeurs de perfusion (de 0 à 100ml.l00g" 1 min" 1 ) par trois procédés d'investigation : la débitmetrie électromagnétique (Q v ), les microsphères marquées (Q m ) et la clairance du xénon (Qxe)- Les deux premières techniques ont été parfaitement corrélées (r = 0,98 avec Qm/Q v = 1), alors que la mesure par le xénon semble sous-estimer approximativement d'un facteur 2 les mesures de flux (Qxe/Qv = 0,57, Qxe/Qm = 0,49). Par contre, ces résultats divergent des travaux précédents de Marcus et al (1981) qui suggéraient une corrélation significative entre ces trois méthodes sur le même muscle mais avec une gamme plus étroite de valeurs de perfusion (0 à 36 ml.loog-wn" 1 ). 58

66 Au vu des résultats et des limites de chaque technique présentée, aucune ne peut être clairement considérée comme plus fiable que les autres (LeJemtel et al, 1992). On peut, en simplifiant, en déduire quelques généralités : la pléthysmographie et la méthode du xénon fournissent des valeurs comparables au repos comme à la récupération d'exercice ou d'ischémie. La débitmétrie électromagnétique semble donner des résultats concordants avec la mesure par microsphères marquées mais supérieurs à ceux de la pléthysmographie et du xénon. La technique des microsphères, réservée à l'expérimentation animale, peut mener à des valeurs de perfusion proches de celles obtenues par l'indicateur coloré ou thermique, soit 2 à 4 fois supérieures aux mesures pléthysmographiques. En raison de leur essor récent, peu de travaux comparatifs existent entre les méthodes utilisant la RMN et les autres plus anciennes. Les ordres de grandeur relevés par les techniques RMN sont toutefois comparables. 59

67 C.OXYGENATION MUSCULAIRE Les principaux facteurs dont dépend l'oxygénation tissulaire sont : - le débit circulatoire local et sa répartition dans le réseau capillaire, - les paramètres de diffusion depuis les capillaires vers les cellules, - les besoins énergétiques, - la qualité du sang en tant que vecteur et distributeur de l'oxygène. 1. DISTRIBUTION DE L'OXYGÈNE AUX TISSUS : LE ROLE DE LA MYOGLOBINE Le transport de l'oxygène jusqu'aux capillaires est assuré par un mécanisme de diffusion et de convection circulatoire. L'oxygénation tissulaire est la dernière, mais non la moindre des étapes de ce transport. Au niveau des capillaires, selon les besoins en oxygène, l'oxygène se dissocie de l'hémoglobine et va diffuser passivement à travers les capillaires jusqu'aux mitochondries des cellules musculaires selon un mécanisme complexe que nous simplifierons par un schéma emprunté à Duvelleroy et al. (1981) représenté sur la figure 12. Nous reviendrons sur ce processus de diffusion. C>a: T) ) i\ Convection Diffusion Consommation O 2 Figure 12 : Représentation simplifiée de la distribution de l'oxygène aux tissus. La boite représente le tissu et le cylindre symbolise l'ensemble des capillaires d'un tissu. (D'après Modèle de distribution de l'oxygène par M. Duvelleroy, Masson éditeur). 60

68 CD2 Figure 13 : Modèle de la molécule de myoglobine. Sur le groupe hème, représenté en rouge, s'attache l'histidine proximale F8 coloriée en vert. Histidino E7 6th coordination position 0 a binding site Home Figure 14 : Représentation détaillée de l'hème de la molécule de myoglobine. Au centre de l'hème, l'atome defer, en jaune, établit quatre liaisons avec des atomes d'azote, une cinquième liaison avec l'histidine proximale F8 et la sixième liaison de coordination peut se faire de façon réversible avec l'oxygène. 61

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70 L'analyse quantitative des échanges au niveau des tissus est difficile car interviennent des facteurs purement locaux. Ainsi, la consommation d'oxygène augmente avec l'activité de l'organe et parallèlement à la baisse de la pression de l'oxygène intra-tissulaire ; ceci élève le gradient de pression entre l'oxygène tissulaire et l'oxygène sanguin et les échanges sont accélérés. Les différences locales de pression sont aussi influencées par le débit sanguin et le nombre de capillaires perfuses. En admettant que la P02 veineuse (PVO2) représente, la pression moyenne d'oxygène dans le capillaire, la force motrice de la diffusion est proportionnelle à la différence entre PvC>2 et la P02 tissulaire moyenne. Le transfert d'oxygène par diffusion tient compte de la qualité de la paroi capillaire, de la surface et du nombre de capillaires. La majeure fraction de l'oxygène qui diffuse va se fixer sur une protéine, la myoglobine (figure 13) qui elle diffuse également au sein de la cellule (Moll, 1968). Parmi les 1350 ml d'oxygène présent à chaque instant chez un individu de 70 kg, 400 ml sont liés à la myoglobine. La myoglobine (Stryer, 1988) est une protéine que l'on trouve exclusivement dans le muscle squelettique et cardiaque. Elle se compose d'une seule chaîne polypeptidique de 153 acides aminés et a un poids moléculaire de daltons. Cette molécule, composée de huit segments hélicoïdaux constituant 75 % de la chaîne, est extrêmement compacte avec très peu d'espace libre à l'intérieur. De conformation similaire aux chaînes a et p* de l'hémoglobine, la myoglobine possède également un groupe hème contenant en son centre un seul atome de fer. Cela lui confère une couleur rouge distinctive, tout comme l'hémoglobine. Ainsi, les fibres musculaires rouges sont celles qui possèdent le plus de myoglobine. Cet atome de fer (figure 14) possède quatre liaisons avec l'azote, une cinquième avec l'histidine F8 nommé histidine proximal. La sixième valence s'établit de façon réversible avec l'oxygène, lui conférant la propriété de stocker l'oxygène. suivante : Cette source supplémentaire d'oxygène pour le muscle est exprimée par la réaction O 2 Ç$ MbO 2 63

71 En plus de sa capacité à stocker l'oxygène, la myoglobine facilite (Wittenberg et Wittenberg, 1975) le transfert d'oxygène aux mitochondries, par un mécanisme de diffusion, à un niveau approximativement double du niveau observé quand cette protéine est inactivée. La diffusion d'une substance est définie comme un processus d'équilibre dans lequel les molécules d'une substance migrent des lieux de fortes concentrations vers ceux de plus faibles contenus. Dans ce cas, les facteurs favorisant cette diffusion sont la faible pression en oxygène présente lors d'un exercice intense, le gradient du complexe myoglobine-02 qui produit une force motrice pour un diffusion facilitée, et la mobilité dans la cellule de la myoglobine-02 qui permet la diffusion du porteur d'oxygène (De Koning et al, 1981; Wittenberg et Wittenberg, 1981; Cole, 1982). La concentration de myoglobine dans le muscle strié est 40 fois plus faible que celle de l'hémoglobine dans l'érythrocyte. La myoglobine, se retrouve environ à 0,7 g pour 100 g de muscle frais (soit 0,4 mmol/kg). Saturation de la Myoglobine (%) Figure 15 : Courbe de dissociation de la myoglobine qui exprime la saturation en oxygène de la molécule de myoglobine à différentes pressions partielles en oxygène du muscle. La courbe de dissociation de la myoglobine, illustrée sur la figure 15, est du type Michaelis-Menten. Cette courbe indique que la myoglobine retient mieux l'oxygène à des pressions plus basses que l'hémoglobine, ce qui se traduit par une P50 beaucoup plus faible que celle de l'hémoglobine, soit de l'ordre de 2,3 torr (Schenkman et al, 1997) selon une étude très récente. Par exemple, au cours d'un exercice, pour une P02 de 50 torr, la myoglobine retient 95 % de son oxygène. Retenons qu'à une P02 de 20 torr, elle est encore saturée à 75 %. C'est lorsque la P02 descend au dessous de 5 torr que l'oxygène se dissocie le plus de la myoglobine. A la différence de l'hémoglobine, la myoglobine ne montre aucun effet Bohr. 64

72 Les fibres musculaires lentes qui peuvent produire beaucoup d'atp en aérobiose contiennent relativement plus de myoglobine. H a été démontré chez les animaux que des programmes d'entraînement en endurance amélioraient les réserves de myoglobine dans les muscles sollicités par l'effort (Pattengale et Holloszy, 1967; Hickson, 1981). La démonstration de ce phénomène n'est pas encore faite chez l'homme (Jansson, 1982; Nemeth et Lowry, 1984). Cette concentration de myoglobine est dépendante du muscle étudié (répartition des fibres I et H) et de l'âge du sujet (Moller et Sylven, 1981) ; elle se situe cependant chez les mammifères dans la gamme allant de 0,1 à 0,5 mmol/kg (Biorck, 1949; Wittenberg, 1970). 2. LE MODELE DE KROGH La pression partielle d'oxygène diminue lorsqu'on progresse du pôle artériolaire vers l'extrémité veinulaire et que l'on s'éloigne radialement du capillaire. Le premier modèle classique de capillaire a été établi par Krogh et Erlang en 1919 et al. (1919). Cette représentation modélise l'apport d'oxygène à un tissu dont la consommation d'oxygène par unité de volume est homogène et constante. La Po 2 au long du capillaire est schématisée en 3 dimensions sur la figure 16 afin de visualiser la diminution progressive de la P02 du côté artériolaire vers le côté veinulaire du capillaire et dans le tissu entourant le capillaire (Thews, 1967). CAPILLAIRE.SEUIL DE REACTION SEUIL CRITIQUE "" 1 SEUIL LETAL Figure 16 : Représentation schématique des gradients de P02 autour d'un capillaire symbolisé par le cylindre. L'oxygène diffuse selon les gradients de concentration dans le volume de tissu. Les variation de P02 du pôle artériolaire au pôle veinulaire du capillaire sont représentées en trois dimensions selon Thews. Selon les conditions d'hypoxie de plus en plus sévères, la P02 autour du capillaire diminue progressivement d'un seuil normal à un seuil léthal. 65

73 Trois niveaux peuvent être identifiés comme en dessous de la normale (figure 16). Un seuil de réaction survient lorsque la pvc>2 abaissée vers 25 à 28 torr provoque une vasodilatation, un seuil critique est atteint lorsque pvc>2 est voisine de 20 torr et on définit un seuil «léthal» pour une pvû2 de 12 torr qui correspond alors à une pression partielle d'oxygène proche de 0 torr dans la mitochondrie à mi-distance de deux capillaires. De nombreuses modélisations ont utilisé comme point de départ le modèle développé par Krogh. Le modèle pionnier est une simplification des échanges au niveau des capillaires, il ne prend pas en compte ni le fait que le débit sanguin dans les capillaires adjacents n'a pas toujours la même direction (Blum, 1960), ni l'existence d'une diffusion longitudinale de l'oxygène dans les tissus autour du capillaire, ni l'hétérogénéité de la distribution des capillaires autour des tissus (Ellsworth et Pittman, 1990). En effet, la morphologie au niveau de la microcirculation est loin d'être uniforme (Honig et al., 1971; Renkin, 1985) et un modèle trop simple ne reflète pas la complexité du réseau capillaire. Piiper et al. (1984) ont proposé un autre modèle de «diffusion-shunt» mettant en évidence un processus de diffusion d'oxygène à «contrecourant» entre les artérioles et les veinules proches, qui viendrait se superposer au processus de diffusion entre le capillaire et les tissus. Ce phénomène réduirait l'efficacité du transfert de l'oxygène entre le sang et les cellules, surtout dans les tissus hétérogènes (Piiper et Scheid, 1991). Honig et al. (1991) ont montré que la contribution de ce flux d'oxygène «perdu» était négligeable. Le processus de diffusion de l'oxygène, des capillaires jusqu'aux mitochondries, est plus complexe que celui alvéolo-capillaire dans le poumon. Certains travaux suggèrent une résistance au transport d'oxygène par les globules rouges au sein des capillaires (Heliums, 1977), mais aussi une résistance à la libération de FO2 par l'oxyhémoglobine (Gutierrez, 1986) ou encore un frein à la diffusion entre l'hématie et la membrane cellulaire adjacente (Gayeski et Honig, 1986; Groebe, 1990). Vu la densité et la complexité de ce réseau capillaire, il est très difficile d'apprécier précisément tous ces mécanismes et les contributions respectives à cette échelle microscopique. De nombreuses équipes continuent à se pencher sur ces problèmes complexes de modélisation du transport de l'oxygène (Secomb et Hsu, 1994; Groebe, 1995). 66

74 3. METHODES PERMETTANT D'EVALUER LA CONSOMMATION D'OXYGENE GLOBALE ET REGIONALE La consommation d'oxygène est corrélée à la dépense énergétique au niveau de l'organisme en entier, tout en étant également dépendante de l'oxygénation musculaire. H faut aussi comprendre que les mesures de pression partielle en oxygène et de consommation d'oxygène sont toutes deux complémentaires. Une réduction de la Vo 2 avec une P02 tissulaire haute ou basse relève d'un mécanisme différent : dans le premier cas c'est le système de production de l'énergie qui est en cause (altération de la chaîne respiratoire au niveau mitochondrial) tandis que dans le second cas il s'agit d'une adaptation tissulaire à un trouble situé en amont (insuffisance de l'apport d'oxygène). H existe en effet une large variété de techniques permettant de quantifier toutes ces variables dans les gaz respires, les tissus ou les fluides. Ces méthodes exploitent les deux caractéristiques essentielles de l'oxygène qui font de lui un bon oxydant des réactions biologiques : son paramagnétisme à l'état de repos (il a deux électrons célibataires sur la dernière couche de son orbite) et son potentiel réducteur largement négatif (la réduction de l'oxygène s'accompagne d'une production d'énergie libre de 0,82 kcal/mol à ph 7 et à 25 C). La technique idéale rassemblerait les caractéristiques suivantes : précision et reproductibilité, bonne résolution spatiale et temporelle, sensibilité aux concentrations physiologiques, facile à mettre en oeuvre et non-invasive. Dans cette partie, nous aborderons les différentes méthodes qui permettent d'apprécier la consommation d'oxygène. Toutes les démarches globales ou locales présentent des avantages et des inconvénients au regard des critères définis. a) Calorimétrie directe La calorimétrie directe est extrêmement précise et reproductible mais rarement mise en oeuvre de nos jours car le coût de conception est élevé et le temps nécessaire à la mesure est de l'ordre de 20 à 30 minutes ce qui le rend inutilisable en physiologie de l'exercice. 67

75 b) Calorimétrie indirecte La mesure de la consommation d'oxygène globale par calorimétrie indirecte est pratiquée depuis longtemps en physiologie de l'exercice (Saltin et Astrand, 1967) ainsi que dans le domaine clinique (Patterson et al, 1972; Massie et al, 1996). Le sujet est muni d'un embout buccal ou d'un masque auquel est adapté un jeu de soupapes inspiratoire et expiratoire. H respire l'air ambiant de composition constante et rejette la gaz expiré dans une enceinte hermétique (sac de caoutchouc). La mesure du volume expiré dans l'unité de temps à l'aide d'un gazomètre de Tissot ou d'un pneumatographe et la détermination des fractions expirées d'c>2 et de CO2 permettent de calculer la consommation d'oxygène (Vo 2 ) et l'élimination du dioxyde de carbone. La mesure de Vo 2 nécessite le recueil de quatre paramètres ; il s'agit de la fraction inspiratoire et expiratoire d'oxygène et du débit ventilatoire inspiré et expiré : Vo 2 = VI x FIO 2 - VE x FEO 2 Un calorimètre indirect est composé de trois parties principales : 1) un circuit de circulation des gaz, 2) un système de mesure des débits et 3) un dispositif de mesure des concentrations des gaz. Sur cette infrastructure, se greffe un système de mesure des conditions de gaz (température, humidité et pression) et un système informatique de traitement des données. Les gaz recueillis sont analysés par une électrode polarographique ou par une cellule paramagnétique pour l'oxygène et par absorption infrarouge pour le gaz carbonique. La calorimétrie indirecte est relativement simple et peu coûteuse comparée à la méthode directe. Elle fournit de plus des résultats comparables à la calorimétrie directe. Chez le sujet sain, la reproductibilité et la précision de la méthode des échanges gazeux est de 1-4 % et 2-3 % respectivement (Chiolero et al, 1993). Cette technique a permis d'établir les corrélations entre la consommation d'oxygène et l'intensité du travail d'une part (Knight et al, 1992; Poole et al, 1992) et de la fraction d'oxygène inspiré d'autre part (Roca et al, 1989). H est également possible de suivre la cinétique de prélèvement de l'oxygène au cours de exercice (Zhang et al, 1993). La consommation maximale d'oxygène lors d'un effort sévère dépend non seulement de l'âge de l'individu (Coggan et al, 1993) mais également du 68

76 niveau et du type d'entraînement (Saltin et Astrand, 1967). Cette méthode a été employée pour révéler une altération de la consommation d'oxygène chez des patients souffrant d'insuffisance cardiaque (Cohen-Solal et ai, 1995). c) Prélèvements sanguins : application du principe de Fick La consommation d'oxygène peut être calculée en appliquant le principe de Fick (Chiolero et al, 1994), qui est également fondé sur la différence des flux d'oxygène entrant et sortant d'un système. Cette méthode repose sur la mesure d'un débit sanguin cardiaque ou régional, ainsi que sur la mesure du contenu en oxygène du sang artériel et du sang veineux. La consommation en oxygène s'écrit : \Zo 2 =fx(cao 2 -CvO 2 ) où CaO 2 et CvO 2 désignent respectivement les contenus en oxygène artériel et veineux en ml d'o2.100 ml" 1 de sang et fie débit sanguin en ml. 100g' 1. min" 1, avec CaO 2 = [Hb] x Saturation x 0, x pao 2 Le deuxième terme de l'équation correspond à l'oxygène dissous dont la fraction est quasinégligeable. La mesure de la consommation d'oxygène par le principe de Fick peut être globale ou locale. La détermination de la consommation d'oxygène globale est effectuée à distance, au niveau de la circulation pulmonaire. Elle nécessite la pose d'un cathéter artériel pulmonaire permettant la mesure du débit cardiaque par thermodilution et le prélèvement du sang veineux mêlé dans l'artère pulmonaire. Comme nous l'avons décrit, il est rarement possible d'assimiler l'utilisation de la Vo 2 de l'organisme comme un index de la Vo 2 tissulaire. La Vo 2 totale représente la somme des consommations d'oxygène de chaque organe, aussi bien des territoires inactifs que des territoires musculaires en activité. Le principe de Fick peut de la même façon s'appliquer au niveau de la circulation régionale. On doit alors mesurer simultanément le débit sanguin musculaire local. La différence artério-veineuse des gaz du sang au niveau du muscle exploré peut s'estimer en posant des cathéters artériels et veineux. En fonction du muscle étudié, les échantillons de 69

77 sang sont prélevés au niveau des artères fémorale, radiale ou humérale. Par contre, la ponction du sang veineux doit être précise car le sang de chacune des veines est constitué de substances caractéristiques de l'activité métabolique des régions spécifiques desservies par les veines en question. Le contenu en oxygène du sang veineux varie dans des proportions importantes selon l'intensité de l'exercice et la masse musculaire impliquée. Dans tous les cas, la mesure des contenus artériels et veineux en oxygène se fait par oxymétrie. L'erreur liée à la mesure de la Vo 2 par le principe de Fick provient surtout de la mesure du débit sanguin et, dans une moindre mesure, de l'appréciation du contenu en oxygène (Iparraguirre et al, 1988). La variabilité de la détermination par cette approche avoisine les 6 % si on applique une procédure stricte ; sinon elle peut atteindre les 15 %. La principale critique dont elle fait l'objet tient à sa nature agressive pour l'organisme. Même s'il est facile de repérer les artères, la perforation d'une artère constitue un traumatisme. A l'exercice et pour des déterminations régionales, le principe de Fick est très peu employé à l'exception des mesures des membres supérieurs (Hartling et al., 1989; Joyner et ai, 1992). Cette approche, même pour des appréciations régionales, est considérée comme imprécise puisqu'elle sonde un volume grossièrement défini et fournit ainsi une estimation moyenne de la consommation d'oxygène. Pour des mesures systémiques nécessitant un cathétérisme cardiaque, cette technique se limite le plus souvent à des appréciations de la consommation d'oxygène au repos dans le but de caractériser certaines pathologies comme le sepsis, l'insuffisance cardiaque (Mohsenifar et ai, 1983; Astiz et ai, 1987; Dhainaut et al, 1987a) ou certains mécanismes biochimiques (Larsson et al, 1977). Néanmoins, les résultats des études comparant Vo 2 pulmonaire et Vo 2 locale au cours d'un effort divergent. Alors que Whipp et al. (1972) affirment que la Vo 2 pulmonaire sousestime la véritable Vo 2 requise pour un exercice non stabilisé, Poole et al. (1992) et Knight et al. (1992) montrent que pour des exercices soutenus impliquant une masse musculaire importante, les deux mesures sont superposables : plus l'exercice est intense et plus la masse de muscle en jeu est grande, plus la consommation totale d'oxygène mesurée au niveau pulmonaire est le reflet de l'activité locale, en vertu de la redistribution du débit cardiaque à ce stade. Dans cette optique, Saltin et al. (1985) ont établi que lorsqu'un exercice était réduit aux quadriceps, au maximum 60 % de la V02 pulmonaire pouvait être attribuée à ces muscles. 70

78 Devant l'ambiguïté de la signification de la mesure de la V02 pulmonaire en fonction des protocoles, d'autres approches plus ou moins invasives et/ou irradiantes ont été développées afin de localiser les mesures. d) La tomographie par émission de positons (TEP) La TEP, couplée à l'inhalation d'û2 suivie d'une inhalation de CO2 ou de l'administration d'un bolus d'eau, tous marqués à l'oxygène-15, donne non seulement accès au débit sanguin local mais également au coefficient d'extraction local (Jones et al, 1976; Depairon et Depresseux, 1988). Ces deux paramètres permettent le calcul de la consommation locale d'oxygène selon la formule : Vo 2 = f x EO 2 x CaO 2 avec EO2 le coefficient d'extraction de l'oxygène exprimé en %. Pour cela, des molécules d'oxygène marquées à l'oxygène-15 ( 15 C>2) sont inhalées en continu par le sujet à l'aide d'un masque dans le but de suivre l'évolution temporelle de la radioactivité artérielle. Un problème se pose à ce niveau, dû à la transformation métabolique de l' 15 C>2 en H2 15 O puisque le détecteur de radioactivité sera sensible aux deux éléments sans pouvoir préciser leur contribution respective. De plus, la formation d'h2 15 O recueilli en tomographie, provient de deux sources qui sont l'h2 15 O produit localement en proportion de la consommation locale d'oxygène par le métabolisme local et l'h2 15 O amené au tissu par le sang artériel et provenant de la recirculation de l'eau marquée, produite par le métabolisme général. En se basant sur le fait que YO2 se distribue entre les globules rouges et le plasma, selon des coefficients de partage différents de ceux de l'h^o, les concentrations respectives de H2 15 O et 15 C>2 dans le sang artériel sont calculées. La modélisation et la mise en équation mathématique de tous ces phénomènes (Depresseux, 1989) permettent de déterminer l'extraction définie par la relation : EO 2 =- avec V le volume d'eau marquée, tous deux calculés précédemment lors de la première mesure avec l'h2 15 O dans les mêmes conditions, A, la constante de décroissance de l'oxygène- 15 et a et b sont obtenus par calcul matriciel en résolvant les équations de la modélisation. 71

79 Depairon et al. (1988) ont les premiers mis à profit la technique TEP avec inhalation de C 15 C>2 et 15 O 2 pour étudier au niveau des membres inférieurs la perfusion, l'extraction et la consommation d'oxygène chez des patients atteints de claudication intermittente unilatérale. Vanderthommen (1993) s'est attaché à mesurer par cette technique les valeurs de consommation moyenne d'oxygène au niveau des quadriceps de 8 sujets. Il a obtenu les valeurs suivantes : 0,06 ± 0,04; 0,72 ± 0,34 et 3,01 ± 2,3 ml O2.min" 1.100g" 1 respectivement au repos, lors d'un travail volontaire ou électrostimulé. 4. METHODES PERMETTANT D'EVALUER L'OXYGENATION MUSCULAIRE ET CAPILLAIRE a) Mesure directe de la Po 2 tissulaire par électrodes La mesure de la P02 tissulaire est le plus souvent réalisée de façon expérimentale au moyen d'électrodes polarographiques présentes dans une solution électrolytique (contenant des ions chlorures). La méthode polarographique consiste à établir une différence de potentiel entre une électrode en platine appelée cathode qui fournit les électrons et une électrode de référence en argent, l'anode. Les ions présents sont soumis à l'action du champ électrique. Les ions négatifs se dirigent vers l'anode alors que les ions positifs se déplacent vers la cathode. L'oxygène diffusant dans le milieu est réduit à la cathode. Les électrons nécessaires sont fournis à l'anode où l'argent est oxydé parallèlement avec la formation de chlorure d'argent : - à la cathode : O H 2 O + 4 e" -> 4 OH' - à l'anode : 4 Ag Cl"-» 4 AgCl Un courant électrique proportionnel à la quantité d'oxygène consommée dans la solution est ainsi créé entre la cathode et l'anode ; c'est ce courant qui sera analysé et, après une calibration soignée, transformé de pression partielle en oxygène. On doit à Wintzler et al. (1941) et à Davies et Brink et al. (1942) le premier emploi d'électrodes permettant la mesure d'oxygène tissulaire chez les animaux. Les innovations technologiques ont amélioré au fil des ans la fiabilité et la précision des électrodes et surtout d'obtenir une miniaturisation nécessaire à la réalisation des mesures à l'échelle micrométrique (Cater et Silver, 1961; Fatt, 1964; Whalen et al, 1967). La mesure de l'oxygène dans les 72

80 liquides biologiques a été initiée par les travaux de Clark et al. (1956) qui ont suggéré d'isoler électriquement l'anode et la cathode par une membrane perméable aux gaz (figure 17). - anode en argent cathode en platine KCI anneau de caoutchouc membrane perméable i l'oxygène Figure 17 : Electrode de Clark. Sur le principe de l'électrode de Clark, Kunze et al. (1962) opèrent une surveillance continue de la P02 tissulaire au moyen de micro-électrodes placées à la surface des organes. L'électrode idéale ne doit pratiquement pas consommer d'oxygène afin de ne pas perturber la mesure, avoir une réponse rapide aux variations de la P02, et être facilement calibrable et stable. Toutefois, quelles que soient les électrodes, il existe un certain nombre de limitations technologiques à leur emploi chez l'homme in vivo. L'insertion d'électrodes au niveau tissulaire provoque inévitablement des distorsions du tissu et parfois une compression de la microcirculation. Au niveau musculaire, les mesures ne peuvent s'effectuer qu'au repos (Bylund- Fellenius et al., 1981). Dans des études récentes, Boekstefers et al. (1990) ont utilisé chez l'homme les électrodes polarographiques à aiguilles au niveau des muscles squelettiques pour y apprécier la distribution de la pression partielle en oxygène. Depuis, la même équipe (Boekstefers et al., 1994) a mis en évidence, dans une population atteinte de choc septique, une P02 élevée chez ces patients (48 torr) comparée à des sujets sains (28 torr) ou à un groupe en choc cardiogénique (22 torr). Des mesures répétées ont montré une augmentation de la P02 musculaire parallèlement à l'aggravation du sepsis. La méthode polarographique est en réalité la seule méthode directe d'évaluation de la teneur en oxygène des tissus in vivo. H faut préciser que la détermination se fait à l'échelle extracellulaire. Cette mesure polarographique peut difficilement être couplée à un examen RMN car les électrodes à oxygène subissent des interférences électromagnétiques importantes en présence de signal radiofréquence, même après interposition d'un écran (Eijgelshoven et 73

81 al, 1993). Un inconvénient des électrodes polarographiques est leur usure rapide et la nécessité de remplacer le bain d'electrolyte. La reproductibilité de la mesure est bonne puisque Franzeck et al. (1982) ont obtenu chez 15 sujets contrôles un coefficient de variation inférieur à 10 % sur 2 séries de mesures répétées à 15 min d'intervalle. b) La spectroscopie proche infrarouge (NIRS) Cette méthode repose sur la capacité d'absorption de la lumière par les tissus dans la région proche infrarouge (NIR pour Near Infra Red) du spectre électromagnétique (longueur d'onde de 700 à 1000 nm). Dans cette gamme spectrale, la lumière se propage dans les tissus, y compris à travers la peau et les os. Les photons sont absorbés principalement par les cuivres oxydés du cytochrome a-a3 (cytaa3) et par les complexes fer-porphyrine des formes oxygénées et désoxygénées de l'hémoglobine et myoglobine (HbÛ2, Hb, MbC>2, Mb respectivement). L'absorption NIR apprécie les changements d'oxygénation des tissus au niveau des petits vaisseaux sanguins, des capillaires et des cellules musculaires qui sont le siège de 90 % de la consommation d'oxygène. La distinction des petits et gros vaisseaux repose sur la loi de Beer-Lambert (Chance, 1991) définie par la relation : = exp (- E C L) avec L le chemin parcouru par les photons en cm, C la concentration de la substance absorbante soit l'hémoglobine en mm, E le coefficient d'extinction des photons dans le tissu en cm"'.mm"'. En réalité, on a u. = E.C où (i représente le classique coefficient d'absorption en cm". Le coefficient d'absorption des artères et des veines ne va pas permettre aux photons d'émerger. Seiyama et al. (1988) assurent que seulement 10 % des photons survivront à l'absorption au coeur des artères de 1 mm de diamètre. Il en déduit que le signal reçu proviendra essentiellement des artérioles, capillaires et veinules. Les spectres d'absorption de l'hémoglobine (Hb) et de la myoglobine (Mb) sont trop similaires pour être séparés in vivo dans chacune des deux formes d'oxygénation (De Blasi e 74

82 al, 1991). Plusieurs auteurs s'accordent à définir la faible contribution (10 à 25 %) du signal NIRS issu de la myoglobine par rapport à celui de l'hémoglobine (Seiyama et al, 1988; Chance et al, 1992). La concentration de myoglobine totale dans la région d'intérêt étant constante au cours du temps, l'addition du pic relatif aux formes oxygénées (HbC>2+MbO2) et du pic relatif aux formes désoxygénées (Hb+Mb) est indépendante des variations de saturation de la myoglobine. On a alors accès à l'hémoglobine totale qui reflète des changements de volume sanguin et fournit ainsi un index de la perfusion (Homraa et al, 1996). Ces molécules absorbent la lumière à 800 nm dans les formes oxygénées et désoxygénées alors qu'à 760 nm l'absorption se fait principalement par les composantes désoxygénées. La différence des signaux obtenus à 760 nm et 800 nm est utilisée pour indiquer les changements de saturation de l'hbo2 et fournit donc une mesure relative de la saturation en O2. Cet index d'oxygénation est indépendant du volume sanguin (Chance et al, 1992). Dans des conditions particulières où les changements de saturation de la myoglobine n'interviennent pas ou peu, où le chemin de la lumière est connu (Chance et al, 1988) et où des calibrations précises ont été opérées au préalable sur des animaux, on peut chiffrer la consommation d'oxygène (De Blasi et al, 1993). Le chemin moyen du faisceau de lumière NIR est de 6 à 10 cm selon la disposition des sondes et correspond alors à une profondeur de pénétration de 2 à 3 cm (Irwin et al, 1995). En pratique, deux diodes laser constituent les sources de lumière monochromatique aux deux longueurs d'onde (760 et 800 nm). Ces diodes sont séparées de 2 à 3 cm et délivrent des impulsions séquentielles de 200 ns pour illuminer le tissu exploré. Entre les diodes deux photodétecteurs (un à 760 nm et l'autre à 800 nm) recueillent les signaux qui seront traités par ordinateur en temps réel (figure 18). Cette technique voit son champ d'application grandir. De nombreux travaux font référence au NIRS en tant qu'outil d'investigation de la physiologie de l'exercice (Mancini et al, 1994; McCully et al, 1994), et même dans des situations cliniques telles que le choc hémorragique (Hampson et Piantadosi, 1986), le choc septique (Piantadosi et al, 1991), l'insuffisance cardiaque (Mancini et al, 1991; Belardinelli et al, 1995; Matsui et al, 1995), et depuis peu dans l'évaluation des maladies génétiques (Chance et Bank, 1995). 75

83 Diode laser fibres optiques Photo déte cteur source lumineuse nm ordinateur Changement de concentrations de Hb, HbO2, HbT, cytaa3 Figure 18 : Illustration schématique d'un spectromètre proche infrarouge disposant de deux sources lumineuses à 760 et 800 nm. Cette technique permet de détecter des changements de concentrations en hémoglobine totale, en désoxyhémoglobine et en oxyhémoglobine ainsi que des changements de l'état de réduction du cytochrome aa3. Ainsi, des études sur le muscle de l'avant-bras ont assuré que la spectroscopie proche infrarouge était une technique suffisamment sensible pour mettre en évidence «l'aspect dynamique de l'ischémie tissulaire», puis de l'hyperémie secondaire survenant au cours d'une épreuve d'ischémie-reperfusion (Hampson et Piantadosi, 1988). H est intéressant de constater que le degré d'oxydation du cytaa3 ne chute pas pendant les premières minutes d'ischémie. Cette constatation in vivo est en accord avec la cinétique de désaturation de la myoglobine obtenue par RMN lors d'épreuves équivalentes et conforte la notion que la captation de l'oxygène par la mitochondrie ne disparaît seulement qu'après quelques minutes d'ischémie complète. L'approche NIRS est, par ailleurs, adaptée à la mesure de la réoxygénation musculaire post-ischémique. Cheatle et al. (1991) ont montré que cette récupération était nettement ralentie chez des patients atteints d'artériopathie comparés à des sujets sains. Chez des patients souffrant d'insuffisance cardiaque, cette technique a également permis de mettre en évidence une importante différence de niveau d'oxygénation des muscles respiratoires (Mancini et al, 1991) ainsi qu'une hypoperfusion du vaste latéral (Wilson et al, 1989) au cours de divers protocoles d'exercices. Des études expérimentales ont été réalisées dans des modèles animaux de choc septique. Les mesures de P02 en différents points du tissu à l'aide de la technique NIRS confirment l'hétérogénéité de l'oxygénation tissulaire déjà connue ou supposée dans ce modèle expérimental (Piantadosi et al, 1991). 76

84 Il faut néanmoins souligner que cette approche atraumatique, très intéressante d'un point de vue qualitatif, ne permet pas d'envisager des mesures quantitatives pour des explorations musculaires. La détermination précise de la profondeur de pénétration de la lumière infrarouge dans le tissu et la contribution éventuelle du signal de désoxymyoglobine restent des limitations à la quantification absolue de l'oxygénation tissulaire (figure 19). Photon Migration Probability Profil» Gaitrocramnil Lat«ralis Pow«r Connector,, (to Oifftrcntiol Amplifier») Light Souret» ' ' { Flashlight Bulbil B5O «m 760nm Intorforonct Filltrs and Oiod* tendon Figure 19 : Illustration de la profondeur de pénétration du faisceau proche infrarouge à l'intérieur les muscles jumeaux latéral et médian. Lorsque les sources sont éloignées de 4 cm, la profondeur de pénétration atteint 2 cm. Certains auteurs ont pourtant tenté de quantifier la consommation d'oxygène en mesurant les changements du signal NIRS au cours d'épreuves d'ischémie de la jambe et de l'avant-bras (Cheatle et al, 1991; De Blasi et al, 1993). Cette mesure doit être restreinte à une fenêtre temporelle pour laquelle le signal NIRS ne peut provenir que de l'hbo2 et de l'hb, c'est-à-dire les 60 premières secondes de l'occlusion artérielle (le signal de désoxymyoglobine non discriminable pouvant intervenir par la suite). Cheatle et DeBlasi ont pu ainsi quantifier leurs résultats en adoptant, comme profondeur de pénétration de la lumière, des calibrations réalisées au préalable in vitro et chez des sujets sains (Wray et al, 1988; Ferrari et al, 1992). Cette même démarche ne peut pas être menée lors de protocoles d'occlusion veineuse car les modifications du signal NIRS peuvent alors être issues de l'accumulation de sang veineux (De Blasi et al, 1994; Chen et Armory, 1995). Le NIRS est une technique atraumatique récente et très prometteuse. Elle est très alléchante par sa simplicité et sa résolution temporelle élevée (le signal peut être enregistré en continu), ce qui constitue un atout important. Cette méthode est la moins onéreuse et la plus «portable» parmi celles destinées à évaluer l'oxygénation. Dans des conditions très précises 77

85 d'expérimentation, cette approche peut fournir une mesure de la perfusion musculaire (Edwards et al, 1993). L'impossibilité de discriminer les contributions respectives des signaux de désoxyhémoglobine et de désoxymyoglobine est un inconvénient majeur, pouvant rendre parfois peu fiables les interprétations des résultats des travaux qui négligent la composante cellulaire. Au niveau musculaire, les contraintes citées rendent cette technique inutilisable pour nos protocoles visant à étudier des exercices aérobies ou anérobies suivis de leur phase de récupération. c) La résonance magnétique nucléaire (RMN) (1) La spectroscopie du proton ( 1 H) de la myoglobine Nous avons eu recours à cette technique qui constitue un des axes principaux de nos travaux sur l'oxygénation tissulaire. La spectroscopie en proton de la myoglobine est détaillée dans le chapitre suivant qui décrit les développements méthodologiques. (2) Mesure de la relaxation transversale de l'eau Cette partie fait l'objet d'une description détaillée car la mesure de la relaxation transversale de l'eau est utilisée dans plusieurs protocoles présentés au chapitre m. La relaxation transversale des protons de l'eau musculaire peut être mesurée par deux constantes de temps, le T2 et le T2*. Le T2 caractérise la vitesse de la relaxation spin-spin. Il s'agit d'une relaxation intrinsèque indépendante de l'homogénéité du champ Bo. Le T2 peut être mesuré par une séquence d'écho de spin. Le T2* caractérise à la fois la relaxation spinspin en T2 et la décroissance du signal résultant de l'inhomogénéité de Bo- Cette composante liée aux gradients d'inhomogénéité est parfois caractérisée par la constante T2', aboutissant ainsi à la relation : = + avec = y-ab 0 T2* T2 TT TT Le T2* peut être mesuré par une séquence d'écho de gradient multi-écho. 78

86 Par les propriétés électroniques de ses formes oxygénées et désoxygénées, l'hémoglobine influe sur les constantes de temps de relaxation transversale. Rappelons que l'hémoglobine assure le transport de l'oxygène à l'intérieur du compartiment sanguin dans tout l'organisme. L'hémoglobine possède un atome de fer qui a quatre liaisons possibles avec l'oxygène. L'hémoglobine oxygénée est une molécule diamagnétique. Lorsque l'hémoglobine perd une ou plusieurs de ses molécules d'oxygène, elle possède alors un ou plusieurs électrons célibataires et devient paramagnétique. D y a plus de cinquante ans, Pauling et al. (1936) ont le premier mis en évidence les propriétés paramagnétiques de la désoxyhémoglobine. Plus récemment, Thulborn et al. (1982) ont constaté un raccourcissement de la relaxation transversale de l'eau du sang total en solution causé par la diffusion des protons à travers les inhomogénéités de champ local provoquées par l'hémoglobine désoxygénée paramagnétique. Ainsi, le déphasage entre les protons de la désoxyhémoglobine et ceux du plasma se manifeste par une diminution de signal RMN. In vitro, Matiywoff et al. (1990) se sont récemment préoccupés de l'élargissement des raies spectrales RMN de l'eau du sang associé aux variations du contenu en désoxyhémoglobine. In vivo, lorsque l'hémoglobine se désoxygène, le compartiment sanguin devient de plus en plus paramagnétique. H en résulte des différences de susceptibilité magnétique (A%) entre le tissu et le réseau vasculaire, qui induisent alors des gradients de champ magnétique entre l'intérieur et l'extérieur des vaisseaux sanguins. Sur le cerveau de rat, Ogawa et al. (1990) ont observé que sur une image en écho de gradient (sensible au T2*), l'intensité du signal des tissus avoisinant les gros vaisseaux dépendait de la concentration de désoxyhémoglobine. Belliveau et al. (1991) ont les premiers utilisé l'augmentation de perfusion dans les zones corticales activées à partir d'une injection de gadolinium lors de phases de repos et d'activations neuronales. En effet, toute tâche neuronale détermine une augmentation locale de l'apport sanguin en sang oxygéné, disproportionnée par rapport à l'augmentation de la consommation d'û2. La conséquence directe est une diminution de la quantité de désoxyhémoglobine qui rallongeant le T2*, ce qui se traduit par une augmentation localisée du signal d'écho de gradient dans la région cérébrale mobilisée par la tâche. C'est l'avènement de l'imagerie fonctionnelle cérébrale. Ce type de contraste généré par le niveau d'oxygénation vasculaire est connu sous le nom de BOLD (Blood Oxygénation 79

87 Level Dependent) (Ogawa et al., 1990). Couplé à la technique ultra rapide d'imagerie échoplanar, Turner et al. (1991) ont cartographie des modifications d'oxygénation du sang au niveau du parenchyme cérébral d'un chat placé en hypocapnie. Suite à ces constatations, certains expérimentateurs se sont penchés plus précisément sur les effets de susceptibilité magnétique entre le réseau vasculaire et le tissu environnant, qui sont à l'origine d'une atténuation du signal et d'un élargissement des raies spectrales. Ces phénomènes de susceptibilité modulent le signal RMN de deux manières : Les gradients de champ magnétique générés entre les capillaires et le tissu entraînent une dispersion de la phase de l'aimantation de l'eau située autour des capillaires. Ceci se traduit par un raccourcissement du T2* du muscle mesurable en écho de gradient. A priori, cet étalement des fréquences de résonance est réversible : il devrait être compensé par une séquence d'écho de spin, le T2 n'étant pas sensible aux inhomogénéités de Bo- Cependant, les molécules d'eau diffusent autour des capillaires, et les quelques millisecondes qui séparent l'impulsion radiofréquence de la lecture du signal suffisent à l'eau pour se déplacer à travers les gradients régnant autour des capillaires. H en résulte un étalement des phases qui n'est pas compensé par un écho de spin. Ces déphasages, qualifiés de non réversibles, se traduisent donc par un raccourcissement du T2 musculaire. Le plus souvent, ces deux phénomènes se combinent avec une pondération des déphasages réversibles et non-réversibles dépendant de la nature du tissu observé et des paramètres de la séquence (temps d'écho, intensité et durée d'application des gradients). Les séquences RMN en écho de gradient, sensibilisées au T2*, sont à même de fournir un indice d'oxygénation capillaire. En effet, l'intensité du signal RMN d'écho de gradient est modulée par la concentration en désoxyhémoglobine paramagnétique. Cependant, la géométrie du volume capillaire influe également sur le signal pondéré en T2* rendant toute estimation quantitative hasardeuse. Si on observe un tissu musculaire, il faut mentionner la contribution potentielle de la désoxymyoglobine également paramagnétique. Cependant, le niveau de désaturation en oxygène de la myoglobine, qui reflète l'oxygénation tissulaire, ne peut avoir qu'une très faible influence sur la mesure du R2*. En effet, au cours d'une ischémie musculaire, alors que J 80

88 compartiment sanguin se désature quasi-immédiatement, la désaturation de la myoglobine atteint seulement 5 % après 3 minutes d'occlusion pour ne se désaturer complètement en oxygène au bout de 6 minutes. Par ailleurs, la concentration en hémoglobine (9 mmol/1 de sang) est 40 fois plus élevée que la concentration en myoglobine (0,22 mmol/kg de muscle) au niveau du muscle squelettique. Enfin, la myoglobine ne présente pas les mêmes propriétés de compartimentation que l'hémoglobine : elle est en effet répartie dans toutes les cellules musculaires alors que l'hémoglobine est confinée dans le réseau capillaire. La désaturation de la myoglobine n'induit donc pas de gradient de champ magnétique local dans le muscle. Son influence sur la relaxation transversale du tissu n'est donc à priori pas évidente. 5. LA CONSOMMATION MAXIMALE D'OXYGENE La consommation maximale d'oxygène est la quantité maximale d'oxygène qui peut être prélevée (ventilation, respiration), transportée (système cardio-vasculaire et érythrocytaire), consommée (tissus, en particulier musculaire) pendant une unité de temps (minute). Il s'agit d'un débit massique maximal d'oxygène exprimé en ml. 100g" 1.min" 1 noté VC^max. Au repos, la consommation d'oxygène est de l'ordre de 3 à 4ml.l00g" 1.min" 1. A l'effort cette consommation d'oxygène peut être largement augmentée et atteindre un niveau maximal qui se situe selon les sujets entre 25 et 85 ml. 100g" 1.min" 1. La consommation maximale d'oxygène dépend : - des différents muscles recrutés (Kushmerick et al, 1992) - de la masse musculaire en jeu lors de l'effort (Joyner et al, 1992; Knight et al, 1992), - du sexe : chez l'homme sédentaire français sous effort, la VC^max est de 30 à 45 ml. 100g" 1.min" 1, chez les femmes sédentaires, la gamme s'étend de 25 à 35 ml. 100g" 1.min" 1 - du niveau d'entraînement (Saltin et Astrand, 1967; Laurent et al, 1993): chez des sportifs de très haut niveau, pratiquant un sport de fond, la VC^max peut atteindre 85 ml. 100g" 1.min" 1, soit 20 fois le métabolisme de repos. Un entraînement de plusieurs semaines permet d'augmenter la VC^max de 10 à 50 %, 81

89 - de l'âge (Coggan et al, 1993): elle s'élève jusqu'à 20 ans pour se stabiliser jusqu'à 30 ans et diminuer progressivement lorsque l'âge s'avance (70 % à 60 ans), et ce, proportionnellement à la réduction significative de la fréquence cardiaque maximale au delà de 30 ans et à la diminution de la ventilation pulmonaire à l'exercice maximal dès 20 ans. Pour tout individu, la VC^max dépend de l'interaction de tous ces paramètres ainsi que Wagner et al. (1988) et Honig et al. (1992) l'ont souligné. Les effets de l'entraînement sur les performances physiques Les effets de l'endurance sur le muscle squelettique concernent : une augmentation de la masse musculaire (Saltin et Gollnick, 1983), du pourcentage des fibres rouges avec renforcement des capacités oxydatives du muscle (Maxwell et al., 1980), de la densité capillaire (Hudlicka, 1982), du volume des mitochondries (en taille et en nombre) avec une augmentation des enzymes impliquées dans le cycle de Krebs et dans la chaîne de transport des électrons (Saltin et Gollnick, 1983), de l'utilisation des acides gras libres pour un besoin d'énergie lié à la puissance maximale aérobie, de la quantité totale d'hémoglobine circulante (mais la concentration en hémoglobine reste souvent constante), de la quantité de myoglobine favorisant la diffusion de YO2 (avec certitude chez les animaux et comme nous l'avons vu chez l'homme les résultats restent controversés), de la capacité à stocker le glycogène, de la différence artério-veineuse locale en O2 à des niveaux sous-maximaux d'exercice (Blomqvist et Saltin, 1983), du débit sanguin musculaire maximal (Klausen et al., 1982) par augmentation du débit cardiaque principalement dû à l'accroissement du volume d'éjection systolique. La littérature, abordant les effets le plus souvent bénéfiques de l'entraînement sur l'individu, est très riche. Ces revues retracent les conséquences de l'entraînement à tous les niveaux de l'organisme (hémodynamique, biochimie, composition de la musculature) mais également les manifestations sur les performances physiques (Saltin et Astrand, 1967; Karlsson, 1972; Gollnick et al, 1973; Andersen et Henriksson, 1977; Henriksson et Reitman, 1977; Saltin et Rowell, 1980; Klausen, 1981; Holloszy et Coyle, 1984; Terjung et al, 1988; Sundberg, 1994). Ces facteurs contribuent à l'augmentation de la consommation maximale d'oxygène au cours des premières semaines d'entraînement. Certains points contribuent au développement de la puissance aérobie du muscle. 82

90 D. CALCUL DE L'EXTRACTION MUSCULAIRE D'OXYGENE Nous allons voir comment il est possible de combiner les différents développements méthodologiques que nous avons mis en oeuvre, pour en extraire une valeur d'extraction musculaire d'oxygène pour un individu donné sur le muscle exploré. L'extraction de l'oxygène par le muscle est le rapport entre le flux net d'oxygène capté par les myocytes (Captation d'02) et l'apport artériel en oxygène (DO2). Ceci s'exprime par l'équation : Captation d y Oi Extraction (%) = [11] DO2 Nous allons voir comment il est possible de calculer, pour chaque sujet, l'extraction musculaire d'oxygène à partir de nos données RMN mesurées simultanément. Nous avons envisagé la possibilité, grâce à l'approche entrelacée, d'explorer la relation entre l'apport d'oxygène (DO2), la consommation d'oxygène par les mitochondries (Vo 2 mito) et le temps de réoxygénation des cellules aux tous premiers instants de la reperfusion (TMyo). Dans notre situation précise, sur un intervalle de temps dt, la variation de la quantité d'oxygène dans le cytoplasme musculaire est égale à la différence entre les variations d'oxygène entrant et d'oxygène sortant. d[o 2 ] dt dt dt où : d[o 2 ] dt sortant L J représente l'oxygène extrait de la microcirculation (= DO2 x Extraction). La quantité d'oxygène délivrée aux tissus par unité de temps (DO2), est égale au produit de la perfusion par la concentration artérielle en oxygène (CaÛ2). DO 2 = Perfusion xcao 2 [13] La perfusion musculaire est estimée par la méthode de pléthysmographie RMN. 83

91 Le contenu artériel en oxygène (CaC>2) : - est supposé normal chez les volontaires sains (190 ml O2.I de sang" 1 ), - doit être déterminé chez des sujets présentant d'éventuelles altérations du CaÛ2 : - par prélèvement veineux pour mesurer la concentration d'hémoglobine lors d'une anémie, - par une ponction artérielle dans les autres cas. sonant représente l'oxygène consommé par les mitochondries. Cette consommation mitochondriale d'oxygène (Vo 2 mito) est calculée à partir des données mesurées en SRM du 31 P. Ce calcul, utilisant à la fois le rapport Pi/PCr et la constante de temps de resynthèse de la PCr (TPCr) a été détaillé au chapitre I.A.3.b. On peut alors reformuler l'équation [11] sous la forme : d [ O l] muscle.,-,. + V O 2 mito Extraction = [14a] LJKJ L'équation [14a], nous permet de calculer le coefficient d'extraction d'oxygène des capillaires d[o 2 ] musc]e vers les cellules musculaires, car le terme _^EI. représente la variation de la quantité d'oxygène des myocytes, on la notera dmbo2/dt, ce qui donne l'équation : dmbo 2 - Extraction = dt ^ [14b] En effet, au moment précis de la reperfusion, alors que la pression en oxygène est extrêmement faible, l'oxygène présent à l'état dissous est négligeable. Ainsi, le contenu en oxygène des myocytes peut être assimilé à l'oxygène lié à la myoglobine. Or la variation par unité de temps de la quantité d'oxygène lié à la myoglobine (dmbo2/dt) peut être calculée à partir de : 1) son pouvoir oxyphorique (affinité de l'oxygène pour la myoglobine, noté n), 2) la variation de la saturation en oxygène, 3) la concentration en myoglobine du muscle exploré. 84

92 Ce qui nous conduit à : dmbo 2 K x ^Saturation x [ Mb] [15] dt dt Pour évaluer chacun de ces facteurs : 1) On fait l'hypothèse de la constance de son pouvoir oxyphorique (7t = 1,36 ml d'c>2 par g de Mb (Wittenberg, 1970). 2) On mesure par spectroscopie RMN de la myoglobine, les variations de saturation de la myoglobine, au cours de l'intervalle dt. 3) La concentration de myoglobine ([Mb]) sur le muscle exploré, se trouve dans des tables de référence existantes (Biorck, 1949; Moller et Sylven, 1981; Nemeth et Lowry, 1984) mais se mesure également par RMN par référence à l'eau comme nous l'avons vu (Carlier et al, 1994). Dans nos calculs, on utilise la concentration de myoglobine des muscles jumeaux que nous avons préalablement estimée à 0,21 mmol/kg (Carlier et al, 1994) et qui a été convertie en mmol/kg de tissu en considérant une fraction d'eau dans le muscle de 0,77. Ainsi, les changements instantanés de la saturation en oxygène de la myoglobine que nous mesurons, peuvent être directement transformés en la dérivée par rapport au temps du contenu en oxygène du muscle (Le Rumeur et al, 1987). On peut alors calculer le flux net d'oxygène du compartiment vasculaire vers la cellule musculaire à partir de la pente initiale de la resaturation de la myoglobine obtenue par nos données RMN. En conclusion, la captation d'oxygène, définie par la quantité d'o2 prélevée des capillaires par unité de temps est, dans notre cas précis, la somme de YOi consommé par les mitochondries et de YO2 se liant à la myoglobine par unité de temps, ce qui se traduit par l'équation [16a] : Captation O 2 = VO 2 mito + dmbo d t [16a] qui peut encore s'écrire sous la forme : dmbo, = DO 2 x EO 2 - VO 2 mito [16b] dt 85

