Licence Pro Biotechnologies Module UE2 Cultures Cellulaires

Transcription

1 Licence Pro Biotechnologies Module UE2 Cultures Cellulaires

2 La culture primaire

3 Devenir d une culture primaire

4 Courbe de croissance des cellules en culture

5 Cellules HEK 293 ATCC Number: CRL-1573 Organism : Homo sapiens (human) Source: Organ: kidney Cell type: transformed with adenovirus 5 DNA Application: transfection host Receptors: vitronectin, expressed Tumorigenic: Yes, forms tumors in nude mice Age:fetus

6 Cytogenetic analysis : This is a hypotriploid human cell line. The modal chromosome number was 64, occurring in 30% of cells. The rate of cells with higher ploidies was 4.2 %. Comments: Although an earlier report suggested that the cells contained Adenovirus 5 DNA from both the right and left ends of the viral genome [RF32764], it is now clear that only left end sequences are present. [39768] The line is excellent for titrating human adenoviruses. The cells express an unusual cell surface receptor for vitronectin composed of the integrin beta-1 subunit and the vitronectin receptor alpha-v subunit. [23406] The Ad5 insert was cloned and sequenced, and it was determined that a colinear seqment from nts 1 to 4344 is integrated into chromosome 19 (19q13.2). [39768] Références bibliographiques

7 Eagle s Minimum Essential Medium EMEM Inorganic Salts (g/liter) CaCl2 (anhydrous) MgSO4 (anhydrous) KCl NaHCO NaCl NaH2PO4 H2O Vitamins (g/liter) Choline Chloride Folic Acid myo-inositol Nicotinamide D-Pantothenic Acid (hemicalcium) Pyridoxine HCl Riboflavin Thiamine HCl Autres (g/liter) D-Glucose Sodium Pyruvate Phenol Red, Sodium Salt Amino Acids (g/liter) L-Alanine L-Arginine HCl L-Asparagine H2O L-Aspartic Acid L-Cystine 2HCl L-Glutamic Acid L-Glutamine Glycine L-Histidine HCl H2O L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine HCl L-Methionine L-Phenylalanine L-Proline L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine 2Na 2H2O L-Valine

8 Les systèmes de maintien du ph Système CO 2 /bicarbonate de Na + Acide carbonique bicarbonate H 2 O + CO 2 H 2 CO 3 H + + HCO3 - Autres Systèmes NaHCO 3 Na + + HCO3 - L équation de Handerson-Hasselbach prédit la valeur du ph: ph = log([HCO3- ]/[CO2 ]) Tampons organiques de type HEPES, PIPES (Tampons phosphate)

9 Eagle s Minimum Essential Medium EMEM Inorganic Salts (g/liter) CaCl2 (anhydrous) MgSO4 (anhydrous) KCl NaHCO NaCl NaH2PO4 H2O Vitamins (g/liter) Choline Chloride Folic Acid myo-inositol Nicotinamide D-Pantothenic Acid (hemicalcium) Pyridoxine HCl Riboflavin Thiamine HCl Autres (g/liter) D-Glucose Phenol Red, Sodium Salt Sodium Pyruvate Amino Acids (g/liter) L-Alanine L-Arginine HCl L-Asparagine H2O L-Aspartic Acid L-Cystine 2HCl L-Glutamic Acid L-Glutamine L-Glycine L-Histidine HCl H2O L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine HCl L-Methionine L-Phenylalanine L-Proline L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine 2Na 2H2O L-Valine

10 On ajoute dans le milieu : antibiotiques et antifongiques Bactéries Champignons Levures

11 .. Mycoplasmes Microscopie électronique

12 Serum Source de protéines, acides aminés, facteurs de croissance, lipides, sucres, hormones, transporteurs (acides gras, fer ) Facteurs d adhésion (notamment fibronectine) Pouvoir tampon et il participe donc à la régulation du ph Inactive certaines enzymes protéolytiques viscosité du milieu

13 Problème plus général de l attachement des cellules Matériel de culture traité pour l adhésion Nécessité d un Coating de la surface: Collagène, laminine, poly L-Lysine. Nécessité de la présence d une véritable MEC: Collagène IV + laminine + protéoglycane

14 La conservation des cellules Principe: Congélation des cellules et conservation à basse température

15 Le choc thermique Le phénomène de cristallisation de l eau

16 Congélation extra- et intracellulaire en fonction de la vitesse de refroidissement -2 C -5 C -10 C Refroidissement: 1. lent; 2. rapide

17 Effets de la vitesse de refroidissement

18 LES PALIERS DE TEMPERATURE

19 Effets d un agent cryoprotecteur: le DMSO (diméthylsulfoxide)

20 Décongélation: Rapide (pour éviter l instabilité des cristaux intracellulaires) Dilution des cellules dans le milieu: Lente (dilution brusque du DMSO: choc osmotique) Centrifugation: Nécessaire uniquement si les cellules sont très sensibles au DMSO En résumé Attention à : -Vitesses de congélation -Température de stockage longue durée - Processus de décongélation

21 Cellules HEK 293 Propagation des