93 This page is intentionally left blank.

94 CHAPITRE II : DEVELOPPEMENTS METHODOLOGIQUES ET DESCRIPTION DES DIFFERENTS SUPPORTS TECHNIQUES A. PREAMBULE : PRESENTATION DE NOTRE SYSTEME Toutes les études RMN de ce manuscrit ont été réalisées au moyen du spectromètre/imageur BRUKER de type MEDSPEC 30/100, mis en service au sein du Service Hospitalier Frédéric Joliot en H est piloté par un ordinateur X32 associé au logiciel UXNMR. Il est interface à un aimant corps entier OXFORD qui génère un champ magnétique de 2,94 Tesla. H dispose d'un tunnel de 2,5 m de long d'un diamètre de 72 cm, bobines de shims et gradients écrantés actifs en place. Les gradients possèdent un blindage actif et ont une intensité maximale de 10,6 mt/m. Le temps de commutation (montée et descente) des gradients est de 540 fis. B. INTRODUCTION Notre objectif a consisté à développer ou à optimiser des outils techniques et méthodologiques afin de pouvoir exploiter l'approche multi-paramétriques de la RMN, dans le but de corréler un certain nombre de variables physiologiques du muscle strié squelettique soumis à diverses stimulations. La mise en oeuvre de séquences spéciales combinant imagerie et spectroscopie hétéronucléaire est une étape indispensable pour une analyse fine des paramètres hémodynamiques et métaboliques. Un tour d'horizon rapide du potentiel RMN nous a permis de cibler et d'envisager le développement d'un certain nombre d'outils RMN. Ainsi, les séquences RMN développées dites «entrelacées» permettent d'acquérir en pseudo-simultané plusieurs types de données parmi : - des images en proton pour déterminer la perfusion, - des spectres en proton permettant de suivre l'évolution du signal de myoglobine, reflet du niveau d'oxygénation des myocytes, 87

95 - des spectres en proton du lactate pour appréhender le métabolisme glycolytique anaérobie, - des spectres en phosphore pour apprécier le métabolisme énergétique et le ph intracellulaire du muscle. Le terme «acquisitions hétéronucléaires entrelacées» résume les différentes étapes de l'approche méthodologique. Des développements techniques à plusieurs niveaux ont été nécessaires : - Les séquences entrelacées mises en oeuvre sont directement écrites en fonction des variables hémodynamiques et métaboliques que l'on envisageait de mesurer. L'acquisition «hétéronucléaire» a nécessité la construction de sondes spécifiques, chacune étant ajustée au noyau ciblé, avec une géométrie adaptée aux exigences du protocole. - «L'entrelaçage» de signaux RMN issus de différents noyaux nous a conduit à réaliser une interface électronique permettant de changer instantanément le noyau excité ou observé, sans l'intervention de l'utilisateur, par simple lecture des instructions présentes dans la séquence de pilotage du spectromètre. - L'interface électronique et le matériel utilisé dans le cadre de nos protocoles sont ensuite décrits. Les détails technologiques spécialisés permettant au lecteur de construire le même matériel sont en petits caractères. A la fin de ce chapitre, nous décrivons la procédure de traitement des données brutes. Nous avons écrit une automation spécifique à chaque séquence qui, dans un premier temps, redistribue le vecteur acquis en plusieurs vecteurs contenant des données de même nature. Ces données sont ensuite traitées par des logiciels RMN déjà existants. La procédure de traitement de chaque type de signal est détaillée. 88

96 C. NOUVEAUX OUTILS RMN MIS EN OEUVRE AU SEIN DES SEQUENCES 1. PRINCIPE DE LA MESURE DE PERFUSION PAR PLETHYSMOGRAPHIE RMN La plethysmographie par RMN est une adaptation de la méthode conventionnelle très répandue de plethysmographie par occlusion veineuse. Nous avons récemment proposé une approche RMN de la plethysmographie (Brillault-Salvat et al, 1997), parallèlement à la version écho-planar proposée par Toussaint (1996). Cette approche consiste à suivre par imagerie, l'augmentation progressive de la surface d'une coupe transversale du membre. Cette «plethysmographie RMN» permet de mesurer la perfusion de repos et également, l'augmentation du débit sanguin musculaire induite par une stimulation. Le rythme d'acquisition des images sera alors ajusté en fonction de la cinétique du phénomène. L'hyperémie réactionnelle étant un processus rapide, la résolution temporelle doit être élevée : de l'ordre d'une image par seconde. En revanche, la mesure de la perfusion de base se déroulant sur plusieurs minutes (4 à 5 minutes selon les cas) à cause du faible débit sanguin, la séquence d'imagerie en écho de gradient sera répétée toutes les 3 à 5 secondes. Dans ce cas, nous signalons qu'il est possible d'acquérir des images en mode multi-coupes sur l'ensemble du membre puisque la résolution temporelle permet une exploration étagée du segment considéré. Cette alternative offre un avantage certain par rapport à la mesure conventionnelle par jauge de contrainte. Dans le cas de pathologies veineuses où la compliance veineuse peut être altérée sur une portion du membre plutôt que sur une autre (Boccalon et al, 1981), l'intérêt d'une mesure simultanée sur coupes étagées est évident. Chez le sujet sain où la compliance veineuse est uniforme, la version multi-coupes n'apportera rien de plus. Dans ce cas, la coupe explorée sera toujours la plus grande section du membre, placée au centre de la sonde. L'épaisseur de la tranche étant figée, la perfusion, exprimée en ml. 100g" 1 tissu.min" 1, est proportionnelle à la variation de section maximale mesurée sur quatre images successives, rapportée au temps nécessaire à l'acquisition de ces quatre images. Il faut souligner que ce «test pléthysmographique» ne permet pas d'explorer sélectivement un muscle mais réalise la mesure sur l'ensemble du membre. D'un point de vue pratique, la détermination de la perfusion, par plethysmographie RMN ou par les autres techniques, doit respecter certaines conditions de mesure qui seront exposées par la suite. 89

97 2. LA SPECTROSCOPIE PROTON DE LA MYOGLOBINE a) Principe Dans la forme oxygénée de la molécule de myoglobine, les électrons du fer(ii) de Thème sont appariés et la molécule d'oxymyoglobine est diamagnétique. En l'absence d'oxygène sur le site de fixation, deux électrons du fer sont non-appariés, rendant la désoxymyoglobine paramagnétique. Le proton N-ô de l'histidine proximale F8 donne alors naissance à une résonance bien définie à 75 ppm du pic d'eau vers les bas champs. La spectroscopie RMN en proton de la myoglobine, initiée in vitro par Livingston et al. (1983) puis appliquée in vivo par Wang et al. (1990) et Jue et al. (1990) est la seule technique atraumatique et non irradiante qui permette de mesurer la pression partielle en oxygène du muscle en situation d'hypoxie. A l'état oxygéné, la résonance engendrée est indécelable car elle se situe sous le pic de l'eau de concentration 10 6 fois plus élevée (Moller et Sylven, 1981). b) Mise en évidence Le signal de désoxymyoglobine peut être mis en évidence par RMN du proton en appliquant, à 75 ppm du pic d'eau (8700 Hz à 3 Tesla), une impulsion sélective gaussienne de 750 jxs de durée. Cette durée est le résultat d'un compromis. En effet, comme le T2* de la myoglobine est très court (nos mesures le situent selon les muscles entre 1,5 et 1,8 ms), plus l'impulsion est longue plus le signal est atténué, la perte de signal étant liée au phénomène de relaxation en T2 pendant l'impulsion. En revanche, la sélectivité fréquentielle de l'impulsion est quant à elle proportionnelle à sa durée. Plus l'impulsion est sélective, plus le résiduel d'eau (persistant malgré l'excitation sélective à 8700 Hz du pic d'eau) est diminué. Le rapport de l'intensité du pic de désoxymyoglobine sur l'eau résiduelle est primordial, d'une part pour régler le gain du récepteur afin d'obtenir une dynamique maximale du convertisseur sur le signal de myoglobine et, d'autre part pour le traitement des spectres. 90

98 c) Mesure du T2* et du T1 de la myoglobine du muscle squelettique à 3T Les mesures du T2* et du Tl de la myoglobine ont été faites en considérant que le pic à 75 ppm provenait exclusivement de la désoxymyoglobine 100 % visible par RMN, hypothèses que nous justifierons par la suite. Le temps de répétition entre les excitations de myoglobine doit tenir compte de la relaxation longitudinale. Si le signal n'est pas récolté en condition de relaxation complète (TR> 5xTl), la connaissance de ce Tl est indispensable pour toute quantification, afin de déterminer le facteur de saturation de l'aimantation. Le Tl de la myoglobine du muscle squelettique in vivo n'avait pas encore été évalué à un champ magnétique de 3 Tesla. La connaissance du T2* du membre exploré est également nécessaire au choix optimal du temps d'échantillonnage du signal (Tacq > 3xT2*). Détermination du T2* de la mvoglobine Cette mesure est très facilement accessible puisque le T2* du metabolite est inversement proportionnel à la largeur à mi-hauteur du pic selon la relation (Gadian, 1982; Taylor etal., 1983): 1 Au, = \ n T2* Sur les muscles de la jambe, on obtient des raies de largeur 208 ± 19 Hz. On en déduit un T2* de 1,53 ± 0,14 ms. Détermination du Tl de la mvoglobine La détermination du Tl de la myoglobine in vivo peut se faire par deux méthodes qui sont l'inversion-récupération et la saturation-récupération. Nous avons opté pour cette dernière approche puisque : 1) le T2 court de la myoglobine suppose des impulsions RF brèves, 2) il faut limiter le dépôt de chaleur pour des impulsions RF rapprochées, 3) par une simple saturation de l'aimantation, cette séquence fait aussi l'économie du long délai de relaxation. Cette dernière considération est importante." En effet, pour que les variations de signal soit uniquement liées au niveau de repousse de l'aimantation, l'état d'oxygénation de la 91

99 molécule doit être stable au cours de l'expérience. Or, l'oxymyoglobine étant indécelable par RMN, la mesure se réalise sur une molécule 100% désoxygénée. Comme nous le montrerons plus tard, l'expérience ne peut débuter chez le volontaire qu'après 6 minutes d'ischémie du membre étudié. H n'est pas souhaitable in vivo de maintenir l'ischémie au delà de 10 minutes alors que plusieurs mesures peuvent être répétées chez le même individu 2. Nous avons ainsi choisi d'ajuster les paramètres expérimentaux pour un temps d'acquisition total ne dépassant pas les 4 minutes. La figure 20 illustre la séquence de mesure du Tl de la myoglobine. Les gradients appliqués dans les trois dimensions de part et d'autre de l'impulsion pi servent à disperser préalablement le signal de l'eau du muscle qui a un Tl de l'ordre de 1,35 s à 3 Tesla (mesure effectuée dans notre laboratoire par inversion-récupération). L'impulsion de saturation, p2, centrée sur la myoglobine, est suivie du délai variable (vd) pendant lequel l'aimantation repousse. A un instant précis de la repousse, l'impulsion p3 bascule de nouveau cette aimantation dans le plan transversal où s'effectue la détection du signal pendant la période ACQ. Cette séquence se termine par un délai de repousse constant fixé à 20 ms. Gradients enx,y,z fl a A Pi 1 A vd 1 A P2 P3 cyclage de phase (NS) incrément de vd (M) nombre d'accumulations (NA) n A0Q 2Oms Figure 20 : Séquence de détermination du Tl de la myoglobine in vivo par la méthode de saturation-récupération. Les 3 flèches indiquent les 3 changements de fréquence d'irradiation. La première impulsion est appliquée pour saturer le signal de l'eau, les deux impulsions suivantes respectivement à la fréquence de la myoglobine et de l'eau sont destinées à saturer puis à mesurer l'aimantation en phase de récupération. 2 Sur les muscles squelettiques, une ischémie artérielle peut être maintenue pendant plus d'une heure avant qu'une nécrose n'apparaisse. 92

100 Dans cette expérience de saturation-récupération in vivo, la faible concentration de la myoglobine (~ 0,25 mmol/kg) impose l'addition d'un nombre important d'acquisitions. D faut alors considérer réchauffement potentiel du tissu du fait de la succession rapprochée de ces impulsions RF, à ces délais de répétition courts. Nous devons alterner les délais (vd) courts et longs pendant la mesure afin de lisser toute dérive dans le temps, qu'elle soit instrumentale ou physiologique. Les conditions expérimentales sont les suivantes : Une impulsion sélective de 500 u,s de durée et de 1 KHz de largeur spectrale a été utilisée pour cette mesure. Après un shim manuel (Ài)i/2 =18 Hz) sur le signal de l'eau musculaire, cette impulsion a été calibrée en condition de relaxation complète pour obtenir un angle de bascule de l'aimantation de 90. Les mesures du Tl de la myoglobine fournies aux autres valeurs de champ Bo nous permettait d'envisager un Tl de l'ordre de 10 ms à 3 Tesla, ce qui nous a aidé à sélectionner la série de délais. Douze délais variables vd nous ont permis d'enregistrer 12 points expérimentaux avec 256 accumulations par point (NSxNA). Les délais appliqués : 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 9; 12;15 ms étaient en réalité précédés d'un autre délai constant de 1,58 ms (gradient appliqué après l'impulsion p2 pour déphaser l'aimantation résiduelle de l'eau). Le nombre de points de mesure doit être le compromis entre la qualité de l'ajustement des données expérimentales et le rapport S/B (nombre d'accumulations par point) rappelant que le laps de temps de la mesure était approximativement limité à 4 min. Les autres paramètres sont : NS = 8, NI = 12, NA = 32, TD = 256, SW = 25 KHz et Tacq= 5,12 ms. La durée de l'expérience était de 3 min et 30 s. Les spectres de myoglobine sont traités selon la procédure habituelle sans suppression du signal de l'eau au traitement (cf. ch n.h.4). Il sont corrigés manuellement pour la phase et la ligne de base. Le Tl peut être évalué par l'ajustement d'une courbe exponentielle aux données expérimentales obtenues par l'aire des pics de myoglobine (figure 21). L'équation de la courbe donnant l'aimantation Mz(t) après l'impulsion de lecture p3 est donnée par (Bloch, 1946) : ( -*} Mz (t) = Mz (0) 1 - exp i où Mz(0) est l'aimantation longitudinale relaxée. 93

101 Nous avons mesuré à 3 Tesla le Tl de la myoglobine à 9,6 ms dans le muscle de jambe humaine. H faut signaler que le signal issu des deux premiers points de mesure était inexploitable car le rapport S/B était trop faible. Nos résultats concordent avec la valeur de 7,4 ms proposée par Wang sur les muscles de l'avant-bras à 1,5 T (Wang et al, 1992) et les données de La Mar (1977) sur ces protéines en solution qui avaient fourni un Tl de 14 ms à 7 Tesla. Aimantation longitudinale (%) Données expérimentales Ajustement exponentiel -\ Temps (ms) Figure 21 : Amplitude du signal de myoglobine à différents temps de lecture au cours de la repousse de l'aimantation préalablement saturée. L'ajustement exponentiel de ces données expérimentales donne accès au Tl de la myoglobine dans le muscle de jambe humaine in vivo à 3 Tesla. d) Mobilité et visibilité de la myoglobine L'environnement cellulaire de la molécule de myoglobine ne semble pas restreindre sa diffusion. En effet, la largeur des pics de myoglobine in vivo n'est que très légèrement supérieure à celle des pics de myoglobine en solution. Les protéines liées à des macromolécules ou à des organites deviennent immobiles ou quasi-immobiles, leurs protons ont alors un T2 très court (Ho et Russu, 1981). Ces protéines donnent naissance à un pic si large que la résonance est invisible par RMN à ces faibles concentrations. Livingston et al. (1983) et Kreutzer et al. (1991) ont obtenus des T2 comparables pour la myoglobine in vivo et in vitro. Ceci semble signifier que la myoglobine cellulaire diffuse librement in vivo. Par conséquent, puisqu'elle n'est aucunement liée au sarcolemme ou à d'autres organites 94

102 cellulaires 3, on peut considérer que la myoglobine est alors 100% visible par RMN. De plus, Kreutzer eî al. (1991) ont affirmé que la myoglobine myocardique est 100% visible par RMN en comparant les données d'une analyse biochimique et d'une mesure par RMN sur un extrait de tissu myocardique. Au cours de cette étude, la forme des raies obtenues plaide une fois de plus en faveur d'une myoglobine diffusant librement in vivo, même si on ne peut exclure une infime fraction liée. Le signal RMN étant directement proportionnel au nombre de noyaux détectés, l'intégrale du pic de désoxymyoglobine est directement proportionnelle à sa concentration. e) Interférences II faut contrôler que le pic apparaissant à 75 ppm est sans ambiguïté le signal de désoxymyoglobine attendu. A ce déplacement chimique, deux autres composantes paramagnétiques, les cytochromes et la métmyoglobine à l'état Fe(III), pourraient être la source d'interférences contaminant le spectre dans la gamme de 60 à 100 ppm. Or la concentration de métmyoglobine est insignifiante au sein de la cellule (Stryer, 1988). En outre, une seule résonance apparaît sous hypoxie (la sensibilité est telle que toute contribution éventuelle de l'ordre de 5% serait détectée). Ce point conforte la notion que les cytochromes sont liés à des membranes, ont une mobilité restreinte et sont par conséquent invisibles par RMN. Pour les explorations humaines ou animales in vivo, la plus grande interférence spectrale susceptible d'intervenir se situe au niveau d'autre autre protéine très voisine de la myoglobine : l'hémoglobine (Hb). Dans une solution désoxygénée, l'hémoglobine érythrocytaire est suffisamment mobile pour induire un signal provenant du proton N-ô* de l'histidine à l'origine de deux résonances. Ce sont les chaînes a et (3, pas complètement similaires, qui sont à l'origine de ces deux raies approximativement assignées à 76 et 64 ppm (La Mar et ai, 1977; Ho et Russu, 1981). Ces résonances peuvent contaminer le pic de myoglobine (Mb), les concentrations de Mb dans le muscle et d'hb dans le sang étant respectivement de 0,25 mmol/kg et de 2,25 mmol/1. 3 Ces résultats confortent l'hypothèse selon laquelle la myoglobine facilite la diffusion de l'oxygène dans la cellule. Cependant, les conclusions des études expérimentales (Wittenberg et Wittenberg, 1975; Jones et Kennedy, 1982) et théoriques (Loiselle, 1987; Groebe, 1990) divergent encore sur la contribution de la myoglobine sur le transport en oxygène dans la cellule. 95

103 Il faut toutefois insister sur le fait que ces pics ne sont pas visibles sur les spectres acquis dans nos conditions expérimentales et ce pour plusieurs raisons : - dans le muscle, le réseau vasculaire occupe environ 5 % du volume tissulaire, réduisant la contribution de l'hb (0,12 mmol/kg) vis-à-vis de la Mb (Kreutzer et al, 1993), - le T2 de l'hb, dont la valeur n'a été que très récemment mesurée (Fetler et al., 1995) (141 is et 137 (xs pour les chaînes a et p respectivement à 7 T), est beaucoup plus court que celui de la myoglobine. Le signal engendré forme alors deux raies très larges. Par conséquent, la durée des impulsions d'excitation de la myoglobine de l'ordre 750 ^is est trop longue devant le T2 de l'hb, induisant une relaxation transversale trop rapide du signal de désoxyhémoglobine, et atténuant les résonances alors indécelables pour un nombre d'accumulations restreint (au maximum 256 signaux dans nos expériences). Afin de compléter ces considérations, il nous a semblé bon d'introduire dans ce manuscrit d'autres manipulations effectuées au cours de cette thèse sur l'aimant vertical à 7 Tesla du laboratoire. En effet, nous avons été amenés à réaliser des expériences in vitro sur du sang humain manipulé sous diverses conditions (Vaufrey et al, 1997). Trois échantillons ont été étudiés successivement : 1) une solution de sang humain héparine dilué dans un volume 2/1 d'un sel isotonique, 2) une solution de sang humain contenant des globules rouges lysés obtenus par dilution dans 2 volumes d'eau, 3) un coeur de rat découpé en morceaux dont la concentration de myoglobine est estimée à 0,19 mmol/kg (Wittenberg, 1970; Jue et Anderson, 1990). La dilution des solutions permettait d'obtenir une concentration en Hb de 50 mg/ml. Le signal des échantillons de sang a été collecté et étudié à l'état oxygéné puis à l'état désoxygéné, état obtenu par bullage sous argon pendant 20 minutes. La P02 résiduelle, mesurée dans la solution par un analyseur de gaz (NOVA), était alors très faible (de l'ordre de 1 à 2 torr). A l'état oxygéné, aucun pic n'a été détecté dans la gamme 50 à 100 ppm. A l'état désoxygéné, la préparation d'érythrocytes lysés faisait apparaître les deux résonances attendues à 72 et 62 ppm (figure 22), contrairement à la préparation d'érythrocytes intacts. Pour l'échantillon contenant le coeur de rat, nous avons bien retrouvé un pic de désoxymyoglobine à 75 ppm. En référençant cette intégrale au signal d'eau acquis préalablement sur cet échantillon avec la 96

104 même impulsion, nous avons obtenu la concentration de myoglobine attendue sur un coeur de rat. Le principe de la quantification de la myoglobine par référence directe à l'eau est expliquée plus loin. i i i i p p m r r Figure 22 : Spectres de désoxyhémoglobine de sang humain (globules rouges lysés) acquis à 7 Tesla avec les deux résonances à 72 et 62 ppm des chaînes a et fide l'hémoglobine. Ces résonances ont été mises en évidence avec les paramètres expérimentaux suivants : TR = 138 ms, NS = 12288, TD = 16 K, SW = 83 KHz, NR = 1. Nous allons désormais nous intéresser aux différentes aspects du potentiel de la spectroscopie en proton de la myoglobine, pour les investigations in vivo du muscle squelettique. La spectroscopie proton de la myoglobine permet : - d'estimer la saturation en oxygène de la myoglobine, - d'évaluer la pression partielle en oxygène (P02) intracellulaire musculaire, - de calculer la concentration de myoglobine de différents muscles. Les deux premiers points sont abordés dans les deux paragraphes suivants, alors que le troisième l'est dans le chapitre HI traitant les applications. f) Mesure de la saturation en oxygène de la myoglobine Nous avons vu que le signal de désoxymyoglobine est visible à 100 % par RMN. La désaturation complète (100 %) en oxygène est obtenue après 6 minutes d'ischémie du membre, temps nécessaire au signal pour atteindre un plateau. A partir de ce signal maximal de référence représenté par l'aire du pic, il est naturellement envisageable d'attribuer, à tout pic de désoxymyoglobine collecté au cours d'une mesure dynamique, une valeur de désaturation en oxygène de la myoglobine compris dans la gamme 0 à 100 %. Comme détaillé par la suite, il est également possible de calculer le temps de resaturation de la myoglobine à partir des données de saturation récoltées au cours de l'hyperémie réactionnelle. 97

105 g) Calcul de la Po 2 intracellulaire musculaire L'équation de dissociation de la myoglobine avec l'oxygène est la suivante : Mb+0 2 ~Mb0 2 [17] avec K la constante de dissociation, [MbO2] la concentration d'oxymyoglobine, [Mb] la concentration de désoxymyoglobine et Y la saturation en oxygène en % : [MbO 2 ] [18] Y_ [MbO 2 ] En substituant l'équation [18] dans l'équation [19], on obtient : y = 7-J4J [20] Puisque l'oxygène est un gaz, il convient d'exprimer sa concentration en terme de P02. En remplaçant dans l'équation [3] le terme [O2] par a P02/76O et avec K' = a K/760, on obtient : [MbO 2 ] = K'x [Mb] x Po 2 En substituant [MbCy dans l'équation [19], on aboutit à l'expression liant la saturation à la P02 musculaire : Po 7 Y = Po2 + P 50 En reformulant cette équation et à la seule condition de faire une hypothèse sur l'affinité de l'oxygène pour la myoglobine (représenté par la P50 myoglobine), on exprime la P02 musculaire à partir de la valeur de saturation Y en oxygène de la myoglobine : 2~ SOmyoglobine X X Y (%) ( 100 _y) 98

106 Rappelons que la P50 myogiobine représente la pression partielle en oxygène à 50% de saturation. Les travaux les plus récents réalisés par Schenkman et al. (1997) sur du muscle de cheval mentionnent une valeur de 2,3 torr, en accord avec les résultats publiés sur le muscle humain in vivo, qui la situe entre 1,3 et 5,3 torr. Cette P50 myogiobine semble dépendre du type de muscle (Jurgens et al, 1994) et de la température (Wittenberg et Wittenberg, 1989). 99

107 D.MISE EN OEUVRE DES MODULES DES SEQUENCES ENTRELACEES Nous avons insisté sur le principe de la pléthysmographie par RMN et de la spectroscopie en proton de la myoglobine car ce sont deux approches peu communes dans le cadre des explorations RMN et qui de plus, se retrouvent dans plusieurs de nos séquences. Nous allons désormais introduire les autres outils RMN puis détailler dans cette partie les aspects délicats de la mise au point méthodologique des séquences entrelacées. En effet, la définition des divers protocoles envisagés conditionne le développement et l'optimisation une à une des séquences en fonction de leurs objectifs. 1. HISTORIQUE DE L'ENTRELAÇAGE La RMN permet d'explorer de manière atraumatique et reproductible le métabolisme et les fonctions des tissus. L'étude des interactions ou des régulations du métabolisme nécessite une approche intégrée, combinant des données RMN entre elles ou avec des données dérivant d'autres techniques. La pertinence de telles confrontations dépend essentiellement de la coïncidence temporelle des données expérimentales. De nombreuses investigations ont déjà reposé sur une association de la RMN avec d'autres méthodes telles que l'eeg, l'ecg, l'emg, le NIRS, l'échographie, la vélocimétrie par laser Doppler, l'oxymétrie, le monitorage de la pression sanguine ou les électrodes de Clark (Eijgelshoven et al, 1993; Kloiber et al, 1993; Mancini et al, 1994; Conger et al, 1995; Vestergaard Poulsen et al, 1995). L'enregistrement simultané de plusieurs paramètres RMN constitue une seconde approche. De telles expériences multinucléaires sont couramment pratiquées en spectroscopie RMN à haute résolution et cette implementation pour des explorations ex vivo fut relativement facile. Ainsi, de nombreuses expériences ayant recours aux combinaisons de noyaux 31 P/ 1 H, 31 P/ 2 H, 31 P/ 23 Na, 23 Na/ 19 F ont été menées sur des organes perfuses, des tissus ou des cellules (Corbett et al, 1991; Schussheim et al, 1993; Espanol et al, 1994; Tauskela et Shoubridge, 1996). Toutefois, le transfert de cette approche dans des conditions in vivo sur un aimant corps-entier est nettement moins répandu. Ceci résulte de la moindre flexibilité des systèmes cliniques d'imagerie et de la difficulté croissante de la construction des sondes multifréquences pour de gros volumes d'intérêt. 100

108 A notre connaissance, la première expérience simultanée in vivo fut réalisée par Thulborn et al. (1981) au début des années 80. Cette équipe surveillait avec une sonde 31 P les metabolites phosphorylés de la jambe d'un lapin soumis à des stimulations nerveuses électriques tout en mesurant le débit sanguin et l'oxygénation du sang veineux en détournant la veine cave à travers une sonde proton. Il faut insister sur le fait que cette expérimentation a nécessité deux spectromètres différents qui opéraient simultanément et indépendamment aux deux fréquences de travail. Des chercheurs de Philadelphie (Schnall et al, 1985) furent les pionniers de l'enregistrement simultané de signaux spectroscopiques RMN in vivo. Ces véritables acquisitions entrelacées multinucléaires reposaient sur le développement de sondes multi-accords (de deux à quatre fréquences) (Eleff et al, 1988). Plus récemment, ce concept s'est étendu à la spectroscopie localisée (CSI) et la littérature fait état de plusieurs travaux regroupant des données entrelacées l W 31 P CSI (Chang et al, 1991; Moore et al, 1991; Gonen et al, 1994). En imagerie à 1,5 T des acquisitions concourantes *H et 23 Na ont été menées avec succès sur du cerveau humain en effectuant la moyenne de 4 échos en sodium pour un écho en proton (Lee, W. et al, 1986). H faut souligner que contrairement à la démarche que nous avons entreprise, l'objectif des travaux entrelacés antérieurs était de profiter d'un temps de relaxation long d'un noyau pour acquérir le signal d'un autre noyau en vue de réduire le temps d'examen du patient (Gonen et al, 1994a). Tous ces signaux étaient acquis avec des vecteurs d'acquisitions identiques (ou symétriques) sans aucune adaptation des canaux électroniques et de plus avec une résolution temporelle qui n'autorisait pas des mesures successives rapprochées. De façon plus surprenante, aucune acquisition alliant imagerie et spectroscopie RMN n'avait été réalisée pour exploiter la cinétique de phénomènes dynamiques. Dans le cadre de nos travaux, la RMN répond à un besoin réel puisque jusqu'à présent aucune approche méthodologique satisfaisante n'avait permis d'entrelacer des données dynamiques en vue de mener une étude physiologique atraumatique la plus exhaustive possible. 101

109 2. DEFINITIONS Le terme «séquence RMN» désigne une succession temporelle d'événements synchronisés par le séquenceur, qui peuvent être des impulsions radiofréquence (RF), des impulsions de gradients, des délais ou des périodes de détection afin de mettre en évidence des signaux RMN. Ces signaux peuvent être soit des signaux d'induction libre (FID) en spectroscopie soit des échos en imagerie. Le terme «module» de séquence RMN désigne un ensemble d'instructions successives qui pourraient constituer une séquence classique d'imagerie ou de spectroscopie en configuration standard de la machine. Un module est défini pour un noyau et contribue à la détermination d'une mesure physiologique. Nous appellerons «séquence entrelacée», toute séquence alliant plusieurs modules RMN au sein d'une même session d'acquisition. H peut s'agir d'une association de signaux hétéronucléaires de spectroscopie uniquement, ou combinés à des signaux d'imagerie. Comme nous l'avons déjà souligné, l'irm est un outil de choix pour la détermination atraumatique du débit sanguin. Pour mesurer la perfusion musculaire par RMN, nous avons envisagé deux approches qui exploitent toutes deux le volet imagerie de la RMN. La plethysmographie RMN exploite en effet le volet volumétne de l'irm et s'applique au repos tout comme en condition de stress. L'autre approche est plus spécifique à la RMN et repose sur la détection pixel par pixel de variations significatives du Tl du tissu musculaire à l'issue d'une vasodilatation maximale. 102

110 3. MODULES ÉLÉMENTAIRES INSÈRES DANS LES SEQUENCES ENTRELACÉES a) Evaluation de la perfusion post-ischémique par pléthysmographie RMN L'étude du muscle en condition de stress (exercice ou ischémie) est très importante. L'insuffisance cardiaque est, par exemple, une pathologie pour laquelle l'anomalie de perfusion des membres inférieurs n'est pas décelée au repos mais seulement à l'effort. Le modèle d'ischémie-reperfusion a été abordé au chapitre I.B.4.C. Nous pouvons simplement rappeler que la levée d'un brassard maintenu pendant 5 minutes à 230 torr, induit une augmentation instantanée du débit sanguin du membre ischémie. Pour une mesure pléthysmographique, le brassard est dégonflé à 60 torr. Le pic d'hyperémie durant moins de 30 secondes, les coupes transverses du membre étudié doivent être acquises au rythme d'une seconde sur une durée d'une minute. Cette résolution temporelle, essentielle pour observer la dynamique du phénomène pendant l'hyperémie réactionnelle à la levée d'une occlusion artérielle, requiert l'implémentation d'une séquence d'imagerie rapide. (1) Mise en oeuvre d'une séquence d'imagerie rapide L'imagerie rapide a pour but de réduire le temps d'acquisition des images. Nous avons ainsi recours à une séquence d'écho de gradient, moins coûteuse en temps que les séquences d'écho de spin. En théorie, si on applique des impulsions de 90, il faut laisser le temps à l'aimantation longitudinale de repousser sous peine de réduire le signal observé dans le plan transverse. Ceci suppose une valeur de TR supérieure au Tl du tissu exploré. Le cas échéant, lorsqu'une aimantation est excitée continuellement par des impulsions avec une période TR courte devant le Tl, un régime d'équilibre dynamique de l'aimantation s'installe. La méthode d'équilibre dynamique a été proposée pour la première fois en 1958 par Carr et al. (1958) en spectroscopie. L'aimantation d'équilibre créée est déterminée par l'angle a de basculement de l'impulsion RF. Cet angle connaît une valeur optimale, nommé angle d'ernst, défini par la relation : cos a = exp (-TR/T1). Cette stratégie permet de réduire considérablement le temps d'acquisition (de 10 à 100 fois). La technique d'imagerie rapide correspondante, fondée sur le régime d'équilibre dynamique de l'aimantation longitudinale à petits angles, est apparue en 1986 (Haase et al, 1986). 103

111 Une séquence d'imagerie rapide de type GRASS (Gradient Recalled Acquisition in Steady State) a été utilisée. Cette séquence GRASS, représentée figure 23, est une variante de l'approche FLASH (plus connue) car elle opère en plus un traitement de l'aimantation transversale résiduelle. Pour atteindre le régime d'équilibre dynamique, une première condition doit être satisfaite : le déphasage produit par le gradient de codage de phase Gy doit être annulé en le compensant par un gradient de rembobinage de la phase avant chaque nouvelle excitation RF. Ce gradient est égal en amplitude mais de polarité inverse. Si l'encodage de phase varie de -Gymax à +Gymax au cours des Ny pas de la séquence, alors le gradient de rembobinage varie de +Gymax à -Gymax. L'état d'équilibre des aimantations transversales est alors stable mais dépend de la position spatiale dans la direction de sélection et de lecture. Pour compenser ce phénomène, des gradients de «brouillage» doivent être ajustés pour que l'aimantation résultante d'un voxel représente la moyenne de tous les états d'équilibre. Cette condition s'écrit : t G lecture Gphase 7 J (Gx(t) r x + Gz(t) rz) dt = 2izn o n pas d'encodage de phase / \ / Gsélection/ \ / nr \ / ACQ "A Figure 23 : Séquence d'imagerie en écho de gradient du type GRASS avec rembobinage du gradient de phase, de lecture et de sélection de coupe. L'impulsion est une gaussienne de 1 ms de durée. La modification de la séquence d'écho de gradient d'origine a consisté à compacter les délais, les temps de montée et descente des gradients pour diminuer au maximum le TR. Les temps de commutation des gradients ainsi que leurs intensités sont désormais figés et non plus calculés par l'algorithme «Méthode» du spectromètre. En imposant un champ de vue de 19 cm xl9 cm pour une matrice de 128x128, la résolution spatiale est de 1,5 mm x 1,5 mm pour un TR de 7,4 ms soit une résolution temporelle de 900 ms par image. 104

112 (2) Brouillage par la phase (RF spoiling) A haute résolution temporelle, il est prévu d'intercaler un signal de myoglobine entre deux échos successifs issus de cette séquence GRASS. Le TR effectif du module GRASS est alors de l'ordre de 14 ms, inférieur au T2* du muscle (environ 20 ms). L'équilibre dynamique très rapide de l'aimantation transverse est à l'origine d'artefacts sur l'image. En effet, pour TR<T2 une aimantation résiduelle est maintenue en tout point du plan de Fourier, comme expliqué précédemment. Pour certaines valeurs de gradients, l'aimantation résiduelle ne sera pas déphasée, ce qui se traduit sur l'image par un hypersignal central en bande dans la direction de la lecture. Malgré la mise en oeuvre d'une séquence de type GRASS, une aimantation résiduelle persiste, provoquant un léger artefact central sur des images de mollet. La technique du brouillage par la phase de l'impulsion RF (ou RF spoiling), développée par Crawley et al. (1988), a été mise en oeuvre afin de supprimer cet artefact typique. Crawley a démontré qu'un gradient de «spoiling» revenait à créer un déphasage ( )(i)rf relatif à la phase de l'impulsion RF et fonction de l'itération i du gradient d'encodage de phase. H a alors proposé de créer un déphasage identique par action de la phase sur l'émetteur : Cette stratégie de cycle d'offset de phase de l'impulsion RF minimise la cohérence de phase entraînant un étalement du signal résiduel sur toute l'image et non plus centré en hypersignal. La phase de chaque impulsion est déterminée à partir de l'impulsion précédente selon la relation : H s'agit donc de générer la suite arithmétique de phases ( )RF(i) dont la raison i est suffisamment grande pour supprimer l'état d'équilibre et assez petite pour ne pas causer de trop larges variations de cycle à cycle qui pourraient rendre l'image floue. Un incrément de 10 a permis de supprimer complètement l'artefact central qui apparaissait sur les images de jambe à cette valeur de TR. 105

113 (3) Interventions sur le système Cette partie aurait pu être traitée en dehors du module consacré à l'imagerie. Cependant, les améliorations du spectromètre ont suscité des modifications uniquement sur ce module imagerie des séquences. L'installation d'un Dual DDS (Dual Direct Digital Synthetizer) sur notre système nous a offert la possibilité de commuter l'émission des ondes radiofréquences entre deux canaux A et B, le canal A restant en cohérence de phase. Cette nouvelle technologie a malheureusement rendu impossible la gestion de phases RF requises pour le RF spoiling, les phases étant désormais des multiples de TC/2 uniquement. En réalité, seules les images collectées lors du premier protocole ont bénéficié du RF spoiling. L'autre intervention importante sur le système a concerné le changement de l'alimentation des gradients, pour cause de panne, ce qui n'a pas été sans répercussion au niveau des séquences. En effet, jusqu'alors une intensité correspondant à 100% du gradient de lecture (10,6 mt/m) était acceptée par l'alimentation. La modification en question a entraîné une diminution du niveau maximum du gradient de lecture (Gmax) aux alentours de 88%. Cette valeur fut d'ailleurs l'objet d'une optimisation pour chaque séquence en fonction du «duty cycle» des gradients. La marge de manoeuvre fut étroite : il fallait trouver la valeur critique du gradient de lecture (Gmax) qui supporte un nombre conséquent de répétition, le risque étant de faire disjoncter l'alimentation en cours d'acquisition sur volontaire, tout en essayant de maintenir à la fois un FOV et un TR minima. Nous avons recalculé la séquence en fonction de ces contraintes qui se sont traduites par une augmentation du FOV de 19 xl9 cm à 23 cm x 23 cm et un allongement sensible du TR du module imagerie de 2 ms. Ces nouvelles conditions ont toutefois contribué à réduire l'artefact central, le rendant désormais invisible sur des images de mollet. (4) Les paramètres de la séquence d'imagerie L'onde RF de sélection de coupe est de type «tomogauss» de durée 1 ms (2740 Hz à mi-hauteur). H s'agit d'une impulsion gaussienne modifiée de manière à conserver une sélectivité spatiale raisonnable malgré sa durée. Les pieds de l'enveloppe ont été ajustés pour tendre plus rapidement vers zéro afin de minimiser la troncature (inférieure à 1%) et les lobes d'excitations secondaires dans le domaine fréquentiel. Comme toutes les impulsions gaussiennes, cette impulsion est peu sensible aux distorsions (non-linéarité des amplificateurs) et demande une faible puissance d'émission RF ce qui est intéressant à haute fréquence. 106

114 Les autres paramètres sont : 0 TR effectif = 14 ms, TE = 5,5 ms o a = 20 0 SW=100KHz,FW=125KHz 0 épaisseur de coupe =10 mm 0 FOV = 23x23 cm 0 matrice = 128x128 ou 128x64 b) Détermination simultanée du T2*, et de la perfusion par la méthode du T1 apparent, grâce à la séquence d'échos de gradient multiples (Lebon, Carlier, Brillault-Salvat et al, 1997b) En physiopathologie, il est important de dissocier le contenu en oxygène des capillaires et le débit sanguin. Ces deux facteurs contribuent à la fourniture en oxygène au tissu et tous deux peuvent être à l'origine d'une altération du métabolisme. Ces deux déterminants physiologiques peuvent être respectivement estimés par RMN à partir des variations du T2* et du Tl apparent (Tl app ). La détermination de la perfusion par mesure des variations du Tl app a été présentée dans le chapitre I. Rappelons que les séquences pondérées Tl (TR et TE courts) sont sensibles à la perfusion du tissu et à la densité de proton alors que les séquences pondérées T2* (TR et TE longs) sont majoritairement sensibles à l'oxygénation et à l'architecture des capillaires. Jusqu'à présent aucune approche RMN ou atraumatique n'a permis de mesurer simultanément ces deux composantes. Vincent Lebon a développé une nouvelle méthode (Lebon et al, 1997) qui mesure parallèlement les variations de perfusion tissulaire et l'oxygénation capillaire. Cette approche repose sur une séquence d'échos de gradient multiples, représentée sur la figure 24, où le signal RMN est échantillonné à plusieurs temps d'écho pendant sa relaxation transversale. L'ajustement de la décroissance du signal par une exponentielle donne lieu - à la détermination de la constante de temps de relaxation transversale T2*, qui est sensible aux variations d'oxygénation du compartiment sanguin - et à l'estimation de l'intersection avec l'axe des ordonnées qui représente l'aimantation longitudinale extrapolée à temps d'écho nul (Mo). 107

115 Par cette démarche, lors d'une épreuve du type ischémie-reperfusion, les variations du signal d'imagerie, vont nous permettre de calculer les variations du RI apparent. Comme nous allons le voir maintenant, cette information permet de quantifier les variations de la perfusion musculaire. Mtj ansverse Décroissance ent2* M o m RF ' ; : â ACQ... ' "...ACQ -1 M 1- M M 1--i ui i ma -i i-n~m i- T G lecture /~~V /""< G phase G sélection /~^\ ^^K / ~TT- -.. p a a TE1O vj vy \_JI w i Temps (ms) Figure 24 : Séquence d'échos de gradient multiples donnant accès, par ajustement des données selon une fonction exponentielle, au T2* du tissu et à l'aimantation longitudinale à temps d'écho nul qui permet de calculer les variations de perfusion. En théorie, pour une expérience d'écho de gradient utilisant un angle de bascule de 90 et un TR sensiblement plus long que le T2*, le signal (SI) peut être approximativement donné par l'équation [23] en fonction du Rl app (=1/Tl ap p) et du R2* (=1/T2*) : xexp(-*2*-7e) [23] où k est une constante liée à des considérations instrumentales, Mo la densité de proton, R2* le taux de relaxation transversale incluant les effets des inhomogénéités de champ magnétique et Rlapp le taux de relaxation longitudinale tenant compte des effets de perfusion. On peut reformuler l'équation sous la forme : SI = S7 (7E=O) x exp(-i?2 *-TE) [24] où SI (TE=0) =k- M o [l-exp(-/?l app 77?)] représente l'aimantation à temps d'écho nul. L'équation [24] permet de mettre en évidence et de séparer les deux composantes recherchées qui sont le Rl app et le T2*. 108

116 H est possible de calculer les variations de Rl app (ARl app ) à partir de celles de SI (TE=O) : (1er terme de l'équation [23]) : AS/ (r =0) SI (TE=O) [cxp(-rl app -TR)\ l-exp(-/?l n TR)\ l f\ app >\ et d'en déduire les variations de perfusion grâce au modèle développé par Williams (1992) aboutissant à la formulation suivante : Rlapp = RI + f/1 ou encore ARl app = Af / X [26] où À représente le coefficient de partition de l'eau entre le sang et le tissu. En combinant les équations [25] et [26], et en considérant Rl app «RI, on obtient la variation de perfusion en fonction de la variation de l'aimantation à temps d'écho nul : A/ A L \ 1K } J x ^ [27] En prenant comme référence le débit sanguin nul pendant la période d'occlusion artérielle, les variations de perfusion Af peuvent être converties pixel par pixel en une valeur absolue de la perfusion. A chaque répétition, une cartographie de la perfusion peut alors être établie en vue d'isoler et de quantifier les différents groupes musculaires. De même, l'équation [24] permet d'évaluer directement le T2* pixel par pixel et donc de générer une carte de T2* pour chaque série de 10 images. A chaque répétition à partir des 10 images acquises à 10 temps d'écho différents, l'intensité du signal de chaque pixel est ajustée par un modèle exponentiel (équation [23]). Les temps d'échos se répartissent de 6,1 ms à 41 ms avec un temps inter-écho de 3,8 ms. Le TR utilisé pour la détermination de la perfusion résulte d'un compromis entre un TR court qui maintient une bonne sensibilité à la perfusion et un TR plus long qui assure à la fois le rafraîchissement du sang capillaire et la relaxation de l'aimantation longitudinale entre deux impulsions RF séquentielles. Le TR choisi s'établit à 234 ms ce qui a conduit à une résolution temporelle acceptable de 15 s pour la série des 10 images de matrice 128x

117 Un logiciel de traitement des images interactif conduisant aux deux cartographies a également été développé par V. Lebon. Afin de minimiser le temps de calcul, un premier test est réalisé sur une image représentant la somme des huit premières images de repos. Ce test portant sur le rapport S/B de cette image, sur l'appartenance du R2* des muscles de la jambe à une certaine gamme attendue comprise entre 25 et 100 s" 1 assure 1'.élimination des pixels dépourvus d'information. En outre, le calcul du coefficient de corrélation (r) entre les données expérimentales et leur ajustement par une décroissance exponentielle va permettre de préciser la propreté de la décroissance en T2* au cours des 10 échos. Les pixels ayant une décroissance «suffisamment exponentielle» seront retenus, la valeur seuil de r ayant été fixée à 0,98. Des résultats antérieurs (Brillault-Salvat et al, 1996) nous montrent que les variations en T2* sont corrélées aux modifications du niveau d'oxygénation du compartiment sanguin. Comme la procédure de traitement des images sélectionne les pixels du tissu musculaire en éliminant les pixels contenant des vaisseaux sanguins ayant une décroissance T2* impropre (Menon et al, 1993), nous pouvons donc considérer les cartes R2* comme des cartographies de l'oxygénation du réseau capillaire. c) La spectroscopie proton de la myoglobine Le module élémentaire de spectroscopie proton de la myoglobine, illustré sur la figure 25, se compose d'une impulsion sélective centrée à 8700 Hz de la fréquence de référence constitué par le pic de l'eau, suivie de la détection du signal centrée sur l'eau et de durée comprise entre 5,12 et 10,24 ms. Cette durée d'acquisition du signal dépend du nombre de points échantillonnés (TD compris entre 128 et 512) et de la fréquence d'échantillonnage. Le nombre d'accumulations par point de mesure de ce signal est modulé par la résolution temporelle du protocole. La condition de relaxation complète, maximisant le signal de la myoglobine, est respectée si le TR entre deux impulsions successives est de l'ordre de 50 ms (TR> 5 Tl, le Tl ayant été mesuré à 9,6 ms). Dans le cas contraire et si l'intérêt d'une quantification se fait ressentir, il est impératif de calculer le facteur de saturation dans nos conditions expérimentales. Les propriétés de relaxation de la myoglobine (Tl très court) autorisent l'accumulation rapide du signal, ce qui présente un avantage certain pour la détection d'un metabolite à faible concentration. 110

118 ACQ Figure 25 : Représentation schématique du module élémentaire d'excitation-détection du signal de myoglobine. L'excitation sélective est centrée sur le pic de myoglobine alors que la lecture du signal est centrée sur le signal de l'eau. d) La spectroscopie proton du lactate Lors d'exercices intenses, l'apport en oxygène au muscle n'est pas suffisant pour assurer une oxydation totale des substrats de la glycolyse. Le métabolisme anaérobie entre alors en jeu pour compenser l'insuffisance du métabolisme aérobie et continuer la synthèse d'atp, ce qui entraîne une production de lactate qui peut atteindre jusqu'à 30 mmol/kg (Karlsson, 1971) au niveau des muscles impliqués. La détection du lactate in vivo sur la jambe humaine est difficile. Le pic de lactate à 1,33 ppm est recouvert par des signaux intenses de lipides couvrant la gamme de 0 à 2 ppm (tels que les lipides sous cutanés). En outre, la présence du pic d'eau de forte concentration réduit la dynamique d'observation des signaux de faible concentration. La détection du lactate in vivo, non contaminée par le signal des lipides, est cependant nécessaire pour de nombreuses études musculaires en spectroscopie proton. Les techniques d'édition utilise l'existence du couplage scalaire J entre les protons CH et CH3 du lactate, pour ne conserver que sa résonance en éliminant le signal de l'eau et des lipides. Ce couplage (JCH-CH3-7 Hz) donne naissance, à 1,33 ppm, à un doublet caractéristique de la molécule de lactate. Il existe trois principes d'édition : 1) la modulation de phase des cohérences à un quantum des spins couplés relativement aux spins non couplés, 2) l'induction de transfert de polarisation entre les spins des systèmes couplés, 3) et l'exploitation des cohérences à zéro ou à multiple quantum caractéristiques des systèmes couplés. 111

119 Parmi ces techniques, celle que nous emploierons a été développée par Hurd et al. (1989) et Knuttel et al. (1989) et repose sur la sélection des cohérences à double quantum par des impulsions de gradients. Rappelons qu'il s'agit de mesurer la production et l'élimination du lactate au cours d'exercices dynamiques et de la phase de récupération. L'approche choisie est tout à fait cohérente avec cet objectif car elle édite le signal lactate en une seule acquisition, ce qui lui confère une faible sensibilité au mouvement. En revanche, toute méthode de soustraction de signaux est à rejeter dans ce contexte. G. Bloch et L. Jouvensal (Bloch et al, 1995; Jouvensal et al, 1996) ont implémenté et optimisé une séquence d'édition du lactate par filtre à double quantum pour des applications chez l'homme. Les cohérences à zéro quantum (CZQ) et à double quantum (CDQ) sont crées par application de deux impulsions de 90 séparées par un délai correspondant à 1/2J (71 ms). L'application d'un gradient d durant l'évolution de ces cohérences permet de déphaser sélectivement les CDQ. Un second gradient G2 (G2 = 2xG0 pendant le dernier écho de spin permet de rephaser sélectivement l'aimantation issue des CDQ alors que celle issues des CZQ et des cohérences à un quantum est déphasée. La sensibilité de cette séquence est de 50 %, ce qui n'est pas rédhibitoire puisque nous bénéficions d'un haut champ. G. Bloch et L. Jouvensal ont combiné trois éléments supplémentaires pour améliorer la suppression des lipides et de l'eau opérée par le filtre à double quantum : - le signal des lipides résiduels est réduit par un module de préparation (inversionrécupération) introduit en début de séquence, exploitant le fait que le Tl des lipides est plus court que le Tl du lactate, - le «tl cycle» contribue à l'amélioration de la suppression des résonances non-couplées comme celles de l'eau et des CH2 des lipides, ainsi qu'à la suppression des lipides couplés (CH 3 et CH 2 ), - un gradient de surface, dont le principe est donné au chapitre ÏÏ.G.3, est enroulé autour de la jambe. Un courant appliqué pendant le dernier écho de spin va déphaser le signal des lipides sous-cutanés. En début de séance, l'intensité du courant parcourant le tapis est calibré sur une séquence d'écho de spin classique afin de minimiser les signaux résiduels des lipides des tissus adipeux sans affecter le signal qui provient du muscle. 112

120 Après suppression des résonances contaminantes, cette méthode de détection sélective permet d'envisager la quantification du lactate. La séquence lactate est représentée sur la figure 26. Les délais expérimentaux sont ajustés en fonction du couplage des noyaux d'intérêt : tl = 7,9 ms ; xl = 27,6 ms ; x2 = 43,4 ms ; xo = 1/2J = 71ms ; Ti = 200ms ; t2 = 600ms. Le temps d'écho de la séquence est de 1/J soit 143 ms. 32 accumulations 180 Canal 1 H 180 ï ACQ gradients desélection CDQ gradient de surface -*»«- Ti t, Figure 26 : Séquence d'édition du lactate musculaire par un filtre sélectionnant les cohérences à double quantum (CDQ). Une préparation d'inversion-récupération améliore la suppression des lipides. Le cyclage de phase requiert 32 accumulations répétées toutes les secondes. Gi et G2 : gradients du filtre CDQ avec G2 = 2xG] e) La spectroscopie du phosphore-31 : spécificité de nos conditions d'expérimentation La détection des signaux en phosphore suit l'application d'une impulsion rectangulaire de 200 (is de durée (figure 27). Le TR de ce module phosphore est très variable et doit être adapté aux besoins des différents protocoles. L'impulsion est calibrée en fonction de ce TR ; le TR est de une seconde pour la séquence la plus exigeante. Les valeurs du Tl de la PCr et du Pi du muscle squelettique humain sont respectivement de 5,5 et 4,0 s à 1,5 T (Thomsen et al., 1989) mais encore de 2,5 s et 2,5 s à 4,7 T (Goudemant et al, 1997). Leur T2 est d'environ 420 et 200 u.s (Thomsen et al, 1989a). Toutes nos acquisitions en phosphore sont effectuées dans un contexte de saturation, car le délai de 20 s n'est pas respecté entre les impulsions successives. 113

121 ol i RF ACQ Figure 27 : Module élémentaire de spectroscopie du phosphore-31. Le temps de lecture du signal dépend des conditions d'expérimentation mais dépasse généralement les 120 ms. A haute résolution spatiale, l'enregistrement du signal 31 P-SRM pendant l'exercice contrôlé et la récupération associée nous permet de détecter les cinq composés majoritaires qui sont Pi, PCr, a-atp, p-atp et y-atp. Lorsqu'un muscle se contracte, on observe une modification des concentrations des divers metabolites par rapport à l'état de repos. Une diminution du pic de PCr symétrique à l'augmentation du Pi est constatée alors que la concentration de l'atp, estimée à partir du p-atp varie peu lors de l'exercice même s'il est d'une grande intensité, alors que le ph diminue (Taylor et ai, 1986). Les trois types de métabolismes évoqués au chapitre I.A.2. entrent en jeu pour essayer de maintenir le niveau d'atp. La concentration d'atp peut toutefois diminuer de façon sensible lors d'exercices maximaux brefs (sprint). A la fin de l'exercice, on peut calculer la constante de temps de resynthèse de la concentration de PCr, notée (xpcr) et appelée généralement temps de resynthèse de la PCr. Ce xpcr reflète l'activité des oxydations phosphorylantes de la mitochondrie. Nous allons également calculer le rapport Pi/PCr en fin d'exercice ischémique. Ces deux informations vont nous permettre de calculer la consommation d'oxygène mitochondriale ( Vto 2 mito) et la consommation oxydative maximale apparente d'oxygène par les mitochondries ( Vo 2 max ap p) (cf. I.A.3.b.). 4. CONTRAINTES ET COMPROMIS DES SEQUENCES ENTRELACÉES En mode standard (non entrelacé), tous les paramètres de l'acquisition sont définis dans le fichier «ACQP» du logiciel qui ne gère qu'un seul jeu de variables. Lors du chargement du protocole, certaines relations entre les paramètres sont alors calculées. Les valeurs chargées par l'expérimentateur, ou calculées par le logiciel «Méthode» Bruker, ne peuvent en aucun cas être modifiées en cours d'acquisition. Les séquences entrelacées 114

122 juxtaposent plusieurs modules de séquences RMN que nous venons de décrire. H faut alors optimiser tous les paramètres propres à chaque module en tenant compte de la gestion intrinsèque du logiciel qui considère l'acquisition dans sa globalité. Il va donc falloir contourner certaines variables des «ACQP» de leur finalité initiale. a) Gestion des bandes passantes et des tailles variables des vecteurs d'acquisition Le temps de lecture du signal RMN est défini par le rapport entre le nombre de points du vecteur d'acquisition (TD) et la fréquence d'échantillonnage ou bande passante (SW). En imagerie rapide standard, les bandes passantes sont de l'ordre de 50 à 100 KHz. Les matrices sont au maximum égales 256 x 128. Les besoins en spectroscopie sont tout autres : - La fenêtre spectrale de l'acquisition doit être plus restreinte car les déplacements chimiques des metabolites recherchés sont parfois regroupés sur une petite largeur spectrale (le spectre phosphore se trouve sur 25 ppm). - Le nombre de points de lecture du signal est beaucoup plus important qu'en imagerie car la résolution fréquentielle (nombre de points d'échantillonnage du signal par Hz) doit être plus élevée afin d'identifier les structures parfois complexes des multiples résonances du spectre. - Les FIDs en proton mettant en évidence le signal de myoglobine et le résiduel d'eau, peuvent être collectés avec une résolution moindre car la largeur spectrale s'étend sur une vingtaine de KHz. - La durée d'acquisition des signaux spectroscopiques doit tenir compte du T2 des metabolites du tissu (Tacq > 3 xt2). L'entrelaçage d'images rapides et de spectres hétéronucléaires soulève donc certaines difficultés quant au choix des paramètres expérimentaux. La flexibilité de la structure du langage de programmation Bruker offre la possibilité à l'expérimentateur, grâce à un contrôleur nommé External Address Advance, de contrôler le temps de lecture du signal en définissant lui-même le nombre de points du vecteur d'acquisition ainsi que la fréquence d'échantillonnage des données. Cette modalité du langage Bruker nous permet d'introduire, au sein d'une même séquence, plusieurs modules 115

123 d'excitation-détection dont les paramètres des vecteurs d'acquisition sont indépendants. Ces variables sont individuellement définies dans la séquence et non lors du chargement du protocole dans le fichier «ACQP». Ces séquences utilisent la syntaxe suivante : image, 3u:x stadc_cw spectre, 25u:x stadc_cw 2u 25u 3u:x 25u:x 2u 25u lo to image times 128 lo to spectre times 1024 L'instruction «:x» offre la possibilité au récepteur d'enregistrer alternativement le signal correspondant au point réel puis au point imaginaire. A chaque répétition de la boucle, un couple de points complexes est ainsi collecté. Les délais présents dans la boucle imposent directement le temps d'échantillonnage entre deux points, c'est-à-dire la bande passante du vecteur d'acquisition. Dans l'exemple donné, on peut aisément déterminer les durées d'échantillonnage qui sont de 10 us et 100 us pour les boucles «image» et «spectre» respectivement. Elles définissent ainsi une bande passante de 100 KHz et 10 KHz, alors que la détection du signal est réalisée sur 128 et 1024 points complexes correspondant à des temps de lecture de 1,28 ms et 102,4 ms respectivement. L'instruction «stadc_cw», empruntée pour une finalité voisine aux séquences écho-planar Bruker, autorise l'enregistrement séquentiel du nombre de points du vecteur d'acquisition, taille figée par la boucle. La commande «stade» normalement utilisée dans les séquences classiques non écho-planar, ne prend en compte que la valeur affectée à la variable acq_size[0], variable présente dans les «ACQP» et qui définit en mode classique du système la taille de ce vecteur. b) Gestion du filtre électronique Nous venons de voir qu'il est possible de contrôler à chaque acquisition le temps d'échantillonnage du signal. H est aussi nécessaire de tenir compte de la présence et du rôle du filtre électronique qui se trouve au niveau de la chaîne de réception. D s'agit d'un filtre analogique passe bande qui est chargé, à la réception, d'ajuster la bande passante (FW) du récepteur à la fenêtre spectrale de l'acquisition (SW) pour limiter le bruit. En effet, la largeur spectrale du récepteur de notre spectromètre est de 200 KHz. En pratique, lors de la définition du paramètre SW dans les «ACQP», la valeur de FW est automatiquement calculée selon la relation :FW= 1,25 SW En réalité, FW peut être imposée par l'expérimentateur et ne peut être modifiée en cours d'expérience. 116

124 L'adaptation de ces deux largeurs spectrales (FW et SW) a pour fonction principale la minimisation de la figure de bruit. Le bruit électronique est également réparti sur toute la largeur spectrale du récepteur. Plus le récepteur est ouvert sur une large gamme, plus la puissance de bruit augmente. FW doit être étroitement lié au paramètre SW pour assurer la transmission intégrale de toutes les fréquences du signal. Il ne doit donc pas être trop étroit car dans ce cas on diminuerait certes le niveau de bruit, mais réciproquement certaines fréquences seraient coupées, atténuant ainsi le signal. Cette troncature serait à l'origine d'une perte d'information sur les images ou les spectres. H ne doit pas être trop large non plus car le bruit serait replié dans la fenêtre spectrale du récepteur SW et le rapport S/B serait dégradé. La définition du compromis est ainsi un point sensible des séquences entrelacées, puisque par exemple, la gestion des bandes passantes variables en cours de séquence est opérationnelle, mais que la fenêtre spectrale du récepteur doit être figée avant l'acquisition. Dans cet exemple précis, une solution pourrait consister à regrouper les bandes passantes des différents signaux entrelacés dans une gamme restreinte, en jouant sur le nombre de points du signal détecté. Or, en se référant à une séquence alliant imagerie et spectroscopie phosphore, et en rappelant les temps de lecture des signaux (Tacq i mage rie = 1,28 ms et Tacq phosphore >100 ms), imposer la valeur de bande passante de l'image (100 KHz) à celle de l'acquisition phosphore supposerait l'enregistrement de 20x10 3 points pour une seule répétition du signal phosphore. Pour des acquisitions dynamiques à haute résolution temporelle (de l'ordre de la seconde), l'enregistrement complet d'un phénomène physiologique sur plusieurs minutes peut réclamer un nombre important de répétitions (200 à 300 par session). Pour certains protocoles comportant 2, 3 voire 4 sessions chez le même volontaire, le volume de données à acquérir est considérable. Un des facteurs limitant concerne donc non seulement la capacité de stockage du disque dur mais aussi la capacité de la mémoire vive de la machine. Dans nos séquences, ces considérations ont ainsi entraîné la suppression en cours d'acquisition de l'affichage graphique et de la reconstruction en temps réel des données. H aurait également été possible de réduire la bande passante de l'image, mais cela aurait été au détriment de la résolution temporelle. 117

125 Avant de débuter la mise au point des séquences entrelacées et de restreindre la bande passante des images, nous avons voulu tester les caractéristiques réelles du filtre analogique en place sur notre système. Pour ce genre de composant, les caractéristiques réelles diffèrent parfois beaucoup des spécifications théoriques. Nous avons fait varier les variables FW et SW pour observer l'évolution du rapport S/B des images de jambe. Nous avons retrouvé les grands principes de fonctionnement d'un filtre passe bande mais de façon inattendue nous avons constaté qu'en imposant une SW de 100 KHz, on pouvait diminuer FW jusqu'à 62 KHz sans tronquer l'image. Les fréquences de coupures du filtre sont donc moins restrictives que ce que l'on avait envisagé. Ce constat nous est favorable puisque nous allons pouvoir maintenir à 100 KHz la bande passante des images sans pour autant augmenter considérablement FW (qui aurait dû être à 125 KHz). Cette mesure nous aurait en effet coûté un facteur 1,4 en rapport S/B des metabolites qui requièrent une bande passante étroite. Si cela avait été le cas, la seule alternative aurait consisté à doubler le nombre d'accumulations du signal au prix d'une dégradation de la résolution temporelle. Les contraintes liées aux bandes passantes des vecteurs d'acquisition sont les suivantes : 1) La bande passante de l'image est de 100 KHz. 2) Le spectre de myoglobine se situe sur 10 KHz environ car la résonance correspondante se positionne à 8700 Hz du pic de l'eau. Le signal résiduel de l'eau doit également être inclus dans la fenêtre spectrale pour éviter toute troncature et donc tout repliement du signal, à l'origine d'artefacts et de distorsions de la ligne de base dans le domaine fréquentiel. La présence d'un filtre digital et non analogique aurait permis de résoudre ce problème. En réalité, pour faciliter le traitement des spectres, nous opterons pour une bande passante de 25 KHz afin de centrer à zéro le pic résiduel de l'eau. 3) Le spectre phosphore est restreint sur une gamme de 3 KHz environ. Pour optimiser toutes les séquences, nous devons ainsi tenir compte des limitations techniques inhérentes au spectromètre, et des contraintes liées aux metabolites observés. Les facteurs pris en compte sont la fréquence d'échantillonnage, le nombre de points de lecture du signal, la largeur spectrale du récepteur et le rapport S/B de chaque metabolite recherché. Ils conditionnent la résolution temporelle. Les priorités attribuées aux diverses contraintes ont été définies pour chaque séquence en fonction du protocole. Dans ce contexte, nous avons mis au point et optimisé une à une les séquences entrelacées. 118

126 c) Gestion de la mémoire du système Nous avons été amenés à rechercher une variable des «ACQP» du logiciel Bruker qui nous permette de définir un succession de signaux (échos et FIDs) acquis consécutivement comme appartenant à un seul objet. En effet, les premières tentatives d'acquisitions entrelacées ont révélé des décalages dans les enchaînements chronologiques des signaux, décalages aléatoires au cours d'une répétition d'une session mais reproductibles en relançant l'acquisition. Il s'est avéré que ce problème était lié à la gestion de la mémoire du système qui ne reconnaissait pas la fin d'une répétition. Ainsi, les signaux étaient scindés en différents blocs intercalés par des temps morts variables. Le paramètre ACQ_phase_factor, détourné de sa finalité prévue par le constructeur, est la variable qui nous a permis de réserver avant l'acquisition l'espace mémoire pour chaque répétition. En théorie, l'acq_phase_factor, présent dans les «ACQP» et prévu pour les séquences du type RARE, définit le nombre de pas d'encodage de phase par objet pour une acquisition multiplexée (nombre de coupes >1). Ainsi, pour toutes les séquences entrelacées, la gestion de la mémoire est opérée en dimensionnant une matrice, comme en mode standard. La première dimension de cette matrice contient toujours la taille du plus petit vecteur acquis (acq_size[0]), appelée aussi taille unitaire, sachant que la dimension de tous les autres vecteurs est un multiple de cette valeur. Il s'agit le plus souvent de la résolution de l'image dans le sens de la lecture. La deuxième dimension, notée acq_size[l], contient la somme des blocs de taille unitaire collectés par répétition. Ces constantes permettent au système de définir et donc de réserver la place mémoire nécessaire à toute l'acquisition. L'ACQ_phase_factor, toujours égal à l'acq_size[l], oblige le système à considérer le produit acq_size[o]xacq_size[l] comme une entité indissociable correspondant en réalité aux données d'une seule répétition. H est important de préciser que l'acq_phase_factor est par construction du logiciel de notre système égal à une puissance de 2, ce qui oblige l'acq_size[l] à l'être également, au détriment de la flexibilité de la gestion des tailles d'acquisition des différents vecteurs. Cette contrainte supplémentaire est donc à considérer pour toutes les séquences. La dimension réelle de la matrice image est alors définie en ce qui concerne la première dimension dans la séquence elle-même, le nombre de points collectés pour toute acquisition y étant toujours présent. L'autre dimension, représentant le nombre de pas d'encodage de phases, est imposée dans le fichier de gradients et n'est pas représenté par la variable l'acq_size[l] comme en mode standard. 119

127 d) Relations entre les paramètres appelés par les séquences Chaque séquence entrelacée a été développée spécifiquement selon le cahier des charges du protocole correspondant. Comme nous l'avons déjà souligné, pour chaque séquence, le jeu de paramètres retenu est le résultat de nombreux compromis. Dans tous les cas, nous avons cherché à favoriser la cinétique des phénomènes métaboliques et hémodynamiques. Pour mieux comprendre la gestion des divers paramètres, il faut retenir : - acq_size[0] = nombre total de points réels et imaginaires, - TD = nombre de couples de points complexes (on a toujours acq_size[0] = 2 x TD). A chaque répétition, la somme totale des points des signaux recueillis doit correspondre à la place mémoire réservée pour chaque objet insécable de l'acquisition. Cette contrainte peut s'écrire sous la forme : Nbre de pas d'encodage S (, TDi x Ni ) - i acc l- -"^[0] / 2) x NI x ACQ_ phase_ factor [28] N=\ Pour chaque protocole, nous veillerons à justifier l'ensemble des paramètres de l'acquisition. D faut également prêter attention à la bande passante du récepteur (FW) vis-à-vis de celle de l'acquisition (SW). H faut aussi surveiller le temps d'acquisition de chaque signal qui est défini par la relation [29] sachant que la relation [29] est imperative. Tacq = TD/SW [29] Remarques valables pour toutes les séquences entrelacées hétéronucléaire : Le paramètre acq_size[l] ne correspond pas au nombre de pas d'encodage de phase de l'image. C'est la valeur imposée dans les fichiers de gradients qui détermine le nombre de lignes de l'image. On doit toujours programmer ACQ_phase_factor = acq_size[l] bien que nous ne soyons parfois qu'en mode spectroscopie. Pour chaque protocole, il a été développé une automation dédiée qui permet, en saisissant une commande spécifique au clavier, de rentrer automatiquement tous les paramètres nécessaires à l'acquisition. La saisie automatique et instantanée de tous les paramètres réduit notablement la durée du protocole et évite les erreurs de paramétrage. 120

128 5. VALIDATION DES DIFFÉRENTES SEQUENCES ENTRELACÉES a) Optimisation des séquences sur fantôme La validation étape par étape des séquences a tenu une place importante dans l'exécution de nos travaux. Nous avons confectionné des fantômes dédiés dont les caractéristiques et les concentrations des metabolites présents étaient voisines de celles de nos futures applications. (1) Les séquences homonucléaires Les séquences faisant appel uniquement au noyau proton, devant mettre en évidence le signal de désoxymyoglobine ainsi qu'une coupe de jambe, ont été mises au point sur un fantôme contenant 0,5 mmol/1 de porphyrine (Aldrich, Milwaukee, Wi) dissoute dans du chloroforme, dont la forme imitait celle d'une jambe. La porphyrine a une résonance analogue à celle du proton N-ô de l'histidine de la myoglobine. Les déplacements chimiques 5 sont liés par : ÔCHCL3 " Ôporphyrine = 8H20 " Sdésoxymyoglobine (2) Les séquences hétéronucléaires Elles ont été mises au point et testées sur un fantôme plus complexe constitué d'un récipient bicompartimental. Une sphère interne, remplie de porphyrine dissoute dans du chloroforme, est plongée dans un bêcher extérieur de forme cylindrique qui contient de l'isopropanol - dont la structure moléculaire très voisine de celle du lactate fait également apparaître un doublet à 1,33 ppm (400 Hz) - mélangé à une solution de phosphate obtenue en dissolvant du K2HPO4 dans de l'eau distillée. Les diverses solutions de porphyrine, d'isopropanol et de phosphate ont été préparées à des concentrations du même ordre de grandeur que celles des metabolites dans le muscle. Ceci a permis d'estimer in vitro le rapport S/B des différentes résonances exploitées par la suite in vivo. Cette phase a contribué de façon non négligeable à la mise au point des séquences : par exemple, il est arrivé que le rapport S/B insuffisant de la résonance phosphate dû à des 121

129 impulsions trop rapprochées conduise à un remaniement complet de la séquence, certains paramètres expérimentaux étant interdépendants. Ces fantômes ont également été utilisés pour vérifier que les images acquises dans le mode entrelacé étaient strictement superposables à celles collectées dans le mode conventionnel. Dans ces deux modes, avec un jeu de paramètres expérimentaux identiques, les résonances de porphyrine ou d'isopropanol, qui imitent respectivement celles de désoxymyoglobine et de lactate, ont été comparées tout comme le pic du phosphate. Conclusion intermédiaire : Tous les spectres acquis in vitro ont témoigné d'une parfaite reproductibilité et stabilité en terme de rapport S/B. La démarche de développement, optimisation, évaluation et comparaison sur fantôme a été mise en oeuvre pour toutes les séquences entrelacées homonucléaires et hétéronucléaires avant d'envisager leur utilisation pour des explorations humaines. b) Calcul du dépôt de chaleur en RMN Les ondes électromagnétiques dont la fréquence dépasse le MHz ont des effets physiques sur les tissus qui se manifestent essentiellement par un échauffement. Due à l'effet Joule des courants induits dans les tissus, la quantité d'énergie apportée par seconde et par unité de masse de tissu (W.kg' 1 ) porte le nom de puissance spécifique absorbée (PSA ou SAR en anglais). La puissance radiative de l'onde varie comme le carré de son amplitude Bi. A durée d'application fixe de l'impulsion RF, l'intensité de Bi permet d'ajuster l'angle a de bascule. La proportion d'énergie absorbée sur énergie émise dépend également de la fréquence d'irradiation des tissus. Le facteur final important est l'élévation thermique qu'elle engendre. La vascularisation joue un rôle important dans le refroidissement des organes. Pour ce qui nous concerne, le muscle supporte bien une élévation de température. Par exemple, la puissance dissipée par le métabolisme au repos est de 1,5 W/Kg pouvant s'élever jusqu'à 15 W/Kg lors d'efforts musculaires intenses. H faut savoir qu'une PSA de 4W/Kg appliquée pendant 10 min fait monter la température de 0,7 C (Bottomley et al, 1985). Nos séquences, faisant appel à des impulsions rapprochées, nous ont conduit à calculer l'élévation de température pour la séquence la plus contraignante en terme d'impulsions RF, il s'agit de la séquence " PerfMyoPhos " que nous verrons par la suite. 122

130 Formule théorique permettant de déterminer la PSA moyenne : * vide *Z enchuge V" 1 "é mise' P PSA moyenne = x x Q vide i=l V objet TR où Q est le facteur de qualité de la sonde (mesurable hors aimant), V ob j e t est le volume de l'objet, p est la durée de l'impulsion RF et N le nombre d'impulsions de la séquence. Estimation de la PSA à partir des données expérimentales : Pour un amplificateur de puissance de 1 kw en proton et 4 KW en phosphore, l'atténuation des différentes impulsions de la séquence correspond à des niveaux d'émission de 13, 350 et 400 W pour les impulsions d'imagerie, de spectroscopie proton et de spectroscopie phosphore. Les durées, p, des impulsions associées sont de 1 ms, 750 (is et 200 fis. D'après les mesures effectuées sur analyseur de réseau, les facteurs de qualité de la sonde à vide puis chargée par une jambe pour les sondes Helmholtz et surface phosphore sont 124, 56, 360 et 138 respectivement. On considère le volume du muscle contenu dans la sonde Helmholtz à 3 litres soit environ 3 kg alors que celui en regard de la sonde de surface phosphore est estimé à 1 kg. Le module proton de la séquence est répété toutes les 14 ms alors que celui du phosphore n'est réitéré que toutes les secondes, on obtient donc : flxl x350^ ^0.20x400^ Ï - * l J^i h^ï^*kïï5^ Pour simplifier le calcul, nous avons considéré les impulsions protons rectangulaires alors qu'elles sont en réalité gaussiennes. La PSA réelle est donc inférieure à la PSA moyenne calculée. Le dépôt de chaleur doit rester inférieur au seuil fixé par la FDA (Federal Drug Administration). Cette norme donne pour limite supérieure au PSA, 8 W/kg en tout point de l'organisme ; 0,4 sur l'ensemble du corps et 3,2 sur le cerveau pour une durée d'exposition d'environ 10 minutes. Le but de cette norme est d'être certain que même en l'absence d'évacuation de la chaleur aucun tissu ne subira une élévation de température supérieure à 1 C. Le dépôt de chaleur provoqué par l'exécution de la séquence la plus exigeante, qui dure jusqu'à 6 min, respecte les normes de sécurité, tout comme les autres séquences. 123

131 Nous allons maintenant aborder les développements d'ordre technique tels que la construction des sondes, la conception de l'interface électronique. Nous présentons également la mise en oeuvre ou l'optimisation d'outils non RMN nécessaires à la réalisation du protocole tels que le support de sondes, l'ergomètre, les gradients de surface et le dispositif de gonflage et dégonflage rapide d'un sphygmomanomètre. 124

132 E. RAPPORT SIGNAL SUR BRUIT ET SONDES RMN Les sondes constituent un élément particulièrement délicat de la chaîne d'émission réception car elles contribuent de façon très sensible au rapport signal sur bruit (S/B). 1. LE RAPPORT SIGNAL SUR BRUIT EN RMN Deux signaux électriques s'ajoutent aux bornes d'une sonde RMN : le signal, porteur de l'information recherchée et le bruit qui tend à masquer le signal. a) Le signal RMN Le signal RMN est de la forme : 5(0 = A exp(-r IT 2 *)- sin(û) 0 t + q>) avec A = M Q - -y B o sin0 Ve et û) o = yb Q où Bi est le champ produit par le courant i parcourant la bobine, Ve le volume de l'échantillon, 6 l'angle de bascule de l'aimantation, y le rapport gyromagnétique du noyau et Mo l'aimantation d'équilibre. En théorie, le signal RMN est proportionnel au carré du champ magnétique statique Bo. b) Le bruit Une bobine placée dans un aimant en contact avec un patient subit des pertes qui correspondent à quatre types de bruit : - Les pertes résistives proviennent d'une dissipation thermique dans la sonde due à un conducteur imparfait qui possède une certaine résistance électrique. A l'exception de circuits supraconducteurs, elles sont inévitables. - Les pertes magnétiques sont dues au champ B 1 oscillant qui crée des boucles de courant dans le patient et provoque une dissipation par effet Joule. 125

133 - De plus, la distribution de potentiel le long de la sonde entraîne l'apparition d'un champ électrique traversant l'échantillon. Ces pertes diélectriques peuvent être minimisées en réduisant la différence de potentiel aux bornes de la bobine, en répartissant des capacités le long de l'inductance. - Des pertes parasites sont également induites par le couplage entre la sonde et l'environnement (aimant, bobines de gradient). Elles augmentent avec les dimensions de la sonde. On peut les réduire en interposant un écran conducteur entre la sonde et les bobines de gradients. L'utilisation d'une sonde qui crée un champ confiné à l'intérieur de son volume permet de diminuer ce type de pertes. La tension de bruit B t où R symbolise l'ensemble des pertes et FW la bande passante 4 du récepteur s'exprime par la relation [30] 4 : Bt = 74 k b FW R [30] Les pertes résistives de la sonde et les pertes dues à l'échantillon varient respectivement comme -^ B o et Bo 2. Les pertes de l'échantillon sont majoritaires à haut champ. c) Le rapport signal sur bruit Les observations précédentes confirment l'intérêt de travailler à haut champ car le rapport signal sur bruit est directement proportionnel au champ statique Bo- En effet, le signal varie comme le carré du champ alors que le bruit augmente proportionnellement au champ. Le facteur Bi/ i-jr dans l'expression du S/B apprécie «globalement» l'efficacité de la sonde. R symbolise l'ensemble des pertes. La facteur Q traduit l'aptitude de la sonde à stocker de l'énergie. D s'agit du rapport entre l'énergie stockée sous forme magnétique et l'énergie dissipée dans la sonde et dans l'objet. Q doit être le plus élevé possible. La Q =ir 4 Comme nous l'avons mentionné, la largeur de la bande passante du récepteur (FW) est un paramètre important de l'acquisition intervenant au niveau du rapport S/B. 126

134 L'intérêt de ce coefficient est qu'il est facilement mesurable hors de l'aimant, pour la sonde à vide ou chargée par une jambe. En effet, un analyseur de réseau permet en exploitant la méthode de l'onde réfléchie, de visualiser les réglages de l'accord et de l'adaptation de la sonde sur un oscilloscope. Cet analyseur de réseau mesure le facteur de qualité de la sonde, qui est défini par la largeur à mi-hauteur du pic de résonance de la sonde, ou encore en échelle logarithmique, par la largeur de la résonance à - 3 db du maximum. Le facteur de qualité en charge évalue R. 2. DEVELOPPEMENT D'UNE SONDE DE TYPE HELMHOLTZ a) Principe La sonde en configuration Helmholtz est réalisée à l'aide de deux circuits accordés et connectés en série pour obtenir des courants en phase. Ces circuits sont constitués de deux bobines circulaires identiques de rayon R, accordées à la même fréquence F o par une capacité C o. Ces deux bobines sont couplées entre elles et éloignées d'une distance D. Les deux boucles sont parcourues par un courant de même intensité et de même sens produisant un champ fi, orthogonal à l'axe des spires et au champ B o. La meilleure homogénéité du champ B i est obtenue quand la distance D entre les bobines est égale à leur rayon (Pimmel, 1990). b) Caractéristique de notre sonde Une sonde volumique génère des excitations homogènes sur une ou plusieurs coupes d'une jambe. Cette sonde est employée également dans les modules de spectroscopie proton. Elle a été choisie pour sa bonne homogénéité, sa facilité de construction, et la latitude de positionnement du volontaire qui est amené à effectuer un exercice sur un ergomètre. La puissance nécessaire est diminuée en rapprochant les boucles. Nous avons choisi de développer cette bobine avec un écartement variable des deux spires, ajustable à la morphologie du sujet. Le terme employé pour désigner cette bobine devrait être «pseudo- 127

135 Helmholtz» car le terme «Helmholtz» est réservé à la géométrie qui maximise l'homogénéité du champ fi, en respectant un écartement égal au rayon. Pour simplifier la réalisation, le couplage est capacitif. Deux capacités variables dans la gamme 1-25 pf permettent l'accord à 125,1 MHz et l'adaptation à 50 Q.. Les deux spires de rayon 20 cm, parfaitement symétriques, comportent 4 capacités également distribuées le long de l'inductance des 2 boucles. Ces capacités réparties améliorent le facteur de qualité de cette sonde de façon appréciable et diminuent son inductance, sinon trop élevée. L'espacement des boucles se fera dans une plage de 14 à 17 cm en cherchant à améliorer l'efficacité. Q (sonde) Helmholtz avide 124 en charge (mollet) 56 Tableau 1 : Facteurs de qualité de la sonde proton Helmholtz 3. MISE AU POINT D'UNE SONDE DE SURFACE PHOSPHORE A ACCORD INDUCTIF a) Généralités On appelle «antenne de surface» une sonde que l'on pose sur l'échantillon. Elle crée un champ radiofréquence inhomogène, décroissant de la sonde vers l'intérieur de l'échantillon. La sensibilité est limitée en RMN du fait des très faibles niveaux d'énergie mis en jeu. Peu de pertes intrinsèques sont associées à ces sondes de petites tailles et proches de l'échantillon, leur conférant la meilleure sensibilité (rapport Bi/i élevé). Ces sondes de surface sont d'usage très répandu. Cette méthode de localisation, la plus simple et la première historiquement (Ackerman et ai, 1980), explore en effet une profondeur environ égale à son rayon. Par conséquent, la taille de ces sondes de surface doit être étroitement adaptée à celle de l'objet étudié. L'utilisation de ce type de sonde est justifié pour l'exploration d'organes peu profonds tels que les muscles squelettiques. 128

136 b) Caractéristiques de notre sonde La sonde de surface envisagée doit assurer la détection du signal phosphore sur deux groupes de muscles squelettiques qui sont soit la loge postérieure de la jambe (jumeaux et soléaire) soit le loge antérieure (jambier antérieur) (figure 28). Figure 28 : Coupe axiale d'un mollet de volontaire. Coupe de 5 mm, champ de vue de 17 cm x 17 cm, avec une matrice 256 x 256. Les principaux muscles de la jambe.jambier antérieur, soléaire et les jumeaux internes et externes sont indiqués. Les dimensions de la sonde ovale (5 cm x 8 cm) sont adaptées à nos explorations musculaires. Elle sera accordée à 50,65 MHz (à 3 T). Quatre capacités régulièrement réparties le long de l'inductance et un couplage inductif contribueront à l'obtention d'un facteur de qualité élevé. Q Sonde construite (5 cm x 8 cm) Sonde Bruker (5 cm de 0) avide en charge (mollet) Tableau 2 : Facteurs de qualité de 2 sondes de surface en phosphore 129

137 4. CONSTRUCTION D'UNE SONDE DE SURFACE PROTON RECEPTIVE DECOUPLEE PASSIVEMENT a) Introduction Les impératifs de certains protocoles nous ont menés à construire une sonde réceptrice proton. La détection du signal de myoglobine et/ou du lactate issu des groupes musculaires à explorer justifiaient la construction d'une sonde de surface. Cette géométrie assure une détection localisée tout en augmentant la sensibilité, ce qui est important pour mettre en évidence des metabolites de faibles concentrations. Pour certains protocoles, cette sonde proton est superposée à la sonde de surface phosphore afin de collecter les signaux issus du même volume. Placée au plus près du volume à examiner, elle est utilisée en réception uniquement car le champ Bi émis par une sonde de surface n'est pas homogène. On réalise donc l'émission par la sonde volumique proton de type Helmholtz déjà décrite. L'émission et la réception par sondes distinctes supposent l'utilisation quasi-simultanée des deux sondes. Ces deux circuits placés à proximité, interfèrent entre eux, entraînant un couplage qui perturbe les cartes de champ des sondes et qui déplace les fréquences de résonance. Pour pallier à ces inconvénients, un dispositif électronique de découplage doit être inséré. Ce dernier inclut un transistor qui assure un étage d'amplification supplémentaire. b) Réalisation de la sonde proton en réception seule Technique de photogravure : Un circuit ovale de 6 cm x 5 cm est dessiné sur transparent. Ce dessin est ensuite posé sur une plaque semi-rigide de circuit imprimé sur laquelle a été préalablement déposé une couche régulière de vernis photosensible. Après séchage, l'ensemble est introduit dans un appareil à ultraviolet pendant 4 minutes pour être révélé par les rayonnements. La plaque de cuivre révélée est déposée quelques secondes dans un bain de soude caustique afin de supprimer le vernis insolé, puis plongée dans une solution de perchlorure de fer pour supprimer le cuivre superflu entourant le circuit dessiné. Enfin, l'immersion de ce circuit en cuivre dans une solution d'argent permet un dépôt d'argent pur de 2 mm très adhérent et suffisant pour améliorer la conduction du courant, assurer une bonne protection et faciliter les soudures. Une interruption est prévue dans le circuit, afin d'introduire une capacité variable qui permettra en début de session expérimentale de réaliser l'adaptation de la sonde en fonction de l'échantillon. 130

138 c) Principe de fonctionnement du découplage passif Cette sonde de détection doit comporter un dispositif de découplage afin de ne pas provoquer des perturbations du champ B, lors de l'impulsion RF destinée à la sonde d'émission, en l'occurrence la sonde Helmholtz. Rappel : A l'émission, il est important que l'impédance de la sonde.oit de 50 Q. pour transmettre au maximum l'énergie à l'échantillon (adaptation d'impédance : Z sortie de l'amplificateur = Z entrée de la sonde). A la réception, cette contrainte n'est pas aussi stricte, puisque tout écart par rapport à cette impédance induit une perte de transmission du signal RMN mais également du bruit. Cependant, il vaut mieux être également adapté à la réception car les différents étages d'entrée des préamplificateurs l'imposent le plus souvent, minimisant ainsi la dégradation du rapport S/B. Cette sonde est seulement constituée d'une inductance en série avec la résistance propre du circuit, et d'une capacité variable en parallèle pour réaliser l'accord. Son impédance est grande. Aucun dispositif d'adaptation n'est à prévoir. Nous verrons par la suite que l'impédance de sortie du montage constitué par cette sonde élémentaire et son préamplificateur associé, n'est autre que la résistance intrinsèque du transistor à effet de champ utilisé. En présence de deux sondes différentes pour l'émission et la réception, si le couplage entre ces deux sondes est important, chaque tension générée dans la sonde d'émission induit un courant dans la sonde de réception. Dans notre configuration, les deux sondes protons sont perpendiculaires entre elles, ce qui induit un découplage primaire géométrique : la surface de la sonde réceptrice est à peu près parallèle au Bi émis, le flux induit est alors négligeable. De plus, l'impédance propre de la petite sonde de réception est grande, le courant induit qui y circule est très faible et ne perturbe que très peu le champ Bi émis dans la sonde volumique. A la réception, le signal RMN induit dans la bobine de détection est de l'ordre de quelques micro volts. Le préamplificateur comporte à son entrée une série de diodes tête-bêche afin de supprimer d'éventuels voltages importants qui peuvent apparaître lors d'un mauvais découplage. Dans notre montage, les diodes tête-bêche protègent le transistor à effet de champ associé. Ce dernier a pour but de préamplifier le signal et de réaliser l'adaptation d'impédance. Le choix des diodes est primordial, elles doivent être rapides pour protéger instantanément le 131

139 transistor et doivent avoir de plus une capacité parasite très faible, inférieure à lpf, afin de ne pas perturber l'impédance totale du montage. H faudrait sinon ajouter des inductances de compensation, sources de pertes résistives supplémentaires. Lors de l'émission qui concerne la sonde Helmholtz, le découplage passif généré par le niveau d'impédance de la sonde élémentaire vient seconder le découplage naturel dû au positionnement des sondes entre elles. Réalisation du circuit de préamplification Un transistor à effet de champ (FET: Field Effect Transistor), utilisé pour ses performances à haute fréquence a été couplé à cette sonde élémentaire. Le FET est un composant actif à trois électrodes : la Source (S), le Drain (D) et le Gate (G). Le FET fait appel à une tension appliquée sur son Gate pour commander le courant qui circule entre l'émetteur et le collecteur. Ce transistor transforme l'impédance imaginaire de la sonde en impédance réelle pour obtenir une impédance correcte (idéalement 50 2) au niveau du préamplificateur. La caractéristique essentielle du FET est sa transductance ou conductance mutuelle, notée Gm. C'est le rapport entre la variation du courant de sortie et la variation de la tension d'entrée qui l'a provoquée (Gm = AIs/AVe). Sa connaissance permet de calculer le réseau de polarisation et le gain b de l'étage d'amplification. Schéma statique du boîtier : VDD=3V L = 22 uh Vers la sonde Ci =. 1 nf lnf Vers le préamplificateur Is Ve 1M ltc 2 =lnf Vs Figure 29 : Schéma électronique du circuit de découplage et de préamplification de la sonde élémentaire de surface en proton pour la réception uniquement. 132

140 Calcul du réseau de polarisation : La chute de tension aux bornes de la résistance R2 produit la tension de polarisation nécessaire pour un fonctionnement en amplification linéaire ; en pratique et pour éviter l'effet de contre réaction en alternatif, on connecte en parallèle sur la résistance de source un condensateur de découplage C 2. La résistance de 1 MW participe également à la polarisation du transistor. Un compromis est à réaliser sur la valeur de cette résistance, elle ne doit être ni trop petite ni trop grande pour ne pas dégrader le facteur de qualité et avoir une bonne immunité au bruit. Les spécifications du constructeur assurent un bruit intrinsèque minimal du transistor à 20 ma. Une pile de 3 V alimente le transistor. La tension de sortie Vs du transistor doit être égale à VDD/2 soit 1,5 V pour maximiser la dynamique du signal sans écrêter. Rl=Vs/i A.N:R1=1,5/O,O2=75Q On a pris en réalité 68 Q comme valeur de résistance pour RI. Etude du régime dynamique : La tension Vgs doit être négative pour que le transistor à effet de champ, de type N, conduise. De plus, une inductance doit être ajoutée au circuit afin de compenser le résiduel capacitif, causé par les diverses capacités des diodes ou capacités parasites. Les relations de tension du circuit donnent : Vgs=Ve-IdxR2 La tension Ve, tension d'entrée de ce montage correspond à la tension décelée aux bornes de la sonde, directement branchée à ce niveau. Nous savons que le signal induit une tension de l'ordre de quelques microvolts. Supposons donc Ve=0. On obtient : Vgs=-IdxR2 Or par définition, Id=VgsxGm d'oùr2=l/gm. Gm est donné par les caractéristiques du transistor, le constructeur fournit une valeur de 62mS. Suivant les valeurs de résistances disponibles, on a pris R2=22 Cl. En fonctionnement dynamique, la capacité est équivalente à un court-circuit et l'inductance (L) à un circuit ouvert. Les condensateurs suppriment les composantes continues. La self, en s'interposant entre la pile et la résistance RI, empêche tout signal de haute fréquence (HF) de retourner à la pile (circuit ouvert). Comme la tension d'entrée Ve est inférieure à la tension de seuil des diodes (0,6V), la capacité Ci est un court-circuit. 133

141 Ve t gs G D t R* Vs Figure 30 : Schéma dynamique équivalent du transistor à effet de champ. Dans ce montage dynamique : Id=Vs/Rds et rappelons Id=GmxVgs Donc Vs=Rds x Gm xvgs Or, Ve=Vgs dans cette configuration D'où Vs/Ve=GmxRds =(3 (gain du préamplification de l'étage) avec Gm=62 ms et Rds=l 10 Q P = 0,062x110 = 6,82. Le facteur d'amplification de ce montage est donc de 6,8 d'après les spécifications du constructeur. En pratique, si on connecte cette sonde sur l'analyseur de réseau, la résonance induite à la fréquence proton présente un maximum de 17 db, ce qui correspond au cahier des charges du constructeurs (20 log (6,8)=17 db). En dynamique, l'impédance de sortie de ce montage équivaut à : Vs/Id=Rds=110 l Cette impédance de sortie est définie par les spécifications du transistor. En pratique, cette valeur d'impédance est présentée à la chaîne de réception. Idéalement on aurait souhaité une valeur très proche de 50 Cl afin de minimiser les pertes du rapport S/B. Il est possible d'ajouter en parallèle une résistance pour arriver à l'impédance optimale. Cependant, cette alternative engendre inévitablement des pertes résistives. 134

142 F. CONCEPTION DE L'INTERFACE ELECTRONIQUE L'enregistrement simultané de paramètres métaboliques et hémodynamiques va permettre de mieux comprendre les mécanismes d'interaction entre les différentes variables physiologiques. Le potentiel multiparamétrique de la RMN laisse envisager une mesure concomitante d'un grand nombre de déterminants physiologiques. Une modification en profondeur de notre système a été nécessaire, tant au plan informatique qu'au plan électronique dans le but d'intercaler, à haute résolution temporelle, des acquisitions dynamiques d'imagerie et de spectroscopie hétéronucléaire. H est ainsi essentiel de présenter la structure de notre spectromètre/imageur afin d'en connaître précisément le fonctionnement et les possibilités d'origine offertes par le constructeur. Ceci facilite la compréhension et l'appréciation des évolutions que nous avons été amenées à effectuer afin de récolter des acquisitions hétéronucléaires entrelacées. 1. STRUCTURE DE NOTRE SPECTROMETRE/IMAGEUR Cage de. Faraday Système de champs magnétiques : (champ statique B o, bobines de compensation et de gradients) ; antenne d'émission antenne de réception patient Alimentation des bobines de gradients émission réception Spectromètre Système informatique 1 Console Synthétiseur 1 Figure 31 : Schéma de principe de la structure du spectromètre à 3 Tesla. Le CAN désigne le convertisseur analogique-numérique 135

143 La figure 31 montre la structure générale de notre imageur/spectromètre Bruker à 3 Tesla. H est composé de quatre modules principaux : un aimant, des bobinages de gradients de champs magnétiques, un spectromètre RMN, un ensemble de sondes électromagnétiques pour l'excitation et la réception du signal, un système de modulation/démodulation et l'informatique de calcul. Nous ne reviendrons pas sur les sondes électromagnétiques. Nous ne détaillerons pas le champ magnétique statique BQ, ni les gradients de champs. Impulsion Synthétiseur FI Triggeuri bfl Impulsion Modulateur FI chaîne d'émisssion Ampli Intech 0H/ 19 F) Synthétiseur F2 bf2 Modulateur F2 Ampli ENI (WP) chaîne de réception Récepteur 2nd étage : sélection et amplification o préampli 13 C : ' bfl préampli 31 P : A B préampli i i CAN (BC132) Système informatique (X32) Figure 32 : Synoptique simplifié du spectromètre en configuration standard. 136

144 Le spectromètre, dont le synoptique simplifié est représenté figure 32, est constitué d'un émetteur et d'un récepteur. Il effectue alternativement l'émission d'une impulsion RF de champ B x puis la détection du signal de précession libre émis par le noyau observé. Sa fréquence de travail est délivrée par le synthétiseur. L'émetteur est constitué de deux générateurs d'impulsions RF de puissance réglable, permettant d'induire un champ B x : - L'émetteur Intech fonctionne entre 110 et 130 MHz pour les noyaux hydrogènes et fluors, fournissant des impulsions RF de puissance maximale de 1 KW. - L'émetteur ENI dispose d'une bande passante large (20 à 90 MHz) pour les noyaux X (phosphore et carbone) et fournit une puissance maximale de 4 KW. La chaîne de réception regroupe : - un préamplificateur avec un filtre RF sélectionnant le noyau étudié, - un deuxième étage d'amplification avec sélection de l'amplificateur parmi quatre ( 1 H, 31 P, 13 C et 'H-HP pour haute puissance), - un démodulateur synchrone à deux voies en quadrature, de fréquence ajustable, qui permet de restituer sous forme complexe les composantes de l'aimantation tournante, - le filtre FW, - un étage d'atténuation du signal afin d'utiliser au mieux la dynamique du convertisseur analogique-numérique (CAN) : l'expérimentateur doit régler le gain Rg du récepteur. Les deux signaux obtenus à la sortie du récepteur sont envoyés au CAN pour être numérisés. Le système informatique est organisé autour d'un calculateur 32 bits (X32). H effectue à l'aide du logiciel associé, le contrôle automatique de l'acquisition, la visualisation et la manipulation des signaux et des images, le traitement des données. Un séquenceur assure l'enchaînement précis de tous les événements de la session expérimentale : pilotage du synthétiseur, émissions RF, commutations des gradients, déclenchement du CAN, éblouissement du récepteur. Le signal est échantillonné à l'aide d'un seul convertisseur 32 bits (BC132) avec une fréquence d'échantillonnage maximale de 200 KHz. Selon les options de reconstruction, les données peuvent être envoyées à un processeur qui effectue la transformation de Fourier puis elles sont stockées sur un disque dur de 1 Go. 137

145 Nous venons de souligner que les circuits d'émission et de réception font tous deux appel à des amplificateurs. La sélectivité fréquentielle des étages d'amplification a requis le développement de l'interface pour réaliser la sélection de l'amplificateur en fonction du noyau. En effet, les noyaux les plus utilisés en RMN sont le proton, le fluor, le carbone et le phosphore. Leurs fréquences respectives sont 125,12; 117,6; 31,4 et 50,65 MHz pour un champ magnétique de 3 Tesla. Ces données nous permettent de regrouper les noyaux selon leur fréquence de résonance «basse» ou «élevée». Pour optimiser les performances (gain et rapport S/B) à ces fréquences élevées, les circuits électroniques des amplificateurs ont recours à des éléments accordés. L'efficacité optimale de ces amplificateurs est ainsi déterminée à une fréquence de travail donnée et sur une bande passante plus ou moins étroite. En mode standard, la sélection des canaux d'émission et de réception est opérée par l'expérimentateur au niveau du boîtier de commande spécialisé. Au niveau informatique, l'expérimentateur sélectionne son protocole (différentes séquences d'imagerie possible, spectroscopie simple ou localisée etc.,...). H a alors accès sur la console au fichier de paramètres «ACQP» qui permettent d'attribuer toutes les valeurs des paramètres de l'acquisition. Lors de la définition du protocole dans les «ACQP», les fréquences d'excitation et d'observation (à un offset près) sont proposées lors de la sélection du noyau. L'aiguillage des voies électroniques à partir du boîtier de commande du pupitre et les paramètres définis dans les «ACQP» ne peuvent en aucun cas être modifiés en cours d'acquisition. 138

146 2. DEFINITION DU CAHIER DES CHARGES DE L'INTERFACE ELECTRONIQUE Le cahier des charges que nous avons défini regroupe les considérations suivantes : - Possibilité de commuter entre les deux modes : mode standard et mode entrelaçage, - Génération des impulsions RF par un synthétiseur de fréquence sur un canal unique pour synchroniser la phase de tous les signaux ; le second canal d'émission (bf2) reste, selon la modalité du constructeur, réservé aux impulsions du type NOE ou de découplage, - Gestion de la commutation des amplificateurs de l'excitation RF suivant le type de noyau (Intech ou ENI), - Transmission de l'impulsion RF vers la sonde émettrice appropriée, - Sélection instantanée de la sonde réceptrice, - Routage du signal RMN vers un des quatre préamplificateurs sélectifs pour une amplification optimale, - Réglage du gain de réception (Rg) afin d'obtenir une conversion analogique-numérique optimale. 3. REALISATION DE L'INTERFACE L'interface électronique, comme illustré sur la figure 33, est physiquement placée entre les commutateurs des différentes voies électroniques et le boîtier de commande du pupitre. Dans le circuit de l'interface un commutateur manuel permet de sélectionner le mode normal ou le mode entrelaçage. La position standard rend l'interface inopérante. L'interface électronique développée permet de court-circuiter le boîtier de commande du pupitre et ce sont alors les instructions présentes dans le module informatique au sein des séquences RMN qui doivent remplir son rôle. Au cours d'une session expérimentale hétéronucléaire, il faut donc que chaque instruction corresponde spécifiquement à l'exécution d'une ou de plusieurs commutations de la chaîne électronique du spectromètre. H faut non seulement effectuer la commutation instantanée des sondes en fonction du noyau, du mode émission ou détection, mais aussi sélectionner les voies correspondant à l'amplificateur et au préamplificateur dédiés. 139

147 Gain Référence FI Récepteur : Module : ul2 : informati( lue ui3 JT Interface 1 électronique r Boîtier de commande t J fc> o 1 1 i - Accord Sondes 1 BF1 r _y X Intech U^ Amplificateur IIF ENI L^ *_ L --i t>1 i> Yj yj*. 31p rvi H "1 lu np Oi Figure 33 : Vue d'ensemble de la structure du spectromètre en présence de l'interface électronique. Dans cette position définie comme «entrelaçage», plusieurs multiplexeurs du circuit de l'interface détaillée en annexe, assurent instantanément les commutations des voies selon les instructions ul2 et ul3 reçues. Ces commandes logiques binaires sont accessibles et programmables par l'utilisateur. a) Les commandes binaires u12 et u13 L'idée originale consiste à associer à chaque ligne d'instruction de la séquence une nouvelle commande qui va opérer à distance les commutations nécessaires. H s'agit, par une logique binaire, de faire véhiculer l'impulsion RF vers la sonde appropriée à l'émission et, en phase de détection, de diriger le signal RMN vers son étage d'amplification. 140

148 Un compteur binaire dans l'interface permet à partir des deux entrées logiques ul2 et ul3 d'offrir quatre sorties que nous exploiterons. La position u 12 est réservée au proton, ul3 au carbone et ul2:ul3 au phosphore. L'absence de ce type de commande à la réception constitue la quatrième voie dont l'utilisation est développée par ailleurs. Remarque : II faut préciser qu'à l'émission les noyaux 31 P et 13 C utiliseront le même amplificateur de puissance (4 KW) alors qu'à la réception, ils ont chacun leur propre circuit d'amplification d'où la nécessité de définir l'instruction ul3. Notre système dispose d'un second synthétiseur sur la voie F2. En première analyse, nous avions envisagé d'émettre les impulsions RF des noyaux X sur cette voie en vue d'une simplification de la réalisation de l'interface. Cependant, à fréquence égale, nous avons observé lors des acquisitions successives un glissement progressif et aléatoire de la phase du canal F2 par rapport à celle de la voie FI, rendant impossible l'accumulation de signaux, leur démodulation étant toujours effectuée en prenant le canal FI comme référence de phase. Ainsi, à l'émission comme à la réception, le canal FI est sélectionné quel que soit le noyau. La fréquence du spectromètre est alors modifiée instantanément en changeant simplement la fréquence du synthétiseur au niveau de la voie FI, par application d'un offset ne pouvant pas dépasser 40 MHz. La cohérence de phase obtenue entre les signaux acquis successivement offre par conséquent la possibilité de les additionner si nécessaire. Le canal F2 reste disponible pour les excitations de découplage ou du type NOE. A l'émission, l'ordre logique permet de sélectionner un des deux amplificateurs sélectifs de l'onde RF (l'intech ou ENI). En outre, la sélection alternée de la sonde d'émission ou de réception est opérée en temps réel avec les mêmes commandes. Au niveau de la chaîne de réception, un parmi les quatre amplificateurs doit être sélectionné. Pour nos applications, la sonde de surface phosphore (ul2:ul3 actif) est utilisée à la fois en émission et en réception. Pour ce qui concerne la sonde de réception proton, la position ul2 validée assure la détection du signal par la sonde volumique de type Helmholtz. En l'absence d'information à ce niveau, le signal est recueilli par la sonde de surface proton découplée passivement reliée au préamplificateur haute puissance ('H-HP). Le gain du 141

149 récepteur est fixé dans le fichier de paramètres d'acquisition de l'ordinateur. Une amplification supplémentaire de 20 db peut ainsi être obtenue entre le signal phosphore et le signal proton de manière à optimiser la résolution digitale du CAN. b) Isolation des masses entre l'informatique et l'électronique de réception Notre spectromètre est conçu afin d'éviter toute mise en commun des masses des modules informatiques et électroniques de la chaîne de réception. Cette séparation de masses empêche de rapporter le bruit informatique sur la partie électronique du circuit de réception, ce qui dégraderait le rapport signal sur bruit des acquisitions. Pour la conception de cette interface, nous avons souligné la nécessité d'une relation de cause à effet entre les instructions présentes dans le module informatique (ordres logiques au sein de la séquence RMN) et la sélection des voies électroniques par commutation instantanée. Dans cette optique d'isolation des masses entre les deux entités, l'envoi des informations permettant l'attribution des amplificateurs et des préamplificateurs est réalisée par couplage optique. Un optocoupleur juxtapose une diode luminescente et un transistor. La diode est reliée à la partie informatique alors que le transistor est connecté au module électronique. Le transfert de l'information se fait par activation d'une position logique qui fait conduire la diode. Elle devient alors luminescente. L'intensité lumineuse reçue à la base du transistor le rend passant, véhiculant ainsi le signal entre les deux modules physiques sans connexion directe. Le circuit ainsi que le principe détaillé du fonctionnement de l'interface sont détaillés dans l'annexe l 5. c) Installation d'un commutateur pour alterner les détecteurs en proton Comme nous l'avons vu, l'instruction ul2 est réservée à la réception en sonde volumique alors que l'absence de cette commande rend la sonde de surface active pour une détection localisée. Selon les objectifs du protocole, cette démarche permet de recueillir instantanément à la réception le signal proton issu soit de la sonde volumique pour les données d'imagerie, soit de la sonde de surface pour collecter les signaux en regard du groupe musculaire impliqué lors d'un effort. Pour cela, nous avons eu recours aux deux 5 Se reporter à la Figure 1A en annexe. 142

150 préamplificateurs protons, la sonde volumique étant connectée sur le standard alors que la sonde de surface est branchée sur le préamplificateur proton haute puissance ('H-HP). Ce dernier ayant été quasiment hors service pendant un semestre, une alternative a donc du être mise en place à ce moment. Nous avons acheté un commutateur rapide (Elhyte/JWF, Indianapolis, In) qui permet de brancher les deux sondes à la fois sur le même préamplificateur proton classique. Ce commutateur est lui même également commandé par l'interface et utilise la logique développée pour alterner la détection des signaux entre les deux sondes et selon les instructions de la séquence. Cependant, nous avons été confrontés à des difficultés techniques lors des tests sur fantôme de ce commutateur. Quand deux sondes protons utilisables en émission/réception étaient connectées, en dépit du phénomène de couplage, ce commutateur alternait comme souhaité la réception sur une sonde ou sur l'autre. En revanche, quand on utilisait la sonde proton réceptrice comportant un circuit de découplage, le transistor était endommagé au delà d'un certain nombre aléatoire d'acquisitions. Plusieurs pistes ont été scrutées pour essayer de comprendre et de résoudre ce problème. Un courant de fuite non négligeable à l'émission se dirigeant vers la sonde de réception a été incriminé. Ce courant pourrait provenir du temps de commutation trop long des diodes insérées dans le montage de la sonde réceptrice. De trop fortes puissances alors acheminées vers cette sonde destinée à ne capter en réception que de très faibles tensions, pourraient ainsi être à l'origine de la détérioration du transistor. On peut cependant se demander pourquoi un certain nombre d'acquisitions était nécessaire. Nous avons cherché à remplacer nos diodes par des diodes ultra-rapides également amagnétiques. Ces diodes auraient possédé une capacité parasite intrinsèque trop importante (100 pf au lieu de 1 pf actuellement) qui aurait réduit significativement l'impédance de la sonde, la rendant inutilisable. Rappelons que le principe de cette sonde repose sur une impédance purement imaginaire très élevée. Des recherches sont toujours en cours pour résoudre cette difficulté. Ainsi, pour la plupart des acquisitions alternant la réception des signaux en proton entre l'antenne de surface et la sonde Helmholtz, nous avons été contraints de brancher chaque sonde sur un préamplificateur proton : le préamplificateur haute puissance alors opérationnel et le préamplificateur proton standard. 143

151 4. VALIDATION DE L'INTERFACE ÉLECTRONIQUE H s'agit désormais d'apporter la preuve du parfait fonctionnement de cette interface électronique. La validation sur fantôme de ce dispositif, constituait un préalable indispensable à toutes acquisitions ultérieures sur l'homme. Nous avons comparé pour tous les types de signaux, avec des paramètres expérimentaux strictement identiques, les acquisitions en mode normal des acquisitions en mode entrelacé. Rappelons que la réalisation de l'interface a progressé de pair avec la mise au point de la première séquence entrelacée hétéronucléaire. Nous ne détaillons pas les longues étapes de validation de cette interface ni les données chiffrées de tous les rapports S/B obtenus dans chaque configuration, pour chaque metabolite et pour chaque séquence. Signalons simplement qu'aucune différence du niveau de signal ou de bruit n'a été constatée sur les images, sur les spectres en proton du pic d'eau, du pic de myoglobine, du pic de lactate, ou sur les spectres en phosphore. Ces résultats jumeaux ont validé ce nouveau mode d'acquisition qui n'introduisait nullement une dégradation du signal ou une hausse du niveau de bruit, ce qui a logiquement autorisé le passage à l'application humaine. 144

152 G.MATERIEL NECESSAIRE A LA REALISATION DES PROTOCOLES 1. L'ERGOMETRE Les exercices ont été réalisés sur un ergomètre amagnétique développé à l'université de Gand en Belgique. Cet ergomètre, illustré figure 34, a été conçu pour le travail des membres inférieurs pouvant impliquer deux types de groupes musculaires de la jambe : le triceps sural en poussant la pédale de l'ergomètre au cours de flexions plantaires, et le jambier antérieur en tirant la pédale au cours de flexions dorsales du pied. Figure 34 : Représentation schématique de l'ergomètre pneumatique amagnétique. Le résistance de la pédale est adptée en régulant la presion du gaz injecté dans l'enceinte oùse trouve le piston. L'ergomètre est constitué d'une pédale connectée à un cylindre rempli d'air comprimé, d'un tuyau d'air branché sur un régulateur de pression, de senseurs de force et de déplacement et d'une interface électronique reliée à un micro-ordinateur permettant de rassembler les divers signaux. Cet ergomètre, entièrement piloté par ordinateur, facile à mettre en place, est ajustable à la morphologie du volontaire. La pédale possède un axe de rotation situé au niveau de calcaneum. On peut aussi la positionner au repos selon l'angle souhaité et choisir sa course. La force résistante de l'ergomètre est générée par un système pneumatique qui est couplé à une source extérieure d'air comprimé régulé électroniquement. Au cours de l'exercice, la pression effective constituée par la pression différentielle entre les deux chambres du cylindre (PHaut-PBas) se situe entre 0 et 5 bars. Cette pression effective est choisie par l'expérimentateur selon le type de protocole (exercice aérobie ou anaérobie), la masse musculaire impliquée et l'intensité du travail demandé au volontaire (pourcentage de la force maximale volontaire de contraction FMV). Pour des exercices progressifs, la durée et l'amplitude de chaque incrément sont aussi définis par l'expérimentateur et gérés par ordinateur tout au long de l'expérience. La connaissance de la section du piston du cylindre (27 mm de 0) et de la valeur de la pression différentielle (PHaut-PBas) permet de calculer la force appliquée sur la pédale, force 145

153 exprimée en Newton. La résistance imposée sur la pédale est fonction de la pression différentielle. Un incrément de 1 bar correspond à une augmentation de 57 N de la résistance. Les pressions Phaut et Peas sont continuellement mesurées par un transducteur de pression connecté aux deux chambres, alors qu'un capteur linéaire de déplacement enregistre la position (x) de la pédale. Les deux mesures de pression et de déplacement (dx) sont converties en signaux électriques et envoyées après amplification à une carte d'acquisition des données qui échantillonne les signaux en permanence. Un dispositif électronique réalise la synchronisation de ces deux types de signaux. Le travail instantané (dw = (P Hau t-pbas)-s.dx/dt.dt) et la puissance effective (P = W/dt) produite à chaque mouvement de pédale sont ainsi calculés en continu. Le système d'acquisition des données mécaniques (force et déplacement) possède un enregistreur graphique et une interface reliée à l'ordinateur. Il est possible de surveiller en temps réel sur l'ordinateur le bon déroulement de l'exercice, la régularité des contractions dynamiques et la progression du travail cumulatif. L'ergomètre permet non seulement de standardiser l'exercice mais également de recueillir de façon entièrement automatisée le travail total et la puissance effective déployée par le sujet. 2. CONSTRUCTION D'UN SUPPORT DE SONDES EN PLÂTRE Dans l'intention d'installer le sujet le plus confortablement possible avec un dispositif stable et fiable et sans pour cela y consacrer trop de temps, un support amagnétique de sondes a été construit. Ce support permet, tout en s'intégrant au rayon de courbure du lit d'examen, de maintenir l'ensemble des deux voire des trois sondes RMN positionnées autour de la jambe du sujet. Les matériaux amagnétiques étant rares et parfois difficiles à travailler (Plexiglas), du plâtre a été coulé dans un moule en bois en contre-plaqué fin fabriqué pour l'occasion aux dimensions du support souhaité. Ce dispositif, schématisé sur la figure 35 supporte les deux pans de bobinage de la sonde Helmholtz permettant de centrer les boucles de part et d'autre de la partie la plus large du mollet et de placer l'antenne de surface phosphore en regard du triceps sural par exemple. 146

154 La géométrie de ce dispositif a été définie afin de pouvoir coupler l'utilisation du support à celle de l'ergomètre. L'épaisseur du plâtre reposant sur le lit a été prévue pour que, le talon du volontaire reposant sur la pédale de l'ergomètre, le mollet soit ainsi positionné au centre magnétique de l'aimant dans la direction verticale. sonde 1 H support en plâtné support en plâtre. 11 boucles de la sonde Helmholtz 1 H section de mollet sonde 31 P Figure 35 : Coupes axiales et sagittales de l'ensemble du dispositif comprenant le support en plâtre, le mollet du volontaire, les sondes. 3. REALISATION DE GRADIENTS DE SURFACE Crowley et Ackerman (1985) puis Chen et Ackerman (1989) ont décrit le principe et l'application de gradients de champ magnétique générés par un courant électrique circulant dans un bobinage de surface pour supprimer un signal superficiel. Le système se présente comme un tapis souple qui contient un zigzag de fil électrique entre deux surfaces adhésives (figure 36). Le plan du fil conducteur est perpendiculaire au champ principal Bo. Ce tapis, revêtu de matière isolante, est interposé entre la peau et la sonde. Un courant continu de l'ordre de l'ampère, synchronisé aux impulsions RF, est appliqué pendant une période correspondant à la durée de l'impulsion et au délai s'écoulant avant l'ouverture du récepteur. Le gradient de champ magnétique intense créé localement autour des fils détruit la cohérence de phase des spins dans les directions Ox et Oz (By = 0). L'aimantation est détruite sur une épaisseur qui dépend de l'écartement (e) entre les fils, de l'intensité du courant parcourant le bobinage et de la durée d'application du gradient. Cette technique permet de supprimer les tissus à proximité du tapis. Pour les besoins de certains protocoles explorant la jambe, ce gradient de surface est employé pour éliminer le signal issu de la peau et une grande partie des 147

155 lipides des graisses sous-cutanées. Cette technique a été longuement testée dans notre laboratoire (Jehenson et Bloch, 1991). La fabrication et l'utilisation sont simples. Nous avons fabriqué deux tapis de gradients épousant la forme du mollet. Les deux versions se distinguent par l'espacement entre les fils du conducteur afin de choisir au mieux le tapis selon l'épaisseur des tissus adipeux superficiels à éliminer chez le volontaire. B o L X >^ Tapis souple e 1 1! 1 ^> V il^ y *! Figure 36 : Représentation du tapis souple de gradients. : I 4. LE DISPOSITIF DE GONFLAGE ET DÉGONFLAGE RAPIDE DU BRASSARD Pour éviter que le sang ne s'accumule dans le réseau veineux au cours du gonflage du brassard de 0 à 230 torr qui permet d'induire l'ischémie, le temps nécessaire au gonflage doit être le plus court possible. Parallèlement, le temps de dégonflage du brassard jusqu'à la pression souhaitée doit être également rapide. Ainsi, nous avons installé un dispositif de gonflage et dégonflage rapide constitué de deux valves (une entrée et une sortie) (Hokanson, Washington). L'entrée est directement reliée à une bouteille d'azote sous pression qui alimente le brassard par un tuyau de gros calibre (1,5 cm de 0). Sur cette ligne, un manomètre indique la pression du manchon. Cette procédure permet le gonflage du brassard de 0 à 230 torr en moins de 2 secondes. Le dégonflage est opéré par l'expérimentateur qui n'a alors qu'à ouvrir une valve de grand diamètre pour chasser quasi-instantanément l'azote du brassard sur cette même ligne. 148

156 Pour les protocoles d'ischémie envisageant la mesure de perfusion par pléthysmographie RMN, le dégonflage jusqu'à 60 torr est réalisé de la façon suivante : aussitôt après le dégonflage quasi-instantané à 0 torr, le réamorçage immédiat de la valve permet de regonfler la manchette à 60 torr en 2 s. En réalité, nous avons imposé 2 secondes supplémentaires entre la dégonflage à 0 et l'ouverture de la valve d'entrée permettant d'atteindre la nouvelle pression de 60 torr. Cette démarche permet de chasser le sang éventuellement accumulé dans les veines au cours des phases précédentes. Ceci a été réalisé par souci de minimiser les éventuelles erreurs de mesures du débit sanguin par la méthode de pléthysmographie RMN. 149

157 H. METHODOLOGIE DE TRAITEMENT DES DONNEES RMN 1. INTRODUCTION Le traitement des données brutes a été effectué sur une console de travail autonome. Les acquisitions combinant des FDDs hétéronucléaires et des signaux d'imagerie doivent subir un traitement préliminaire, consistant à la redistribution des données dans différents fichiers. Tous les vecteurs ainsi redistribués peuvent ensuite être traités individuellement selon les procédures classiques, comme s'ils avaient été acquis séparément. Nous expliquons la succession de traitements subis par ces données en vue de quantifier les variables physiologiques explorées. En spectroscopie standard, l'échelle de déplacement chimique des résonances dépend du champ magnétique statique, du noyau détecté et de la largeur spectrale de l'acquisition. Dans le cadre de nos acquisitions hétéronucléaires, il peut arriver qu'aucun de ces facteurs ne soit juste. En effet, la fréquence de référence bfl est arbitrairement fixée à une valeur intermédiaire entre la valeur de la fréquence de l'eau en proton et celle de la phosphocréatine en phosphore à 3 Tesla. Ceci s'explique par le fait que les offsets de fréquence (ol) sont limités à 40 MHz sur notre système. L'irradiation et la détection alternées en proton et en phosphore sont donc effectuées en fixant la fréquence bfl à + 90 MHz et en introduisant un offset de + 35 MHz ou de - 40 MHz pour atteindre respectivement le proton et le phosphore. Nous avons découvert par tâtonnement cette limitation des offsets de fréquence car la documentation technique de notre système n'aborde pas cet aspect. A partir du déplacement chimique affiché, on calcule par une règle de trois le facteur de correction et on assigne la bonne fréquence à son pic. 2. DEVELOPPEMENT D'ALGORITHMES DEDIES A LA REDISTRIBUTION DES DONNEES ENTRELACEES Pour chaque session expérimentale, les données brutes entrelacées sont stockées séquentiellement dans un vecteur unique. Elles ne peuvent être traitées en temps réel, vu le volume de données acquis et l'imbrication des diverses composantes. La première étape de 150

158 traitement consiste à redistribuer l'ensemble de l'acquisition dans un certain nombre de vecteurs regroupant chacun des données de même nature. Des automations, incluant des commandes Bruker à l'intérieur d'une structure écrite en langage C, ont ainsi été écrites pour réorganiser tous les vecteurs d'acquisition. Chaque séquence entrelacée possède son automation spécifique. La quantité de fichiers régénérés correspond au nombre de catégories de données collectées. L'automation revient à déplacer un pointeur sur le vecteur d'acquisition. Ce pointeur est défini par sa position et sa taille. Ainsi, à tout instant, en suivant les instructions de l'automation, un pointeur a en mémoire un écho ou un FTD de myoglobine, de lactate ou encore de phosphore. La taille de ce pointeur correspond à un instant précis de la procédure à la taille réelle de l'écho ou d'un des FIDs. Le pointeur va alors écrire son contenu dans le fichier dédié puis va se positionner sur le bloc suivant et ainsi de suite. L'automation définit également pour chaque metabolite, le nombre de FIDs collectés successivement qui doivent être sommés avant d'être stockés dans le fichier correspondant. Pour les metabolites de faibles concentrations, les FIDs sont additionnés à ce niveau grâce à un second pointeur. Si un FID n'est acquis qu'une seule fois par répétition, ce FID sera simplement replacé dans le fichier approprié. Ainsi, prenons comme exemple ce qui est illustré sur la figure 37 avec un vecteur d'acquisition rassemblant des échos d'imagerie, des FIDs en proton de la myoglobine et des FIDs en phosphore. Les échos sont regroupés au sein d'un nouveau vecteur de façon à pouvoir appliquer les procédures classiques de reconstruction d'images. De même, pour une répétition donnée, les n signaux de spectroscopie proton, acquis séquentiellement entre les n échos, sont additionnés en fonction du nombre n de pas d'encodage de phase. Un signal de désoxymyoglobine, cumulant n signaux, est alors stocké dans un second vecteur. Le FID phosphore est quant à lui recopié dans un troisième vecteur. Pour chaque répétition correspondant à un instant précis du processus dynamique, une image est associée à un signal de myoglobine et à un signal phosphore. Dans cet exemple, la résolution temporelle est de une seconde. Pour comprendre la philosophie des automations, si la résolution temporelle l'exigeait, et que le rapport S/B le permettait, nous aurions pu additionner n/2 signaux de myoglobine toutes les 0,5 s. 151

159 Les signaux de myoglobine et de phosphore sont le plus souvent regroupés par répétition. Pour une séquence particulière ayant une résolution temporelle de 15 s, ces signaux dynamiques acquis séquentiellement sont respectivement cumulés, analysés et représentés graphiquement toutes les 1 et 2 secondes. L'automation est facilement modifiable pour atteindre le meilleur compromis entre la résolution temporelle et le nombre d'accumulations (rapport S/B) des divers metabolites. Figure 37 : Illustration de la procédure appliquée aux données brutes entrelacées (un échantillon de l'acquisition est représenté sur le panneau supérieur de la figure). Le vecteur est redistribué en deux fichiers : les échos d'imagerie et les FIDs de spectroscopie (panneau intermédiaire) qui peuvent alors ensuite être reconstruits et analysés selon les procédures et avec les outils standards. 152

160 Les signaux peuvent être également additionnés en cours d'acquisition à l'aide du paramètre NS défini dans les «ACQP». Une boucle de NS accumulations est alors considérée avant le cyclage sur le nombre de répétitions. Dans ce cas, tous les différents types de données subissent les NS accumulations. Prenons l'exemple de la séquence entrelacée «MyoPhos» qui juxtapose 36 signaux de myoglobine et un FID phosphore. Pour chaque répétition, cet ensemble est additionné NS fois. L'automation cumule les 36 signaux protons dans un vecteur et l'isole du signal phosphore, ces deux FTDs étant les résultantes de 36xNS et lxns accumulations respectivement par répétition. Selon les tâches actives sur l'ordinateur et la taille du fichier à redistribuer, l'opération de réorganisation peut durer plus d'une heure et monopolise une place mémoire importante sur le disque dur. En effet, cette redistribution duplique le jeu de données alors que la taille initiale du vecteur acquis est déjà d'environ 200 Mo pour un disque dur de 1 Go. En outre, les signaux de spectroscopie doivent ensuite être traités isolément et pour cela une autre automation est lancée afin de redécouper les NR répétitions de l'acquisition en NR fichiers individuels. De ce fait, les données spectroscopiques sont triplées. Nous verrons par la suite comment faire ressortir de ces données brutes les informations physiologiques quantitatives qui vont nous permettent d'établir les corrélations. 153

161 3. TRAITEMENT DES IMAGES DE PLETHYSMOGRAPHIE L'augmentation dv du volume V du segment de membre est proportionnel à l'apport artériel de sang. La perfusion est la dérivée première de l'augmentation relative du volume par rapport au temps, à l'instant de l'interruption veineuse. Si on exprime les variations en pourcentage, la perfusion est définie en ml de sang par 100 g de tissu et par minute, en tenant compte du facteur densité. L'objectif est de déterminer l'évolution de la surface de la coupe imagée en fonction du temps, pendant la manoeuvre pléthysmographique mise en oeuvre en hyperémie réactionnelle ou au repos. A un instant donné, la section de la jambe d'épaisseur fixe est déterminée par comptage des voxels impliqués. La méthode du double masquage La procédure consiste à dessiner manuellement un double masque, l'un à l'intérieur du mollet approximativement à l'interface entre le muscle et les graisses sous cutanées et l'autre à l'extérieur, comme représenté sur la figure 38. Figure 38 : Analyse des images de plethysmographie. Un exemple de la procédure du double masque est montrée. Les deux tracés (en noir et en blanc) sont appliqués à toutes les images de la pile. Le dénombrement automatique des pixels au delà du seuil prédéfini et à l'intérieur du double masque, et de tous les pixels se trouvant à l'intérieur du contour interne permet de déterminer les changements de volume de la jambe au cours d'une occlusion veineuse. Tous les voxels à l'extérieur du contour externe sont rejetés. Ceux à l'intérieur du masque interne le sont également mais seront comptabilisés dans le calcul final. Pour l'anneau restant, un seuillage est appliqué afin de supprimer tous les voxels de bruit sans toucher aux voxels appartenant au contour du mollet. Le niveau de seuillage est fixe pour la série d'images 154

162 à traiter. Les pixels dont l'intensité est supérieure au seuil s'ajoutent à ceux de la surface interne provisoirement mis à l'écart. La section finale de la jambe est le produit du nombre total de voxels par leur taille, l'épaisseur de la coupe étant figée à 10 mm. Cette procédure est appliquée à l'ensemble des images. Les variations de section de la jambe sont ensuite représentées en fonction du temps, après normalisation par la moyenne des sept premières images collectées avant relâchement du brassard (figure 39). La perfusion est définie par la pente maximale d'augmentation de volume, obtenue par régression linéaire sur chaque série de 4 points consécutifs. Variation de section du mollet (%) 2.5 T Occlusion veineuse Figure 39 a et b: Série d'images acquises à la levée de l'occlusion artérielle. Variation de la section du mollet en (%) pendant les dernières secondes d'ischémie suivie de l'hyperémie réactionnelle se produisant au dégonflage du brassard. La méthode du filtrage Une autre méthode du traitement de ces images, toujours basée sur le comptage des pixels, consiste à appliquer à l'image un filtre passe-bas faible de matrice i 2 r Il a 1 2 1j pour effet d'uniformiser l'intensité des pixels en fonction des plus proches voisins. Il permet de mieux mettre en évidence le contour du mollet en diminuant le niveau de bruit. Un seuillage adapté permet ensuite de supprimer tous les pixels de bruit n'appartenant pas au mollet. Toutes les images de la série sont analysées avec ces considérations. Pour une même série de données, deux utilisateurs différents ont comparé les deux approches. L'augmentation de section détectée par la méthode du filtrage donne des résultats strictement similaires à ceux obtenus par la technique jusqu'alors utilisée du double masquage qui est toutefois plus lente. 155

163 4. ANALYSE DES SIGNAUX DE MYOGLOBINE, CALCUL DE TMYO Les spectres en proton de la myoglobine mettent en évidence deux résonances : un pic de désoxymyoglobine et le signal résiduel de l'eau. Pour affiner la précision de la quantification de la résonance de myoglobine, il est nécessaire de réduire au maximum le signal de l'eau vis-à-vis du signal de myoglobine. Sur les spectres, l'intensité du signal résiduel de l'eau est dépendante de la sélectivité de l'excitation RF porté sur la myoglobine à 8700 Hz de l'eau. Le compromis, déjà mentionné, entre la sélectivité de l'impulsion et de la perte du signal de myoglobine limite la longueur de notre impulsion gaussienne qui excite par conséquent les protons de l'eau. Dans notre cas précis, le signal résiduel de l'eau est réduit grâce au TR très court de la séquence (13,5 ms), le Tl de l'eau du muscle à 3 Tesla étant long (1,3 s). La qualité du shim peut également intervenir sur le niveau du résiduel d'eau. En effet, pour une impulsion sélective donnée, plus le pied du pic de l'eau est affiné, moins l'impulsion sélective englobe la résonance de l'eau. L'introduction complémentaire d'excitations ou de gradients visant à saturer l'eau préalablement est très efficace (Wang et ai, 1990) mais se fait au détriment de la résolution temporelle et d'un dépôt de chaleur sensiblement accru. Cette solution est évidemment à exclure dans nos études puisque la résolution temporelle constitue une priorité. Pour certains protocoles, nous nous sommes tournés, en plus de l'excitation sélective, vers une démarche non plus destinée à l'acquisition mais au traitement. Dans ce cas, les FlDs sont analysés dans le domaine temporel par la méthode non-itérative HSVD (Pijnappel, 1992). Nous avons utilisé un logiciel dédié (FIDAN, distribué par CRIS, Belgique) qui modélise le FID par des sinusoïdes amorties. La résonance de l'eau étant modélisée correctement, le pic d'eau peut ainsi être soustrait du signal original. L'atténuation du pic d'eau d'un facteur 100 permet au rapport eau sur myoglobine de ne pas dépasser la valeur 10 sur le spectre final. Un module de ce logiciel avait été développé à notre demande par l'auteur. Une minorité seulement des FIDs de myoglobine ont toutefois pu subir cette première phase de traitement. Les FIDs de myoglobine, prétraités ou non pour l'eau résiduelle, sont ensuite tous analysés à l'aide du logiciel UXNMR (Bruker). Ces FIDs sont suréchantillonnés à 1K points. Quand le prétraitement a pu être réalisé, ils sont multipliés par une fonction cosinus. Dans le 156

164 cas contraire, ils sont multipliés par une fonction exponentielle-gaussienne avec des constantes de temps de 2,12 ms et 0,5 ms 2 respectivement. Après transformation de Fourier, les spectres sont phases à l'ordre 0 et à l'ordre 1. Le pic de désoxymyoglobine, illustré sur la figure 40, est ensuite intégré entre 68 ppm et 85 ppm après application d'une ligne de base automatique. Le rapport S/B de la résonance de myoglobine, en accumulant 64 signaux, est d'environ 60. Pour les deux modalités de traitement, après ajustement des paramètres de traitement sur quelques spectres, une procédure automatique est lancée. Toutes les données issues d'une même acquisition sont analysées avec les mêmes paramètres, à l'exception des paramètres de phase qui sont retouchés sur certains spectres. I Figure 40 : Spectre de myoglobine acquis à l'état de désoxygénation complète, avec 256 accumulations. Calcul de la désaturation en oxygène de la mvoglobine Cette étape requiert une référence correspondant à l'aire de la résonance à 100% de désaturation de la myoglobine. Cette désaturation totale est obtenue après une occlusion de six minutes (Wang et al., 1990; Carlier et al., 1994) ou encore après 3 à 4 min d'exercice ischémique. L'absence de signal correspond à 0 % de désaturation. Le pourcentage de désaturation de la myoglobine est obtenu en divisant l'aire du pic recueilli par l'aire de référence. La figure 41 illustre la réoxygénation des territoires musculaires à la suite d'une ischémie de 7 minutes. 157

165 Calcul du temps de resaturation de la mvoglobine des territoires musculaires Le temps de resaturation de la myoglobine (TMyo) est déterminé en ajustant les données expérimentales par une fonction en 3 étapes (figure 41) qui comprend : - un plateau de désaturation, appartenant à la phase finale de l'ischémie, - une resaturation linéaire décroissante, - une ligne de base, plate et stable, correspondant à un état normal entièrement oxygéné. L'algorithme d'ajustement utilise la méthode des moindres carrés qui optimise simultanément les quatre paramètres suivants : la valeur du plateau de désaturation, l'instant de début de resaturation (TininaiX la pente de resaturation et l'instant de réoxygénation complète (Tf ma j). On obtient ainsi : TMyO = Désaturation de la Myoglobine (%) 1OOTL 0Q,. Dégonflag du brassa Temps (s) Figure 41 : Série de spectres de désoxymyoglobine récoltés toutes les 1,75 s sur la jambe d'un volontaire lors de la reperfusion. Le taux de réoxygénation de la myoglobine est calculé en interpolant les données expérimentales selon une fonction linéaire. 5. CALCUL DU PH INTRACELLULAIRE Sur les spectres 31 P, la position du Pi par rapport à la celle de la PCr (8) permet de déterminer la valeur du ph intracellulaire qui est obtenu par la formule suivante (Taylor et ai, 1983): 158

166 6. QUANTIFICATION DES METABOLITES PHOSPHORYLES ET DETERMINATION DE XPCR Les FIDs en phosphore, récoltés avec une résolution temporelle de 1 à 2 s, ont été suréchantillonnés à 8 K points puis multipliés par un filtre exponentiel de 31,8 ms (soit 20 Hz). Les intensités des signaux ont été intégrées dans le domaine fréquentiel après application de la transformation de Fourier, correction à l'ordre 0 de la phase et correction linéaire de la ligne de base. Un spectre typique est montré sur la figure 42. Pi PCr ATP l Figure 42 : Spectre en phosphore-31 acquis à 3 T sur un mollet de volontaire au repos. L'origine des déplacements chimiques est donnée par la position du pic de phosphocréatine (PCr). On remarque également les autres pics tels que le Pi et les trois résonances de l'atp. Le pic de résonance de la PCr est utilisé comme référence de l'échelle de déplacement chimique des spectres phosphores. La stabilité du signal permet d'optimiser les paramètres sur un spectre et de lancer le traitement automatique sur tous les spectres de la série. Dans la plupart des acquisitions en 31 P, le signal n'est pas acquis dans des conditions de relaxation complète mais dans un contexte de saturation. Les facteurs de saturation sont quasiment identiques pour la PCr et le Pi et ne changent pas pendant l'exercice. Ainsi, le rapport Pi/PCr est inchangé quel que soit le temps de répétition entre deux impulsions. Pour nos protocoles, une quantification relative des signaux en phosphore est suffisante. On mesure ainsi l'évolution du signal de Pi, PCr et de l'atp au cours de l'effort et de la récupération postexercice. 159

167 Figure 43 : L'intégration de l'intensité du pic de phosphocréatine au cours de la reperfusion donne accès au temps de normalisation de la PCr par ajustement des données expérimentales selon une fonction exponentielle. Les données dynamiques de PCr, récoltées au cours de la récupération, sont exprimées en échelle relative par rapport à la PCr de repos comme l'illustre la figure 43. Ces données expérimentales sont ajustées par une fonction mono-exponentielle, représentée par l'équation [32], pour déterminer, lors de la récupération, la constante de temps de resynthèse de la PCr, notée tpcr. PCr(t) = Cl+C2x(l-exp ^ ^ [32] où Cl, C2 et to sont des constantes données par l'ajustement où Cl correspond à la concentration initiale de PCr, C2 est la différence entre la concentration initiale et finale, et to représente l'instant initial du processus de récupération. xpcr est le temps nécessaire à la reformation de 63 % de la PCr dégradée pendant l'exercice. Ce temps reflète la capacité des oxydations phosphorylantes des mitochondries. Cette valeur peut être corrigée en fonction du ph minimum atteint en fin d'exercice à partir de l'équation de Iotti et al. (1993). Le tpcr corrigé se calcule par la formule : TPCr CO nigé - 43 X (7,0-160

168 7. DETERMINATION DE LA PRODUCTION ET DE L'ELIMINATION DU LACTATE MUSCULAIRE Les FTDs lactate ont été enregistrés toutes les 64 s, suréchantillonnés sur 4 K points et multipliés par un filtre exponentiel de 5 Hz. La correction manuelle de la phase et de la ligne de base a été effectuée après la transformation de Fourier. Le premier signal acquis au repos représente la ligne de base, et constitue ainsi le spectre de référence. Cette ligne de base est soustraite de tous les autres spectres collectés au cours du protocole afin d'éliminer les signaux résiduels d'eau et de lipides. Le pic de lactate est ensuite intégré sur chaque spectre entre 0,9 ppm et 1,8 ppm (figure 44). Figure 44 : Spectre de lactate musculaire acquis à 3 Testa sur le jambier antérieur d'un volontaire en une minute. La quantification en terme molaire, qui d'habitude pour des signaux homonucléaires, peut s'effectuer par référence directe à l'eau n'est pas applicable ici, en raison d'une sensibilité différente aux inhomogénéités du champ RF des spins qui passent à travers le filtre à double quantum. Une solution à ce problème a été trouvée par G. Bloch. Elle consiste en l'application d'une série d'impulsions RF qui créent pour le signal de l'eau la même dépendance vis-à-vis du champ magnétique de la RF que celle subie par les spins de lactate (cf. chji.d.3.d). Cependant, cette démarche n'a pas permis de retrouver les concentrations attendues et en comparant ces mesures à des résultats biochimiques, la quantification n'était pas correcte. Des études plus poussées ont ainsi été menées par L. Jouvensal et al. (1996b; 1997) quant à la visibilité du lactate par RMN utilisant le filtre à double quantum. Nous ne sommes donc pas 161

169 en mesure d'exprimer nos signaux lactate en terme de concentration molaire. La production et l'élimination du lactate sont ainsi exprimées en unité relative. Les aires des pics de plus grande amplitude et de la ligne de base soustraite sont référencées comme 100 et 0 respectivement (cf. H.H.7.). 8. STATISTIQUES Pour les mesures de reproductibilité, les variables quantitatives seront exprimées pour chaque paramètre en moyenne ± écart type. La reproductibilité est estimée pour les divers paramètres à partir du coefficient de variation des mesures successives répétées chez le même volontaire. Les recherches des relations entre les variables quantitatives sont établies par le calcul du coefficient de corrélation r. Les résultats obtenus chez les patients et chez les sujets sains ont été statistiquement comparés à l'aide d'un test de Student. Pour l'ensemble des tests, la limite pour laquelle les résultats sont considérés comme significatifs a été fixée à p<0,

170 CHAPITRE III : MISE EN OEUVRE DE PROTOCOLES D'EXPLORATIONS PHYSIOLOGIQUES, APPLICATION A. ETAPES COMMUNES AUX DIVERS PROTOCOLES Après obtention du consentement éclairé et respect des critères d'inclusion et d'exclusion (chaque protocole ayant été accepté par un Comité Consultatif de Protection des Personnes en Recherche Médicale : C.C.P.P.R.B), l'examen RMN comporte des étapes de repérage anatomique et de réglages préalables, qui sont décrites dans l'ordre chronologique. 1. INSTALLATION DU SUJET Le sujet est allongé sur le dos sur le lit d'examen. Cette étape fait l'objet d'un soin particulier pour assurer un confort maximum du volontaire. Pour les protocoles faisant appel à la mesure de perfusion, le mollet étudié est légèrement rehaussé de façon à positionner le coeur au même niveau que la zone à explorer pour éviter des variations de pression hydrostatique. Nous veillons également à stabiliser la température du local à 22 C. Un support de mousse placé au niveau du creux poplité permet de soutenir horizontalement le mollet afin d'obtenir et de conserver un fléchissement de la jambe d'environ 5 par rapport à la cuisse, avec le talon en appui sur la pédale de l'ergomètre. L'autre jambe repose sur le lit. Le dispositif expérimental permet d'effectuer un exercice musculaire dans l'aimant. La pédale de l'ergomètre, la position des sondes et l'écartement des boucles de la sonde Helmholtz sont ajustés à la morphologie du volontaire. Ce dernier point permet d'optimiser l'efficacité de la sonde. Le support en plâtre facilite le positionnement de la jambe avec les différentes sondes. Les deux boucles de la sonde Helmholtz sont disposées de part et d'autre du mollet alors que la (ou les) sonde(s) de surface se trouve(nt) sous le mollet en regard du triceps sural pour certaines explorations, ou posée(s) sur le jambier antérieur pour d'autres protocoles. La jambe ne doit subir aucune pression : la sonde Helmholtz ne repose donc pas sur la jambe et les sondes de surface ne font que l'effleurer. Un ensemble de mousse et du ruban adhésif soigneusement placés au niveau du talon et de la cuisse permettent de stabiliser la jambe afin 163

171 de minimiser tout mouvement involontaire de l'individu au moment du dégonflage du brassard. Le ruban adhésif maintient la position de la cheville et du genou. Nous prêtons une attention spécifique au système de contention afin de ne gêner en aucun cas le processus de reperfusion, ce qui pourrait engendrer une erreur de mesure et altérer la reproductibilité. 2. TESTS DES BRASSARDS Deux brassards pneumatiques gonflables à distance sont placés, l'un sur la cuisse et l'autre au dessus de la cheville. Le premier permet de réaliser l'occlusion veineuse ou artérielle, tandis que le second est seulement gonflé en fin d'ischémie, juste avant la mesure de reperfusion afin que le sang irriguant le pied ne vienne pas perturber les mesures de flux de la jambe, comme en pléthysmographie conventionnelle. Les deux brassards sont testés en début de séance pour voir d'une part s'ils sont en état de fonctionnement, et d'autre part si le volontaire accepte cette contrainte. L'installation du sujet est schématisée sur la figure 45. Par souci de clarté, nous n'avons pas représenté le support en plâtre. Figure 45 : Représentation schématique du positionnement de la jambe du volontaire dans l'aimant. Les deux manchons gonflables à distance se situent au dessus de la cheville et sur la cuisse, à proximité des deux points de fixation qui empêchent tout mouvement de la jambe du sujet. La sonde proton Helmholtz et la sonde de surface phosphore sont centrées au niveau de la partie la plus large du mollet. 164

172 3. FAMILIARISATION DU SUJET AU TRAVAIL DYNAMIQUE SUR L'ERGOMETRE L'expérimentateur fixe l'intensité de l'exercice d'entraînement à une valeur moyenne de la gamme de résistance de l'ergometre. En condition aérobie, le volontaire doit synchroniser son mouvement de flexion ou d'extension au rythme d'un métronome, constitué d'une impulsion de gradient qui engendre un signal sonore toutes les 2 secondes. L'expérimentateur veille au bon déroulement de l'exercice grâce à l'interface graphique de l'ordinateur pilotant l'ergometre, qui transcrit le déplacement de la pédale en fonction du temps. Un autre expérimentateur est présent près du volontaire pour expliquer et corriger si besoin son geste. Le sujet ne doit pas mobiliser les muscles de la cuisse mais seulement ceux de la jambe. Deux sangles sont à la disposition du volontaire pour l'aider à stabiliser son corps. Quelques minutes, pauses comprises, sont nécessaires à la personne pour apprendre à réaliser correctement l'exercice demandé. 4. MESURE DE LA FORCE MAXIMALE VOLONTAIRE DE CONTRACTION Dans l'ordre logique du déroulement du protocole, cette étape intervient maintenant avant d'introduire, dans l'aimant, le lit d'examen sur lequel est allongé le volontaire. Toutefois, pour simplifier l'exposé de la corrélation entre la FMV et la section musculaire déterminée par IRM, nous présenterons la mesure de la FMV au paragraphe 7 du présent chapitre. L'installation du sujet est terminée. Le lit d'examen est ensuite avancé dans le tunnel jusqu'à ce que les sondes et le mollet du sujet soient au centre magnétique de l'aimant. Le manipulateur et le sujet sont amenés à contrôler le bon fonctionnement des divers systèmes de sécurité (caméra, microphone en émission/réception). 165

173 5. REGLAGES PRELIMINAIRES A L'ETUDE RMN Cette étape comporte pour l'essentiel le réglage des sondes, la procédure de shim et l'ajustement des puissances des impulsions RF. Le réglage des sondes consiste à accorder la fréquence de résonance de la sonde à la fréquence du noyau détecté au champ Bo, et à réaliser l'adaptation de la sonde à 50 Q en utilisant un réflectomètre à diodes lumineuses. Homogénéisation du champ (ou shim) : Les inhomogénéités du champ magnétique sont compensées en ajustant un courant dans chacun des bobinages de correction qui sont au nombre de neuf. Pour tous les protocoles, le shim est effectué manuellement par l'expérimentateur. Cette procédure est poursuivie jusqu'à ce que la largeur à mi-hauteur du pic de l'eau soit comprise entre 20 et 30 Hz. Ce réglage dure 2 à 10 minutes. Calibration des impulsions RF : H s'agit de maximiser le rapport S/B des différentes mesures. Pour cela, on doit ajuster l'angle de bascule a de l'aimantation. Généralement, nous fixons la durée de l'impulsion et nous réglons la puissance envoyée dans la sonde d'émission. Calibration des impulsions de la séquence lactate : Cette séquence est la seule pour laquelle la puissance est fixée à une valeur maximale et la durée de l'impulsion varie. En effet dans cette séquence, plusieurs excitations RF sont à calibrer et il est plus aisé de calculer, par une règle de trois, les longueurs d'impulsion correspondants aux différents angles de bascule que de mesurer précisément la puissance qui ne varie pas linéairement (amplificateur imparfait). L'impulsion rectangulaire générant un angle de bascule de 180 est préalablement calibrée sur l'eau à l'aide d'une séquence de spectroscopie classique en relaxation complète, ce qui permet d'en déduire la durée de l'impulsion nécessaire pour basculer l'aimantation de 90. L'impulsion adiabatique d'inversion-récupération est émise à la puissance maximale (1 kw) pendant 4 ms. 166

174 Calibration de l'impulsion de myoglobine : Le signal de myoglobine n'est pas détectable en une seule acquisition. H est donc impossible de calibrer l'impulsion sur ce signal. En revanche, la puissance qui maximise le signal de myoglobine correspond à celle qui maximise également le signal de l'eau pour des conditions de relaxation comparables, c'est-à-dire en se plaçant, pour les deux metabolites, en situation de relaxation complète (TR^5xTl). Ainsi, en fixant la durée de l'impulsion myoglobine, la puissance permettant de basculer l'aimantation de la myoglobine d'un angle de 90 avec une repousse totale entre deux irradiations successives, est calibrée sur le pic d'eau avec un TR de 6 s (le Tl de l'eau du muscle se situe autour de 1,3 s). Nous avons vérifié qu'avec un TR de 50 ms, l'excitation de la myoglobine remplit les conditions de relaxation complète. Calibration de l'impulsion phosphore : L'impulsion phosphore est calibrée de façon à maximiser, pour le temps de répétition effectif de la séquence, le signal de précession libre de la phosphocréatine. 6. ACQUISITION D'UNE IMAGE DE REPÉRAGE A HAUTE RESOLUTION SPATIALE Une image de repérage (FOV = 17 cmxl7 cm et de matrice 256x256) permet de vérifier immédiatement le positionnement du mollet du sujet vis-à-vis des sondes. Rappelons que le mollet ne doit pas être comprimé par la sonde de surface au cours de l'expérience. En réalité plusieurs images avec cette résolution peuvent être collectées à ce stade. Une séquence d'imagerie en écho de gradient avec suppression des graisses facilite la détermination de la section musculaire de l'individu. Cette séquence a été mise au point en vue du protocole d'exploration des myopathies. En effet, par simple modification de la fréquence d'irradiation, l'aimantation annulée peut être, soit celle de l'eau, soit celle des lipides. Par conséquent, des images d'eau et de graisse sont systématiquement acquises pour apprécier la dégénérescence musculaire des muscles étudiés. Chez les individus sains, l'image de l'eau dépourvue de la plus grande partie du signal adipeux sous-cutané offre la possibilité d'isoler rapidement la section de muscle recherchée, par une simple procédure de segmentation et l'application d'un seuillage. C'est cette section du muscle ou du groupe musculaire recruté par l'effort qui sera corrélée à la FMV. 167

175 7. MESURE DE LA FORCE MAXIMALE VOLONTAIRE DE CONTRACTION Contrairement aux étapes préliminaires, la mesure de la FMV (exprimée en N) doit être effectuée seulement si le protocole l'exige. H est en effet important, pour pouvoir comparer les résultats métaboliques, de connaître le travail dépensé au cours d'un exercice dynamique (Chance et al, 1981). H est également essentiel d'adapter l'intensité de la charge à la capacité musculaire de l'individu (Fukunaga et al., 1996). Plusieurs auteurs se sont penchés sur ce problème et ont montré des relations linéaires entre la FMV et la section d'un groupe musculaire sollicité par l'effort (Maughan et al, 1983; Young et al, 1985). Nous avons souhaité préalablement établir cette relation au niveau du mollet d'une population de volontaires, pour nous permettre à l'avenir, à partir de la section du mollet évaluée sur une image IRM de repérage, d'imposer au volontaire engagé une résistance adéquate sur l'ergomètre. La FMV est obtenue par la démarche suivante : Les contractions volontaires sont opérées par l'individu allongé sur le lit d'examen dans des conditions identiques à celles qui seront utilisées dans le protocole. Cette phase se déroule en effet en dehors de l'aimant afin de contrôler les mouvements de flexion ou d'extension du volontaire. Ces mouvements sont ceux requis par la suite lors du protocole d'exercice. Le sujet réalise les contractions au rythme d'une toutes les deux secondes. La résistance de la pédale de l'ergomètre est incrémentée régulièrement toutes les 10 secondes. Le volontaire fait une pause à chaque augmentation de la charge. La résistance de la pédale, à partir de 60 N, est augmentée par pas de 30 N, jusqu'à atteindre une valeur pour laquelle le sujet ne peut plus effectuer de contraction volontaire, il s'agit de la FMV. Dans la pratique, nous avons été limités par la charge maximale de 300 N fournie par l'ergomètre (F max = 0piston x Pmax). La plupart des individus de sexe masculin étaient en effet capables de dépasser cette valeur. 168

176 8. CORRELATION ENTRE FMV ET SECTION MUSCULAIRE Pour cette raison, nous avons recruté 11 femmes, pour lesquelles nous avons cherché à correler la FMV (N) à la section (en cm 2 ) du triceps sural évaluée par imagerie, comme décrit précédemment. Les résultats sont représentés sur la figure 46. Nous avons fait l'hypothèse d'un ajustement linéaire sur l'ensemble des sections musculaires des volontaires recrutés. Cet ajustement aboutit à l'équation : FMV = 6,6 x Section musculaire ; r = 0,89 [34] Remarque : Cette démarche est celle employée dans la littérature pour lier la FMV à la section musculaire. En théorie, à section musculaire nulle, la FMV est nulle. Si on force la régression linéaire pour qu'elle passe par ce point, l'équation devient FMV = 4,3 x Section musculaire avec r = 0,84, ce qui tend à démontrer que l'on ne peut extrapoler la relation [34] sur l'intervalle allant de 0 à 40 cm 2 de section musculaire. Le recrutement de femmes nous a permis de réaliser notre calibration et de l'appliquer ensuite à une population d'hommes. En effet, d'une part les relations déjà proposées entre FMV et section musculaire ne mettent pas en avant de différence significative entre des femmes et des hommes jeunes (Maughan et ai, 1983; Schantz et al, 1983), et d'autre part la résistance appliquée sur la pédale par la suite au cours des protocoles d'effort impliquant le triceps sural ne dépasse pas 50 % de la FMV. Force Maximale Volontaire (N) 350 " r = " ioo o Section du mollet (cm 2 ) 70 Figure 46 : Corrélation linéaire entre la FMV mesurée (en N) lors d'un exercice de flexion plantaire réalisé sur l'ergomètre et la section du triceps sural (en cm ) déterminée par imagerie à haute résolution spatiale de la jambe de l'individu. 169

177 Nos résultats sont remarquablement concordants avec ceux de Young et al. (1985) qui propose une pente de 6,9 sur le même groupe musculaire chez une population de femmes jeunes non entraînées. Cette correspondance justifie la démarche qui sera utilisée par la suite. Nous allons en effet pouvoir extrapoler la relation obtenue pour l'utiliser quelle que soit la section musculaire mesurée chez le volontaire en début de protocole par IRM. Nous allons en déduire sa FMV théorique pour ensuite imposer au sujet recruté 50 % de cette valeur comme résistance de l'ergomètre. Grâce à cette alternative, la borne supérieure de la charge est désormais théoriquement repoussée à 600 N ce qui correspond à une section de triceps sural supérieure à 100 cm. Cette musculature est exceptionnelle même chez des athlètes (Laurent étal, 1993). 170

178 B. EXPLORATIONS PRELIMINAIRES Les explorations préliminaires n'ont pas requis de développement spécifique. Nous avons eu pour objectif de tester la faisabilité individuelle de chaque type d'exploration en utilisant les outils à notre disposition sur le système (séquences d'imagerie et de spectroscopie classique). Nous avons donc cherché : - à mesurer le débit sanguin de repos et en hyperémie réactionnelle par l'approche pléthysmographie RMN, - à mettre en évidence la cinétique de désoxygénation des myocytes, par la spectroscopie proton de la myoglobine, au cours de diverses stimulations, - à apprécier l'évolution des concentrations des metabolites phosphorylés à l'exercice par la spectroscopie du phosphore LA PERFUSION DE REPOS PAR PLETHYSMOGRAPHIE RMN A ce stade, l'idée est d'évaluer la faisabilité de la mesure du débit sanguin musculaire au repos par la technique de pléthysmographie RMN. Cette mesure au repos est intéressante dans certaines pathologies comme le diabète pour lequel une diminution de la perfusion de repos a été suspectée (Laakso et al, 1992; Baron et Brechtel, 1993). Certaines pathologies veineuses pour lesquelles la compliance des veines n'est pas uniforme méritent une exploration étagée du membre (Boccalon et al, 1981). Nous avons donc envisagé une exploration multi-coupes, tout à fait compatible avec la cinétique du phénomène. La perfusion de base étant faible, l'acquisition pléthysmographique doit durer 4 à 5 minutes. Après avoir installé le volontaire dans les conditions optimales, un brassard pneumatique est positionné sur sa cuisse. Une fois les réglages préliminaires terminés, l'acquisition IRM pléthysmographique est démarrée en utilisant la sonde volumique proton de type Helmholtz. 171

179 En pratique, on acquiert en continu NR séries de NI coupes du mollet avec une séquence classique d'écho de gradient, à notre disposition sur le système. La ligne de base est représentée par les premières secondes d'acquisition qui sont suivies du gonflement du brassard à 60 torr pour occlure le réseau veineux. Cette pression est maintenue pendant toute l'acquisition. H est possible de réitérer cette mesure en respectant.un délai minimum de 10 minutes entre les acquisitions. Selon les protocoles, pour un nombre de coupes défini, le jeu de paramètres peut privilégier soit la résolution spatiale soit la résolution temporelle. Les paramètres de cette séquence imagerie peuvent être : 0 NI = 3 0 résolution spatiale = 2,65 mm 0 TR = 2,2s 2 0 NI = 3 0 résolution spatiale = 1,28 mm 0 TR = 6,4s 2 D faut insister sur le fait que l'amélioration de la résolution spatiale contribue à augmenter le volume des données. Ce point est particulièrement critique pour ces mesures puisque la capacité de la mémoire vive pendant la reconstruction des images, ou encore celle du disque dur de stockage peuvent constituer un facteur limitant. Sur les volontaires sains, nous aurons le plus souvent recours à des acquisitions monocoupe puisque la compliance veineuse est supposée constante sur tout le mollet. Les paramètres expérimentaux sont les suivants : 0 NI=l,TR=12s 0 matrice = 128 x FOV= 19cmxl9cm 0 épaisseur de la coupe =10 mm Nous avons exploré une seule coupe avec une résolution temporelle de 12 s car la cinétique du phénomène est relativement lente pour une mesure au repos. 172

180 Variation de surface de la coupe de plus grande diamètre (%) 2,5 _ , , Gonflage du brassard à 60 Torr Temps (s) \ 1 H Figure 47 : Cette figure montre les variations de volume de la coupe de plus grand diamètre de la jambe au cours d'une mesure pléthysmographique de repos. Le moment du gonflage du brassard à 60 torr est indiqué par la flèche. La perfusion de base, obtenue par régression linéaire sur 24 s, est estimée à 3,1 ml.loog' 1.miri 1. Au cours de la mesure pléthysmographique, la courbe représentant les variations de volume du membre comporte trois phases : 1) A l'état initial, le volume du segment du membre reste constant. 2) L'application d'une pression de 60 torr, largement inférieure à la pression systolique et supérieure à la pression diastolique bloque le flux veineux tout en autorisant le flux artériel entrant. Le sang va ainsi s'accumuler dans les veines, élastiques mais de compliance limitée, induisant progressivement une dilatation du membre et une augmentation de la pression veineuse. La partie linéaire croissante de la courbe traduit ce débit artériel constant. 3) L'équilibre est atteint lorsque la pression veineuse transmurale redevient positive sous le brassard (60 torr), provoquant le rétablissement du retour veineux malgré la présence du brassard. Conformément à la procédure de traitement des images par application du double masque, le débit sanguin du mollet du volontaire au repos a été estimé à 3,1 ml. 100g" 1.min" 1. Cette valeur est tout à fait en accord avec les valeurs de perfusion de repos, allant de 1 à 5 ml. 100g" 1.min" 1, obtenues par pléthysmographie par jauge de contrainte sur le mollet (Cowley et al, 1986; Roberts et al, 1986; Meneilly étal, 1995). La technique du Xénon-133 fournit des mesures également proches avec 2,0 et 1,8 ml. 100g" 1.min" 1 au niveau du jambier antérieur et des jumeaux respectivement (Lassen et al, 1965). 173

181 2. LA PERFUSION EN HYPEREMIE REACTIONNELLE PAR PLETHYSMOGRAPHIE RMN Au cours d'une manoeuvre pléthysmographique, les trois phases décrites ci-dessus sont conservées quel que soit le débit artériel. Nous allons maintenant appliquer l'expérience précédente, au cours de la reperfusion faisant suite à une occlusion artérielle de 5 minutes imposée par un brassard gonflé à 230 torr. A la levée de l'occlusion, la vasodilatation maximale peut engendrer un débit artériel musculaire au moins 10 fois plus important que celui de repos. Pour observer ce phénomène, il suffit d'adapter la résolution temporelle de l'acquisition à la cinétique du phénomène d'hyperperfusion en conservant la résolution spatiale. La séquence d'écho de gradient standard, débarrassée de ses gradients de déphasage de l'aimantation résiduelle, ne nous permet pas de réduire la résolution temporelle au dessous de 2 s (TR m inimum= 15,6 ms) avec la résolution spatiale fixée. Cette étude a donc été envisagée au rythme d'une image toutes les 2 secondes. Le protocole est simple. L'acquisition utilisant la sonde Helmholtz est démarrée à la fin de la cinquième minute d'occlusion. La ligne de base est représentée par les premières secondes d'acquisition avant le dégonflage à 60 torr du brassard. Le débit est mesuré immédiatement après le rétablissement de la circulation. Les images ont été traitées par la procédure du double masque. Les résultats, présentés sur la figure 48, illustrent les trois étapes du processus pléthysmographique. Chez ce sujet, l'augmentation du volume de la jambe atteint 3 % en une dizaine de seconde. Une régression linéaire à quatre points fournit, en hyperemie reactionnelle, une valeur de perfusion de 21 ml. 100g" 1.min" 1. Variation de la surface du mollet (%) 3,0-- 2,5"- Dégonflage du 2,0 brassard à 60 Torr i,o-- 0,5" I Temps (s) Figure 48 : Variation de la surface du mollet au cours de Vhyperemie reactionnelle postischémique. La perfusion, mesurée par la technique de plethysmographie RMN est estimée à 21 ml.loog'.min' à partir d'une régression linéaire à 4 points. 174

182 Un volontaire a participé à trois reprises à cette expérience, pour estimer la reproductibilité de la séquence, sur trois jours différents. La perfusion post-ischémique vaut 19,2 ± 2,4 ml. 100g" 1.min" 1. Même si le nombre de pixels mettant en évidence l'augmentation de volume est faible, la résolution spatiale et temporelle est suffisante pour mesurer la perfusion musculaire à ces débits sanguins élevés. Les valeurs obtenues sont du même ordre de grandeur que celles fournies par les autres techniques avec de plus une reproductibilité satisfaisante de 12,5 %. Nous pouvons donc quantifier le débit sanguin en hyperémie réactionnelle à la limite de résolution temporelle de notre système. Ces premiers résultats ont suscité le développement d'une séquence d'imagerie encore plus rapide. L'intensité des gradients dans la séquence classique est de l'ordre de 50 % du gradient maximal. En augmentant le niveau de ces gradients, nous pouvons réduire leur temps d'application et donc restreindre le temps de répétition. H faut pour cela paramétrer une nouvelle séquence d'écho de gradient, ce qui impose de calculer les relations entre le champ de vue, l'épaisseur de la coupe, la résolution spatiale et temporelle pour un jeu d'intensités de gradient figées par l'expérimentateur. 3. LA CINETIQUE DE DESATURATION DE LA MYOGLOBINE PENDANT L'ISCHEMIE Nous voulions avant tout confirmer les résultats de Wang et al. (1990), selon lesquels les myocytes sont complètement désoxygénés après 6 minutes d'occlusion artérielle. Ce résultat provient de travaux en spectroscopie proton de la myoglobine. La séquence élémentaire de spectroscopie proton de la myoglobine est répétée toutes les 50 ms au moyen de la sonde Helmholtz. L'impulsion utilisée est de type tomogauss de 512 fis de durée. La circulation est stoppée pendant 9 minutes en gonflant le brassard autour de la cuisse du volontaire sain à 230 torr. Six cents signaux sont accumulés sur une période de 30 secondes. Au cours de cette ischémie, pendant laquelle les cellules musculaires utilisent les réserves en oxygène qui diminuent, on observe le début de la désaturation dès la fin de la première minute. La désoxygénation se poursuit, ce qui se traduit par une progression continue de l'aire du pic de désoxymyoglobine. Ce pic se trouve à 75 ppm de l'eau (Figure 49). 175

183 Figure 49 : Pic de désoxymyoglobine se trouvant à 75 ppm de l'eau vers les bas champ. Ce signal est acquis après 6 min d'occlusion et correspond à 100 % de désaturation en oxygène du tissu musculaire. Désaturation de la Myoglobine (%) Occlusion artérielle àt= 0 / -Données expérimentales (%) Ajustement Temps (s) H Figure 50 : Evolution du signal de désaturation de la myoglobine au cours d'une ischémie de la jambe de 9 min. Le muscle commence à se désoxygéner à la fin de la première minute d'interruption de la circulation sanguine. Le signal atteint un plateau correspondant à 100 % de désaturation après 6 min. Les données expérimentales ont été ajustées par un modèle linéaire à 3 segments. Comme Wang l'avait montré, nous observons que l'amplitude du signal se stabilise à la fin de la sixième minute d'occlusion (Figure 50). D faut s'assurer de cet état de depletion, avant de pouvoir transcrire le niveau du signal de désoxymyoglobine en terme de désaturation totale en oxygène du tissu musculaire. La résolution temporelle a été améliorée (12 s) aux dépens du rapport signal sur bruit en passant de 600 à 240 accumulations. La figure 51 illustre l'évolution du signal de désoxymyoglobine au cours de ce protocole. Nous retrouvons dès la sixième minute le plateau qui se maintient au cours de la stimulation additionnelle. Ainsi, nos résultats confortent ceux de Wang et nous pouvons donc conclure à une désaturation totale en oxygène du muscle ayant subi 6 minutes d'interruption de la circulation artérielle. Par la suite, l'aire de la résonance de désoxymyoglobine obtenue par cette procédure constituera le niveau de référence. La vérification des résultats avancés par Wang constituait un point essentiel pour la suite de nos travaux qui s'appuieront sur ce résultat. 176

184 Désaturation de la myoglobine (%) 100 f 80 -" Début de -I- l'ischémie àt=o Exercice ischémique entre t=6 min et t=8 min t Fin de ^ischémie Temps (s) H h Figure 51 : Evolution du signal de désaturation de la myoglobine au cours du protocole comportant 7 minutes d'occlusion artérielle, puis 2 minutes d'exercice anaérobie et une dernière minute d'ischémie. Le plateau atteint à la fin de la sixième minute reste stable malgré la stimulation additionnelle. 4. APPLICATION A LA MESURE DE LA CONCENTRATION DE LA MYOGLOBINE MUSCULAIRE In vivo, le potentiel quantitatif de la RMN n'a encore jamais été mis à profit pour déterminer la concentration de myoglobine du muscle squelettique humain. H s'agit pourtant d'une alternative élégante aux mesures effectuées par biopsie. En spectroscopie in vivo, la quantification d'un metabolite consiste le plus fréquemment à ramener, par des facteurs de correction appropriés, le signal à mesurer au signal d'une référence de concentration connue. La concentration de l'eau est en effet connue (55x0,77 mol/kg de muscle, en supposant une teneur en eau du muscle de 77 %) et constitue une référence stable (Christiansen et al, 1993). Ainsi, la détermination de la concentration de myoglobine de divers muscles squelettiques peut se faire par cette référence sous réserve que le signal de l'eau soit acquis avec la même impulsion. La démarche est intéressante car si ce rapport est constant pour un muscle donné et dans une population d'individus, il servira de référence. Nous pourrons alors faire l'hypothèse que la désaturation de la myoglobine peut être évaluée à partir de ce rapport. La connaissance de la désaturation nous permettra ensuite d'approcher la P02 musculaire. 177

185 La concentration de myoglobine, notée [Mb], se calcule ainsi par rapport à la concentration de l'eau [H2O] à partir des paramètres suivants : - les aires des pics respectifs (A) - les gains du récepteur (Rg) - le nombre d'accumulations (NS) - le nombre de noyaux d'hydrogène contribuant au signal pour chaque molécule (N) ce qui donne : ^^x5îj^x!^l^x!ll^x[h2 o] [35] R NS N l J H est néanmoins nécessaire de revenir sur un point particulier dans l'acquisition du signal de myoglobine. Comme nous l'avons déjà mentionné (cf. H.C.2.b), à cause du T2* court devant la durée de l'impulsion, il faut tenir compte du phénomène non négligeable de relaxation de l'aimantation pendant l'impulsion. La résolution numérique des équations de Bloch permet de calculer le facteur correctif de relaxation du T2* pendant l'impulsion. Dans nos conditions expérimentales, pour lesquelles l'impulsion appliquée est une gaussienne de 1,024 ms (T2* myog iobine = 1,53 ms), ce facteur de correction s'évalue à 25 % pour le signal de myoglobine alors qu'il n'est que de 1 % pour l'eau (dont le T2* dans le muscle a été mesuré dans notre laboratoire à 20 ms à 3 T). Ainsi, nous présentons dans le tableau 3 nos mesures de concentrations de myoglobine des différents muscles, avec et sans correction. Protocole Dix volontaires sains âgés de 22 à 46 ans ont participé à cette étude destinée à : 1) mesurer la concentration de Mb sur différents muscles : les muscles fléchisseurs des doigts, les jumeaux et le jambier antérieur, 2) définir une méthode qui permette à tout moment, chez un individu présentant des troubles de l'oxygénation de calculer sa P02 musculaire sans imposer d'ischémie supplémentaire. 178

186 Parmi les volontaires, six ont subi les trois étapes du protocole, espacées de 24 heures. Quatre d'entre eux ont subi l'ischémie sur le jambier antérieur uniquement. Trois volontaires ont accepté plusieurs ischémies sur le même membre afin de tester la reproductibilité des mesures. Une sonde de surface proton de 5 cm de diamètre, utilisée en émission et réception, était placée en regard du muscle ou du groupe musculaire exploré. Un brassard, positionné selon l'étude sur la cuisse ou sur le bras, maintenu gonflé à 230 torr pendant 7 minutes, a permis d'enregistrer 7 signaux de désoxymyoglobine au cours de la désaturation avec une résolution temporelle de 1 min (TR = 50 ms et NS = 1200). Le signal de l'eau est ensuite mesuré avec la même impulsion en une seule acquisition (NS = 1). Le gain du récepteur (Rg) a été ajusté à l'intensité du signal. Les signaux de myoglobine sont analysés selon la procédure habituelle sans suppression de l'eau résiduelle en post-traitement. Nous nous intéressons ici au pic maximum atteint dès la sixième minute, ainsi qu'au signal de l'eau. Les aires, estimées par l'intégrale respective des deux pics, permettent en appliquant la relation [35] de calculer les concentrations de myoglobine des différents muscles étudiés. Concentration de myoglobine (mmol/kg) Fléchisseurs des doigts Triceps sural Jambier antérieur Sans facteur de correction 0,213+0,018 0,238±0,017 0,266±0,022 Avec facteur de correction 0,266±0,023 0,29810,018 0,33310,028 Tableau 3 : Concentration de myoglobine de différents muscles squelettiques. Les valeurs de la concentration de myoglobine sont établies avec un intervalle de confiance à 95 % (Mb ± 2o) où (5 représente l'écart-type. La variabilité inter-sujet est faible avec des coefficients de variation de 10,5 %, 6,9 % et 14,0 % sur les muscles fléchisseurs des doigts, sur les jumeaux et sur le jambier antérieur respectivement. La mesure de reproductibilité inter-étude est de 3,6 %. Les seules mesures de la concentration de myoglobine dans différents muscles humains étaient jusqu'alors effectuées par le biais de techniques invasives nécessitant des biopsies. Les concentrations que nous obtenons sont tout à fait en accord avec les résultats de Nemeth et al. (1984), Jansson et al. (1983) et Moller et al. (1981) qui proposent 179

187 respectivement des valeurs de 0,33; 0,34 et 0,25 mmol/kg à partir de biopsies prélevées sur le vaste latéral du quadriceps. Des données obtenues sur le muscle de l'avant-bras en RMN par référence à une solution de Mb de concentration connue font état d'une concentration de 0,34 mmol/kg (Wang et al, 1990) alors que Biorck et al. (1949) rapportent des valeurs de l'ordre de 0,5 mmol/kg sur les muscles squelettiques humains. De plus, les valeurs publiées sur des muscles d'animaux se situent plutôt dans la gamme 0,38 à 0,49 mmol/kg (Wittenberg, 1970). La concentration de myoglobine peut ainsi être mesurée avec précision, la variance étant faible, sur certains muscles grâce à la SRM. Nous avons observé sur ces données très fragmentaires que la concentration de myoglobine varie en fonction du pourcentage de fibres de type I au sein des trois muscles explorés (Johnson et al, 1973). Ce constat est en accord avec le fait que la myoglobine est majoritairement présente dans les fibres rouges oxydatives de type I (44 % de plus que dans les fibres de type II (Nemeth et Lowry, 1984)). Pour atteindre le second objectif de ce protocole qui est la détermination de la P02, il est nécessaire d'acquérir le signal de désoxymyoglobine pendant une minute, sur le muscle du volontaire présentant des troubles de l'oxygénation, placé en situation supposée d'hypoxie, et de rapporter l'aire de ce signal à celui du pic de l'eau. On obtient ainsi la concentration de désoxymyoglobine du muscle étudié, notée DMb. Pour obtenir un intervalle de confiance à 95 % (moyenne ± 2a) de la valeur de désaturation Y (en %) associée à la concentration de DMb, on divise la concentration de DMb mesurée par la concentration moyenne de myoglobine déterminée sur le même muscle chez les volontaires sains, les bornes inférieure et supérieure de l'intervalle étant Mb-2c et Mb+2a respectivement. H est dès lors aisé de transformer l'intervalle de désaturation en oxygène de la myoglobine (Y) (équation [36]) en terme d'intervalle de confiance à 95 % de la P02 (équation [37]). DMb Mb + 2o DMb Y Mb-2c [36] avecy i <y<7 2 P 50 myoglob ine X 180

188 Un exemple est donné dans le tableau 4, calculé à partir de la dispersion de la mesure de concentration en Mb du triceps sural (0,298 ± 0,018 mm) et en prenant Pso= 2,3 torr. * en mmol/kg Tableau 4 : désaturation. Désaturation (%) 11,3 14,3 21,4 28,6 35,7 42,9 50,0 57,1 64,3 71,4 78,6 85,7 100,0 Concentration de désoxymyoglobine* 0,03 0,04 0,06 0,09 0,11 0,13 0,15 0,17 0,19 0,21 0,23 0,26 0,30 P02 intracellulaire en torr supérieure inférieure 34,04 29,90 15,87 13,80 9,81 8,43 6,79 5,75 4,97 4,14 3,76 3,07 2,89 2,30 2,24 1,73 1,74 1,28 1,33 0,92 1,00 0,63 0,73 0,38 0,30 0,00 Intervalle de valeurs des P02 intracellulaires pour chaque niveau de La figure 52 illustre les résultats du tableau 4. Pour un muscle donné, toute concentration de DMb associée à une saturation en oxygène des myocytes fournit la P02 musculaire sur un intervalle de confiance à 95%. Comme nous pouvons le constater sur ce tableau, l'incertitude absolue portée sur la détermination de la P02 intracellulaire du triceps sural est minime. Chez des patients pour lesquels on peut attendre une gamme plus étendue de la concentration de Mb que chez des sujets sains, la relation entre le signal de DMb et la P02 même établie avec un intervalle de confiance 3 fois plus important (Mb ± 6a) reste une démarche fidèle pour appréhender la sévérité de l'hypoxie. Cette approche permet de déterminer de façon atraumatique la P02 musculaire chez un individu qui ne pourrait tolérer un stress ischémique supplémentaire, il peut s'agir par exemple de patients artériopathiques ayant une ischémie critique de la jambe. De surcroît, cette méthode requiert au plus quelques minutes, ce qui facilite l'utilisation de cette procédure dans le domaine clinique. 181

189 Po, intracellulaire (torr) 0,03 -H h- 0,06 0,11 0,15 0,19 0,23 0,30 Désoxymyoglobine en m mol/kg Figure 52 : Courbe de calibration avec un intervalle de confiance à 95 % permettant d'obtenir à tout instant la P02 intracellulaire (en torr) à partir de la concentration de désoxymyoglobine (en mmol/kg) mesurée par RMN. Ces données ont été obtenues sur les muscles jumeaux. 5. L'EVOLUTION DES CONCENTRATIONS DES METABOLITES PHOSPHORYLES SUR UN MUSCLE CONTRAINT A DIFFERENTS NIVEAUX DE STRESS A ce stade préparatoire, il s'agit de suivre l'évolution des concentrations des phosphates sur un mollet de volontaire engagé dans un programme comportant plusieurs exercices ischémiques poursuivis à différents niveaux de résistance sur notre ergomètre. Les exercices étant réalisés à la même fréquence, l'objectif préliminaire consiste à apprécier la linéarité du travail musculaire quantifié sur cet ergomètre. De plus, n'ayant pas trouvé dans la littérature de données faisant état de l'évolution temporelle précise du rapport Pi/PCr au cours d'une ischémie simple poursuivie jusqu'à 10 minutes, nous avons réalisé cette stimulation afin de modéliser l'évolution de ce rapport en fonction de la durée de l'ischémie. Ainsi, le protocole expérimental, illustré sur la figure 53, comprend une première session ischémique de 10 minutes puis trois séries d'exercices ischémiques de 5 minutes, séparées par des périodes de 10 minutes de repos. Les flexions plantaires, de charge constante à chaque série, sont effectuées au rythme d'une contraction toutes les 3 s. Les trois épreuves successives sont renouvelées à intensité croissante avec les niveaux de résistance de 115 N, 170 N et 230 N. Un exercice de flexion plantaire recrute le triceps sural constitué par les jumeaux et le soléaire. Pendant les flexions plantaires, les variations de concentration des metabolites phosphorylés en SRM du 31 P sont mesurées par la bobine de surface phosphore de 5 cm x 6 cm placée en regard du tiers proximal des jumeaux. Sur le mollet, la contamination 182

190 du signal RMN en 31 P par les tissus superficiels est négligeable. H n'y aura pas lieu de recourir aux gradients de surface pour éliminer d'éventuelles contributions non-musculaires. Charge de la pédale (N) ACQ 0 ACQ ACQ ACQ ischémie (10min) exercice ischémique (5 min) repos (10 min) Figure 53 : Illustration schématique du protocole expérimental destiné à collecter l'évolution des concentrations des metabolites phosphorylés par SRM du 31 P au cours de 4 différentes épreuves. Le protocole recouvre une ischémie simple de 10 min et 3 sessions d'exercice ischémique de 5 min. Les flexions plantaires sont effectuées à charge constante à une fréquence de 0,33 Hz et la résistance de l'ergomètre est incrémentée à chaque session. Toutes les séries sont séparées par 10 min de repos. Les paramètres expérimentaux sont les suivants : 0 TR =3 s, NS = 4, résolution temporelle = 12 s 0 NR = 50ou25 0 SW=10KHz,TD = 4K 0 Tacq = 200 ms L'ischémie est initiée dès le début de l'acquisition RMN et pour toute la durée de la session (10 min pour l'ischémie seule et 5 min pour le travail anaérobie). La séquence élémentaire phosphore est répétée toutes les 3 s. Pour les 4 sessions d'acquisition, chaque spectre résulte de l'addition de 4 signaux toutes les 12 s. Le temps de lecture du signal est de 200 ms. Pour le travail poursuivi à l'intensité maximale, le volontaire épuisé a stoppé l'exercice à la fin de la quatrième minute. La figure 54 est un exemple de spectres enregistrés sur le mollet d'un individu sain au repos et en fin de 3 min d'exercice ischémique à 50 % de la FMV. Figure 54 : Spectres en phosphore obtenus à 3 Tesla sur le mollet d'un volontaire sain au repos (A) et après un exercice ischémique de 3 minutes (B). 183

191 Résultats des épreuves d'exercice Les figures 55, 56, 57 montrent l'évolution du signal de la PCr, du Pi, et du rapport Pi/PCr pendant les phases d'effort. Les profils de depletion de la PCr et de production de Pi sont symétriques. L'augmentation régulière de la résistance entre ces trois exercices se retrouve sur les courbes de PCr alors que les variations de Pi à la résistance maximale se détachent des courbes rapportées avec les deux autres niveaux de charge. Les modifications du rapport Pi/PCr en fonction de la charge sont en accord avec de nombreuses autres explorations musculaires (Chance et al, 1985; McCully et al, 1994). Pour un exercice effectué jusqu'à épuisement, il n'est pas rare de rencontrer un rapport Pi/PCr de l'ordre de 8 à 10 (Matheson et al, 1991; Kent-Braun et al, 1993; Rodenburg et al, 1994). Nos résultats sont cohérents avec ceux issus de travaux d'autres équipes. Nous constatons que le rapport Pi/PCr est lié à la puissance de l'exercice. Comme nous le soulignerons plus tard, le rapport Pi/PCr est un paramètre important puisqu'il est considéré comme un index sensible de l'activité mitochondriale (Arnold et al, 1984) io 0 Résistance - -ON N N -*-230N Temps (s) Figure 55 : Evolution sur un mollet de volontaire sain de la concentration de phosphocréatine (PCr) au cours des 4 épreuves décrites (cf. figure 53). 184

192 Tjemps (s) Figure 56 : Evolution de la concentration de phosphate inorganique (Pi) au cours des 4 épreuves ' 8 7 ' 6 5 " " 0 "Pi/PCr Résistance - -ON N -*-170N -*~230N Temps (s) Figure 57 : Représentation du rapport Pi/PCr au cours de l'exercice ischémique à différents niveaux de résistance. Nous n'avons pas constaté de modification significative de l'intensité des trois résonances attribuées aux groupes phosphates en position a, P et y de l'atp au cours de ce protocole. Nous n'avons pas représenté ici les variations de ph au cours de l'exercice, puisqu'il ne s'agissait pas de l'objectif de cette étude préliminaire. Signalons qu'au cours de ces épreuves nous avons souvent constaté un dédoublement du pic de Pi potentiellement lié à la présence de 2 populations cellulaires à ph différents au sein du muscle exploré, l'une restant à ph stable ou presque alors que l'autre témoigne d'une baisse de ph. Une hypothèse de recrutement de différents types de fibres musculaires a été formulée par plusieurs auteurs qui se sont déjà intéressés au dédoublement du pic de Pi. Nous y reviendrons plus tard lors du protocole reliant les variations du ph à la production et à l'élimination du lactate. 185

193 Le protocole d'ischémie simple de 10 minutes Nous avons enregistré les variations du rapport Pi/PCr au cours d'une ischémie simple de 10 min. Une fonction quadratique constitue le meilleur ajustement de ces données expérimentales. D'après les données, représentées sur la figure 58,.le rapport Pi/PCr se détache du niveau de repos au delà de la sixième minute d'ischémie. A la 9 ième minute d'occlusion, le ratio Pi/PCr est le double du ratio de repos. Nous utiliserons par la suite cette courbe pour discuter la mise en oeuvre d'un modèle qui nous permettra de calculer le taux d'extraction de l'oxygène à l'instant de la reperfusion. Remarque : Par la suite, pour les protocoles impliquant des volontaires sains, un travail ischémique de 3 minutes à 50 % de la FMV sera demandé faisant suite à une première minute d'occlusion. Pour les patients, nous adapterons pour chacun le niveau d'effort à leur capacité musculaire et il leur sera demandé de stopper cet exercice dès qu'une gêne sensible est ressentie. 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Pi/PCr Données expérimentales Ajustement quadratique y=8,10" 7 x 2-0,0002 x + 0,132 Temps (s) H h H h H Figure 58 : Evolution du rapport Pi/PCr au cours de l'ischémie simple de 10 minutes. Nous constatons que le rapport Pi/PCr est presque constant pendant les six premières minutes d'interruption de la circulation. Les données expérimentales ont été ajustées par un modèle quadratique soulignant l'augmentation rapide de ce rapport au delà de la 6 ième min. Le rapport Pi/PCr double par rapport à son niveau de repos entre la 6 ième et la 9 ième minute. 186

194 Désormais, nous allons aborder différents protocoles physiologiques. Par une démarche commune, nous envisagerons successivement pour chacun d'entre eux les objectifs, la description de la séquence, la réorganisation des données en vue du traitement, le descriptif du protocole avant d'aborder, puis de discuter les principaux résultats. Les perspectives d'applications des approches développées à l'exploration des muscles pathologiques, seront introduites dans les conclusions. C. INFLUENCE DE LA RESTRICTION DE PERFUSION SUR LA REOXYGENATION MUSCULAIRE CHEZ LE SUJET SAIN (SEQUENCE PERFMYO) (Brillault-Salvatefa/., 1997) 1. OBJECTIF Un de nos premiers objectifs concerne une meilleure compréhension de la relation perfusion/oxygénation du muscle strié squelettique. Notre étude s'est portée sur l'hyperémie réactionnelle faisant suite à la levée de l'occlusion artérielle car les modifications qu'induit une ischémie d'un membre, par rapport à l'état de repos, permettent une exploration dynamique de la microcirculation musculaire. Nous avons voulu quantifier en même temps le débit sanguin et le temps de réoxygénation des territoires musculaires étudiés. L'idée originale consiste à rassembler au sein d'une même séquence les outils RMN développés pour pouvoir apprécier simultanément les deux variables. Nous allons ainsi recourir à la pléthysmographie RMN et à la spectroscopie proton de la myoglobine pour évaluer respectivement la perfusion musculaire et la captation de l'oxygène des capillaires vers les myocytes dans le but de calculer l'extraction musculaire d'oxygène chez le sujet sain. 187

195 2. LA SEQUENCE «PERFMYO» La première séquence entrelacée allie des acquisitions en proton uniquement avec, sur chaque ligne, un écho d'imagerie et un FID de spectroscopie. Ainsi, à chaque répétition, la séquence entrelace les 128 échos de gradient correspondant aux 128 pas d'encodage de phase, avec les 128 FIDs résultant de l'excitation sélective de la myoglobine, pour une matrice image définie en 128x128 et des FIDs acquis sur 128 points complexes (Brillault-Salvat et al, 1995a). Le schéma d'entrelaçage imagerie et spectroscopie proton est le suivant : [(1er pas d'encodage de phase = 1 écho) - (1 excitation sélective = 1 FID)]i [(n ième pas d'encodage de phase = 1 écho) - (1 excitation sélective = 1 FID)] n [(128 ième pas d'encodage = 1er écho) - (1 FID = 1 excitation sélective)]i28 La séquence, représentée sur la figure 59, juxtapose la séquence GRASS, décrite au chapitre n.d.3.a.l, au module élémentaire de spectroscopie de la myoglobine. Le TR effectif de la séquence est de 13,5 ms pour un TE de 5,5 ms. Il s'agit de la meilleure résolution temporelle envisageable avec la configuration actuelle de notre système. Les bandes passantes des images et des spectres sont de 100 KHz et de 25 KHz respectivement. Le filtre du récepteur (FW) est de 62 KHz. Le champ de vue des images est de 19 cm x 19 cm assurant une résolution spatiale de 1,5 mm x 1,5 mm. 3. REDISTRIBUTION DES DONNÉES La séquence IRM-SRM a été conçue de façon à faire correspondre, au même instant, la coupe axiale du mollet avec un signal de désoxymyoglobine. Pour obtenir une image et un spectre de myoglobine à chaque répétition, une automation en post-traitement redistribue les échos dans un fichier imagerie et additionne les 128 FIDs de myoglobine (ch HG.2). Une image de matrice 128x128 et un spectre myoglobine cumulant 128 signaux sont ainsi enregistrés toutes les 1,75 secondes. La représentation schématique de cette redistribution se trouve sur la figure 37. La mesure de la perfusion est obtenue à partir de la méthode du double masque. Les spectres de myoglobine ont été ici traités sans suppression de l'eau résiduelle. 188

196 n pas d'encodage de phase Pléthysmographie RMN DMB^H MRS Figure 59 : Diagramme de la séquence entrelacée imagerie et spectroscopie RMN du proton. La partie imagerie par écho de gradient est représentée sur la gauche alors que le module élémentaire de spectroscopie se trouve à droite sur le diagramme. Chaque écho enregistré correspond à une ligne du plan de Fourier et l'excitation RF suivante est une impulsion sélective du proton N-b de la désoxymyoglobine. La séquence réitère sa boucle autant de fois qu'il y a de pas d'encodage de phase prescrits pour l'image. On obtient une acquisition alternée ligne à ligne des données brutes d'une image et d'un spectre. 4. PROTOCOLE Onze sujets sains (3 femmes et 8 hommes) âgés de 24 à 39 ans, ont participé au protocole. Us ont été installés selon la procédure habituelle avec la sonde volumique Helmholtz centrée sur la section la plus large du mollet. Le protocole comporte 15 minutes de repos, 7 minutes d'ischémie provoquée par un brassard placé au dessus du genou gonflé à une pression de 230 torr, et une période de récupération d'au moins 10 minutes. Les acquisitions débutent 15 secondes avant le dégonflage du brassard et se poursuivent pendant les 52 premières secondes de l'hyperémie réactionnelle. L'objectif de ce protocole étant d'évaluer l'influence de la restriction de perfusion sur la réoxygénation musculaire, l'épreuve a été répétée trois fois pour tous les volontaires avec des variantes à la récupération (figure 60). Pour la première session, le brassard a été dégonflé à 60 torr, valeur de contre-pression correspondant aux conditions de la pléthysmographie conventionnelle. La deuxième fois, le manchon a été ouvert à l'air libre ; le pic de perfusion a ainsi été mesuré alors que la pression résiduelle du brassard était légèrement au dessous de la pression veineuse. Pour des questions de simplicité, on nomme cette condition d'acquisitions «0 torr». Enfin, pour la dernière série d'acquisition, le brassard a été dégonflé à 100 torr afin de réduire de manière significative le flux artériel. 189

197 Pression du manchon (torr) ISCHEMIE ISCHEMIE ISCHEMIE o REPOS l ACQ ^ ^ H REPOS 7-min ACQ REPOS 7-min i ACQ Lta Figure 60 : Représentation schématique du protocole expérimental réalisé sur chaque volontaire. L'épreuve comprend 15 minutes de repos, puis 7 minutes d'ischémie en gonflant le brassard à 230 torr et se termine par une période de récupération après dégonflage du brassard. Ce protocole est répété trois fois avec trois différents niveaux de contre-pression imposée par le brassard lors de la reperfusion : 60 torr, 0 torr et 100 torr. Les données RMN sont enregistrées 10 secondes avant la fin de la période d'ischémie. 5. RESULTATS ET DISCUSSION a) Détermination simultanée du pic de perfusion en hyperémie réactionnelle et de la réoxygénation des territoires musculaires La figure 61 est un exemple de données collectées simultanément, en utilisant la séquence entrelacée ligne à ligne, au cours de la reperfusion post-ischémique. Parmi les 33 séries de données obtenues sur les 11 sujets, 3 ont dû être rejetées à cause d'une insuffisance de qualité des images ou du trop faible rapport signal sur bruit des spectres. Les résultats des 30 autres évaluations sont présentés dans le tableau 5, où les valeurs de perfusion et de resaturation en oxygène sont données pour chacune des contre-pressions imposées à la récupération. Comme prévu, lorsque la pression du brassard excède la pression diastolique artérielle, le débit sanguin musculaire est significativement réduit et le temps de resaturation en oxygène de la myoglobine est allongé. 190

198 Contre-pression du brassard en torr «0» Perfusion de la jambe en ml. 100g de tissu^.min" 1 19,5 ± 2,9** 15,3 ± 1,6* 7,3 ±0,5 Demi-temps de resaturation de la myoglobine en s 5,3 ±0,8** 5,9 ± 03** 12,5 ± 1,0 * : vs 100 : p<0,01; ** vs 100: p<0,001 Tableau 5 : Les données sont présentées sous la forme moyenne ± écart-type. Désaturation de la Myoglobine (%) Variation de section du mollet (%) 40+ Dé Eonglage à 60 Torr Temps (s) Figure 61 : Exemple d'une série de données acquise avec la séquence entrelacée imagerie et spectroscopie RMN pendant l'épreuve d'ischémie-reperfusion de la jambe. Les changements de saturation de la myoglobine (O) et de la section de la jambe (+) au cours de la manoeuvre pléthysmographique sont mesurés strictement au même instant. b) Corrélation entre le pic de perfusion post-ischémique et le taux de resaturation de la myoglobine La réoxygénation musculaire, estimée par le demi-temps de resaturation de la myoglobine, comme indiqué sur la figure 62, est corrélée à la perfusion de la jambe. Le meilleur ajustement des données expérimentales a été obtenu par une fonction puissance, d'exposant voisin de -1, avec y en secondes (s) et x en ml.loog'.min" 1, (y = 70,83 x ~ 0 ' 94 ; r= 0,84; p = 10" 8 ). La valeur de l'exposant de l'équation ajustée est proche de -1 indiquant que la relation entre la perfusion et le taux de resaturation de la myoglobine est presque linéaire. 191

199 Demi Temps de RESATURATION de la MYOGLOBINE en s 20 T 16" ,94 y = 70,83 x 2 0,70 4Î PERFUSION en ml.mirvmoog tissu 1 Figure 62 : Relation entre la perfusion et le demi-temps de resaturation de la myoglobine sur la jambe d'un volontaire sain. Ces mesures ont été effectuées au premier instant de la reperfusion du mollet à la suite d'un stress ischémique de 7 minutes. Les données de reperfusion ont été recueillies à 3 différentes contre-pressions du brassard afin d'étendre la gamme de valeurs de débit sanguin musculaire. c) Influence du débit sanguin régional sur la réoxygénation musculaire de la jambe Ce protocole a été défini pour tester directement l'effet d'une restriction de perfusion sur la réoxygénation musculaire. Au cours de la séance, nous avons seulement influencé la contre-pression au dégonflage, en maintenant tous les autres facteurs constants pour chaque individu étudié. Si on fait la différence entre les mesures de perfusion obtenues à «60 torr» et les deux autres séries de mesure («0 torr» et «100 torr»), les 18 couples de points disponibles, représentés sur la figure 63, montrent une dépendance linéaire entre le degré d'hyper ou d'hypo-perfusion imposée à chaque volontaire et le degré d'hyper ou d'hyporéoxygénation musculaire (y = 0,0077 x + 0,0075 ; r = 0,90; p = 3,5.10" 7 ). Nos travaux confirment ainsi, que dans nos conditions expérimentales, la perfusion est un facteur limitant de la réoxygénation musculaire. Ces résultats sont en accord avec des données in vitro recueillies sur une préparation de muscles d'animaux (Horstman et al, 1976). 192

200 A TAUX de RESATURATION de la MYOGLOBINE en s" /^^ -0.1 y = 0,0077x + 0,0( R 2 = 0, y.1 i A PERFUSION en ml.min " 1.100g tissu 1 Figure 63 : Les données représentées ici sont issues de la série illustrée sur la figure 62. Pour chaque sujet, la différence de perfusion entre les conditions «100 torr» et «60 torr» ont été comparées à la différence du taux de resaturation de la myoglobine entre ces deux mêmes contre-pressions. La même procédure a été appliquée pour les mesures «60 torr» et «0 torr». Ce graphique met en évidence une relation linéaire significative entre la restriction de perfusion et la réoxygénation musculaire. d) Calcul du taux maximum d'extraction en oxygène du muscle squelettique à partir des données individuelles Comme nous l'avons détaillé au chapitre I.D., le calcul de l'extraction musculaire d'oxygène repose sur la détermination de la DO2 et sur l'évaluation de la captation d'oxygène musculaire. Calcul de la DO? La DO2 individuelle est calculée à partir de la mesure de la perfusion musculaire par pléthysmographie RMN. Calcul de la captation musculaire d'oxygène A chaque instant, le contenu d'oxygène musculaire correspond à la différence entre la captation de l'oxygène par le muscle et la consommation d'oxygène par les mitochondries (Vo 2 mito), encore appelée respiration mitochondriale. Comme nous l'avons expliqué au chapitre I.D., à la reperfusion la captation d'oxygène musculaire peut être déduite du taux de resaturation de la myoglobine si la consommation d'oxygène mitochondriale post-ischémique 193

201 peut être déterminée (cf. équation [16a]). Dans ce protocole, il s'avère que cette consommation d'oxygène par les myocytes est négligeable par rapport à la captation d'oxygène. En effet, la respiration mitochondriale du muscle au repos après 6 minutes d'ischémie ne diffère que de quelques pour-cents par rapport à la valeur de la respiration de base. Cette affirmation est issue de l'enregistrement de l'évolution du rapport Pi/PCr pendant 10 minutes d'occlusion (cf. IH.B.5). On fait l'hypothèse que la concentration totale de créatine reste constante (Gyulai et al, 1985). Le rapport Pi/PCr peut alors être transformé en une concentration d'adp libre qui exerce un contrôle étroit sur la respiration mitochondriale du muscle squelettique (Chance et al, 1981). Après 6 minutes d'ischémie, le rapport Pi/PCr augmente de 7,8 ± 1,0 % (n= 5, p = 0,05). Selon Gyulai et al. (1985), qui a proposé une procédure de calcul de la concentration d'adp à partir du rapport Pi/PCr, l'augmentation de 7,8 % du ratio Pi/PCr correspond à une hausse maximale de 7 % de la concentration d'adp. A la reperfusion comme au repos en situation normoxique, ni l'oxygène, ni les équivalents réducteurs ne constituent un facteur limitant l'activité des oxydations phosphorylantes mitochondriales, le complexe enzymatique étant lui même normal et constant pour chaque individu sain sur la période d'observation. Dans ces conditions, la concentration d'adp peut servir d'indicateur du taux de la respiration mitochondriale. Par conséquent, à la reperfusion faisant suite à 6 minutes d'occlusion, la consommation d'oxygène mitochondriale n'est que faiblement accrue, de l'ordre de 5 %, par rapport à la valeur de base. Comme la consommation mitochondriale d'c»2 au repos est déjà faible (0,015 à 0,03 ml O2 s^.kg.tissu" 1 (Guyton, 1976)), la l/o 2 mito, à la reperfusion, reste donc d'au moins un ordre de grandeur plus faible que la captation d'oxygène par les cellules musculaires. Dans nos conditions post-ischémiques simples, la respiration mitochondriale postischémique diffère donc très peu de la valeur de base et reste de plus très faible par rapport au flux net d'oxygène entrant dans le tissu musculaire. Cette captation musculaire d'oxygène est estimée à partir de la formule [16a] où l'on néglige la respiration mitochondriale. Ainsi, dans nos conditions d'acquisitions dynamiques post-ischémiques, on mesure directement le flux net d'oxygène dans le cytoplasme, à partir des variations d'intensité de la résonance de la désoxymyoglobine aux premiers instants du rétablissement du flux artériel (dmbcvdt). 194

202 Nous avons également calculé le coefficient individuel d'extraction d'oxygène en appliquant la relation [14b]. Ce calcul d'extraction a été appliqué à l'ensemble des données de cette étude. Dans notre population d'individus sains, la captation moyenne d'oxygène a été estimée à 0,043 ml O2.IOO g tissues" 1 (ou 25,8 ml O2-kg tissu" 1.min" 1 ). Les valeurs de captation aux différentes contre-pressions sont : 0,051 ± 0,014 ml.o2.loo g tissu" 1.s" 1 à «Otorr»; 0,036 ±0,004 ml O g tissu" 1.s" 1 à «60torr» et 0,016 ±0,001 ml O g tissues" 1 à «100 torr» conduisant à des extractions égales à 78 ±11 %, 79 ± 9 % et 72 ± 5 % respectivement. Au moment de la reperfusion, les réserves d'oxygène du tissu sont épuisées, le gradient de pression en oxygène entre les capillaires et les myocytes est ainsi maximal. Dans ces conditions, l'extraction d'oxygène calculée est maximale puisque la captation d'oxygène par le tissu l'est. Nos valeurs d'extraction sont très proches des valeurs d'extraction maximales rapportées dans la littérature. Des mesures comparables ont été effectuées, au moyen de techniques invasives, dans des conditions expérimentales différentes : à la suite d'un exercice volontaire maximal (Richardson et al, 1995c; Richardson et al., 1995b) ou encore sur une préparation de muscle stimulé électriquement (Horstman et al, 1976; McAllister et Terjung, L. 1991). Pour les trois sessions du protocole et les 8 volontaires ayant une série de données complète, les résultats individuels sont illustrés sur la figure 64. Pour 6 des individus, l'extraction d'oxygène est constante et indépendante de la perfusion (la droite de régression passe par l'origine). Ceci suggère qu'il s'agit du taux d'extraction maximal réalisable à chaque étape du protocole. Les résultats indiquent également une forte hétérogénéité dans cet échantillon de population puisque les valeurs constantes pour chaque individu s'échelonnent entre 76 % et 120 %. Les valeurs d'extraction supérieures à 100 % sont évidemment surestimées, provenant probablement d'une sous-évaluation de la valeur de perfusion lors de la manoeuvre pléthysmographique et/ou d'une concentration de myoglobine sous-évaluée pour certains sujets. Môller et al. (1981) a en effet montré que la concentration de myoglobine augmentait avec l'âge du sujet. L'entraînement peut également intervenir sur la concentration de myoglobine. Cette possibilité reste à prouver chez l'être humain (Nemeth et Lowry, 1984) alors qu'elle a été démontrée chez les animaux (Pattengale et Holloszy, 1967; Hickson, 1981). Les deux volontaires restants, dont les données sont représentées le plus à droite sur la figure 64, n'ont pas augmenté leur captation d'oxygène en proportion de leur perfusion 195

203 (comme indiqué par l'intersection avec l'axe des ordonnées ne passant pas par l'origine) menant à une valeur d'extraction de 41 %. L'hétérogénéité de l'extraction en O2 chez des individus sains peut résulter des différences individuelles de sensibilité à l'ischémie. 0.4 T y = 0.009X 0.3 \ R 2 = T y = x 0.3" R2= T y = 0.002x " 0.1" « y = x R 2 = w 1X1 0.1 " cr " 0.1" y = x R 2 = T 0.4 T y = y = 0.002x ' R 2 = R2= " 0.1" 0.0 "" 0.0 -» PERFUSION en ml.mhrmoog- 1 tissu Figure 64 : Cette figure montre les séries de données individuelles mettant en évidence la corrélation entre la perfusion et le taux de réoxygénation de la myoglobine chez les différents volontaires au cours du protocole «PerfMyo». L'extraction d'oxygène par le muscle pendant l'hyperémie réactionnelle post-ischémique est directement proportionnelle au rapport entre le taux de resaturation de la myoglobine et la perfusion. L'intersection à l'origine des lignes de régression sur 6 des graphiques souligne l'indépendance de l'extraction d'oxygène vis-à-vis de la perfusion. L'hétérogénéité des pentes des différents graphiques illustre une importante variabilité interindividuelle de l'extraction d'oxygène pouvant provenir des différences de sensibilité des individus à l'ischémie. Les deux graphiques de gauche correspondant à deux individus se distinguent des autres relations. L'extraction d'oxygène est faible et dépendante du niveau de reperfusion post-ischémique (intersection ne pasant pas par l'origine). La figure 64 montre que les changements de perfusion sont bien corrélés au taux de resaturation de la myoglobine. Au niveau individuel, on constate qu'une différence importante de perfusion est associée à une modification comparable du taux de resaturation de la myoglobine. Ce constat peut refléter une méthodologie expérimentale imparfaite mais aussi des différences intrinsèques entre les sujets comme nous venons d'en faire l'hypothèse. 196

204 e) Originalité et pertinence de l'approche IRM-SRM L'idée de mesurer simultanément par RMN la perfusion et l'oxygénation d'un tissu revient à Thulborn et al. (1981). Dès 1981, il détecta au moyen d'une dérivation veineuse sur une préparation de muscle de lapin, des variations de Tl liées au flux et de T2 liées à l'oxygénation du sang. Pour poursuivre dans cette direction, nous avons proposé une solution reposant sur une méthodologie originale et quantitative de la perfusion et de l'oxygénation musculaire. Notre démarche donne accès à des paramètres fiables à partir desquels des informations physiologiques de première importance peuvent être déduites (apport, consommation et extraction d'oxygène). Nous ne reviendrons pas sur les autres techniques qui permettent d'évaluer le niveau d'oxygénation, rappelons simplement que le NIRS souffre de certaines limitations concernant la localisation exacte du signal, sa, quantification, et surtout ne discrimine pas la composante tissulaire de la composante vasculaire de l'oxygénation. La contribution du signal vis-à-vis des artères et des veines est également débattue. En revanche, le signal du proton N-ô de la myoglobine provient du compartiment intracellulaire et n'est pas contaminé par le signal de désoxyhémoglobine in vivo (Wang et al, 1993). La limitation majeure de la spectroscopie RMN de la myoglobine in vivo réside certainement dans son incapacité à mettre en évidence la forme oxygénée de ce composé, contrairement à des expériences in vitro (Kreutzer et al, 1992). Dans notre contexte, la mise en oeuvre d'une version RMN de la pléthysmographie est une solution efficace pour mesurer de façon concomitante la perfusion et l'oxygénation. Même si la méthode pléthysmographique semble archaïque, toute autre mise en oeuvre d'une méthode non RMN évaluant la perfusion aurait eu à faire face à l'environnement relativement hostile d'un aimant à 3 Tesla alors que la spectroscopie proton de la myoglobine à haut champ semble être, in vivo, la sonde la plus sensible du niveau d'oxygénation tissulaire. f) Comparaison de nos valeurs de perfusion musculaire avec les autres techniques Nos valeurs de perfusion en hyperémie réactionnelle (15,3 ± 1,6 ml. 100g" 1.min" 1 ) sont cohérentes avec des résultats obtenus après 15 secondes de reperfusion post-ischémique avec 197

205 la pléthysmographie à jauge de contrainte ou encore par la technique du 133 Xe avec respectivement des valeurs de 15 et 23,2 ml.l00g" 1.min" 1 (Lassen et al, 1965; Lindbjerg, 1966). En comparant nos mesures avec une autre méthode purement RMN, la technique du Tl apparent, il semble que notre approche sous-estime le débit sanguin musculaire. Comme nous l'avons déjà souligné, l'arrivée artérielle est sensiblement obstruée par la simple application d'une contre-pression de 60 torr intégrée à la mesure pléthysmographique, à l'origine d'une diminution de flux de 13 à 20 % selon les auteurs (Hiatt et al, 1989; Sundberg et Kaijser, 1992). De plus, la compliance limitée de la jambe est une explication potentielle souvent avancée en faveur de cette sous-estimation puisque la mesure pléthysmographique dépend à la fois du flux sanguin et de la compliance globale de la jambe incluant les compliances des vaisseaux, du tissu conjonctif et de la peau. Dans le chapitre II.G.6, contenant la discussion du protocole «PerfMyoPhos», nous présentons la synthèse de toutes nos mesures RMN du débit sanguin musculaire, obtenues avec les différents tests de provocation. Nous y confrontons également nos résultats par rapport aux données de la littérature. 6. CONCLUSION ET PERSPECTIVES Nous avons développé un nouvel outil d'exploration musculaire, combinant IRM et SRM, qui mesure simultanément et de façon atraumatique la captation d'oxygène et la perfusion périphérique. Cette nouvelle approche a été testée chez des volontaires sains et nous a permis de calculer l'extraction individuelle musculaire d'oxygène. A des fins cliniques, cet outil peut être utilisé : - pour appréhender les anomalies d'apport en oxygène aux tissus périphériques pouvant provenir : d'un apport artériel inadéquat, et/ou d'une extraction tissulaire altérée, - pour déterminer les contributions relatives de chacun de ces facteurs. L'appréciation de ces fractions constitue une difficulté, surtout lorsqu'il s'agit d'utiliser des procédures non invasives. 198

206 D. L'OXYGENATION TISSULAIRE ET VASCULAIRE AU COURS D'UNE EPREUVE D'ISCHEMIE-RECUPERATION CHEZ LE SUJET SAIN (SEQUENCE T2MYO) Ce protocole a été mené en binôme avec Vincent Lebon. (Lebon, Brillault-Salvat et al; 1997a) 1. OBJECTIF Le muscle squelettique permet très avantageusement de discriminer certaines composantes de l'oxygénation intervenant sur le contraste des images RMN. Tout d'abord, les effets de perfusion et d'oxygénation peuvent être dissociés en stoppant, temporairement et sans risque, le débit sanguin. Le premier objectif de la présente étude est de démontrer à 3 Tesla l'existence des changements d'intensité du signal pondéré T2* des images RMN au cours de l'ischémie de la jambe. En focalisant notre attention sur l'occlusion, nous tenterons d'explorer la correspondance temporelle entre les changements du signal des images en écho de gradient et le contenu en oxygène du tissu musculaire mesuré par la spectroscopie proton de la myoglobine. Ce travail a été motivé par deux publications récentes où : - dans la première (Toussaint et al, 1996a), il est fait état d'une décroissance du signal pondéré T2* des images du muscle squelettique pendant une ischémie brève de la jambe, - dans la seconde (Hajnal et al, 1996), les auteurs ne détectent pas, lors d'un stress comparable, une telle variation du signal et poussent leur réflexion jusqu'à remettre en cause l'existence de l'effet BOLD dans le muscle. L'imagerie fonctionnelle cérébrale repose sur la mesure, par une séquence IRM pondérée T2*, des variations de l'oxygénation capillaire au cours de différents stimuli (Belliveau et al, 1991). Le second objectif de ce protocole est d'examiner, au niveau des muscles périphériques, les relations entre les variations du signal d'imagerie pondéré T2* et les variations de saturation de l'hémoglobine, au cours d'une ischémie de la jambe. 199

207 2. LA SEQUENCE «T2MYO» La confrontation des variations temporelles des signaux d'imagerie pondérés T2* et de la spectroscopie de la myoglobine ne peut reposer que sur un enregistrement simultané des deux paramètres. Pour cela, nous avons adapté l'approche intégrée imagerie/spectroscopie qui a été proposée précédemment (Brillault-Salvat et al, 1997). La séquence T2Myo implémentée réalise ligne à ligne l'acquisition alternée d'un écho d'imagerie et d'un FID de spectroscopie, ce motif étant renouvelé pour les 64 pas d'encodage par la phase de l'image. Pour chaque répétition, on obtient alors au même instant une image 256x64 représentant la coupe axiale de la jambe et un spectre de désoxymyoglobine cumulant 64 signaux acquis sur 256 points complexes. Les images pondérées T2* de la jambe (TR/TE = 94/15 ms) ont été acquises en mode mono-coupe. Les autres paramètres expérimentaux sont : Pour les images 0 pi = sinc3-3ms, a = 40 0 FOV = 40 cm x 20 cm, SW = 50 KHz 0 matrice = 256 x 64, 0 épaisseur de coupe =10 mm Pour les signaux de myoglobine 0 p2 = tomogauss u.s à 75 ppm 0 a = 90 avec un TR de 94 ms 0 TD = 256,NS = 64 0 SW = 25KHz Les paramètres des «ACQP» sont : 0 NI = 2, acq_size[0] = 256, acq_size[l] = 64, FW = 50 KHz 3. REORGANISATION DES DONNÉES Selon la procédure classique de traitement des données entrelacées, une automation a été développée spécifiquement pour séparer les échos d'imagerie des FIDs protons. Ainsi, une image 256x64 et un spectre de myoglobine accumulant 64 signaux sont enregistrés toutes les 6 s. Les FIDs protons ont été traités selon la procédure ne comportant pas la suppression de l'eau résiduelle car le logiciel de suppression de l'eau n'était pas encore disponible au moment de la réalisation de ce protocole. A chaque instant du protocole, la désaturation en oxygène du 200

208 muscle est exprimée en rapportant le signal de désoxymyoglobine au signal de référence correspondant à une désoxygénation totale obtenue après 6 min d'ischémie. Après reconstruction des images pondérées T2*, l'intensité moyenne du signal a été calculée en regroupant plusieurs régions d'intérêt : le soléaire, les jumeaux et le tibial antérieur. Le signal moyen a été normalisé par rapport au signal de repos. La procédure de traitement est schématisée sur la figure 65. B Figure 65 : Représentation schématique du traitement des données brutes. (A) Les signaux entrelacés IRM-SRMsont collectés et stockés dans un seul vecteur. (B) Le vecteur d'acquisition est séparé en deux segments, les échos d'imagerie et les FIDs de spectroscopie. Les échos d'imagerie sont réarrangés afin d'obtenir un plan de Fourier classique et les FIDs de spectroscopie sont additionnés. (C) Les échos et les FIDs sont reconstruits en appliquant la procédure standard de transformation de Fourier 2D et ID respectivement, pour obtenir des images et générer des spectres de myoglobine. 201

209 4. PROTOCOLE Cinq sujets sains (3 hommes et 2 femmes) âgés de 24 à 45 ans ont été recrutés pour participer à ce protocole. Un brassard pneumatique a été placé au dessus du genou du volontaire allongé sur le lit d'examen. Une sonde proton du type cage d'oiseau, en quadrature, a été utilisée pour l'obtention des images et des spectres. Cette sonde de 25 cm de diamètre interne, a été centrée au niveau de la plus grande section de la jambe étudiée. Pour chaque individu, 120 répétitions de signaux entrelacés IRM-SRM ont été recueillies au cours du protocole qui comporte trois phases : 1) 120 s de repos correspondant à 20 répétitions, 2) 420 s d'occlusion de la jambe réalisée en gonflant le brassard à 230 torr recouvrant 70 répétitions, 3) 180 s de récupération post-ischémique soit 30 répétitions en hyperémie réactionnelle après avoir rétabli le flux artériel. 5. RESULTATS ET DISCUSSION Les données expérimentales La figure 66 montre les évolutions temporelles de la désaturation de la myoglobine et de l'intensité des images pour l'ensemble du protocole. A chaque instant, les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± écart-type estimés à partir des données expérimentales des 5 volontaires. L'échelle des graphes a été imposée afin que les variations de l'intensité des images et la désaturation de la myoglobine se répartissent sur la même gamme pendant l'ischémie. Sur ce laps de temps, cette adaptation de l'échelle permet de comparer directement les changements relatifs des deux variables. La moyenne des données expérimentales des 5 individus (figure 66) donne la cinétique d'ensemble de la réponse ischémique et les barres d'erreur documentent la reproductibilite du phénomène. En revanche, les deux courbes moyennes ne sont pas le reflet exact des données individuelles. Par exemple, après la pose du brassard, l'instant initial de désaturation de la myoglobine varie d'un sujet à l'autre. Dans ce cas, la moyenne aplatit et lisse la phase initiale 202

210 de la courbe de désaturation. Cette remarque est également valable à la fin de la désaturation. Par conséquent, la période totale de désoxygénation tissulaire semble plus longue qu'elle n'est réellement sur les mesures individuelles. Cela nous conduira à ajuster séparément les données expérimentales, pour chaque série individuelle, afin d'apporter une description quantitative de la dynamique des courbes relevées. Les variations du signal d'imagerie pondéré T2* Immédiatement après avoir interrompu l'influx artériel, le signal pondéré T2* des images décroît rapidement (1,1 % après 9 s alors que la décroissance totale est de 5,6 % à la fin des 7 min d'ischémie). Après cette chute initiale, le signal tend à se stabiliser, incomplètement toutefois. Une décroissance lente et continue persiste jusqu'à la fin de l'ischémie. Ceci est observable sur toutes les courbes individuelles comme cela est illustré sur la figure 66. A la reperfusion, le signal des images augmente rapidement en dépassant largement la ligne de base qui n'est de nouveau atteinte qu'après 3 min de restauration du flux sanguin. Les variations de la désaturation de la myoglobine Comme attendu, la désaturation de la myoglobine n'est pas immédiate après l'interruption de la circulation artérielle. Le point d'intersection des deux courbes se produit après environ 100 s d'ischémie (figure 66). La diminution du signal de l'image est presque achevée alors que la myoglobine commence à peine à se désaturer. En accord avec nos résultats précédents, la désoxygénation tissulaire va être complète en un peu moins de 6 min alors que la réoxygénation est obtenue en moins de 15 s après le rétablissement du flux artériel (Brillault-Salvat et al, 1997). 203

211 Intensité du signal musculaire (unités arbitraires) Désaturation de la myoglobine Temps (s) Figure 66 : Evolutions temporelles de la désaturation de la myoglobine et de l'intensité du signal pondéré T2* du muscle au cours du protocole. Les données expérimentales sont présentées sous la forme moyenne ± écart-type. Les signaux IRM et SRM sont stables pendant la période de repos représentant la ligne de référence. L'intensité du signal pondéré T2* du muscle, décroît immédiatement après le début de l'occlusion, contrairement à la désaturation de la myoglobine qui commence plus tard et plus lentement. A la reperfusion, l'intensité du signal en écho de gradient dépasse la ligne de base. Ce phénomène peut être attribué à l'augmentation du contenu en oxygène des veines mais aussi à l'effet Tl-dépendant de l'hyperperfusion du muscle. La désoxymyoglobine disparaît en moins de 15 s, en accord avec nos résultats précédents. Correspondance entre le signal pondéré T2* et la saturation de l'hémoglobine Sur la base des données du présent protocole, nous allons désormais chercher à établir la corrélation entre les variations du signal d'imagerie pondéré T2* et les variations de saturation de l'hémoglobine. Nous allons donc : - a) regarder la cohérence temporelle des événements physiologiques mesurés, - b) réaliser un modèle physiologique et le confronter à nos données expérimentales, (ce modèle physiologique est développé dans la discussion car c'est d'un élément spécifique de ce protocole) 204

212 - c) nous assurer de la dépendance des variations de T2* en fonction de l'intensité du champ Bo, sur la base de l'hypothèse de l'existence de l'effet BOLD, - d) comparer nos données pondérées T2* avec l'évolution du signal NIRS reflétant la saturation de l'hémoglobine. a) Confrontation temporelle des événements physiologiques mesurés (1) Ajustement des courbes Les ajustements individuels ont été réalisés sur la période recouvrant le repos et l'ischémie. La discussion qui suit porte presque exclusivement sur la période d'occlusion. La figure 67 montre les données expérimentales d'un sujet particulier et les meilleurs ajustements relatifs. L'analyse précédente des variations du signal d'imagerie au cours de l'occlusion artérielle nous a conduit à utiliser un ajustement à deux composantes pour chaque courbe. La première partie de la courbe est ajustée par une fonction exponentielle décroissante sur laquelle vient se superposer plus tardivement une droite de pente négative. L'ajustement, référençant le début du protocole comme origine du temps, identifie le début du raccourcissement du T2* à 118 ± 2 s avec une constante de temps exponentielle de 50 ± 4 s. Ces résultats confirment que la décroissance du signal est rapide et se produit immédiatement après le début de l'occlusion, le brassard ayant été gonflé à 120 s. L'ajustement révèle également que la composante linéaire plus lente débute après 289 ± 27 s d'ischémie. Les données de désaturation de la myoglobine ont été ajustées selon un modèle continu à 3 segments linéaires. Un modèle comparable à trois segments a été détaillé dans le chapitre ÏÏ.H.4 de ce manuscrit. L'ajustement situe l'instant initial et final de désaturation de la myoglobine à 60 ± 14 s et à 213 ± 22 s d'ischémie. 205

213 Intensité du signal musculaire (unités arbitraires) Désaturation de la myoglobine (%) o V \ «s \ \ m m "s m m ' m i o c c Temps (s) Figure 67 : Exemple de l'intensité du signal pondéré T2* et de la désaturation de la myoglobine enregistrés simultanément au repos et pendant l'ischémie chez un volontaire. Les meilleurs ajustements des données expérimentales sont représentés en trait plein. L'intensité du signal des images en écho de gradient et de la désaturation de la myoglobine sont ajustés respectivement par des modèles exponentiel-linéaire et linéaire. (2) Interprétation de la chronologie des paramètres mesurés Un ajustement moyen a été construit pour les deux variables en calculant la moyenne des paramètres déterminés pour chaque fonction d'ajustement. Ces courbes sont présentées sur la figure 68A. Elles confirment que la décroissance exponentielle rapide du signal d'irm pondéré T2* se produit avant la désaturation de la myoglobine. Sachant que l'hémoglobine a une constante de dissociation plus élevée que celle de la myoglobine (Pso,Hb > 10 xp5o,mt>)> la désoxygénation de l'hémoglobine pendant l'ischémie doit nécessairement débuter avant la désoxygénation de la myoglobine, à moins, mais il n'y a pas de raison pour cela, que l'oxygène ne puisse pas diffuser du compartiment vasculaire vers le milieu cellulaire. Cet argument constitue une première indication en faveur de la participation de l'hémoglobine à la décroissance précoce du signal d'imagerie en écho de gradient pendant l'occlusion. Afin de mieux comprendre l'origine de la composante linéaire tardive de la décroissance du signal, des expériences supplémentaires ont été menées avec des périodes d'occlusion plus longues. Trois des 5 volontaires ont répété le même protocole avec une ischémie de 15 minutes. Chez ces 3 sujets, la décroissance linéaire se poursuit toute la durée de l'occlusion, même après que la myoglobine ait franchi le stade de désaturation complète. Cette observation écarte toute contribution de la myoglobine dans cette seconde phase de 206

214 - décroissance du signal pondéré T2* des images. La non contribution de la myoglobine devait être vérifiée puisque les points de départ de la désaturation de la myoglobine et de la composante linéaire coïncidaient. De plus, la myoglobine est paramagnétique et, bien que considérablement diluée dans le cytoplasme, sa désaturation aurait pu engendrer des gradients intra-voxel supplémentaires responsables de cette décroissance tardive en T2*. Une autre explication possible pour ce phénomène de décroissance linéaire concerne la désoxygénation progressive de l'hémoglobine présente dans les vaisseaux en amont et en aval des capillaires. L'oxygène stocké dans ces structures n'est pas directement échangeable mais peut être lentement relâché par un phénomène de «diffusion longitudinale» le long de l'arbre vasculaire. Cette hypothèse est appuyée par l'observation directe de l'assombrissement de la lumière des vaisseaux sanguins lors d'un protocole similaire et dans des conditions comparables d'acquisition des images (Toussaint, communication personnelle). A 1.01 Ajustement moyen du signal musculaire Ajustement moyen de la (unités_arbitraires) désaturation de Mb (%) IX 0.99 / y/ >/ / X 0.93 B 90 Modélisatio n de la satur; ïtion de l'hb (%) -40 M Jdélisation de la désaturation de lan/ib (%) J 60 / / X 10 / X -10 -X -X c ) Temps (s) Figure 68 : Ajustement moyen des données expérimentales (A) et modélisation de la saturation de l'hémoglobine et de la myoglobine (B) au repos et pendant l'occlusion. La forte coïncidence temporelle entre les désaturations expérimentales et simulées de la myoglobine valide notre modèle. La superposition des données (A) et du modèle (B) révèle une grande similitude entre les évolutions temporelles du signal expérimental pondéré T2* et de la saturation simulée de l'hémoglobine. 207

215 b) Modélisation et confrontation avec les données expérimentales (1) Modélisation Nous avons développé un modèle qui prédit l'évolution temporelle de la désaturation de la myoglobine et de l'hémoglobine pendant l'ischémie du membre. Le modèle repose sur des données physiologiques connues de l'oxygénation tissulaire et utilise des constantes bien documentées et fiables disponibles dans la littérature. Le but est de construire les courbes de désaturation de la myoglobine et de l'hémoglobine, indépendamment des données RMN, afin de pouvoir les confronter avec nos données expérimentales en imagerie T2* et en spectroscopie de la myoglobine. Pour tester la fiabilité de notre modèle, nous allons ainsi superposer la courbe de désaturation de la myoglobine calculée, à celle mesurée lors de l'expérience. Si les deux coïncident, les hypothèses et les constantes physiologiques à la base du modèle seront supposées correctes et la modélisation de la courbe de l'hémoglobine pourra alors être considérée comme une estimation réaliste du phénomène de désaturation pendant l'ischémie in vivo. H restera ensuite à confronter la courbe de référence modélisée de désaturation de l'hémoglobine à la courbe des changements expérimentaux mesurés sur les images T2*, pour savoir si les variations mesurées sont le reflet ou non de la désoxygénation du sang capillaire. Considérons le contenu total en oxygène d'un tissu. L'oxygène est réparti dans les compartiments artériels, veineux, capillaires, interstitiel et cellulaire. 02*- =O 2m + O 2vea + O 2capil +O 2interst + O 2intracel [38] Seuls les trois derniers secteurs contiennent de l'oxygène directement consommable après l'arrêt brutal de la circulation, comme c'est le cas dans notre étude. De plus, l'oxygène se présente soit à l'état dissous dans le milieu soit lié à un transporteur. ^icapo. ~ ^ 2 libre capu ~*~ ^2Hbcapil tintera = ^2libre interst ^ 2 intracel ~ ^ 2 libre intracel ~*~ ~ 2 Mb intracel 208

216 On peut exprimer l'oxygène rapidement échangeable sous la forme : O 2lissu =O 2libre +O 2Hb +O 2Mb, [42] avec O 2libre =k sol -Po 2 -Vol muscle [43] 02M=Cap 02M \Hb tot ) capu -Vol capil.s 02, Hb - [44] O 2Mb =Cap Oi^\Mb M )^ -Vol^.S^ [45] k so i : constante de solubilité de YO2 dans l'eau, P02 : pression partielle en O2, Voly : volume du compartiment Y, Pour la suite des constantes, Xb représente soit Hb (Hémoglobine) soit Mb (Myoglobine). Capo2,xb : pouvoir oxyphorique de Xb, So2,xb : saturation en O2 de Xb, (exprimée par l'équation de Hill) [Xb t ot]y : concentration totale (libre et lié) de Xb dans le compartiment Y. L'équation de Hill est formulée : n Xb n D n Xb, D n Xb ~50,Xb + ~O 2 [46] avec nxb, le coefficient de Hill de Xb et rappelons que Pso,xb correspond à la P02 à 50 % de saturation de Xb. Pendant les premières secondes d'ischémie d'un muscle au repos, la consommation d'oxygène par les mitochondries (respiration mitochondriale) maintient son niveau de repos (Brillault-Salvat et ai, 1997) et le contenu musculaire d'oxygène évolue selon une fonction linéaire définie par l'équation : O 2tissu =O 2init -Vo 2 -t [47] où O2 init est le contenu en oxygène initial avant le gonflement du brassard. 209

217 Finalement, les équations [42] et [47] peuvent être réorganisées pour exprimer la P02 en fonction du temps : -Vol capil P"nb 1 D n Ht ~50,Hb "" ~O 2 + Cap O2, Mb.[MbJ-Vol is> 'O 2,Mb L^^^to/Jinmcd Y «"intracel L'équation [48] ne peut être résolue analytiquement, rendant impossible l'expression littérale de la P02 et donc de So2,Mb et So2,Hb en fonction du temps. Nous avons reformulé le problème en calculant le temps t associé à chaque P02 comprise dans la plage 0-40 torr correspondant aux états entièrement désoxygénés et de repos respectivement. A partir de l'équation [46], nous avons déterminé So2,Mb et So2,Ht>- Les quantités d'oxygène lié et libre ont été calculées à partir de [43-45]. Le contenu total en O2 et le temps t associé ont été obtenus à partir des équations [42] et [47]. A chaque valeur de P02, nous avons ainsi associé les résultats des équations [46] et [47] afin de créer des tables de saturation de l'hémoglobine et de la myoglobine correspondant à des instants t précis. La figure 69 résume ce cheminement permettant de simuler la progression de la désoxygénation de l'hémoglobine et de la myoglobine au cours d'une ischémie brève de la jambe. Les simulations sont illustrées sur la figure 68B. Elles reposent sur les constantes et les valeurs de référence suivantes injectées dans le modèle (Wittenberg, 1970; Guyton, 1976; Sjogaard et Saltin, 1982; Saltin, 1985; McArdle et al, 1986; Stryer, 1988; Geigy, 1990; Schenkman étal, 1997). Les constantes physiologiques du modèle sont : Volume capillaire = 1 % du volume musculaire Contenu en eau du muscle =77 % ksol = 0,003 ml O 2.torr" 1.100ml H2O 1 Cap O 2,Hb = Cap O 2,Mb= 1,36 ml.g" [Hb] = 15 g. 100ml sang' 1, [Mb] = 0,45 g. 100 g tissu" 1 Poids moléculaire de FHb : 64500, poids moléculaire de la Mb : P 5o,Hb = 26 torr, P 5o,Mb=2,3 torr nhb = 2,8; n\ib = 1 Consommation d'oxygène au repos (Vo 2 mito) : 0,0025 ml O2.100g tissu" 1.s" 1 210

218 Nous avons ici négligé le gradient de diffusion de l'oxygène entre le compartiment capillaire et intracellulaire. Un tel gradient aurait généré des valeurs différentes de P02 dans ces compartiments. En conséquence, une simulation tenant compte d'un gradient de diffusion tel que P02 Capii = 2x P02 mtracei a été réalisée. Les valeurs des P02 générées n'ont pas été significativement affectées, ce qui a justifié le fait que nous ayons négligé ce phénomène. PO2 50Mb Coeff.deHûl dèïamb CoeffiteHW del'hb ConàLdèscMAité fe 10 Sat. de Mb Sat. de Hb '2Mb '2Hb '2 libre '2 "zwt consommation do o Temps depuis début de l'occlusion Figure 69 : Séquence de calcul utilisée pour modéliser les saturations de l'hémoglobine et de la myoglobine pendant l'ischémie. Cette procédure permet de simuler les variations de saturation de l'hémoglobine et de la myoglobine en fonction du temps écoulé depuis l'interruption de la circulation. (2) Confrontation des expériences et de la simulation Les ajustements moyens des données expérimentales et les résultats de nos simulations présentent des similitudes frappantes, comme on peut le constater sur la figure 68. En ce qui concerne la désaturation de la myoglobine, les courbes modélisées et expérimentales connaissent des évolutions temporelles similaires et toutes deux identifient la désaturation de la myoglobine comme un processus non immédiat. Lors de la phase initiale de désaturation, une différence mineure entre les deux courbes peut toutefois être notée. Après 2 min 211

219 d'interruption de la circulation, les pourcentages de désaturation de la myoglobine atteignent 27 et 15 % respectivement. Ce désaccord provient de la forme non linéaire de la courbe de myoglobine simulée au tout début de la désaturation. Ensuite, les progressions des deux courbes sont semblables. A la fin de la période de désaturation, les deux évolutions sont en parfait accord puisque la moyenne des données expérimentales -établit la fin de la désoxygénation à 273 s après le début de l'ischémie alors que la simulation fournit une valeur de 277 s. En comparant les courbes moyennes et simulées, l'évolution plus lisse et plus progressive de la courbe moyenne de désaturation de la myoglobine est confirmée en fin d'occlusion. L'argument déjà avancé en faveur de cette distorsion se fondait sur la dispersion manifeste des réponses individuelles. La différence constatée pourrait aussi provenir de la simplicité du modèle développé qui considère une consommation d'oxygène constante dans le temps tout au long de l'ischémie. Or, la respiration mitochondriale est indépendante de la P02 pour des pressions en oxygène supérieures à 1 torr. En dessous de ce niveau, la respiration mitochondriale est directement influencée par la disponibilité de l'oxygène, et par conséquent, le taux de désaturation de la myoglobine est progressivement diminué, parallèlement à l'inhibition de la consommation d'oxygène par les mitochondries. Ce point est mentionné pour des raisons de clarté et d'exactitude. Comme c'est un phénomène tardif, il n'a pas d'influence sur la discussion des 4-5 premières minutes d'occlusion. La coïncidence temporelle satisfaisante entre les courbes simulées et les courbes mesurées de la désaturation de la myoglobine valide notre modèle et, par voie de conséquence, la simulation de la saturation de l'hémoglobine. La comparaison entre le signal expérimental en écho de gradient et la modélisation de la saturation de l'hémoglobine révèle aussi de profondes similitudes. La dynamique des deux courbes est très voisine. Par exemple, après 2 min d'interruption de la circulation, les diminutions respectives du signal pondéré T2* et de la simulation sont respectivement de 81 et 85 %. Les deux courbes montrent une décroissance importante au tout début de l'ischémie, processus presque achevé lorsque la myoglobine commence à se désaturer (figure 68). En conclusion, la simulation que nous proposons fournit un second argument en faveur d'une forte corrélation entre le signal IRM pondéré T2* et la saturation de l'hémoglobine du muscle squelettique. 212

220 c) Effet BOLD et dépendance du champ B o (1) Effet BOLD dans le muscle L'effet de l'oxygénation du sang sur la relaxation transversale du signal RMN a été amplement étudié. Depuis les descriptions initiales, ex vivo par Thulborn et al. (1981) et in vivo par Ogawa et al. (1990), le cerveau a fait l'objet de la plupart des travaux sur l'effet BOLD. L'existence de cet effet dans le cerveau n'est plus débattue (Weisskoff, 1995) et des contrastes BOLD ont même été décrits dans le coeur, les reins et le foie. La succession temporelle des désaturations de l'hémoglobine et de la myoglobine et les simulations indépendantes sont deux arguments importants qui corroborent l'existence de l'effet BOLD dans le muscle squelettique en condition d'ischémie. Au cours d'une occlusion du mollet, deux autres publications ont rapporté un profil de décroissance du signal pondéré T2* similaire à nos observations. Toussaint et al. (1996) à 1,5 Tesla, lors d'une description qualitative, n'avait pas corrélé ces variations à l'oxygénation. Van Kylen et al. (1997) à 3 Tesla a fait état d'une diminution semblable du signal de l'ordre de 5 à 7 % après 5 min d'ischémie. En revanche, Hajnal et al. (1996) à 1 Tesla, n'a pas mis en évidence de telles modifications du signal d'imagerie. Une faible sensibilité de ses conditions expérimentales aux modifications du T2* peut être une explication. En effet, les images collectées avec une séquence d'imagerie conventionnelle présentent une faible résolution temporelle (de 2 à 6 minutes) et une résolution spatiale élevée (1,1 mm x 2,2 mm) à l'origine d'un faible rapport signal sur bruit. Une autre raison peut résider dans la séquence utilisée pour évaluer le T2*. Les temps d'écho de 9 et de 60 ms de la séquence à double écho de gradient sont inadaptés à la détection optimale des variations de T2* puisque le maximum de sensibilité est obtenu pour TE = T2* (40 ms à 1 Tesla). Enfin, les constatations de Hajnal portent uniquement sur deux volontaires et une légère décroissance du signal a toutefois été observée sur l'une des deux expériences. 213

221 (2) Dépendance du champ B o Les variations du signal pondéré T2* obtenues dans plusieurs travaux à différents champs magnétiques Bo permettent d'établir une relation empirique entre ces deux paramètres. Une confrontation positive de nos données avec cette relation serait un argument supplémentaire en faveur de l'effet BOLD dans le muscle puisque le contraste BOLD présente une dépendance typique avec Bo. Les simulations et les expériences in vivo convergent pour proposer une dépendance entre le contraste BOLD et Bo. Fisel et al. (1991), après modélisation du compartiment vasculaire cérébral, a proposé la relation suivante : AR2* a Bo 1 ' 6 où R2* est le taux de relaxation transversale. Pour de faibles variations du signal, AR2* étant proportionnel aux modifications relatives du signal (SI) d'écho de gradient ASFSI si TE»T2*, on peut exprimer la relation sous la forme : ASI/SI a B 1>6 o. Cette modélisation est appuyée par la démonstration de Turner et al. (1993). En mesurant les variations du signal BOLD sur le cerveau au cours de stimulations visuelles chez l'homme, Turner a obtenu une même dépendance empirique de ces variations avec l'intensité de Bo, l'exposant de Bo se trouvant dans la gamme 1,5-1,8. Dans ce contexte, nous avons comparé nos résultats avec une étude antérieure menée à 1,5 Tesla. Après 5 min d'ischémie, Toussaint et al. (1996) a quantifié une décroissance du signal d'écho de gradient de 6,5 % avec un temps d'écho de 60 ms. Nos résultats à 3 T (Lebon et al, 1997) et ceux de Hajnal à 1 T et al. (1996) nous permettent d'interpoler une valeur du R2* de Toussaint de 30 s" 1 à 1,5 T. On peut donc calculer un ASI hypothétique de 1,8 % au même temps d'écho que le nôtre (15 ms). Cette variation relative de signal est à confronter au ASI de notre étude de 5,2 % après 5 min d'ischémie également. D'après l'ensemble de ces données, le signal d'écho de gradient sur le muscle ischémie varie selon une fonction puissance dont l'exposant est de 1,5. Ce résultat est cohérent avec les prédictions théoriques et le contraste BOLD déterminé sur le cerveau. Il s'agit du troisième élément qui plaide en faveur d'un effet BOLD du muscle, responsable des variations de signal en T2* constatées pendant l'ischémie. 214

222 d) Comparaison du signal pondéré 12* avec le signal NIRS Nos observations expérimentales peuvent être juxtaposées avec les mesures d'oxygénation musculaire effectuées par la technique NIRS. Cette technique a été mise en oeuvre par plusieurs groupes (Chance et al, 1988; Hampson et Piantadosi, 1988; Sahlin, 1992; De Blasi et al, 1993; Wariar et al, 1994) pour surveiller l'oxygénation du mollet au cours d'un protocole d'ischémie similaire au nôtre. H faut rappeler que le NIRS fournit un index global de l'oxygénation, sans discrimination des composantes vasculaire (hémoglobine) et tissulaire (myoglobine). Après la pose du brassard, le NIRS révèle une décroissance immédiate du niveau d'oxygénation, logiquement imputable à la désaturation de l'hémoglobine. Cette diminution est à mettre en parallèle avec la chute initiale du signal IRM en T2*. Les données recueillies par Sahlin et Wariar et al. mentionnent respectivement des constantes de temps de 2 min 20 s et 1 min 30 s pour l'oxygénation globale. Sachant que les contenus en hémoglobine et en myoglobine sont approximativement égaux (0,6 g d'hb et 0,4 g de Mb pour 100 ml) (Geigy, 1990; Carlier et al, 1994), l'intersection des courbes de désaturation de myoglobine et d'hémoglobine se produit quand Thème, pris dans sa globalité comme pour le signal NIRS, est à 50 % de désaturation. Ainsi, si les modifications du signal T2* sont couplées à la saturation de l'hémoglobine, le point d'intersection de nos deux courbes expérimentales doit correspondre à la constante de temps de désoxygénation proposée par le NIRS, ce qui est le cas puisque le croisement a lieu à 1 min 30 s après le début de l'occlusion. Parmi les 5 travaux portant sur le NIRS mentionnés plus haut, un seul comporte une ischémie dépassant les 8 min (Sahlin, 1992). B est intéressant d'y constater que sur les 20 min d'ischémie, l'enregistrement du signal NIRS dévoile une composante linéaire lente qui survient après 6 min d'occlusion et rappelle la décroissance linéaire constatée en IRM T2*. Le NIRS étant exclusivement sensible à la saturation de l'hémoglobine et de la myoglobine, cette évolution linéaire et constante peut être attribuée à un processus tardif de désoxygénation. Cette remarque conforte l'hypothèse émise sur cette phase tardive, potentiellement issue de la désoxygénation progressive de l'arborescence vasculaire. Cette interprétation doit être considérée avec précaution puisque la géométrie vasculaire peut être amenée à se modifier 215

223 pendant la période d'interruption de la circulation sanguine et peut affecter à la fois le signal NIRS et le signal d'écho de gradient RMN. 6. CONCLUSION ET PERSPECTIVES Les résultats de cette étude éclairent le rôle de l'oxygène dans le raccourcissement du T2* pendant une ischémie du muscle squelettique. A 3 Tesla, l'ischémie engendre une décroissance immédiate et significative du signal pondéré T2* des images IRM, une diminution linéaire et lente venant se superposer après environ 2 min d'ischémie. Plusieurs arguments plaident en faveur de la désoxygénation des capillaires pour expliquer la phase rapide de décroissance initiale du signal. Nous pensons que sur des images pondérées T2* de muscle ischémie, les changements du signal sont corrélés à la saturation en oxygène des capillaires en raison de : - l'enchaînement temporel de ce signal avec la désaturation de la myoglobine, - la coïncidence entre les courbes expérimentales et la modélisation physiologique des désaturations, - l'amplitude des variations du signal T2* vis-à-vis du champ Bo qui validerait l'existence de l'effet BOLD dans le muscle, - la similitude entre l'évolution temporelle du signal T2* et le signal NIRS qui reflète essentiellement la désaturation du compartiment vasculaire. Notre approche entrelacée IRM-SRM permet de surveiller simultanément l'oxygénation capillaire et intracellulaire. Cette exploration intégrée sera un outil utile et puissant pour étudier les pathologies musculaires résultants d'une altération du transfert d'oxygène des capillaires vers les myocytes. 216

224 E. OXYGENATION VASCULAIRE ET TISSULAIRE, PERFUSION ET METABOLISME AU COURS D'UNE EPREUVE D'ISCHEMIE- RECUPERATION CHEZ LE SUJET NORMAL (SEQUENCE PERFT2MP) 1. OBJECTIF Dans le cadre de nos explorations musculaires, les plus exhaustives possibles, nous cherchons à mettre au point une séquence permettant d'étudier, au cours d'une épreuve d'ischémie récupération, les couplages temporels entre : - l'oxygénation tissulaire, - le métabolisme énergétique et le ph intracellulaire, - les variations de la perfusion - l'oxygénation capillaire. Pour cela nous avons cherché à entrelacer, avec une résolution temporelle élevée, les modules suivants : - le module de spectroscopie proton de la myoglobine pour évaluer l'oxygénation tissulaire, - le module de spectroscopie phosphore permettant de contrôler l'activité des oxydations phosphorylantes des mitochondries, - le module d'imagerie par échos de gradient multiples (Lebon et al, 1997b) sensibilisé au Tl (TR«T1) et au T2* (N échos) de façon à mesurer simultanément les variations de perfusion et l'oxygénation capillaire. En effet, les changements de saturation de l'hémoglobine ont été corrélés aux variations du signal pondéré T2* dans le protocole précédent (T2Myo). La séquence par échos de gradient multiples présente l'avantage intrinsèque de distinguer les deux composantes physiologiques, alors que jusqu'à présent, les différentes séquences RMN étaient plus ou moins sensibilisées à la perfusion ou à l'oxygénation (Ogawa et al, 1990; Detre et al, 1992). 217

225 2. LA SEQUENCE «PERFT2MP» Jusqu'alors, nous avons mis en oeuvre des séquences RMN faisant appel uniquement au noyau proton. L'introduction de la SRM du 31 P au sein de nos séquences est à l'origine de la conception de l'interface électronique décrite au chapitre H.F. et d'une gestion singulièrement plus complexe des paramètres expérimentaux puisque les tailles des vecteurs d'acquisition en proton et en phosphore sont très différentes. Le TR requis pour la mesure de la perfusion musculaire par la méthode du Tl apparent est de 234 ms (chapitre H.D.3.b.) alors que l'échantillonnage du dernier écho de la séquence d'imagerie se fait à un temps d'écho de 41 ms. Le temps restant, environ 193 ms, offre la possibilité d'insérer de nombreuses acquisitions complémentaires. D'un point de vue pratique, des signaux spectroscopiques en proton de la myoglobine et en phosphore ont été ajoutés (Brillault-Salvat et al, 1997). La séquence entrelacée «PerfT2MP» (pour Perfusion/T2*/ Myoglobine/Phosphore), représentée figure 70, a toutefois généré quelques problèmes méthodologiques. H a fallu tenir compte de la résolution spatiale et temporelle des images, de la cinétique de chaque variable et du rapport S/B de tous les metabolites recherchés. Ainsi, cette séquence réitère 16 fois le même enchaînement d'instructions. Cet enchaînement comprend 3 blocs consécutifs identiques constitués de 10 échos d'imagerie suivi de 11 impulsions de myoglobine puis un quatrième bloc regroupant la série de 10 échos, suivie d'une impulsion phosphore et de 5 excitations RF de myoglobine. A chaque série d'échos de gradient, le pas d'encodage de phase est incrémenté afin d'enregistrer les 64 lignes de l'image. A chaque répétition toutes les 15 secondes, une série de 10 images aux 10 temps d'échos est collectée. Le laps de temps résiduel autorise l'acquisition séquentielle de 608 acquisitions de myoglobine et de 16 signaux phosphores. Pour des questions de résolution temporelle, nous avons fixé le temps de répétition effectif des impulsions de myoglobine à 14 ms et celui des impulsions de phosphore à 1 s, ce qui ne satisfait pas les conditions de relaxation complète. 218

226 16 boucles canal 1 H 3 itérations canal 31 P canal 1 H 5 scans \ RF MRI DMB- 1 H MRS MRI 31 P MRS )MB - 1 H MRS Gr_ Gp Figure 70 : Représentation de la séquence PerjT2MP permettant l'enregistrement simultané de la perfusion, du T2*, de la saturation en oxygène du tissu et des concentrations des phosphates. Ainsi, cette séquence réitère 16 fois le même enchaînement d'instructions. Cet enchaînement comprend 3 blocs consécutifs identiques constitués de 10 échos d'imagerie suivis de 11 impulsions de myoglobine puis un quatrième bloc regroupant la série de 10 échos, suivie d'une impulsion phosphore et de 5 excitations RF de myoglobine. A chaque série d'échos de gradient, le pas d'encodage de phase est incrémenté afin d'enregistrer les 64 lignes de l'image. A chaque répétition, une série de 10 images aux 10 temps d'échos est collectée toutes les 15 secondes en intercalant 608 signaux de myoglobine et 15 signaux phosphore. Les paramètres d'acquisition sont : Pour les images : 0 pi = sinc3-3 ms 0 TR= 15 s, matrice = 128x64 0 FOV= 16 x 16 cm, épaisseur = 8 mm 0 SW = 50 KHz, FW=50 KHz 0 NI =10 Pour les spectres de myoglobine : 0 p2 = tomogauss is - à 8700 Hz 0 TR=ls 0 SW = 50KHz 0 TD = 256, Tacq = 5,12 ms 0 NS = 38 Pour les spectres phosphores: 0 p3 = impulsion rectangulaire- 200 jxs 0 TR=ls,NS=l 0 TD=1536, SW=13KHz 0 Tacq = 120 ms Les paramètres des «ACQP» sont : 0 acq_size[0] = 256, acq_size[l] = 64 0 ACQ_phase_factor = 64 0 NI=16,NS=1 0 NR =

227 Le cumul total des points recueillis à chaque répétition doit correspondre à la place mémoire réservée pour chaque objet insécable de l'acquisition : [(TDimxNécho)+(TDmyoxNmyol) ] x 3 + [(TDimxNécho) + TDphos + (TDmyoxNmyo2) ] = (acq_size[0]/2) x NI x ACQ_phase_factor avec TDim = 128, Nécho = 10, TDmyo = 256, Nmyol = 11, Nmyo2 = 5, TDphos = REDISTRIBUTION DES DONNÉES BRUTES Une automation spécifique réorganise les trois différents types de données dans trois fichiers indépendants. Les échos d'imagerie sont rassemblés séquentiellement dans un fichier pour pouvoir être traités par un logiciel spécifique développé par l'auteur de la séquence d'échos de gradient multiples (H.D.3.b.). Le second fichier regroupe les FIDs de myoglobine résultant chacun de l'addition des 38 signaux collectés chaque seconde. Chaque FID phosphore, récolté toutes les secondes, est déplacé vers un troisième fichier. Afin de ne pas surcharger le graphique tout en conservant une dynamique suffisante, les signaux de myoglobine et de phosphore ont été respectivement cumulés toutes les 2 et 8 s au cours des 13 minutes d'acquisition. 4. PROTOCOLE Le volontaire est couché sur le lit d'examen avec un brassard pneumatique placé au niveau de la cuisse et un autre au dessus de la cheville. La sonde proton Helmholtz est utilisée pour l'obtention des images et des spectres en proton. La sonde de surface émission-réception phosphore est située au tiers proximal des muscles jumeaux. Le protocole expérimental consiste à acquérir sur le mollet du sujet 50 séries de données entrelacées répétées toutes les 15 secondes. Ces 50 répétitions correspondent à 1 min d'acquisition au repos, 9 min d'ischémie induite par le gonflage du brassard cuisse à 230 torr et 2 min 30 s d'hyperémie réactionnelle suite au rétablissement du flux artériel. 220

228 5. RESULTATS a) Pendant l'interruption de la circulation Dès la pose du brassard à 230 ton, la perfusion est supposée nulle. On constate de manière cohérente avec le protocole précédent (R2* = 1/T2*), que le signal capillaire diminue selon une exponentielle au début de l'occlusion, comme illustré sur la figure 66. A partir de 2 minutes d'ischémie, cette désaturation se poursuit plus progressivement en adoptant une cinétique linéaire. Le contenu capillaire en désoxyhémoglobine augmente, raccourcissant le T2*. L'augmentation du R2* s'établit à 5 % à la fin des 9 min d'occlusion. Comme escompté, la myoglobine est désoxygénée à 100 % après 6 min d'ischémie. Le signal atteint alors un plateau qui se maintient jusqu'à la fin de l'occlusion. Parallèlement, le rapport Pi/PCr a pratiquement doublé, passant de 0,17 au repos à 0,33 à la fin des 9 minutes d'occlusion. b) A la reperfusion Après relâchement du brassard, le débit sanguin est considérablement augmenté. H s'ensuit immédiatement une hyperémie réactionnelle à l'origine d'un pic de perfusion après 30 s qui s'établit à lloml.loog^.min" 1. Après 45 s, le débit descend à 80ml. 100g" 1.min" 1, puis à 40 ml.loog^.min" 1 à la fin de la première minute en retournant progressivement à sa valeur de repos. L'oxygénation capillaire montre tout d'abord une dynamique de récupération plus lente que celle du flux ; le R2* minimum est atteint après 1 min. De plus, une hyperoxygénation est observée au niveau des capillaires puisque le R2* chute de 14 % au dessous de sa valeur de base qui n'est retrouvée qu'après 3 min de récupération. Les cellules musculaires sont entièrement réoxygénées en moins de 12 s, en accord avec nos valeurs déjà rapportées (cf. résultats du protocole "PerfMyo", chapitre H.C.5.a). La restauration en oxygène du tissu musculaire se produit donc avant même la fin de l'hyper-oxygénation observée au sein des capillaires. On peut en déduire qu'à ce stade, l'oxygénation tissulaire est découplée de l'oxygénation capillaire qui doit être régulée par un autre mécanisme. Tout au long de l'épreuve d'ischémie et de la phase de récupération, l'atp non représenté sur les courbes reste stable. L'apport d'oxygène permet une récupération progressive du rapport Pi/PCr qui met environ 60 s pour retrouver sa valeur de repos. 221

229 Perfusion (ml.100g- 1.mirr 1 ) 120 T Temps (s) Désaturation de la myoglobine (%) Temps (s) Ischémie Temps (s) Figure 71 : Evolution temporelle de la perfusion, du R2*, de la désaturation de la myoglobine et du rapport Pi/PCr au cours du protocole d'ischémie-récupération chez un individu sain de 26 ans. Le pic de perfusion de 110 ml. 100g' 1.min' 1 est détecté à 30 s après rétablissement du flux sanguin. L'hyperoxygénation capillaire met 3 min pour retrouver son niveau de base alors que les réserves en oxygène sur la myoglobine se rétablissent en moins de 12 s. Le rapport Pi/PCr qui avait doublé en 9 min d'occlusion, se normalise après 60 s environ de récupération. 222

230 6. DISCUSSION L'analyse de la courbe de perfusion et du R2* pendant l'occlusion souligne un découplage effectif généré par la séquence entre les deux composantes de l'apport en oxygène au tissu musculaire. En effet, les variations du T2* lors de la désoxygénation capillaire, n'entraînent aucune modification simultanée du signal de perfusion. Réciproquement, on peut prédire une insensibilité des variations de Tl face aux changements de saturation de l'hémoglobine au cours de l'hyperémie réactionnelle. Les mesures du T2* sont cohérentes avec celles obtenues par une séquence d'écho de gradient classique. En accord avec les résultats antérieurs, nous confirmons les variations plus importantes du T2* à 3 T qu'à 1,5 T pour des protocoles comparables (Toussaint et al, 1996). En considérant la levée de l'occlusion comme origine des temps, nos résultats montrent une hyperoxygenation qui atteint un maximum après une minute. Cette hyperoxygenation est découplée de l'hyperperfusion puisque le pic hyperémique est lui atteint après 30 s seulement. L'absence manifeste de couplage entre ces deux phénomènes que nous venons de mettre en évidence sur la jambe lors de l'hyperémie réactionnelle, rappelle des observations similaires faites sur le cerveau, qui faisaient état d'un découplage entre la perfusion et l'oxygénation au cours de stimulations cérébrales (Kriiger et al, 1996). Cette hyperoxygenation capillaire ne peut pas non plus s'expliquer par un mécanisme de recharge en oxygène des réserves situées au niveau de la myoglobine puisque les myocytes montrent, bien plus précocement (en moins de 15 s), une resaturation complète en oxygène. En revanche, la cinétique d'hyperoxygenation capillaire semble davantage liée au temps de normalisation du rapport Pi/PCr. Une ischémie simple de 9 min ne permet pas de diminuer la PCr de 30 % par rapport à son niveau de base pour pouvoir ensuite, lors de la reperfusion, ajuster les données expérimentales à un modèle exponentiel, ce qui permettrait d'en déduire précisément la constante de temps de récupération (Mahler, 1985). 223

231 S'il n'est pas possible de confronter nos résultats dans leur globalité avec d'autres travaux, on peut toutefois analyser indépendamment certaines de nos mesures. Toussaint et al. (1996) ont mesuré la perfusion musculaire par la technique RMN du Tl app lors d'un protocole analogue. Us ont proposé une valeur de 103 ml. 100g" 1.min" 1 avec une résolution temporelle beaucoup plus faible. Pour comparer les résultats, nous avons donc dû faire la moyenne de nos mesures d'hyperperfusion sur la première minute, établissant alors une valeur de 57 ml.loog^.min" 1. La raison de la différence importante entre les deux valeurs peut partiellement provenir de notre meilleure suppression de la contribution macrovasculaire dans la mesure de perfusion. Cette suppression a été rendue possible grâce à la procédure de traitement mise en oeuvre pour exclure les pixels ayant une décroissance en T2* typique impropre (c.f.ii.d.3.b). La valeur que nous proposons est supérieure aux évaluations par les méthodes de pléthysmographie RMN, ou par jauges de contraintes, ou encore par la technique de clairance du xénon (gamme 20 à 50 ml. 100g" 1.min" 1 ) qui sont généralement reconnues pour minimiser l'estimation du débit sanguin. Il faut toutefois indiquer que le rafraîchissement de l'eau des artérioles et des veinules affecte les variations du Tl app, ce qui se traduit probablement par une surestimation de la perfusion musculaire. La technique d'échos de gradient multiples souffre cependant, comme les autres méthodes reposant sur les variations du Tl liées au flux, de l'insuffisance de sensibilité de la RMN pour détecter des niveaux de débit sanguin artériel de l'ordre de la perfusion de repos (3 ml. 100g" 1.min" 1 ), ce qui correspond à des modifications de 0,07 % du signal à temps d'écho nul. Nous bénéficions pourtant d'un haut champ, ce qui est un avantage notable pour cette technique puisque les variations de perfusion dépendent du Tl du muscle, lui-même fonction du champ Bo. Ainsi, pour une augmentation de la perfusion de 50ml.l00g" 1.min" 1, le changement de signal est de 1,2 % et 0,7 % à 3 T et 1,5 T respectivement (Lebon et al, 1997). Les variations du ratio Pi/PCr sont remarquablement cohérentes avec notre étude préliminaire recueillant le signal des phosphates au décours d'une ischémie simple prolongée de la jambe. 224

232 7. CONCLUSION Nous avons démontré, par ce protocole, la faisabilité d'une mesure simultanée, à haute résolution temporelle, des variations de la perfusion musculaire, de l'oxygénation tissulaire et vasculaire, et du métabolisme oxydatif, au cours d'une ischémie. Cette approche a également utilisé une séquence d'imagerie novatrice basée sur des échos de gradient multiples. L'atout primordial de cette séquence est en effet de pouvoir réaliser des mesures quantitatives localisées de la perfusion musculaire, alors que la pléthysmographie RMN ne permet qu'une détermination globale sur le segment de membre étudié. Enfin, grâce à cette approche hétéronucléaire entrelacée, nous avons relevé à la reperfusion, une hyperoxygénation capillaire prolongée qui ne peut s'expliquer ni par une relation avec l'hyperperfusion, ni par le mécanisme de recharge en oxygène des myocytes, mais éventuellement par un lien avec le temps de normalisation du rapport Pi/PCr. Cette dernière hypothèse reste à vérifier. Notre approche intégrée devrait permettre de préciser, à la récupération d'un exercice, le lien suspecté entre le temps de resaturation de l'hémoglobine et le taux de resynthèse de la PCr, c'est-à-dire la capacité oxydative maximale apparente des mitonchondries à synthétiser l'atp. Une cartographie précise de la perfusion et de l'oxygénation, couplée à l'évaluation du métabolisme énergétique, pourrait permettre de mieux appréhender et localiser sur les divers groupes musculaires les troubles perfusionnels, diffusionnels et métaboliques rencontrés dans certaines pathologies, comme le sepsis notamment. 225

233 This page is Intentionally left blank.

234 F. EVOLUTION DES DIVERS METABOLITES AU COURS DE L'EXERCICE ISCHEMIQUE CHEZ LE SUJET SAIN (SEQUENCE MYOPHOS) 1. OBJECTIF Jusqu'à présent notre approche combinée imagerie/spectroscopie s'est portée sur l'exploration musculaire au cours des phases d'ischémie et de reperfusion. Le travail musculaire est un puissant stimulus entraînant une adaptation locale de l'hémodynamique et du métabolisme. Par rapport au repos, le test d'effort amplifie la dynamique des phénomènes physiologiques, ce qui facilite l'exploration chez le sujet sain et permet en plus de révéler de manière discriminante les muscles pathologiques. En complément de la phase d'exercice, il est également intéressant de suivre la récupération à l'épreuve de sensibilisation, en raison des informations additionnelles importantes sur les capacités oxydatives mitochondriales qui témoignent de l'efficacité du métabolisme énergétique du muscle (en autres la vitesse de resynthèse de la PCr et le retour du ph intracellulaire à la normale). Nous allons donc maintenant nous intéresser à des protocoles d'exercice musculaire anaérobie suivis de leur phase de récupération aérobie. Ces phases nous renseigneront respectivement sur le métabolisme glycolytique et sur le métabolisme oxydatif. Ainsi nous avons premièrement cherché à mettre en oeuvre un protocole d'exercice anaérobie, réalisé sur ergomètre répondant aux conditions suivantes : - durée de l'examen RMN la plus courte possible, sachant toutefois que les informations complémentaires collectées pendant la période d'effort ne rallongent en rien la durée de l'examen puisque cette étape est indispensable à l'observation de la phase de récupération, - obtenir une chute du signal de la PCr d'au moins 30 % par référence au repos, pour qu'à la levée de l'occlusion, la resynthèse d'atp suive une cinétique du premier ordre pour caractériser la capacité oxydative maximale apparente des mitochondries (Mahler, 1985; 227

235 Polack et al, 1988). Dans ce contexte, l'exercice ischémique est intéressant car il provoque une chute plus rapide de la PCr qu'un exercice aérobie de même intensité, - garantir une désaturation complète de la myoglobine pour mesurer, lors du rétablissement du flux artériel, le temps de resaturation. Comme nous l'avons déjà mentionné, un effort en condition anaérobie épuise rapidement les réserves en oxygène du muscle et assure une vasodilatation importante. Ce protocole est piloté par la séquence de spectroscopie «MyoPhos» destinée à sonder : - le métabolisme énergétique et le ph intracellulaire par la SRM P, - l'oxygénation tissulaire par la spectroscopie proton de la myoglobine. Comme la cinétique de variation des metabolites observés au cours de l'effort n'est pas rapide, la résolution temporelle, dans ce cas précis, n'a pas été une contrainte pour le développement de la séquence. Les processus de récupération de l'épreuve d'exercice ischémique sont enregistrés par la séquence «PerfMyoPhos» qui fera l'objet du sous-chapitre suivant. 2. LA SÉQUENCE «MYOPHOS» La séquence implémentée comporte uniquement des acquisitions de spectroscopie. Elle doit permettre de recueillir simultanément le signal en proton de la myoglobine et le signal des divers phosphates au cours du travail musculaire. Etant donné la faible concentration de la myoglobine par rapport aux composés phosphorylés (rapport 1 à 40 environ), 36 FIDs de myoglobine sont accumulés pour un signal phosphore. Les 36 impulsions successives de myoglobine sont effectuées à intervalles réguliers toutes les 50 ms, en condition de relaxation complète. Les cinétiques des processus de désaturation de la myoglobine et de depletion des phosphates sont relativement lentes comparées à la cinétique de l'hyperémie réactionnelle. Le TR de 3 s de cette séquence laisse le temps au signal de PCr et de Pi de se relaxer suffisamment. L'addition des signaux (NA) vise non seulement à limiter le volume des données collectées, mais également à améliorer le rapport signal sur bruit. Ainsi, 360 accumulations de myoglobine et 10 signaux phosphores sont enregistrés toutes les 30 s. 228

236 3. PROTOCOLE Sur ces bases, nous avons élaboré un protocole d'effort à résistance constante. Ce protocole commence par deux minutes de repos, une minute d'ischémie simple est ensuite imposée en gonflant un brassard à 230 torr. L'occlusion artérielle est conservée pendant 3 minutes supplémentaires alors que le volontaire effectue des flexions plantaires à 50 % de la FMV. Il a été demandé aux volontaires de synchroniser le rythme de leurs contractions, à une fréquence de 0,33 Hz, sur l'impulsion de gradient introduite dans la séquence comme métronome. La sonde proton Helmholtz est utilisée à l'émission comme à la réception. La sonde de surface P est disposée en regard de la loge postérieure qui produit l'effort dans ce cas précis. Le bon déroulement de l'exercice est contrôlé sur l'ordinateur relié à l'ergomètre. Les paramètres expérimentaux sont les suivants : Pour les acquisitions de myoglobine : 0 TR = 50 ms, NS = 360 toutes les 30 s 0 SW = 50 KHz, TD = Tacq = 5,12 ms Pour les acquisitions en phosphore : 0 TR = 3 s, NS = 10 toutes les 30 s 0 SW = 50KHz,TD = Tacq = 144 ms Dans les «ACQP» : NR= 12, NA= 10, FW= 50 KHz, acq_size[0]= 512, acq_size[l] = 64, ACQ_phase_factor=64. Les paramètres doivent vérifier la relation : [ (TDmyo x Nmyo)+(TDphos) ] = (acq_size[0]/2) x ACQ_phase_factor avec TDmyo = 256, Nmyo = 36, TDphos =

237 4. RESULTATS ET DISCUSSION La figure 72 illustre les profils métaboliques observés au cours du protocole. La première minute d'ischémie simple ne modifie pas les concentrations de PCr et de Pi, il s'agit d'une courte période sans effort. Ces résultats ont déjà été rapportés par Klabunde et al. (1979) chez l'animal puis par Blei et al. (1993) lors d'explorations humaines et signifient qu'une courte ischémie n'altère pas le métabolisme mitochondrial de repos. En cette phase initiale d'ischémie, ces observations sont cohérentes avec le maintien du niveau d'atp par la glycolyse en raison de la faible consommation d'atp au repos. Le ph reste également stable. Au cours de la phase d'exercice qui suit immédiatement, la diminution de la PCr est concomitante à l'augmentation du Pi. Le travail anaerobie déployé à la charge de 115 N (50 % de la FMV) a pour effet de désaturer entièrement la myoglobine 2 min et 30 s après l'interruption de la circulation. En fin d'exercice, la PCr a chuté de 50 % par rapport à sa valeur de repos alors que le Pi a triplé. Le ph diminue graduellement au cours de l'épreuve pour atteindre une valeur de 6,6 à la fin des 3 min d'exercice ischémique. 120 T- I I I I I I I I 6, Temps (s) A Désaturation de la myoglobine (%) *: PCr - Pi «ph Figure 72 : Profils métaboliques au cours d'un protocole comportant 1 min de repos, 1 min d'ischémie simple et 4 min d'exercice ischémique. L'exercice consiste en des flexions plantaires à 50 % de la FMV. Dans ces conditions, la désaturation totale de la myoglobine est obtenue après 3 min d'occlusion. Le ph atteint en fin d'exercice est de 6,6. L'analyse des résultats de ce protocole nous conduit à proposer un nouveau protocole d'effort avec une augmentation de la fréquence de l'exercice. 230

238 Désormais, pour les toutes les autre sessions RMN ayant recours à ce type d'exercice, le protocole recouvre 1 min de ligne de base, suivie d'une minute d'ischémie et de 3 min de contractions en condition anaérobie à une fréquence de 0,5 Hz (au lieu de 0,33 Hz) ce qui permet d'augmenter la quantité de travail fourni dans le même intervalle de temps. Nous nous sommes assurés que tous les sujets sains motivés ont bien achevé cette épreuve de provocation. Le temps de répétition de la séquence a été adapté au rythme des flexions. Le délai nécessaire au chargement des paramètres en vue de l'enregistrement de la récupération rallonge de 30 secondes environ la période d'occlusion. H est en effet possible de stopper l'exercice sans collecter immédiatement le signal de récupération car Taylor et al. (1983) puis Blei et al. (1993) ont montré qu'il ne se produisait pas de rephosphorylation de la creatine tant que l'ischémie est maintenue. Ainsi, pour des individus fatigués avant la fin des 3 minutes d'exercice, les contractions peuvent être stoppées, en conservant l'occlusion jusqu'à la fin de la session d'acquisition en cours, sans conséquence sur l'évolution de la phase de récupération. 5. CONCLUSION Nous avons optimisé un protocole d'exercice anaérobie qui répond aux conditions que nous nous étions fixées (épreuve de courte durée, chute de PCr d'au moins 30% et désaturation complète de la myoglobine) et que nous utiliserons dorénavant. Chez les volontaires sains engagés, les modifications des divers composés mesurés se sont avérées très reproductibles pour un rythme de contraction toutes les 2 s à 50 % de la FMV, le travail dépensé l'étant également (W = 482 ± 54 J sur 24 expériences - stimulus identique). 231

239 This page is intentionally left blank.

240 G.RECUPERATION A L'ISSUE D'UNE EPREUVE D'EXERCICE ISCHEMIQUE CHEZ LE SUJET SAIN : MESURE DE LA PERFUSION, DE L'OXYGENATION TISSULAIRE ET DU METABOLISME ENERGETIQUE, DETERMINATION DE L'EXTRACTION D'OXYGENE (SEQUENCE PERFMYOPHOS) 1. OBJECTIF Comme nous l'avons indiqué au sous chapitre précédent, nous allons maintenant étudier la phase de récupération à l'issue d'une épreuve ischemique. L'objectif est d'explorer, pendant cette phase, les couplages entre la perfusion, l'oxygénation tissulaire et le métabolisme énergétique du muscle squelettique. La cinétique des phénomènes mis en jeu au cours de la reperfusion est rapide, ce qui implique la mise en oeuvre d'une séquence permettant l'acquisition dynamique à haute résolution temporelle. Cette séquence, nommée «PerfMyoPhos», réalisera la mesure concomitante de : - la perfusion par pléthysmographie RMN, - l'oxygénation tissulaire par spectroscopie proton de la myoglobine, - la distribution des phosphates énergétiques et du ph intracellulaire par la SMR en 31 P. Nous avons également pour objectif de calculer, aux premiers instants de la reperfusion et pour chaque individu, l'extraction musculaire d'oxygène. Dans le cas précis de la récupération post exercice ischemique, ce calcul d'extraction requiert, à la différence du protocole «PerfMyo», la détermination de la consommation mitochondriale d'oxygène. Enfin, nous avons souhaité évaluer la reproductibilité de cette séquence en réitérant le protocole à quatre reprise, sur chaque volontaire sain recruté. 233

241 2. LA SEQUENCE «PERFMYOPHOS» A chaque répétition de la séquence «PerfMyoPhos», représentée sur la figure 73, une image en écho de gradient, un spectre de myoglobine et un spectre phosphore sont collectés simultanément. Dans la séquence, une boucle entrelace chaque écho de gradient avec un FID de myoglobine. Ce segment est répété autant de fois qu'il y a de pas d'encodage de phase prescrits pour acquérir l'image. La séquence se termine par l'enregistrement d'un FID en phosphore. La perfusion est estimée par la technique de pléthysmographie RMN. Cette séquence est la plus exigeante de toutes en terme de résolution temporelle, ce qui limite à 64 le nombre de pas d'encodage de phase de l'image. La manoeuvre plethysmographique provoque un changement de volume principalement selon la direction de la gravité. Etant donné l'anisotropie de la résolution de l'image (128x64), les gradients de lecture et de phase sont inversés de manière à obtenir la meilleure résolution spatiale selon la direction principale des variations de volume (64x128). Ainsi, le débit sanguin élevé en hyperémie réactionnelle induit un incrément de surface important sur les images. N pas d'encodage de phase Gr canal 1 H \ \ canal 31 P Gp_ Gs /" RF ACQ ACQ Pléthysmographie RMN DMB- SRM-! H SRM 31 P Figure 73 : Diagramme de la séquence PerfMyoPhos réalisant des acquisitions 'H-MRI, ] H- SRM et 3 P-SRM en mode entrelacé. A chaque répétition, la séquence comprend 64 échos correspondant aux 64 pas d'encodage de la phase, entrelacés avec 64 FIDs de myoglobine puis un FID phosphore. La résolution temporelle est de 1 seconde. Cette séquence permet de mesurer simultanément la perfusion, l'oxygénation, la distribution des phosphates et le ph intracellulaire du muscle squelettique exploré, principalement au cours de la récupération d'un exercice post-ischémique. Gr, Gp, Gs sont les gradients de lecture, de phase et de sélection de coupe, ACQ : la fenêtre d'acquisition et DMB pour désoxymyoglobine. 234

242 Les paramètres expérimentaux sont : Pour les images : 0 pi = tomogauss -1 ms 0 TR= 13 ms-te = 3,1 ms 0 FOV = 23 cmx 23 cm 0 matrice = 64 x 128, SW = 100 KHz Pour les spectres de myoglobine : 0 p2 = tomogauss is - à 8700 Hz 0 TR=ls,NS = 64 0 TD = 256, SW = 50 KHz 0 Tacq = 5,12 ms 0 épaisseur de coupe = 10 mm Pour les spectres en phosphore : 0 p3 = impulsion rectangulaire- 200 is 0 TR=ls,NS=l 0 SW = 50KHz,TD = Tacq= 164 ms Les paramètres des «ACQP» sont : 0 acq_size[0] = 256, acq_size[l] = ACQ_phase_factor = FW = 62KHz 0 NI=l,NS=l,NR=140ou70 La somme totale des points recueillis à chaque répétition doit correspondre à la place mémoire réservée pour chaque objet insécable de l'acquisition : [(TDim)+(TDmyo)] x NB_phase + TDphos = (acq_size[0] IT) x ACQ_phase_factor avec TDim = 128, TDmyo = 256, TDphos = 8192, NB_phase = REDISTRIBUTION ET TRAITEMENT DES DONNÉES La redistribution des données brutes en trois fichiers indépendants a été expliquée dans le chapitre ÏÏ.H.2 concernant la procédure de traitement des données brutes. Une image, un spectre de myoglobine correspondant à 64 accumulations et un spectre phosphore sont ainsi recueillis simultanément, à chaque répétition, à raison d'une fois par seconde. La perfusion est déterminée avec la procédure de filtrage appliquée sur la pile d'images. Les signaux de myoglobine ont tous été prétraités avec le logiciel FTDAN pour la suppression du signal résiduel d'eau avant d'être traités avec le logiciel UXNMR Bruker. La procédure de traitement des FIDs phosphores est également détaillée dans le chapitre H.H

243 4. PROTOCOLE Quatre volontaires sains, d'âge 22, 24, 26 et 53 ans, ont participé à quatre reprises au protocole PerfMyoPhos pour évaluer la reproductibilité de la séquence. Pour chaque personne, deux premières séries de mesures ont été réalisées le premier jour, deux séries identiques ont été réitérées une semaine plus tard. Lors de la deuxième session, un des sujets n'a réitéré qu'une seule fois le paradigme alors qu'un autre a décidé de le reproduire une troisième fois. Un des volontaires est un sportif confirmé pratiquant des compétitions de triathlon. Les deux autres jeunes sont plutôt sédentaires. Nous avons demandé à tous les sujets de réaliser des exercices ischémiques selon le paradigme «MyoPhos» décrit plus haut. Les sujets sont installés sur le lit d'examen en position allongée, le talon de la jambe à explorer reposant sur la pédale de l'ergomètre. Deux brassards sont placés, l'un au dessus du genou et l'autre au dessus de la cheville. La sonde volumique! H Helmholtz est utilisée à l'émission comme à la réception des signaux d'imagerie et de spectroscopie proton. Cette sonde est centrée au niveau de la plus grande section du mollet du volontaire. La sonde de surface phosphore ovale, de dimensions 6 cm x 8 cm, est centrée au même endroit en regard du triceps sural. Ce groupe musculaire est recruté lors des flexions plantaires, effectuées sur l'ergomètre à 50 % environ de la FMV du volontaire. En fin d'ischémie, le brassard de la cheville est gonflé à 230 torr pour empêcher le sang d'irriguer le pied lors de la reperfusion. L'acquisition est démarrée 15 secondes avant le dégonflage du brassard à 60 torr. Lors de la récupération post-exercice, le processus de resynthèse de la PCr étant lent, 6 minutes d'acquisition sont nécessaires pour s'assurer que les spectres en phosphore recueillis ont retrouvé leur concentration de PCr de base. Avec une résolution temporelle de 1 s, 360 répétitions sont ainsi requises. La mémoire vive de la machine ne peut faire face à un tel volume de données. Nous avons dû découper l'enregistrement des données en deux séries de 150 répétitions, séparées par une pause d'une minute. La première série permet d'observer le processus de reperfusion et de réoxygénation des territoires musculaires. La seconde session acquiert la fin de la récupération de la PCr, qui est nécessaire à l'ajustement correct des données expérimentales. La pause d'une minute évite d'accumuler un volume trop important de données dans une période du processus de récupération qui ne présente pas d'intérêt. 236

244 5. RESULTATS Cette partie comporte les volets successifs suivants : a) une introduction décrivant principalement la quantification du travail effectué par les sujets sur l'ergomètre, b) une présentation des résultats :. de la mesure de la perfusion musculaire par pléthysmographie RMN,. de la mesure du temps de réoxygénation par la spectroscopie proton,. des données en phosphore, c) le calcul de la VC^maXapp, de la Vo 2 mito et de l'extraction d'oxygène, d) la présentation des corrélations des résultats deux à deux :. TMyo / Perfusion,. xpcr / TMyo,. xpcr / Perfusion,. Captation d'o 2 /DO 2. a) Introduction Parmi les 16 séries de données recueillies sur les 4 individus, deux séries de spectroscopie de la myoglobine ont dû être écartées, l'une à cause d'un artefact situé à proximité du pic de myoglobine et l'autre pour cause d'une distorsion inexpliquée de la ligne de base. Le travail fourni par les 4 volontaires au cours du protocole «MyoPhos» est reproductible et correspond à un travail de 474 ± 50 J pour l'ensemble des 16 exercices ischémiques. La figure 74 illustre chez un volontaire le processus de récupération postexercice ischémique, avec les variations des différents signaux permettant la détermination des variables physiologiques citées. Afin d'apprécier la fiabilité de la séquence, la reproductibilité a été estimée à partir du calcul de la variance sur les trois différents paramètres mesurés : la perfusion, le temps de resaturation de la myoglobine et la constante de temps de resynthèse de la PCr (xpcr). 237

245 Variation de section de la jambe (%) Désaturation de la myoglobine (%) 5-T T ^ Temps (s) 0 i h _l4-10"* " ' 1Q> _ Temps (s) O T PCr Temps (s) Figure 74 : Exemple de l'évolution temporelle des signaux enregistrés au cours de la récupération d'un exercice ischémique avec la séquence PerfMyoPhos. Les acquisitions RMN débutent 15 s avant le relâchement du brassard à 60 torr alors que le manchon de la cheville reste gonflé à 230 torr. Cette démarche évalue simultanément la perfusion par la méthode de pléthysmo graphie RMN à partir des changements de volume de la jambe les premiers instants de la reperfusion (A), la resaturation de la myoglobine (B) et la rephosphorylation de la créatine (C). Les constantes de temps de ces phénomènes vont respectivement permettre de calculer le taux de réoxygénation musculaire et la capacité maximale apparente des mitochondries à synthétiser VATP. b) Résultats des mesures Détermination de la perfusion musculaire à la levée de l'occlusion artérielle La moyenne des mesures de perfusion chez les 4 sujets s'établit à 29,7 ± 11,1 ml. 100g" 1.min" 1. Les valeurs se répartissent dans une gamme allant de 19,4 à 54,6 ml. 100g' 1.min" 1. Détermination du temps de réoxvgénation des territoires musculaires La moyenne des constantes de temps de réoxygénation des myocytes (TMyo) est de 22,7 ± 9,5 s. Les données suggèrent une forte hétérogénéité inter-individu puisque la moyenne 238

246 de la constante de temps de resaturation des 4 sujets diffère d'un facteur 3 allant de 10,4 ± 5,4 s à 28,4 ± 9,3 s. La variabilité la plus importante correspond au sujet sportif chez qui nous avons mesuré non seulement des constantes de temps de diffusion de l'oxygène différentes lors des 4 épreuves mais aussi des écarts des valeurs de perfusion. Les données en phosphore Par rapport au niveau de repos, nous n'avons pas observé de diminution significative du niveau d'atp au cours de l'épreuve. Pour les 4 volontaires, le rapport Pi/PCr vaut 0,15 ±0,02 au repos, et atteint 2,23 ± 0,95 en fin d'exercice. La concentration de PCr a diminué jusqu'à 33 ± 12 % de son niveau de base. Le ph intracellulaire a chuté de 7,01 ± 0,05 au repos à 6,57 ± 0,14 à la fin des contractions. La valeur moyenne de la constante de temps de resynthèse de la PCr s'établit à 54,4 ± 13,1 s et 35,9 ±11,4 s avant et après corrections des variations de ph induites par l'exercice (Iotti et al, 1993). Les valeurs moyennes chez chacun des volontaires sont 23,1; 35,1; 44,0 et 44,7 s Figure 75 : Evolution des spectres en phosphore acquis sur le mollet d'un volontaire au cours de la récupération d'un exercice ischémique. Ces spectres sont acquis avec une résolution temporelle de 1 s, à 3 Tesla et sont représentés ici avec un intervalle de 5 s. On observe une diminution du pic de Pi concomitante à l'augmentation de la PCr. La concentration d'atp n 'a pas changé au cours de l'épreuve. 239

247 c) Calcul de la consommation maximale apparente d'oxygène de la consommation mitochondriale d'oxygène et de l'extraction musculaire d'oxygène Au chapitre I.D., nous avons formulé l'équation suivante, que nous rappelons, permettant de calculer l'extraction musculaire d'oxygène : dmbo 2 Extraction (%) = Captation O 2 ~~^~~ + V0 * mito Les calculs de la DO2, à partir de la mesure de la perfusion par pléthysmographie RMN, et du facteur dmbcvdt reposant sur le temps de réoxygénation musculaire par le biais de la SRM en proton de la myoglobine, ont également été détaillés au chapitre I.D. A l'issue d'un exercice ischémique, l'élévation de la concentration d'adp libre est liée au déplacement de l'équilibre de la réaction de la créatine-kinase. Comme le niveau d'adp est un facteur prépondérant du contrôle de l'activité des oxydations phosphorylantes, nous ne pouvons pas, dans ces conditions, négliger la consommation d'oxygène par les mitochondries à l'instant précis du relâchement de l'occlusion. Nous allons mesurer, à partir des spectres individuels en phosphore, le rapport Pi/PCr et le temps de resynthèse de la PCr (xpcr) pour calculer, pour chaque sujet, la consommation maximale apparente d'oxygène (V02max app ) et la consommation mitochondriale d'oxygène (Vo 2 mito) comme détaillé au chapitre I.A.3.b. Aux premiers instants de la reperfusion, chaque jeu de données RMN mesurées simultanément va nous permettre de calculer le coefficient d'extraction musculaire d'oxygène pour chaque individu. Les résultats rapportés dans le tableau 6 sont ceux pour lesquels le calcul de l'extraction d'oxygène était possible. Cela supposait un jeu de données complet, avec la mesure simultanée de la perfusion, de la resaturation de la myoglobine et du tpcr. Rappelons que sur les 16 séries enregistrant la récupération de l'exercice ischémique, deux temps de resaturation de la myoglobine n'ont pas pu être appréciés. La moyenne de la VO2max app 240

248 déterminée au niveau du triceps sural, atteint 62,3 ± 13,9 ml d'oi.kg^.min" 1. Les moyennes individuelles sont de 77,4 ± 23,3 ; 60,6 ± 13,2 ; 60,6 ± 12,9 et 51,8 ± 14,4 ml d'o 2.kg' 1.min" 1. La consommation mitochondriale d'oxygène lors des 16 sessions varie entre 29,1 à 63.2 ml O2 kg'.min" 1 avec une moyenne globale de 43,9 ± 5,2-ml C^.kg^.mm" 1 (ou 0,073 ±0,016 ml O2.IOO g tissues" 1 ). La Vo 2 miîo moyenne des 4 volontaires est de 53.3 ± 10,5 ; 39,8 ± 6,3 ; 48,4 ± 7,1 et 37,0 ± 8,5 ml d'oa.kg^1 A partir de l'équation [14b], on calcule le taux d'extraction d'oxygène du muscle qui atteint une moyenne de 95,9 ± 19,5 % (plage de 74,0 à 138 %). Trois séries de données aboutissent à des valeurs d'extraction supérieures à 100 %. Il s'agit évidemment d'une surestimation que nous discuterons par la suite. Les extractions moyennes individuelles sont 83,6 ± 8,6 ; 96,2 ± 16,7; 120,7 ± 19,6 et 82,8 ± 8,6 %. Sujet Ct1 Perfusion ml/100g.min 30,6 DO 2 ml/100g.s 0,102 TMyo s 16,3 Resat-Mb ml/100g.s 0,024 -cpcr* s 23,6 xpcr s 43,8 Pi/PCr 0,98 VO2max app ml/kg.min 76,7 VO 2 mito ml/kg.min 42,2 VO2inito ml/loog.s 0,070 Capt O 2 ml/100g.s 0,090 EO 2 % 88,4 Ct2 48,7 0,162 11,0 0,036 21,0 45,1 2,17 74,6 54,5 0,091 0,120 74,1 Ct3 54,6 0,182 5,6 0,070 22,6 41,5 2,85 81,0 63,3 0,105 0,163 89,5 fj1 21,5 0,072 40,2 0,017 58,2 77,2 1,98 43,5 31,0 0,052 0,065 91,1 fj2 19,4 0,065 26,6 0,015 44,8 56,5 1,74 59,5 40,8 0,068 0, ,5 fj3 24,6 0,082 33,3 0,012 34,8 42,6 0,92 78,9 42,2 0,070 0,080 97,8 fj4 24,5 0,082 26,7 0,015 50,4 62,0 1,76 54,2 37,3 0,062 0,074 90,8 fj5 38,8 0,129 15,0 0,026 31,5 50,5 2,07 66,6 48,0 0,080 0,101 78,5 ng1 24,5 0,082 23,5 0,008 36,8 63,9 4,58 52,6 44,8 0,075 0,082 99,7 ng2 20,8 0,069 24,8 0,016 39,4 62,6 3,56 53,7 43,8 0,073 0, ,2 ng4 23,0 0,077 26,6 0,015 32,9 44,5 2,38 75,5 56,5 0,094 0, ,6 ra1 22,8 0,076 30,4 0,013 45,6 68,4 2,14 49,1 35,8 0,060 0,070 92,5 ra2 38,4 0,128 12,5 0,031 30,9 49,8 1,73 67,4 46,1 0,077 0,102 80,2 ra3 24,1 0,080 25,6 0,015 57,6 86,4 2,39 38,9 29,1 0,049 0,061 76,0 * xpcr corrigé pour le ph Tableau 6 : Tableau de synthèse du calcul du coefficient individuel d'extraction en oxygène de la jambe. 241

249 d) Etude des corrélations suite au protocole d'exercice ischémique : Les 3 paramètres RMN mesurés simultanément au cours du processus de reperfusion post-exercice (la perfusion, le temps de resynthèse de la PCr et le temps de resaturation de la myoglobine), sont confrontés 2 à 2.. TMyo / Perfusion Comme le montre la figure 76, la réoxygénation musculaire estimée à partir du temps de resaturation de la myoglobine, est fortement corrélée à la perfusion musculaire. Dans cette étude, le meilleur ajustement a été obtenu par une fonction puissance, avec y exprimé en ml. 100g" 1.min" 1 et x en s (y = 3835 x " 1-58 ; r= 0,94 ; p<0,01). Cette relation, qui est différente de la relation entre les mêmes déterminants de l'oxygénation que nous avons proposée suite à la reperfusion post-ischémique simple, est discutée par la suite. Temps de resaturation de la myoglobine (s) y = 2949 x R = 0,93-1, Perfusion (mlloog-^min 1 ) + Figure 76 : Relation significative entre la perfusion post-exercice ischémique et le temps de resaturation de la myoglobine, évalués sur la jambe de sujets sains. Le meilleur ajustement correspond à une fonction puissance d'équation (y = 3835 x ' ' ; r = 0,94). xpcr/tmyo Cette étude montre également une dépendance significative entre la réoxygénation musculaire et la constante de temps de resynthèse de la PCr. La figure 77 présente cette relation avec y en s et x en s (y = -0,015 x 2 + 1,8 x - 22; r = 0,81; p<0,01). Le taux maximal d'activité des oxydations phosphorylantes des mitochondries est donc lié à la vitesse de resaturation des cellules musculaires. 242

250 Temps de resaturation de la myoglobine (s) 50 """ y = -0,015x 2 +l,8x R = 0, x PCr (s) H Figure 77 : Corrélation entre la constante de temps de resynthèse de la PCr et le temps de resaturation de la myoglobine. Ces paramètres sont liés par une fonction quadratique d'équation (y = -0,015 x 2 + 1,8 x - 22; r = 0,81).. xpcr / Perfusion La figure 78 illustre l'interrelation significative entre le débit sanguin de la jambe et le temps de resynthèse de la PCr. Le meilleur ajustement est donné par une fonction puissance avec y en s et x en ml. 100g" 1.min" 1 (y = 361 x " 070 ; r=0,76; p<0,01). Cette relation montre la dépendance du taux de synthèse mitochondrial de l'atp vis-à-vis de l'apport en O2, à la reperfusion. 60,T PCr (s) y = 361 x R = 0,76-0, Perfusion (ml.loog^.min 1 ) Figure 78 : Corrélation entre la perfusion et le temps de resynthèse de la PCr. Ces paramètres sont liés par la relation (y = 361 x ~ 0 ' 70 ; r = 0,76). 243

251 . Captation d'o 2 /DO 2 La figure 79 illustre la correspondance entre l'apport d'o 2 des capillaires et la resaturation en O2 de la myoglobine d'une part, et la captation totale en O2 par le tissu d'autre part. Les corrélations linéaires significatives, passant par l'origine, ont respectivement pour équation : 1) Captation d'o 2 par la myoglobine = 0,20 x DO 2 ; r = 0,83 ; p<0,01 2) Captation totale d'o 2 = 0,89 x DO 2 ; r = 0,77 ; p<0,01 Pour la relation exprimant la captation totale d'o 2, le meilleur ajustement linéaire passant par l'origine sous-évalue très légèrement le coefficient moyen d'extraction (89 %) par rapport à la moyenne des valeurs individuelles (96 %). Cette figure montre qu'à la reperfusion d'un exercice ischémique, la consommation mitochondriale d'o 2 est non négligeable vis-à-vis de la quantité totale d'oxygène prélevée des capillaires vers les myocytes. Captation d'o 2 (ml.loog^.min 1 ).A ^ 1 Taux de réoxygénation + VO 2 mito Taux de réoxygénation 8 - y = 0,89 x r = 0, DO 2 (ml.loog^min 1 ) Figure 79 : A la reperfusion, la relation «captation d'o2-do 2» est représentée d'une part en considérant seulement la réoxygénation musculaire et d'autre part en tenant compte en plus de la consommation mitochondriale d'oxygène. Les ajustements linéaires de ces deux relations donnent respectivement accès aux droites d'équation (Captation d'o 2 par la myoglobine = 0,20 x DO 2 ; r = 0,83) et (Captation totale d'o 2 = 0,89 x DO 2 ; r = 0,77) fournissant un coefficient d'extraction moyen de 89 %. 244

252 6. DISCUSSION Cette partie rassemble les points suivants : a) validation de la séquence «PerfMyoPhos» en s'intéressant à :. la reproductibilite des résultats,. la confrontation des mesures physiologiques présentées ici avec les résultats antérieurs de la littérature pour chacun des trois paramètres, b) Corrélation entre les différents paramètres physiologiques, c) confrontation de nos calculs de la Vb 2 mito, de la VO2max app, et de l'extraction musculaire d'oxygène avec les données de la littérature. a) Validation in vivo de la séquence entrelacée L'étape de validation in vitro à été effectuée pour toutes les séquences (cf. chap H.D.5.). La validation expérimentale in vivo de la séquence "PerfMyoPhos" repose sur deux considérations. Tout d'abord, la reproductibilite des mesures obtenues dans le mode entrelacé est satisfaisante et ne diffère pas de celle proposée par les approches conventionnelles. De plus, les valeurs déterminées pour chacun des paramètres mesurés sont comparables à celles publiées dans la littérature lors d'acquisitions séparées et indépendantes. Nous allons à présent justifier ces deux remarques. (1) Reproductibilite de la séquence Pour apprécier la fiabilité de notre approche entrelacée, la reproductibilite a été estimée pour chacun des paramètres à partir du coefficient de variation (CV) des mesures successives réalisées chez le même volontaire. La variabilité moyenne de la perfusion par pléthysmographie RMN pour l'ensemble des 4 sujets s'établit à 19,2 %. Les CVs individuels sont de 15,9; 29,4; 8,4; 22,8; 30,4 %. Pour le temps de réoxygénation du muscle TMyo, la moyenne individuelle des CVs s'étend de 6,2 à 48,9 % avec une variabilité moyenne de 27,7 %. La variabilité par sujet du xpcr se répartit de 7,8 à 29,9 % avec une moyenne de 19,2 %. 245

253 Même si ces coefficients de variation ne paraissent pas particulièrement séduisants, ils correspondent à la variabilité intra-sujet in vivo des paramètres métaboliques et fonctionnels mesurés par RMN en mode classique ou par d'autres méthodes de référence. Ainsi, il a été rapporté que la détermination de la perfusion musculaire par la technique pléthysmographique à jauge de contrainte, par la méthode de clairance du 133 Xe et par la technique des indicateurs thermiques présentait des CVs de 14, 17 et 16 % respectivement (Clausen et Lassen, 1971; Wilson et al, 1984a; Edwards et al, 1993). Sur deux mesures consécutives, la débitmétrie LASER Doppler présente un CV de 13,2 % (Fronek et al, 1973). Concernant l'oxygénation musculaire, De Blasi et al. (1993) ont obtenu des CVs allant de 13 à 27 % pour l'évaluation de la constante de temps de récupération de l'oxygénation musculaire par la technique NIRS (Chance et al, 1992). Blei et al (1993) et Chati et al. (1994) ont publié respectivement des CVs de 9 et 19 % des temps de normalisation de la PCr obtenus après ajustement exponentiel de données RMN. H faut souligner que nos mesures de reproductibilite recouvrent en moyenne 4 mesures échelonnées sur deux jours différents. La plupart des chiffres de reproductibilite fournis par les autres techniques concernent deux mesures uniquement, le plus souvent espacées de quelques minutes. Les résultats de reproductibilite du sujet sportif sont intéressants. Ce volontaire a été recruté pour élargir la plage des valeurs de perfusion puisque plusieurs études s'accordent à montrer un débit sanguin et une consommation d'oxygène plus élevés chez les sujets entraînés que chez les sujets sédentaires (Kroese, 1977; Bebout et al, 1993; Reading et al, 1993). Les deux valeurs de perfusion les plus importantes ont bien été obtenues chez cet individu (54,6 et 48,7 ml.loog^.min" 1 vs une moyenne de 29,7 ml. 100g" 1.min" 1 ). En revanche, une autre mesure de perfusion atteint seulement 30,6 ml.loog^min" 1 mais est toutefois en accord avec les mesures correspondantes du temps de réoxygénation et de normalisation de la PCr. Ce volontaire a présenté les coefficients de variation les plus importants pour chacun des paramètres tout en respectant les corrélations entre les variables. Ceci met en évidence la variabilité de la réponse physiologique à une stimulation identique chez un même individu. Cette remarque est encore plus vraie pour les protocoles d'effort que pour les stress ischémiques simples. La détermination de la reproductibilite lors de sessions supposées strictement identiques, est donc seulement un indicateur de la fiabilité de l'approche. Cette constatation renforce l'intérêt d'une évaluation simultanée, lors d'un examen unique, du plus grand nombre de paramètres autorisant alors une corrélation directe entre les mesures. 246

254 (2) Confrontation des mesures avec les travaux antérieurs i/ La perfusion de la jambe à l'issue d'une épreuve d'exercice ischémique De nombreux travaux font état de mesures de perfusion de la jambe au cours d'un protocole très voisin du nôtre. Siggaard-Andersen (Siggaard-Andersen^ 1970) ont publié des débits sanguins de reperfusion comparables (30,9 ± 4,3 ml. 100g" 1.min" 1 ) en utilisant la pléthysmographie à jauges de contraintes. Une autre étude (Lassen et al, 1965), appréciant simultanément la perfusion de la jambe par pléthysmographie à jauges de contraintes et par la technique du 133 Xe mentionne respectivement des débits de 41,9ml.l00g" 1.min" 1 et 31,5 ml.l00g" 1.min" 1 sur les jumeaux. La littérature, très riche dans ce secteur, propose toutefois des valeurs de perfusion du mollet plus élevées (52,3 ± 2,8 ml.loog'.min" 1 ) obtenues par la technique de pléthysmographie à jauges de contraintes (Rueckert et Hanson, 1995). Les valeurs d'hyperperfusion du mollet que nous proposons en pléthysmographie RMN sont du même ordre de grandeur que celles déterminées par la pléthysmographie à jauge de contrainte ou par la méthode du 133 Xe pour des stimuli équivalents. Des études comparatives ont permis de mettre en évidence que les résultats fournis par la pléthysmographie à jauge de contrainte sont bien corrélés, quantitativement, à ceux d'autres techniques comme la tomographie par émission de positon (Depairon et al, 1991; Vanderthommen, 1994) et la débitmétrie du laser Doppler puisé (Levy et al, 1979). En revanche, lors de l'hyperémie réactionnelle (protocole PerfT2MP), la technique du Tl apparent en IRM majore clairement les données pléthysmographiques. Les comparaisons quantitatives ne sont pas si évidentes puisqu'elles doivent prendre en compte la même résolution temporelle. Ainsi, avec une résolution temporelle de 1 min, Toussaint et al. (1996) font état d'un débit sanguin post-ischémique de 103 ml.loog'vmin" 1 qui est à confronter avec notre valeur, accumulée sur 1 min également, de 57 ml. 100g" 1.min" 1. Les auteurs de cette étude ont noté que la pléthysmographie RMN sous-estimait d'un facteur 3,8 les résultats obtenus en Tl apparent. La discussion des mesures par pléthysmographique ou en Tl apparent a déjà été abordée. A l'heure actuelle, on ne peut poursuivre cette discussion en l'absence de travaux supplémentaires sur le même territoire musculaire, employant la même approche relativement récente du Tl app. 247

255 Les équipes utilisant des indicateurs thermiques ou colorés affirment que la technique pléthysmographique sous-évalue largement le flux sanguin musculaire. Ces équipes proposent des valeurs de l'ordre de 250 ml. 100g' 1.min' 1 (Saltin, 1985; Kim et al, 1995) nettement supérieures à celles des autres approches. Au vu du débit cardiaque maximal (251/min) (Astrand et al, 1964), l'argument des auteurs est que ce débit n'est évidemment soutenable que pour un groupe musculaire isolé (2 ou 3 kg maximum) où la pompe cardiaque n'apparaît pas comme un facteur limitant la perfusion maximale des muscles actifs. D'ailleurs, les résultats publiés avec la technique des indicateurs ne sont généralement pas exprimés sous forme de débit massique (ml. 100g" 1.min" 1 ). H est parfois difficile de connaître précisément la masse musculaire irriguée, ce qui pourrait partiellement expliquer les valeurs de perfusion plus élevées. En général les auteurs de travaux comparables, utilisant les indicateurs, s'accordent sur le débit (ml.min" 1 ) mais sont en désaccord profond lorsqu'il s'agit de rapporter ce résultat sous forme de débit massique (Jorfeldt et Wahren, 1971; Andersen et Saltin, 1985; Kim et al, 1995). De plus, la technique des indicateurs a recours à une modélisation de la fonction d'entrée d'injection du traceur puisque l'administration du bolus intravasculaire n'est pas instantanée. La quantification absolue par cette technique fait appel à la modélisation mathématique pour supprimer la recirculation du traceur qui vient s'ajouter en fin du premier passage de l'indicateur. Les sources d'erreur sont nombreuses et, en se cumulant, peuvent significativement amplifier la valeur du débit sanguin. Les valeurs de nos mesures de perfusion à l'issue de l'exercice ischémique apparaissent plus importantes que celles obtenues lors de l'hyperémie post-ischémique du protocole «PerfMyo». Cette différence peut être attribuée aux différences de stimulations entre un exercice ischémique et une ischémie simple. L'exercice anaérobie peut engendrer une vasodilatation plus importante suite à un métabolisme différent avec, par exemple, une dette accrue en oxygène due à l'exercice. Des résultats contradictoires ressortent des études confrontant les débits sanguins musculaires dans ces deux conditions de stress (Sinoway et al, 1986). Certains auteurs affirment que l'ischémie et l'exercice anaérobie sont des stimuli équivalents pour la vasodilatation périphérique (Siggaard-Andersen, 1970; Rueckert et Hanson, 1995) alors que d'autres travaux mettent clairement en évidence une différence (Lassen et al, 1964; Zelis et al, 1968; Barendsen et Van Der Berg, 1981). 248

256 h7 Le temps de réoxygénation des territoires musculaires Peu d'études ont jusqu'ici mesuré le temps de resaturation de la myoglobine. Notre résultat moyen (17,9 ± 10,3 s) est cohérent avec l'observation de Richardson et al. (1995c) qui a constaté, suite à un exercice, que la myoglobine se resaturait complètement en moins de 20 s, pendant le laps de temps s'écoulant entre deux acquisitions lors de son expérience. Les temps de resaturation de la myoglobine (TMyo) obtenus dans le protocole postischémique simple («PerfMyo») (demi-temps de 5,9 ± 0,3 s soit 11,8 db 0,6 s) sont plus courts que ceux mesurés dans le présent protocole («PerfMyoPhos») (22,7 ± 9,5 s) à l'issue d'un exercice ischémique. Au cours de ces deux explorations, nous enregistrons à la reperfusion la captation d'oxygène par les cellules musculaires. Les mesures ne sont toutefois pas directement comparables car, dans le présent protocole, la consommation d'oxygène par les mitochondries n'est pas négligeable. A la suite d'un exercice ischémique, la respiration mitochondriale est fortement stimulée comme en témoigne l'augmentation du rapport Pi/PCr de fin d'exercice. En conséquence, lors des premières secondes suivant la levée de l'occlusion, l'oxygène prélevé par les myocytes depuis les capillaires est en grande partie consommé par les mitochondries. La réserve d'oxygène située au niveau de la myoglobine va ainsi mettre plus de temps à se reconstituer. H est donc normal de trouver un temps de resaturation de la myoglobine plus long lorsque la Vo 2 mito est largement augmentée. La technique NIRS, atraumatique et reproductible, donne accès au temps de réoxygénation du muscle d'où une multitude de données de réoxygénation musculaire postexercice ou post-ischémie. Nous allons tenter de comparer les temps de réoxygénation tissulaire déterminés par la spectroscopie RMN de la myoglobine avec ceux proposés par le NIRS. La comparaison est à mener avec précaution puisque nous n'avons pas trouvé de protocole NIRS identique au nôtre. L'expérience la plus proche a été menée par De Blasi, et al. (1993) qui ont exploré les muscles des avant-bras de volontaires sains non entraînés. Lors de la récupération d'un exercice anaérobie isométrique de 3 min, ils ont rapporté une constante de temps de réoxygénation du muscle de 25,8 s. Pour comparer ce résultat à nos mesures, nous devons le convertir en un temps de réoxygénation total qui nous amène à 37,2 s. Le temps de resaturation en oxygène des cellules musculaires que nous proposons (22,7 ± 9,5 s) est plus court que celui proposé par le NIRS. En effet, le signal NIRS reflète à la 249

257 fois l'oxygène lié à l'hémoglobine et à la myoglobine. Le signal résultant est ainsi modulé par l'oxygénation capillaire et l'oxygénation cellulaire. Si l'on se réfère à des résultats antérieurs du protocole PerfT2MP 6, nous avons mis en évidence par RMN qu'au cours de la perfusion post-ischémique, la constante de temps de resaturation de l'hémoglobine est plus longue (d'au moins 30 s) que celle de la myoglobine. H est difficile de valider une technique par une autre qui ne détecte pas exactement le même phénomène. En revanche, on peut s'attendre à ce que, quel que soit le protocole de réoxygénation musculaire, le temps de réoxygénation estimé par la technique NIRS, de composante essentiellement vasculaire, soit toujours plus long que le temps de réoxygénation de la myoglobine. Ainsi, Chance et al. (1992) a rapporté suite à des exercices modérés, les temps de réoxygénation les plus courts enregistrés par le NIRS sur les muscles d'avant-bras d'athlètes pratiquant l'aviron. Ces temps, qui s'établissent à 22,8 s (15,8 s pour la constante de temps) égalent à peine les temps de resaturation des myocytes que nous proposons alors que la stimulation est faible par rapport à notre protocole. Les résultats de Chance soulignent de plus l'augmentation du temps de réoxygénation parallèlement à l'accroissement de la charge. La constante de temps passe chez les mêmes athlètes de 15,8 s à 70 % de la FMV à 45,3 s à 100 % de la FMV. Ces données confortent notre hypothèse selon laquelle l'intensité et la durée de la stimulation influencent le temps nécessaire au muscle pour retrouver un niveau stable d'oxygénation de la microcirculation pendant la phase de récupération. iii/ Le temps de resynthèse de la PCr Après relâchement du brassard, le signal de PCr évolue selon une fonction exponentielle qui, en supposant un contenu en ATP constant, reflète l'activité de l'atp synthétase au cours de cette récupération post-exercice. Les données obtenues par la SRM du 31 P utilisant l'approche entrelacée sont également avec les autres valeurs publiées antérieurement. Par exemple, le xpcr moyen a été établi à 54,4 ± 13,1 s dans notre étude et à 35,9 ± 11,4 s après correction du ph de fin d'exercice selon Iotti et al. (1993). Ces temps de normalisation de la PCr sont tout à fait similaires à ceux obtenus chez des sujets sains par d'autres équipes qui proposent des valeurs corrigées allant de 30 à 34 s (Hands et al, 1986; McCullyefa/., 1993; McCully étal, 1994). ^es conditions ne sont toutefois pas strictement comparables puisqu'il s'agit ici de la récupération d'un exercice ischémique. 250

258 Une forte hétérogénéité caractérise notre population de volontaires sains. Les valeurs de tpcr, corrigées par le ph, s'étendent sur une gamme relativement large allant de 21,0 à 57,6 s. La différence interindividuelle, qui a été soulevée par d'autres auteurs (Bendahan et al, 1990; Vandenborne et al, 1991), peut en partie s'expliquer par la différence d'activité physique quotidienne et d'entraînement qui fait évoluer la proportion de fibres oxydatives et glycolytiques et donc le volume mitochondrial (Wagner et al, 1991). Cette hypothèse est étayée par les données mesurées chez le jeune sportif vis-à-vis des autres sujets d'âge comparable. Etant donné le petit nombre de volontaires engagés dans le présent protocole, nous mentionnons à titre indicatif, que nos résultats sont tout à fait cohérents avec ce que l'on sait de l'influence de l'âge et de l'entraînement physique sur la capacité mitochondriale. En effet, le volontaire sportif et le sujet âgé de 53 ans ont respectivement les temps de restauration de la PCr les plus rapides et les plus lents, un facteur 2 séparent leur valeur moyenne. Blei et al. (1993) ont étudié le métabolisme énergétique d'une population de 8 sujets sains âgés de 25 à 60 ans. Il a expliqué l'écart entre les résultats de tpcr (facteur 1,8) par une dépendance du taux de synthèse oxydatif de l'atp vis-à-vis de l'âge des sujets (Drexler et al, 1992). Cette correspondance peut se justifier par la différence de densité mitochondriale révélée par biopsies, densité allant de 4 à 7 % dans la tranche d'âge de la population étudiée par Blei. Plusieurs groupes ont également suggéré les interrelations entre l'âge, la perfusion musculaire (Taylor et al, 1992; McCully et Posner, 1995), la capacité maximale des oxydations phosphorylantes (Coggan et al, 1993; McCully et al, 1993) et la VO 2 max (Patterson et al, 1972; Faulkner étal, 1977). b) Corrélation entre les différents paramètres physiologiques L'ensemble des relations établies nous a permis de souligner que plus l'apport en O2 au niveau des capillaires est important, plus le temps mis par les myocytes à se réoxygéner entièrement est court. Cette relation avait été globalement établie lors du protocole postischémique simple "PerfMyo". Cependant, lors de la récupération d'un exercice ischémique, on s'attend, comme le prédit le modèle représenté par l'équation [16b], à une évolution de cette relation puisque la Vo 2 mito n'est plus négligeable et va donc affecter le lien perfusion/ 251

259 réoxygénation. Comme escompté, la comparaison des 2 équations d'ajustement des données expérimentales de ces 2 protocoles (cf. figures 62 et 76) montre qu'à perfusion identique, le temps de resaturation de la myoglobine du protocole comportant l'exercice est plus long que celui ne comportant que la simple ischémie. En effet, l'oxygène prélevé des capillaires sert non seulement à combler la dette en O2 accumulée par les mitochondries, mais également à reconstituer la réserve au niveau des myocytes, où l'oxygène se fixe sur la myoglobine. La capacité oxydative maximale apparente des mitochondries est inversement proportionnelle au temps de normalisation de la PCr. Ainsi, plus la V02max app est élevée (tpcr court), plus la quantité d'o 2 apportée aux mitochondries est consommée rapidement. Au cours de l'épreuve d'exercice ischémique, plus la dette d'c»2 est importante, plus la vasodilatation l'est également. Ainsi, au moment de la reperfusion, plus l'apport en oxygène est important, plus l'augmentation de la P02 est rapide. L'apport accru en O2 va favoriser la reprise des oxydations phosphorylantes. On peut donc s'attendre, pour un temps de resaturation court de la myoglobine, à ce que le temps de resynthèse de la PCr le soit également. Sur la courbe représentant TMyo et tpcr (figure 77), il est donc logique que ces deux variables évoluent dans le même sens et en correspondance directe avec le modèle. De plus, dans une certaine limite, les interdépendances mettent en relief que la capacité oxydative maximale apparente est d'autant plus importante (xpcr court) que la fourniture en O2 (perfusion) est élevée. Cette remarque corrobore l'idée que la consommation maximale d'oxygène apporte non seulement une information concernant l'apport maximal d'énergie d'origine aérobie par unité de temps, mais également une information concernant la capacité fonctionnelle de la circulation. En effet, une très bonne corrélation entre le débit cardiaque et la puissance maximale aérobie a été établie (Ekblom, 1969). Ces diverses dépendances soulignent le rôle essentiel de l'oxygène et l'importance de toutes les étapes de son transport jusqu'au dernier maillon de la chaîne : l'utilisation par les mitochondries. Le métabolisme énergétique, et par extension le travail musculaire, est ainsi étroitement lié au bon fonctionnement de toutes ces étapes. 252

260 Les relations entre apport, consommation d'oxygène et métabolisme ont été explorées par Idstrom et al (1985) sur du muscle de rat perfusé. De nombreuses expérimentations animales sur du muscle isolé confirment les interdépendances entre apport et captation d'oxygène (Horstman et al, 1976; Gutierrez, 1988; Dodd et al, 1993; Hogan et al, 1993; Hogan et al, 1996). Le présent protocole et l'approche méthodologique mis en oeuvre permettent de vérifier in vivo chez l'homme sain la relation de dépendance entre la captation d'û2 et la DO2 au dessous du seuil critique d'extraction en oxygène. Dans nos conditions physiologiques, les valeurs de DO2 engendrées en hyperémie post exercice ischémique n'ont pas permis d'obtenir la seconde phase de la relation captation d'û2-do2. En effet, au delà d'un certain niveau d'apport en O2, la captation d'c>2 reste constante quel que soit le niveau de fourniture en O2. Jusqu'alors les chercheurs avaient recours à des techniques invasives et/ou irradiantes pour appréhender cette relation chez l'homme sain ou pathologique (Gutierrez et Pohil, 1986a). Cette relation de dépendance entre captation d'c>2 et DO2 est essentielle pour tout individu afin d'assurer l'adéquation entre la demande et l'apport en O2. Cette relation pourrait être altérée chez certains patients. Elle est en effet fortement débattue au cours du sepsis (Haupt et al, 1985; Vermeij et al, 1990) et du syndrome de détresse respiratoire (Danek et al, 1980; Mohsenifar et al, 1983; Annat et al, 1986). Cette divergence d'opinions semble s'expliquer par l'approche méthodologique employée pour déterminer la \Zo 2 mito (calculée par le principe de Fick ou mesurée par une technique indépendante) (Ronco et al, 1991; Roncoefa/., 1993). Au sujet des différentes relations entre les paramètres, il faut préciser que la perfusion globale et la réoxygénation de l'ensemble des territoires musculaires de la jambe n'ont pu être corrélées qu'au temps de resynthèse de la PCr du mollet puisque la taille de la sonde phosphore ne permettait pas d'étendre la mesure aux autres groupes musculaires. En complément, la réception alternée entre la sonde volumique proton et la sonde de surface proton n'était pas opérationnelle lors des premières expériences de ce protocole. Nous avons été contraints de mesurer le signal de myoglobine avec la sonde Helmholtz puisque la détermination de la perfusion par plethysmographie RMN oblige à acquérir les images avec une sonde volumique. L'enregistrement des images avec une antenne de surface aurait affecté 253

261 la qualité de la mesure (le bord du mollet à l'opposé de la sonde aurait été noyé dans le bruit) et aurait empêché de procéder à un traitement semi-automatique. Les contraintes imposées par les sondes expliquent potentiellement les moins bonnes corrélations rattachées au paramètre tpcr, la meilleure des corrélations étant obtenue entre deux variables provenant du même volume sondé. c) V02max ap p, VO 2 mito et Extraction La captation moyenne d'oxygène mesurée lors de cette exploration est plus élevée que la captation moyenne du protocole PerfMyo (0,073 vs 0,036 ml O2.IOO g^.s" 1 respectivement soit 62,3 et 21,6 en ml C^.kg^.min" 1 ), ce qui peut s'expliquer par le remboursement d'une dette importante en O2 liée à l'exercice ischémique. En effet, l'ischémie simple, de son côté, n'induit qu'une dette en O2 très faible. Pour des hommes sains, la captation totale moyenne (62,3 ± 13,9 ml d'c^.kg'.min 1 ) est cohérente avec des mesures effectuées au niveau pulmonaire (LeJemtel et al, 1986) ou encore localement en appliquant le principe de Fick (Richardson et al, 1995b) au cours d'un exercice isolé d'une seule jambe. Il est difficile de faire l'analogie entre la VC^maXapp locale mesurée par cette méthode et la VC^max estimée par les méthodes locales ou globales (pulmonaire ou Fick). Il serait logique que la V02max app que nous mesurons soit inférieure à la VC>2max locale du groupe musculaire en question. Selon certaines sources (Aupetit et al, 1991), la mesure de la VC^max semble dépendre de la masse musculaire mobilisée au cours de l'effort. En revanche, certains auteurs (Knight et al, 1992; Richardson et al, 1993) ont montré que dans des conditions assimilables aux nôtres, les mesures de VC^max fournies par les techniques globales ou locales sont comparables. Par une méthode globale, Cerretelli et al. (1992) affichent une plage de VC^max allant de 37,4 à 64,0 ml d'o2.kg' 1.min' 1 pour des sujets jeunes (22 ans) entraînés alors que Cohen-Solal et al (1995) proposent une valeur de 36,7 ± 7,0 ml d'o2.kg" 1.min" 1 chez des individus sains âgés de 50 ± 8 ans. A titre indicatif, on peut souligner que les locales calculées par notre approche (29,1 à 63,3 ml d'c^.kg^.min" 1 ) sont dans la gamme de VC^max mentionnées obtenues chez des individus sains de sexe masculin 7. H est à noter 7 Les patients souffrant d'insuffisance cardiaque ont par exemple des VC^max plus faibles (Wilson et al, 1984). 254

262 qu'au cours de notre étude la VC^maXapp la plus faible et la plus élevée correspondent respectivement au suj< sujet le plus âgé (29,1 ml d'oa.kg^.min" 1 ) et au plus sportif (63,3 ml d'c^kg-'-mm 1 ) (Ekblom, 1969; Faulkner et al, 1977). Nous pouvons confronter nos résultats d'extraction avec des travaux ayant recours à des efforts maximaux car notre épreuve de flexion plantaire sous ischémie constitue un stimulus puissant. Certains volontaires n'auraient pas pu aller au delà des 3 minutes d'exercice ischémique proposé. Les valeurs d'extraction calculées aux premiers instants du rétablissement du flux artériel peuvent être mises en relation directe avec les niveaux d'extraction enregistrés au cours d'efforts aérobies intenses ou d'ischémies partielles. L'augmentation d'extraction par référence au repos traduit le mécanisme de compensation de la diminution de l'apport d'c>2 pour tenter de maintenir la Vb 2 mito. Les extractions individuelles de notre étude (moyenne de 95,9 ± 19,6 %) concordent avec les résultats obtenus au cours d'exercices intensifs avec des outils invasifs (Roca et al, 1989; Knight et al., 1992). L'extraction calculée est maximale, car comme nous l'avons déjà noté, la captation d'oxygène est optimale à cause du gradient majeur en oxygène établi aux premiers instants de la reperfusion entre le sang et le tissu musculaire. L'effort déployé localement explique ce niveau élevé d'extraction. Richardson (Richardson et al, 1993) a montré par une technique invasive qu'un exercice aérobie maximal d'un membre inférieur de sportif pouvait fournir des valeurs d'extraction d'oxygène de 84,6 ± 2,1 %. Les extractions proposées par Vanderthommen (1993) utilisant la TEP au cours d'un effort électro-induit du quadriceps chez des volontaires sains sont également élevées, atteignant 86,6 ± 10,9 %. L'extraction générée lors de l'effort électro-induit n'est que très légèrement inférieure à notre valeur. Elle reflète une \Zo 2 mito sensiblement majorée (58,8 vs 43,9 ml.l00g" 1.min" 1 ) couplée à une perfusion légèrement plus importante (36,6 vs 29,7 ml.loog'.min" 1 ). Des exercices aérobies plus modérés conduisent à des extractions plus faibles (Zelis et al, 1974; Richardson et al, 1995c). Dans notre étude, il faut évidemment considérer les 3 valeurs d'extraction supérieures à 100 % comme une surestimation. Un des individus présente notamment des valeurs allant de 99,7 à 138,5 %, contribuant à l'augmentation de la moyenne des extractions pour notre population étudiée. La relation [14b] suggère que l'erreur peut être attribuée au temps de 255

263 une sous-estimation de l'apport en oxygène. Pour le dernier point, il faut bien noter que, si la pléthysmographie sous-évalue par son principe même la perfusion locale, les autres paramètres mesurés, le temps de resaturation de la myoglobine comme le temps de normalisation de la PCr sont intrinsèquement dépendants du niveau de l'apport. Les relations entre les 3 variables ne sont donc pas influencées. La concentration de la phosphocréatine de base (15 mmol/kg de poids frais), prise comme hypothèse de départ, peut aussi être surestimée chez certains individus. En effet, une des adaptations biologiques qui survient avec l'entraînement concerne l'augmentation de concentration de repos de PCr qui se situe, selon les personnes, entre 11 et 18 mmol/kg de muscle frais (McArdle et al, 1988). L'erreur peut également se situer au niveau des données en phosphore même si l'évaluation du rapport Pi/PCr sous ischémie en fin d'exercice est relativement aisée, et que la résolution temporelle de 1 s à la récupération permet un bon ajustement des données expérimentales par une fonction exponentielle. Remarque : Notre méthode repose sur le couplage entre l'activité des oxydations phosphorylantes et la respiration mitochondriale (P/O2 = 6). Pour les maladies mitochondriales, il n'est pas envisageable de calculer la Vo 2 mito en supposant un rapport P/O2 de 6. Une alternative consisterait à calculer la l/o 2 mito à partir de l'équation [16b] et non plus à la mesurer. Cela suppose que l'extraction individuelle soit évaluée par ailleurs. D est en effet possible de calculer préalablement l'extraction à l'issue d'une épreuve d'ischémie simple de 6 minutes. Dans ce cas, la Vo 2 mito est négligeable d'une part et, comme nous l'avons vu, les valeurs d'extraction individuelles fournies à la reperfusion d'une ischémie simple sont comparables à celles d'un exercice ischémique. 256

264 7. CONCLUSION Les valeurs de tous les paramètres étudiés par notre approche intégrée, ainsi que la reproductibilité des mesures, ne différent pas de celles fournies par les autres méthodes conventionnelles collectant séparément les données. Cette constatation valide chez l'homme notre démarche combinée BRM/SRM hétéronucléaire novatrice, qui est de surcroît attrayante par son caractère atraumatique et non irradiant. Nous avons montré comment la combinaison de l'imagerie et de la spectroscopie permet le calcul de l'extraction musculaire d'oxygène, à la reperfusion d'un exercice ischémique. Les corrélations obtenues entre les paramètres physiologiques mettent en évidence que la captation d'oxygène depuis les capillaires vers les myocytes est fortement liée à la fourniture en oxygène. Le transport d'oxygène par convection et par diffusion conditionne le taux de synthèse oxydatif de l'atp. Dans certaines pathologies où des anomalies de transport et d'utilisation de l'oxygène sont suspectées, cette approche intégrée va permettre de mieux situer l'étape déficiente. Elle peut aussi vraisemblablement apporter un élément de réponse au débat concernant la relation de dépendance Captation d'û2-do2 suspectée dans le sepsis. H reste toutefois encore à améliorer la précision et la reproductibilité des résultats pour affiner l'interprétation des données physiopathologiques à l'échelle de l'individu. 257

265 This page is intentionally left blank.

266 H. EXPLORATIONS DES METABOLISMES OXYDATIF ET GLYCOLYTIQUE AU COURS D'UN EXERCICE ANAEROBIE CHEZ LE SUJET SAIN (SEQUENCE MYOPHOSLAC) (Brillault-Salvat et al, 1997) 1. OBJECTIF L'élévation de la concentration d'acide lactique musculaire ou sanguine est observée dans diverses circonstances : - Les patients souffrant d'insuffisance cardiaque passent précocement en métabolisme anaérobie lactique lors d'un effort, ce qui pourrait expliquer en partie leur intolérance à l'effort (Weber et Janicki, 1985; Zhang et al, 1993). - Le sepsis est une pathologie pour laquelle l'hypoxie tissulaire et l'hyperlactatémie sont présentes au repos par inadéquation entre la demande et l'apport en oxygène (Hotchkiss et Karl, 1992; Hurtado et al, 1992). En revanche, Gutierrez et al. (1996) montrent que la présence d'acide lactique associée au sepsis ne doit pas forcément être considérée comme la preuve d'une dette en oxygène nécessitant une augmentation du transport d'oxygène. - Lors d'un exercice ischémique, la glycolyse anaérobie lactique entre rapidement en jeu pour assurer une production d'atp suffisante afin de maintenir l'effort le plus longtemps possible en l'absence d'oxygène. Les pathologies mentionnées tout comme la physiologie de l'exercice chez des individus sains nous conduisent à définir un protocole permettant l'exploration du métabolisme glycolytique et du métabolisme oxydatif. Pour cela, le test de provocation retenu comporte une épreuve d'exercice ischémique suivie d'une récupération aérobie. L'objectif étant d'étudier, en continu, pendant ces deux phases les interactions entre les metabolites impliqués, nous avons cherché à mettre en oeuvre une séquence associant la mesure simultanée : - du lactate musculaire par la spectroscopie proton basée sur le filtre sélectionnant les Cohérences à Double Quantum (CDQ) (Bloch et al, 1995), - du contenu en oxygène des myocytes par la spectroscopie proton de la myoglobine, - de la distribution des composés phosphorylés et du ph intracellulaire par la SRM 31 P. 259

267 2. LA SEQUENCE «MYOPHOSLAC» Nous avons profité du temps de relaxation Tl relativement long du lactate (1,3 s mesuré chez le rat à 3 T) pour insérer, au sein de la séquence élémentaire lactate proposée par L. Jouvensal et G. Bloch (cf. chap H.D.3.d), d'autres modules de spectroscopie en proton et en phosphore. La séquence hétéronucléaire MyoPhosLac (pour Myoglobine/Phosphore/ lactate), représentée figure 80, a été façonnée pour enregistrer la cinétique d'un grand nombre de metabolites impliqués dans les métabolismes oxydatif et glycolytique. Pour le module d'édition du lactate à double quantum, le cyclage de phase requiert 32 accumulations à un TR de 2 s. A chacun des 32 passages, le signal lactate est entrelacé avec 5 FTDs successifs de myoglobine et un Fïï) phosphore (Brillault-Salvat et al, 1996a). Ainsi, à chaque répétitions, on collecte 160 signaux de myoglobine, 32 signaux de lactate et 32 signaux de phosphore en 64 secondes. canal 1 H nfois canal 31 P 32 accumulations canal 1 H DMB SMR- 1 H SRM- 31 P 90 L 90 90%* IL Gradients selection du filtre DQC i n Gradients de surface G 2n ACQ -M- -X < *- Tî TQ t, T, LACTATE SMR- 1 H Figure 80 : Diagramme de la séquence MyoPhosLac alternant des signaux } H-SRM et 31 P- SRM. Cinq impulsions sélectives de myoglobine et une excitation phosphore précèdent le module d'édition du lactate par sélection des cohérences à double quanta (CDQ). Le cyclage de phase de la séquence d'édition du lactate requiert 32 accumulations répétées toutes les 2 s. La résolution temporelle de cette séquence est alors d'environ 1 min. Cette séquence a été développée pour mesurer simultanément, au niveau du muscle squelettique, l'oxygénation, la production et l'élimination du lactate, les metabolites phosphorylés et le ph intracellulaire, typiquement avant, pendant et après un exercice ischémique. Gl et G2 sont les gradients de sélection des CDQ avec G2 = 2xGl. 260

268 Pour une résolution temporelle de l'ordre de la minute, les conditions expérimentales sont : Pour la myoglobine : Pour le lactate : 0 NS = 160, TD = NS = 32, TD= SW = 25 KHz, Tacq = 5,12 ms 0 SW =16 KHz, Tacq = 650 ms Pour le phosphore : 0 NS = 32, TD = Tacq = 120 ms 0 SW=16KHz Les paramètres des «ACOP» sont : 0 NI=1,NA = 32,NR=15 0 acq_size[0] = 512, acq_size[l] = 64 0 ACQ_phase_factor = 64, FW= 25 KHz L'ensemble des paramètres de la séquence a été fixé, pour qu'à chaque répétition, la relation suivante soit respectée : [ (TDmyo x Nmyo) + (TDphos) + (TDlac) ] = (acq_size[0]/2) xni x ACQ_phase_factor avec TDmyo = 256, Nmyo = 5, TDphos = 3840, TDlac = REDISTRIBUTION DES DONNÉES BRUTES Lors de l'acquisition, la séquence cumule automatiquement les FIDs acquis lors des 32 passages. Une automation réorganise, la somme des 5 signaux résultants de myoglobine, le FID phosphore, et le FID lactate, en trois vecteurs indépendants. 4. PROTOCOLE Les volontaires recrutés pour le protocole MyoPhosLac sont âgés de 26 à 40 ans. Dans cette population, la mise en évidence du lactate musculaire requiert un exercice ischémique soutenu impliquant un groupe musculaire isolé. L'épreuve consiste à faire effectuer au volontaire couché sur le dos une série de dorsiflexions du pied. L'exercice est réalisé en condition anaérobie en gonflant à 230 torr le brassard positionné sur la cuisse. L'ergomètre est 261

269 facilement adaptable pour cet exercice de tractions sollicitant le jambier antérieur. L'effort est imposé à 75 % environ de la FMV. Cette charge est définie en extrapolant la relation linéaire établie entre FMV et section musculaire. La section musculaire du jambier antérieur a été évaluée à partir d'une image anatomique. Le protocole comprend une minute de repos, une minute d'ischémie simple puis l'exercice ischémique poursuivi jusqu'à épuisement. La récupération aérobie, initiée par la levée de l'occlusion et l'arrêt de l'exercice à la fin d'une répétition de la séquence, est enregistrée pendant au moins 8 minutes. Le pied du sujet est soigneusement attaché pour rester solidaire de la pédale de l'ergomètre pendant les contractions. Cette séance dure près de 2 heures car l'ensemble des procédures de calibration requiert, dans le meilleur des cas, 75 minutes. En plus des calibrations communes à tous les protocoles, il faut régler l'intensité du courant circulant dans le gradient de surface pour supprimer le signal des graisses sous-cutanées sans toucher au signal des metabolites du muscle. La durée d'inversion-récupération doit également faire l'objet d'un réglage. Pour cette séquence, l'impulsion de gradient nécessaire à l'édition du lactate est audible à une fréquence de 0,5 Hz représentant le métronome. L'expérimentateur veille sur l'écran de l'ordinateur à ce que le volontaire synchronise ses contractions sur le bruit car la séquence lactate est sensible aux mouvements. Le mouvement de la jambe doit être effectué après la phase de détection du lactate. De même, l'homogénéité du champ B x est essentielle pour la détection de cohérences à double quanta permettant d'éditer le lactate. Cette considération impose d'utiliser la sonde volumique proton Helmholtz à l'émission et de réserver la réception à la sonde de surface proton découplée. La détection localisée assure la meilleure sensibilité au signal lactate et au signal de myoglobine. La sonde 'H de réception, superposée à la bobine 31 P est directement placée en regard du jambier antérieur. 262

270 5. RESULTATS La figure 81 montre les trois types de signaux acquis avec cette séquence. Les spectres de myoglobine, de phosphore et de lactate respectivement de haut en bas, sont acquis au repos (à gauche) et en fin d'exercice ischémique (à droite). A H H ppm ppm ppm ppm Figure 81 : Exemple des spectres acquis simultanément en condition de repos (à gauche) puis en fin d'exercice ischémique (à droite) avec la séquence MyoPhosLac. La résonance du lactate se trouve à 1,33 ppm. Pour la session d'acquisition correspondant à la figure 82, le volontaire a tenu l'exercice pendant 5 minutes avec une force résistante de 60 N. Selon les volontaires, l'épuisement survient entre 3 à 5 minutes de travail ischémique. 263

271 Au repos, aucun signal de lactate ni de désoxymyoglobine n'est mis en évidence. En début d'exercice, une légère alcalose (ph = 7,15) est notée reflétant la consommation des protons corrélée à l'utilisation de la PCr. Dès la deuxième minute d'exercice, la myoglobine est déjà désaturée à 70 %. Le Pi augmente régulièrement parallèlement à une diminution de la PCr. A la fin de l'exercice le Pi a presque doublé alors que la PCr a chuté de 55 % par rapport à son niveau de repos. Au cours de l'effort, nous observons une production régulière de lactate qui reflète un processus de glycolyse anaérobie prépondérant déclenché par l'exercice ischémique. L'acidose intracellulaire concomitante est immédiatement reflétée sur les spectres en phosphore par un déplacement spécifique du signal de Pi à l'origine d'une chute du ph de 7,01 à 6,33. On peut également remarquer l'excellente coïncidence temporelle entre la production de lactate et la diminution du ph intracellulaire. Le rapport Pi/PCr augmente régulièrement pour atteindre la valeur de 3,3 à l'épuisement. Ce ratio n'est pas suffisant pour entraîner une diminution de l'atp comme en témoigne la figure 82. A la reperfusion, on note transitoirement une diminution supplémentaire du ph que l'on peut expliquer par la resynthèse de la PCr qui s'accompagne de la formation simultanée d'ions H +. Plus tard dans le processus de récupération, on observe une augmentation du ph de 0,11 unité ph/min. Malgré la levée de l'occlusion restituant le flux sanguin, le lactate continue à s'accumuler au cours de la première minute. Ensuite, l'élimination se produit à un taux de 14,2 %/min alors que les myocytes ont entièrement récupéré leur niveau d'oxygénation au cours de la première minute de reperfusion. On constate que la récupération du Pi est beaucoup plus rapide (environ deux fois) que celle de la PCr. La resynthèse de la PCr a été ajustée par une fonction exponentielle. Nous avons ainsi mesuré le temps de normalisation de la phosphocréatine à 77 et 54 s sans et avec la correction du ph de fin d'exercice. La formule de correction du tpcr en fonction du ph est exprimée au chapitre ÏÏ.H.6. En raison des problèmes de quantification du lactate par RMN utilisant le filtre DQC (cf. chap II.G.7), nous exprimons le signal lactate en unité relative. 264

272 Exercice Ischémique Desaturation de la myoglobine en PCr en % du repos I Pi en % du repos I ATP en unités arbitraires I I Lactate en unités arbitraires : Exercice Ischémique Temps (s) Figure 82 : Profils métaboliques enregistrés avec la séquence MyoPhosLac, alternant des signaux *H-SRM et 31 P-SRM au cours d'un protocole d'exercice ischémique impliquant le jambier antérieur chez un adulte sain. Après 1 min de repos, le brassard est gonflé à 230 torr pendant 1 min avant que ne débute l'exercice. A l'épuisement du volontaire, au bout de 5 min de dorsi-flexions pour cet exemple, l'occlusion artérielle est levée. L'enregistrement se poursuit pendant les 8 premières minutes de récupération aérobie. 265

273 6. DISCUSSION La stabilité du niveau d'atp au cours de ce protocole est en accord avec les résultats de Blei et al. (1993). Une corrélation linéaire entre le ph et la concentration de lactate a été rapportée par plusieurs auteurs sur le quadriceps humain à la suite de contractions dynamiques (Sahlin et al., 1976; Harris et al., 1977). Ces auteurs avaient recours à une technique invasive par biopsie. L'analyse dynamique des réponses métaboliques pour ce type de travail musculaire intense nous a permis dans un premier temps d'observer une forte hétérogénéité interindividuelle malgré le travail dépensé très proche. Les expériences menées sur le jambier antérieur mettaient systématiquement en évidence une production de lactate alors que les résultats d'épreuves impliquant le triceps sural étaient beaucoup plus dépendants de l'individu. En effet, certains sujets sains recrutés pour le protocole MyoPhosLac à l'occasion d'un exercice de flexions plantaires sollicitant le triceps sural n'ont pas produit de lactate au niveau du mollet. L'absence de lactate était constatée en dépit d'une diminution simultanée du ph de l'ordre de 0,8 unité (Jouvensal et al., 1996b) et de l'évolution comparable des autres metabolites, notamment le rapport Pi/PCr 9. La figure 83 illustre ce résultat chez un des volontaires ayant tenu l'exercice pendant 4 minutes. Ces résultats concordent avec la publication de Gutierrez et al. (1996) qui montrent que la réaction de l'adénylate kinase, constituant une voie anaérobie de synthèse d'atp, peut aboutir à la diminution du ph sans élévation notable du lactate cellulaire. Pour expliquer que certains volontaires n'aient pas produit de lactate sur le triceps sural, on peut supposer que l'effort fourni, rapporté au volume musculaire mis en jeu, ait été insuffisant chez ces personnes. Le lactate mis en évidence sur ce muscle correspondait justement à des individus moins musclés pour lesquels, en fin d'exercice, les phs étaient plus bas et les rapports Pi/PCr plus élevés. De plus, les travaux très récents de L. Jouvensal et al. (1997a; 1997b) proposent une compartimentation du lactate. Les premières hypothèses formulées à la suite de ces travaux sont que le lactate des milieux intracellulaire et interstitiel auraient respectivement un T2 court et un T2 long. Ainsi, le temps d'écho long (TE=150 ms) que nous utilisons dans la séquence d'édition du lactate à double quantum ne permettrait de détecter que lactate à T2 long du compartiment extracellulaire. H semblerait donc que le 'Pendant l'exercice dynamique, le ratio Pi/PCr a été relié au ph (Chati et al, 1994). 266

274 compartiment intracellulaire soit invisible par RMN dans nos conditions expérimentales. Cette hypothèse est étayée par les travaux de Shen et al. (1996) qui affirment, en utilisant une séquence à TE très court (1 ms) sur du muscle isolé, que la visibilité du lactate par RMN est de 100 %. En outre, le taux de diffusion et de transport du lactate du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire dépend de nombreux facteurs, notamment de l'acidité et de la concentration de certains metabolites. Ainsi, une vitesse de transport du lactate vers le milieu extracellulaire différente entre les volontaires, pourrait expliquer que nous n'ayons pas toujours mis en évidence une augmentation du lactate. Ce raisonnement est étayé par les résultats de Saltin (1990) qui a quantifié le rôle de la diffusion du lactate vers les espaces extracellulaires en fonction de l'importance de la masse musculaire mise en jeu, et qui a montré que la diffusion est d'autant plus importante que la masse musculaire sollicitée par l'effort est réduite. Chez les individus recrutés, la composition en fibres du muscle mis en jeu lors de l'effort peut également intervenir. En effet, Hultman et al. (1980) et Morikawa et al. (1994) ont suggéré que les fibres glycolytiques produisaient préférentiellement du lactate. La variabilité interindividuelle de la composition en fibres a été avancée et dépendrait du niveau d'activité et d'entraînement des différents sujets recrutés (Elder et al., 1982; Challiss et al., 1988). Au cours de l'exercice, Bendahan et al. (1990) ont eux aussi fait part, pour certains volontaires, de l'absence de corrélations entre les paramètres métaboliques tels que la PCr, le rapport Pi/PCr et le ph intracellulaire. Au cours de protocoles ayant recours à l'exercice musculaire, il était essentiel de quantifier précisément le ph. Comme nous l'avons déjà mentionné, après 3 minutes d'activité contractile, nous observons généralement un dédoublement de la résonance de Pi. Plusieurs auteurs s'accordent pour expliquer ce dédoublement par la présence de deux ph différents à l'origine des différentes fibres musculaires impliquées dans l'effort (Vandenborne et al, 1991; Yoshida et Watari, 1994). L'un reste proche du ph neutre alors que l'autre diminue progressivement parfois jusqu'à une unité ph. En outre, à la récupération, l'évolution des deux pics de Pi est indépendante, le pic de Pi correspondant au ph acide a une cinétique de disparition plus rapide que le pic de Pi correspondant au ph neutre. Comme le montre la figure 82, dès la quatrième minute de récupération, seul ce pic de Pi est encore visible et a regagné son niveau de repos. C'est pourquoi, à partir de la quatrième minute de récupération, 267

275 le ph est représenté à 7,0 comme ayant totalement récupéré. Pour cette raison, nous ne pouvons pas comparer nos résultats avec ceux de Pan et al. (1991) qui affirment que la cinétique de récupération du ph est plus rapide que celle de l'élimination du lactate musculaire. Après 10 minutes de récupération, la résonance de Pi finit par disparaître totalement rendant la mesure du ph impossible. Taylor et al. (1983) ont suggéré l'existence d'un pool de Pi invisible par RMN. Plus tard, Bendahan et al. (1990) ont émis l'hypothèse que la disparition du Pi pouvant être liée à son utilisation lors de la glycogénolyse. 7,0 6,9 Exercice Ischémique 6,7 6,5 6,3-1 6, ! Désaturation de la myoglobine (%) Temps (s) S Figure 83 : Profils métaboliques enregistrés avec la séquence MyoPhosLac au cours d'un protocole d'exercice ischémique impliquant le triceps sural chez un adulte sain. On constate une diminution du ph de 0,8 unité sans augmentation concourante du lactate musculaire. 268

276 7. CONCLUSION ET PERSPECTIVES Nous avons montré la faisabilité d'une approche intégrée qui permet de comparer simultanément les évolutions des profils métaboliques au cours d'un protocole d'exercice ischémique-récupération. La mesure simultanée par RMN du ph intracellulaire et du lactate extracellulaire est un outil intéressant. En effet, nous allons pouvoir utiliser les corrélations entre le ph et le lactate musculaire, obtenues par biopsies sur différents muscles pour calculer, à partir de la mesure par RMN du ph intracellulaire, la concentration de lactate intracellulaire. Ainsi, si les hypothèses sur la compartimentation du lactate sont confirmées, à tout instant, l'approche combinée pourrait permettre d'apprécier le transport du lactate du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire. Des études complémentaires restent encore à engager pour quantifier le lactate musculaire en terme de concentration molaire. Il sera ainsi envisageable de corréler plus précisément la production et l'élimination de ce metabolite en fonction des autres paramètres du métabolisme énergétique. Le programme d'exploration que nous proposons ici, pourrait être appliqué à des pathologies présentant des altérations du métabolisme énergétique. Par exemple, l'étude concourante du métabolisme oxydatif et glycolytique pourrait probablement permettre d'approfondir les régulations métaboliques de la maladie de Me Ardle, caractérisée par l'absence d'une diminution du ph au cours de l'effort. 269

277 This page is intentionally left blank.

278 I. EXPLORATIONS DE L'OXYGENATION MUSCULAIRE, DE LA PERFUSION ET DU METABOLISME OXYDATIF CHEZ DES PATIENTS ATTEINTS PAR LA MYOPATHIE DE BECKER Ce protocole a été mené en collaboration avec le Dr. J-F. Toussaint. (Toussaint, Brillault-Salvat et al; 1997) 1. POSITION DU PROBLÈME Les myopathies de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD) sont des dystrophies musculaires récessives liées au sexe (chromosome X). Les données moléculaires obtenues ces 10 dernières années ont montré que les dystrophies de Duchenne et de Becker n'étaient en fait que des formes alléliques d'une même maladie, liées au même gène codant pour la dystrophine. En effet, ces affections sont respectivement caractérisées par une absence totale ou une diminution de la dystrophine musculaire (Hoffman et al, 1987). La dystrophine est une protéine du cytosquelette jouant le rôle de lien entre les filaments contractiles et la membrane. Pour ces deux dystrophies, les biopsies musculaires ont mis en évidence des régions de nécrose et de régénération des fibres musculaires associées à une prolifération du tissu adipeux et du tissu conjonctif interstitiel avec une grande variation de la taille des fibres et une prédominance des fibres de type I. La maladie de Duchenne, d'évolution très grave, se distingue de celle de Becker, plus bénigne. La maladie de Becker se déclare généralement plus tardivement que celle de Duchenne (en moyenne autour de 12 ans) avec une hypertrophie musculaire en particulier des mollets et une élévation des enzymes sériques, notamment de la créatine-kinase. La faiblesse musculaire et l'intolérance à l'effort sont des symptômes fréquents, combinés parfois à des crampes et des douleurs. Le déficit de la force musculaire peut être très modeste durant de nombreuses années, la perte de la marche n'est pas obligatoire et peut survenir à un âge très variable. La baisse des capacités fonctionnelles du muscle entraîne à son tour une cascade d'événements qui diffèrent selon le type et le degré d'atteinte considérés. Ceci a des répercussions sur la motricité, sur la posture, et sur les fonctions respiratoires et cardiaques. En effet, la complication principale reste l'atteinte cardiaque avec des risques précoces de troubles du rythme cardiaque et une cardiomyopathie. 271

279 Avant la découverte en 1987 du gène et de la protéine responsable des dystrophies de Duchenne et Becker, deux grandes hypothèses avaient dominé quant à l'étiologie de ces maladies : - la théorie membranaire reposant sur des anomalies du sarcolemme et dont la traduction est une rupture de la membrane plasmique et un influx calcique, - la théorie vasculaire très controversée dont on trouve les premières traces au sein des travaux de Duchenne de Boulogne en personne (Duchenne, 1868). Nous abordons maintenant cet aspect. En effet, un certain nombre d'arguments étaient avancés en faveur de cette deuxième hypothèse qui a, il y a déjà bien longtemps, retenu l'attention du français Démos et al. (1957a; 1961; 1961b), puis de Dreyfus et al. (1962). Des constatations histologiques et expérimentales ont amené Engel à soutenir également cette hypothèse (Engel et Dale, 1968). Les nombreux travaux de Démos et al. (1968; 1968a; 1970a) ont été motivés et complétés à la suite d'observations cliniques et physiologiques incluant des sujets témoins et des myopathes : l'apparition précoce d'un désordre vasomoteur aux extrémités des patients. Démos a poursuivi la piste vasculaire sur les observations suivantes : une augmentation du temps de circulation du sang d'un bras à l'autre, une diminution de moitié de la consommation d'oxygène et un ralentissement de la progression de la myopathie de Duchenne suite à l'administration d'un vasodilatateur. Démos a suggéré une anomalie de régulation de la microcirculation musculaire chez des myopathes étudiés au stade précoce de la maladie en comparant les niveaux de débit sanguin musculaire par rapport à des sujets témoins (Démos et al, 1968). H a noté qu'à de très faibles intensités de travail musculaire, la perfusion est accrue chez les myopathes alors que pour une quantité de travail plus élevée, leur perfusion se révélait significativement plus faible. Il formula l'hypothèse d'une dérivation d'une partie du sang artériel vers une seconde voie du «lit capillaire» musculaire dite non-nutritive (shunts directs artériolo-veineux). Les épreuves thermiques confortaient l'hypothèse du trouble de la régulation vasomotrice chez ces patients. En fait, la théorie vasculaire a fait l'objet de nombreuses critiques. L'altération du débit sanguin musculaire a été remise en cause par plusieurs auteurs. Emery et al. (1965) n'a pas retrouvé cette anomalie circulatoire lors de mesures au repos et à différents niveaux 272

280 d'exercice par la technique de pléthysmographie. Paulson et al. (1974), utilisant la technique du xénon, n'a pas non plus constaté de différence de débit sanguin musculaire au repos et à la reperfusion d'épreuves d'exercice ischémique entre les myopathes de type Duchenne et un groupe de sujets sains appariés. Et pourtant, parallèlement, des signes de dégénérescence et régénération des capillaires musculaires, ont été décrits chez ces myopathes (Jerusalem et al, 1974). Ces anomalies anatomiques, vraisemblablement de nature secondaire, peuvent jouer un rôle important au niveau de la microcirculation musculaire. Le métabolisme énergétique avec, en particulier, la fonction mitochondriale est un aspect intéressant à explorer dans les myopathies puisque nous savons que les fibres nécrotiques perdent leur activité oxydative et que leur contenu en glycogène est extrêmement affecté ou réduit à néant. Des troubles du métabolisme oxydatif sont associés aux myopathies mitochondriales avec une diminution du rapport PCr/Pi au repos et un ralentissement de la vitesse de resynthèse de la PCr (Arnold et al, 1985; Duboc et al, 1987a). En revanche, Kemp et al. (1993b) a suggéré que la fonction mitochondriale de la dystrophie de Becker pouvait être normale. Sockolov et al. (1977) a souligné l'atteinte cardio-vasculaire des jeunes patients atteints de DMD. Une réduction de la ventilation pulmonaire, du débit cardiaque et de la consommation d'oxygène pourraient expliquer la diminution des performances à l'exercice de ce groupe de patients. Dans un article de revue, Lewis et al. (1986) a mentionné l'altération de la VC>2max des patients atteints de dystrophie musculaire. En outre, une analyse par chromatographie de la myoglobine a mis en évidence dans la DMD une anomalie de conformation de cette protéine musculaire (Perkoff et al, 1962) qui a un rôle prépondérant dans le stockage et la diffusion de l'oxygène au sein du muscle. Les anomalies vasculaires et microvasculaires, les altérations de la diffusion et de l'utilisation d'oxygène et les troubles du métabolisme énergétique révélés par les travaux cités portant sur ces dystrophies, justifient une étude approfondie. Les conséquences fonctionnelles de toutes ces anomalies méritent également d'être élucidées. Contrairement aux myopathies métaboliques et à la maladie de McArdle qui ont fait l'objet de nombreuses explorations, notamment par RMN (Ross et al, 1981; Haller et al, 1983; Duboc et al, 1987a), peu d'études ont été menées jusqu'alors sur les myopathies de Becker (Barbiroli et al, 1992; Kemp et al, 1993). 273

281 2. OBJECTIF Les outils développés, jusqu'alors appliqués aux sujets sains, sont tout à fait adaptés à l'étude de pathologies et en particulier à l'exploration des myopathies pour lesquelles les relations de couplage perfusion/métabolisme n'ont jamais été explorées. La grande diversité évolutive de la dystrophie de Becker constitue un aspect intéressant pour une étude portant sur une analyse de couplages afin de mieux comprendre l'implication fonctionnelle et métabolique des éventuelles altérations mentionnées. Les myopathes de type Becker sont la plupart du temps autonomes et aptes à réaliser des contractions musculaires. L'exploration du mollet a été privilégiée puisqu'une hypertrophie de ce membre caractérise cette pathologie. Dans un premier temps, nous avons ainsi souhaité évaluer, chez des patients atteints de la myopathie de Becker, la faisabilité d'une exploration musculaire intégrée, à la récupération de diverses stimulations aérobie et anaérobie. Nous avons cherché à analyser les effets de la restriction de la perfusion post-ischémique sur la réoxygénation et sur l'activité mitochondriale des territoires musculaires de la jambe. Dans ce manuscrit, nous présentons les premiers résultats de cette étude, encore en cours d'analyse, qui compare des patients souffrant de la myopathie de Becker à des sujets normaux appariés en âge. 3. PROTOCOLE Sept patients atteints de la dystrophie de Becker et 9 volontaires sains ont accepté de participer au protocole qui comporte des périodes de repos, de stimulation et de récupération. Plusieurs mesures ont été effectuées chez les individus impliqués. L'acquisition reste strictement identique, les variantes du protocole se situent au niveau du stress. En effet, la stimulation consistait soit en une ischémie simple de 7 min induite en gonflant un brassard à 230 torr, soit en un exercice aérobie de 5 min, soit un exercice ischémique de 3 min. Pour les sujets témoins, l'exercice comporte des flexions plantaires à une fréquence de 0,5 Hz à 75 % de la FMV. Pour les patients, le niveau de résistance de l'ergomètre a été adapté à la capacité 274

282 fonctionnelle du myopathe par mesure de la section musculaire. En effet, le temps de récupération de la PCr est indépendant de la charge imposée sur l'ergomètre. Les patients effectuaient les contractions à leur rythme. Il leur a été demandé de stopper l'effort dès que la fatigue rendait l'exercice pénible. L'enregistrement de la récupération par la séquence PerfMyoPho suivait immédiatement la phase d'exercice ou d'ischémie. Les tensions artérielles systolique et diastolique sont mesurées par un moniteur automatique de pression (Baxter, Colin) relié au bras droit du sujet allongé sur le lit d'examen depuis au moins 5 minutes. L'acquisition RMN enregistre la phase de récupération : de l'épreuve d'hyperémie réactionnelle (HR) suite à l'occlusion de 7 min, de l'exercice aérobie (Aéro), et des deux exercices ischémiques dont le niveau de reperfusion est provoqué soit à la pression diastolique moins 10 torr (DBP-10) (Post-Iscl), soit à la pression systolique moins 20 torr (SBP-20) (Post-Isc2). Pour la mesure de perfusion par la méthode pléthysmographique, les acquisitions HR et Aéro sont également réalisées à DBP-10. La seconde contre-pression (SBP-20) vise à étudier l'effet de restriction de la perfusion sur les autres paramètres. La figure 84 illustre le déroulement des différentes phases du protocole. La succession des événements a été rendue aléatoire. Pression du brassard (torr) 230 T ISCHEMIE EXERCICE ISCHEMIQUE EXERCICE AEROBIE REPOS EXERCICE ISCHEMIQUE 2-min 10-min 10-min 10-min Figure 84 : Illustration schématique du déroulement du protocole. 275

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284 Dans cette étude, nous retrouvons l'effet de restriction de la perfusion (-42 % entre Iscl et Isc2) à la fois sur le temps de resaturation en oxygène du muscle et sur le taux oxydatif de synthèse mitochondriale de l'atp. De plus, on constate que le temps de resynthèse de la PCr n'est pas influencé par la nature de l'exercice, ischémique (Iscl) ou normoxique (Aéro). Ces résultats sont cohérents avec ceux d'une autre étude (Marie et al, 1990). b) Chez les patients du type Becker La perfusion de la jambe en hyperémie réactionnelle ne diffère pas des sujets témoins (25,4 vs 22,4 ml. 100g" 1.min" 1 ). Ces résultats, en contradiction avec les travaux de Démos, confortent le point de vue de certains auteurs évaluant, chez ces patients, la perfusion musculaire par la technique pléthysmographique (Emery et Schelling, 1965) ou par la technique du xénon (Paulson et al, 191 A). L'obstruction partielle de l'arrivée artérielle lors du protocole Isc2, réduit significativement le débit sanguin de la jambe (-32 %) et rallonge le temps de resaturation de la myoglobine (+82 %) ainsi que le temps de normalisation de la PCr (+86 %). Ces résultats sont comparables à ceux des sujets sains excepté pour le taux de resaturation de la myoglobine qui est beaucoup plus court chez les patients post-exercice ischémique. A la vue de ces données, nous pouvons suggérer qu'une plus faible concentration de myoglobine chez les patients pourrait expliquer un temps de resaturation plus court comparé à des témoins. Même si le doute persiste chez l'homme, chez l'animal la concentration de myoglobine a été corrélée à l'entraînement physique. Il ne fait aucun doute que les myopathes ne pratiquent pas d'effort régulier comparé à des sujets sains. Cependant, nous ne pouvons vérifier cette hypothèse en raison de différentes configurations du gain d'amplification entre le signal de myoglobine et le spectre d'eau de référence. Une calibration rigoureuse des gains d'amplification aurait permis la détermination de la concentration de myoglobine, mais le changement récent de notre système d'un point de vue électronique et informatique empêche cette opération. La littérature ne permet pas non plus de répondre à cette question. Comme nous l'avons déjà mentionné, une anomalie de conformation de la myoglobine a été mise en évidence dans la myopathie de Duchenne, très voisine de celle de Becker. Cette anomalie pourrait avoir une conséquence sur la valeur de la P50 de la myoglobine et intervenir 277

285 sur le temps de resaturation de la myoglobine. Nous pouvons également formuler une troisième hypothèse pour tenter d'expliquer la différence du temps de resaturation de la myoglobine entre les sujets normaux et les patients de Becker. Cette hypothèse se fonde sur les relations déjà utilisées (cf. chapitre III.G.5.) entre le rapport Pi/PCr de fin d'exercice, la consommation d'oxygène par les mitochondries et le temps de resaturation de la myoglobine mesurés à la reperfusion. En utilisant le modèle proposé (équation [16b]), en adéquation avec les données expérimentales du protocole «PerfMyoPhos», nous allons raisonner en terme de différence de mesures entre les deux groupes (myopathes vs sujets sains). Comme les valeurs de perfusion entre les deux populations sont voisines, la différence des vitesses de resaturation de la myoglobine entre les deux groupes est égale à l'opposé des variations de consommation d'oxygène par les mitochondries. De plus, à ipcr identique entre les deux populations, les équations [4] et [5] montrent que : plus le rapport Pi/PCr de fin d'exercice est élevé, plus la l/0 2 mito est importante. Donc si les myopathes ont un rapport Pi/PCr plus faible alors la différence de Vo 2 Taito est négative, ce qui est à l'origine d'une différence de vitesse de resaturation de la myoglobine positive entre les myopathes et les témoins. Ceci suggère que la vitesse de resaturation est plus grande chez les myopathes que chez les sujets sains, d'où un temps de resaturation de la myoglobine plus court chez ces patients. En effet, le travail déployé au cours des exercices ischémiques était respectivement de 534 ±136 J et de 95 ± 33J pour les sujets témoins et pour les patients, aboutissant à un rapport Pi/PCr de fin d'exercice de 2,95 ± 0,88 et 1,45 ± 0,65. Ces résultats sont également étayés par les données des travaux de Barbiroli et al. (1992) qui montrent, que pour un exercice impliquant des patients de Becker et des contrôles, un rapport 3 entre le travail fourni par ces deux groupes ne permet pas aux patients d'atteindre en fin d'exercice le rapport Pi/PCr des sujets sains. On peut alors envisager que la différence de rapport Pi/PCr de fin d'exercice soit à l'origine du temps de réoxygénation musculaire plus court chez les myopathes que les sujets sains. Cette suggestion pourrait également expliquer la différence de temps de resaturation de la myoglobine obtenue chez les sujets sains entre le protocole actuel et le protocole PerfMyoPhos au cours duquel les volontaires avaient fourni un travail musculaire plus faible (474 ± 50 J) conduisant à un ratio Pi/PCr plus bas de 2,23 ± 0,

286 Lors de la récupération de l'effort en condition aérobie, le temps de resynthèse de la PCr chez les patients ne diffère pas de celui fourni par les individus sains, en dépit d'une différence considérable entre le travail total déployé par les myopathes et les témoins (300 vs 1322 J, p<0,0001). Le temps de normalisation de la PCr à l'issue des exercices ischémiques est également comparable entre les deux populations étudiées. Une fois l'exercice terminé, nous pouvons alors supposer que les patients atteints de la myopathie de Becker présentent une capacité oxydative mitochondriale normale. La démonstration très récente (Kemp et al, 1997) de l'existence chez les myopathes de type Becker d'une fonction mitochondriale normale avec, lors de la récupération d'un exercice, un taux de synthèse d'atp comparable à celui des sujets sains, conforte les résultats de cette étude. c) Comparaison des résultats avec les protocoles antérieurs En confrontant les résultats de ce protocole avec les acquisitions réalisées dans des conditions comparables chez des volontaires sains («PerfMyoPhos»), les valeurs de TPCr et de perfusion de la jambe en post-exercice ischémique avec une contre pression de 60 torr environ, convergent remarquablement et, comme nous l'avons déjà détaillé, sont en accord avec la littérature. Les mesures de perfusion en post-ischémie simple présentent toutefois des valeurs plus élevées (22,4 ± 9,7 ml. 100g" 1.min' 1 pour les témoins et 25,4 ± 9,1 ml. 100g" 1.min" 1 pour les myopathes) que celles du protocole «PerfMyo» (15,3 ± 1,6 ml. 100g" 1.min" 1 pour des sujets sains). Cette différence peut être attribuée aux conditions expérimentales du protocole «PerfMyo» puisque d'une part les gonflages et dégonflages du brassard étaient opérées manuellement et, que d'autre part, la perfusion du pied était autorisée en l'absence du manchon de la cheville. d) Relations de dépendance La séquence PerfMyoPhos permet dans cette étude d'établir des relations entre les paramètres de perfusion, de réoxygénation musculaire et du temps de normalisation de la PCr mesurés simultanément sur la jambe lors de la reperfusion. Les relations de dépendance sont illustrées sur les figures 85, 86, 87 pour les sujets sains et les patients du type Becker. Le 279

287 temps de resynthèse de la PCr et la mesure de la perfusion étant comparable entre les deux populations, une dépendance similaire entre les deux groupes est illustrée sur la figure 86. Taux de resaturation de la niyoglobine (s -I ) o y = x R=0.20(Bk) y = x R=0.57 (N) 6 - " y=l.l+0.05x R=0.41 (Ensemble) o C) 10 i i ] Perfusion (mlloog-'.miir 1 ) Figure 85 : Relation entre la perfusion et le taux de resaturation de la myoglobine (1/TMyo) de la jambe après les épreuves d'exercice ischémique chez les sujets témoins et chez les myopathes de type Becker. Les relations sont (O) : y = 2,0 + 0,04 x (r = 0,20) chez les myopathes et ( ) y = 0,49 + 0,07 x(r = 0,57) chez sujets normaux. Pour les deux autres corrélations impliquant le taux de resaturation de la myoglobine (figures 85 et 87), même si les ajustements des données expérimentales des deux groupes ne fournissent pas des pentes d'équations exactement identiques, les relations sont proches. On retrouve alors les corrélations déjà proposées pour le protocole PerfMyoPhos avec de meilleurs coefficients de corrélation pour les sujets sains que pour les myopathes. xpcr (s) o y = x y = x y = x R=0.74(Bk) R=0.56(N) R= 0.58 (Ens enrtte) ><&: 20-0 i Perfusion (ml.loog^min 1 ) Figure 86 : Relation entre la perfusion de la jambe et le temps de resynthèse de la PCr après les épreuves d'exercice ischémique chez les sujets témoins et chez les myopathes de type Becker. Les relations sont : (O) y = 82-1,5 x (r = 0,56) chez les sujets normaux et (+)y = 87-2,l x(r = 0,74) chez les patients. 280

288 Taux de resaturation de la myoglobine (s" 1 ) y = x R=0.40(Bk) y = x R=0.42(N) y = x R=0.41 (Ensenrfcle) tpcr(s) 150 Figure 87 : Relation entre le taux de resaturation de la myoglobine (1/TMyo) et le temps de resynthèse de la PCr après les épreuves d'exercice ischémique chez les sujets témoins et chez les myopathes de type Becker. Les relations sont (O) : y = 2,9-0,02 x (r = 0,42) chez les sujets normaux et ( ) y = 4,1-0,03 x (r = 0,40) chez les patients. 5. CONCLUSION Les résultats obtenus par l'approche intégrée ne semblent pas mettre en évidence une altération du couplage perfusion/métabolisme oxydatif chez des patients atteints de la myopathie de Becker par rapport à des sujets sains appariés en âge. Ainsi, les anomalies décrites en anatomie pathologique ne se traduisent pas de façon évidente sur le plan fonctionnel. Les faibles corrélations proposées, bien que significatives, soulignent la complexité des mécanismes imbriqués intervenant dans la synthèse de l'atp. Nous devons souligner la particularité de la dystrophie de Becker qui est une pathologie évolutive. Il est alors possible que les résultats obtenus dépendent de la phase observée dans l'évolution de l'atteinte musculaire de ces myopathes. La différence de travail dépensé sur l'ergomètre par rapport aux sujets sains, suggère la faiblesse musculaire des patients recrutés qui, bien qu'ayant conservé une locomotion autonome, se déplaçaient avec beaucoup de difficultés. 281

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290 CONCLUSION Ce travail tente d'approfondir les connaissances sur la physiologie du muscle strié squelettique, intéressante tant en raison de la complexité des régulations et couplages mis en oeuvre, qu'en raison de la brutalité des variations du métabolisme au cours d'un exercice musculaire, et enfin à cause de la gravité des pathologies qui l'affectent. Pour cela, nous avons développé par imagerie et spectroscopie RMN une méthode atraumatique, non irradiante et quantitative qui permet, à la différence des autres techniques utilisées à ce jour, de mesurer simultanément avec une résolution temporelle élevée plusieurs déterminants de l'oxygénation parmi : o la perfusion musculaire par la méthode de pléthysmographie RMN ou la méthode du 1 1 apparent» o les changements de saturation de l'hémoglobine à partir des variations du signal d'imagerie pondéré T2*, o l'oxygénation tissulaire par la spectroscopie! H de la myoglobine, o la production et l'élimination du lactate musculaire par l'édition des cohérences à double quantum en spectroscopie 'H, o le métabolisme énergétique et le ph intracellulaire par la spectroscopie 31 P. Cette approche originale, combinant IRM et SRM hétéronucléaire au cours d'un seul examen, a nécessité des développements techniques et méthodologiques à différents niveaux : o plusieurs sondes RMN *H et 31 P ont été construites avec une géométrie adaptée aux exigences du protocole, o une interface électronique a été conçue pour piloter les séquences multifréquentielles RMN. Cette interface était indispensable pour assurer la commutation instantanée du noyau excité ou observé. o des séquences hétéronucléaires entrelacées ont été développées. Chacune correspond au cahier des charges d'un protocole particulier. Ces séquences fixent les paramètres d'acquisition de tous les signaux enregistrés. o des automations de traitement ont été écrites spécifiquement pour chaque séquence. Elles redistribuent les données brutes en plusieurs vecteurs qui sont ensuite traités par une procédure semi-automatique. 283

291 Ce travail comporte un volet méthodologique mais aussi un volet expérimental qui ont progressé de concert au cours de cette thèse. Tous les développements techniques et méthodologiques ont été validés sur fantôme avant d'être appliqués à l'homme. Chez des volontaires sains comme chez des patients, ce nouveau type d'exploration a été adapté à l'étude du muscle squelettique en situation dynamique. La compréhension des régulations métaboliques, perfusionnelles et diffusionnelles, comme la détection de telles anomalies, est facilitée par la mise en oeuvre d'épreuves de provocation qui stimulent le muscle à explorer. Un ergomètre nous a permis de contrôler et de quantifier le travail musculaire fourni. Nous avons eu recours à des épreuves ischémiques qui placent tous les individus dans une même situation pour laquelle la composante perfusion est découplée du métabolisme énergétique. Les réponses physiologiques des différents volontaires nous ont permis d'établir des corrélations tant au cours qu'à l'issue des stimulations. Nous avons également apprécié, sur volontaires, la reproductibilité de l'approche intégrée. En conclusion, ces travaux sont novateurs à trois titres : Au plan instrumental, ils montrent les potentialités de la technique RMN. Notre aimant corps entier, doté d'un tunnel à large ouverture, autorise le déroulement de protocoles dynamiques sur ergomètre. De plus, le rapport signal sur bruit obtenu à un champ magnétique élevé (3 Tesla) est un atout majeur pour détecter des metabolites de faibles concentrations, en un temps raisonnable. La résolution temporelle, facteur de première importance quand il s'agit d'enregistrer des processus dynamiques, en a directement bénéficié. Chaque séquence mise en oeuvre en vue d'une application précise détient une résolution temporelle et spatiale compétitive, aux limites de la capacité de notre système et adaptée au suivi de phénomènes de cinétique rapide telle que l'hyperémie réactionnelle ou fonctionnelle. La mise en évidence du signal de désoxymyoglobine a également été facilitée par le haut champ. En effet, pour une impulsion sélective donnée, le pic résiduel d'eau est d'autant plus réduit que l'écart fréquentiel entre les pics d'eau et de désoxymyoglobine est grand. 284

292 Au plan méthodologique, la construction de séquences RMN alternant des signaux d'imagerie et de spectroscopie hétéronucléaire à haute résolution temporelle est une première. L'approche combinée mesurant simultanément plusieurs déterminants de l'oxygénation va permettre de mieux caractériser la fonction musculaire. Les deux techniques de mesure de la perfusion musculaire développées ont chacune une place indéniable. En effet, un des atouts de la pléthysmographie RMN réside dans le fait que cette technique est suffisamment sensible pour pouvoir mesurer des débits sanguins musculaires faibles, au repos ou suite à diverses stimulations dans certaines pathologies, contrairement à la méthode du Tlapparent qui dispose d'autres avantages ; elle permet le suivi temporel de la perfusion avec une résolution de l'ordre de 15 s, et autorise de surcroît une exploration localisée de la perfusion sur les différents muscles de la jambe. Au plan physiologique, les principaux résultats obtenus lors des protocoles d'ischémiereperfusion concernent : o l'effet de restriction de la perfusion sur la réoxygénation tissulaire, o la dépendance entre les variations de la saturation de l'hémoglobine et du T2*, o le découplage entre l'hyperoxygénation capillaire et tissulaire, lors de la reperfusion, o les corrélations entre la perfusion, la diffusion de l'oxygène des capillaires vers les myocytes et le métabolisme oxydatif musculaire. L'enregistrement simultané de ces variables a suscité la modélisation de la relation entre l'apport d'oxygène, la consommation mitochondriale d'oxygène et le taux de réoxygénation des myocytes. Nous avons mis en évidence que le temps de resaturation en oxygène des myocytes est d'autant plus court que l'apport en oxygène est important et que la capacité oxydative mitochondriale apparente est élevée. Le taux de synthèse mitochondriale d'atp par voie oxydative est ainsi dépendant de l'apport d'oxygène par les capillaires et de sa diffusion vers les cellules musculaires. Comme le modèle proposé est en accord avec les données expérimentales, nous avons pu calculer, à la levée de l'occlusion artérielle, l'extraction musculaire individuelle d'oxygène. 285

293 o Chez des patients souffrant de myopathie de Becker, nous n'avons pas identifié, par comparaison à des individus sains, d'altération du couplage perfusion/oxygénation/ métabolisme énergétique musculaire. Les anomalies musculaires et microvasculaires décrites dans cette dystrophie ne semblent pas se traduire de façon évidente sur le plan fonctionnel. Ces résultats ouvrent alors des perspectives dans ces domaines : Afin d'approfondir les relations proposées, il serait intéressant de reproduire certaines études par une même approche combinée mais entièrement localisée. Pour compléter notre démarche, il est également envisageable d'adjoindre l'étude du métabolisme glucidique par la spectroscopie du carbone-13 avec notamment la mise en évidence d'un metabolite particulièrement intéressant, le glycogène. Une des particularités uniques à la RMN, par son potentiel atraumatique et reproductible, est de pouvoir assurer le suivi efficace du patient. La plupart de nos techniques d'exploration sont tout à fait adaptées à la mise en oeuvre de protocoles pharmacologiques pour suivre l'évolution d'un médicament, apprécier l'efficacité d'un régime nutritionnel pour les myopathes, ou d'un programme d'entraînement spécifique pour des patients atteints de décompensation cardiaque. Les effets de réadaptation suite à une intervention chirurgicale pourraient également tirer profit d'une telle approche. Nous avons proposé et validé un nouveau concept dont la précision et la reproductibilité doivent être améliorées pour une utilisation individuelle chez des patients. Ceci permettrait de disposer d'un outil d'investigation plus puissant qui, appliqué à la physiologie de l'effort et aux pathologies, devrait conduire à des interprétations encore plus fiables. 286

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320 Liste d'abréviations et de conventions Proton : Constituant unique du noyau de l'atome d'hydrogène. En RMN, on emploie généralement le terme proton plutôt qu'hydrogène. Hb : hémoglobine Mb : myoglobine DMb : désoxymyoglobine P02 : pression partielle en oxygène PV02 : P02 veineuse VO2OU VO2 mito : consommation d'oxygène des mitochondries (respiration mitochondriale) VC^max : consommation maximale d'oxygène VC^maxapp : consommation maximale apparente d'oxygène par les mitochondries DO2 : apport artériel en oxygène FIO2 et FEO2 : fraction inspirée et expirée d'oxygène CaÛ2 : concentration en oxygène du sang artériel SaC>2 : saturation en oxygène du sang artériel CvC>2 : concentration en oxygène du sang veineux mêlé DAV : différence artério-veineuse soit (CaC»2-CvO2) EO2 : extraction d'oxygène Q : débit sanguin musculaire (ml.min" 1 ) f : perfusion musculaire (ml. 100g" 1.min" 1 ) P50 : pression partielle en oxygène à 50% de saturation de Thème ATP : adénosine-triphosphate ADP : adénosine-diphosphate PCr : phosphocréatine Pi : phosphate inorganique NADH et FADH2 : nicotinamide- et flavine-adénine-dinucléotide xpcr : constante de temps de resynthèse de PCr TMyo : temps de resaturation de la myoglobine CV : coefficient de variation f.é.m : force électro-motrice ppm : partie par millions RF : radiofréquence S/B : rapport signal sur bruit FMV : Force Maximale Volontaire de contraction 313

321 NERS : Near Infra Red Spectroscopy ou spectroscopie proche infra rouge TEP : tomographie à émission de positron BOLD : Blood Oxygénation Level Dependent notations techniques RMN : FID : Free Induction Decay ou signal d'induction libre Tl et RI : temps et taux de relaxation longitudinale (R1=1/T1) Tl app : temps de relaxation longitudinale apparent T2 et R2 : temps et taux de relaxation transversale (R2=l/T2) T2* : temps de relaxation transversale en champ inhomogène CDQ : Cohérence à Double Quantum! H : proton 31 P: phosphore C : carbone 13 Q : facteur de qualité de la sonde a : angle de bascule de l'aimantation y : rapport gyromagnétique ACQ ou Tacq : durée de l'acquisition du signal RMN TD : nombre de points complexes acquis pendant la lecture d'un signal SW : fréquence d'échantillonnage du signal (Hz) FW : bande passante du récepteur (Hz) p(i) : durée de l'impulsion (i) TR : temps de répétition FOV : champ de vue des images TE : temps d'écho d'une séquence NS : nombre d'accumulations NI : nombre d'images NR : nombre de répétitions Unités Les concentrations sont exprimées en moles par litre ou par kg (mol.l" 1 ou mol.kg 1 ) Les forces sont exprimées en Newton (N) Le travail est exprimé en Joule (J) 314

322 ANNEXE Description détaillée de l'interface électronique Dans cette annexe, nous ne détaillons évidemment pas le fonctionnement classique de l'électronique de notre système. Pour aider à la compréhension de ce schéma, rappelons simplement : - A l'émission en proton, seule l'antenne Helmholtz est utilisée, alors qu'en réception deux antennes peuvent être sélectionnée : la Helmholtz sur le préamplificateur 'H proton ou l'antenne de surface alors reliée au préamplificateur haute puissance ^-HP. - Deux amplificateurs RF existent à l'émission, il s'agit de l'intech pour le proton ou le fluor et de l'eni pour les noyaux X ( 13 C et 31 P). A la réception, un parmi les quatre préamplificateurs doit être sélectionné : 'H, ^-HP, 13 C, 31 P. - Les optocoupleurs u et v sont destinés à l'isolation galvanique de la masse de la chaîne de réception. - Le constructeur du système a défini les canaux suivants : - Le canal Sep permet la sélection des préamplificateurs l K et ^-HP, - le canal S3b permet la sélection de l'amplificateur de l'impulsion RF : Intech ou ENI - Le canal S5b se trouve au niveau logique 1 en mode standard statique, en position entrelaçage il doit donc être maintenu au niveau 0 pour désactiver l'aiguillage classique statique. L'interface est ainsi intercalée entre la partie informatique et les modules d'aiguillage de la chaîne électronique. Le principe de la sélection des voies à l'émission et à la réception ayant été détaillé dans le mode standard, nous allons montrer comment les commandes binaires ul2 et ul3 qui pilotent l'interface peuvent remplacer le fonctionnement classique. Pour des raisons de simplicité, nous allons sélectionner à tour de rôle chacune des instructions possibles et nous expliciterons dans chaque cas le cheminement de l'onde RF à l'émission et du signal RMN à la réception. Le multiplexeur électronique logique (composant 4053) permet : - en mode normal de court-circuiter l'interface en reliant directement le boîtier de commande à l'étage électronique et, - en mode entrelacé de considérer les instructions ul2 et ul3 grâce à l'interrupteur manuel qui autorise deux positions : le mode classique (1 : EFG=0) et le mode entrelaçage (2 : EFG=1).

323 La logique interne de la puce 4053 associe : - EFG à XjYiZ] si EFG=0 (mode classique), l'interface est alors transparente. - EFG à XQYQZQ si EFG=1 (mode entrelaçage), le relais (3) fait commuter les deux interrupteurs pour rendre les optocoupleurs u et v opérationnels. Ce sont alors les valeurs binaires de Y o et Z o qui gèrent l'électronique à l'émission, alors que le relais (3) intervient à la réception par le biais de la logique binaire des optocoupleurs u et v. Sur la figure 1A, les deux instructions ul2 et ul3 introduites au sein des séquences sont respectivement liées aux deux entrées A et B du composant Quatre sorties Qo, Qi, Q2, Q 3 sont envisageables selon la logique du tableau suivant : ul2 ul Qo 1 0 Qi 0 1 Q2 0 0 Q3 0 0 Zo Yo Z 0 =l Y 0 =l u=0 v=0 Z 0 =0 Y 0 =l Sélection des voies Tune Intech Proton 'H-HP Sonde Emission Intech logique Emission rien ul2 logique Réception rien u=l v=0 Z 0 =0 Y 0 =0 u=0 v=l Z 0 =0 Y 0 =0 u=l v=l Proton ampli 'H Sonde Emission ENI Carbone ampli 13 C Sonde Emission ENI Phosphore ampli 31 P ul3 ul2:ul3 ul2 ul3 ul2:ul3 - A l'émission les canaux S3b (Y o ) et Sep (Zo) vont respectivement gérer la sélection de l'amplificateur RF (Intech ou ENI) et du préamplificateur relié à la sonde de réception. - A la réception, les niveaux logiques véhiculés par les optocoupleurs u et v vont permettre de sélectionner un des quatre préamplificateurs ('H, 'H-HP, 13 C, 31 P) ainsi que la sonde. Remarque : L'émission en ul2 réalise la sélection de l'amplificateur RF Intech et de l'antenne Helmholtz. A la réception, l'absence de toute commande opère la sélection de l'antenne de surface connectée sur le préamplificateur 'H-HP (Scp=l). Cette même absence de commande à l'émission déclenche le mode tune de notre système permettant de réaliser l'accord des sondes.

324 R VDD=5V S3b' Sep' SCD S3b Préamp H/'H-HP Intech /ENI +V S5b aiguilleur ul2 ul QO Ql Q2 Q3 I -w- 2,2 K optocoupleurs 2,2 K u Y0 VDD zo VDD Schéma électronique de l'interface pour l'entrelaçage hétéronucléaire Vers récepteur 4X1N4148 Second étage d'amplification XI S5b' Zl Yl Sep S3b S5b VDD ** Connecteurs vers console *** Connecteurs vers le boîtier de commande o.. % (i) interrupteur normal/entrelaçage A o/(2) i. vers antenne 'H volumique- VDD vers antenne 'H surface Sep Figure 1A

325 RESUME Ce travail tente d'approfondir les connaissances sur la physiologie du muscle strié squelettique, intéressante tant en raison de la complexité des couplages et régulations mis en jeu, qu'en raison de la brutalité des variations du métabolisme au cours d'un exercice musculaire, et enfin à cause de la gravité des pathologies qui l'affectent. Nous avons développé par imagerie et spectroscopie RMN,- une méthode atraumatique, non irradiante et quantitative qui permet de mesurer simultanément avec une résolution temporelle élevée, au moins trois déterminants de l'oxygénation parmi : la perfusion par la méthode de pléthysmographie RMN ou du Tlapparent, les changements de saturation de l'hémoglobine à partir du signal IRM pondéré T2*, l'oxygénation tissulaire par la SMR *H de la myoglobine, les variations de lactate musculaire par l'édition des cohérences à double quantum en SRM *H mais aussi le métabolisme énergétique et le ph intracellulaire en SMR 31 P. Cette approche originale, combinant au cours d'un seul examen IRM et SRM hétéronucléaire, a nécessité la construction de sondes, le développement de séquences multifréquentielles entrelacées et la réalisation d'une interface électronique pour assurer la commutation instantanée du noyau. Des automations de traitement ont également été écrites pour redistribuer, en plusieurs vecteurs, les données brutes acquises. Tous les développements ont été validés sur fantôme avant d'être appliqués à l'étude du muscle humain en situation dynamique. Un ergomètre nous a permis de contrôler et quantifier le travail musculaire. Les réponses physiologiques des différents volontaires aux épreuves de provocation du type exercice et/ou ischémie-récupération nous ont permis d'établir des corrélations tant au cours qu'à l'issue des stimulations. A la reperfusion, nous avons établi l'effet de restriction de la perfusion sur la réoxygénation tissulaire et sur la capacité oxydative mitochondriale, la dépendance entre le T2* et la saturation de l'hémoglobine, le découplage entre l'oxygénation capillaire et tissulaire. Les données expérimentales, cohérentes avec le modèle proposé liant l'apport, la consommation mitochondriale d'oxygène et le taux de réoxygénation des myocytes, permettent de calculer l'extraction musculaire individuelle d'oxygène. Chez des patients souffrant de myopathie de Becker, nous n'avons pas identifié d'altération du couplage perfusion/oxygénation/ métabolisme énergétique musculaire. Nous avons ainsi proposé et validé un outil d'investigation puissant qui, appliqué à la physiologie de l'effort et aux pathologies, devrait conduire, par des explorations les plus exhaustives possibles, à des interprétations physiologiques plus fiables. Mots clés : RMN, muscle squelettique, perfusion, oxygénation, métabolisme énergétique, ph intracellulaire, pléthysmographie, myoglobine, metabolites phosphores, entrelaçage hétéronucléaire.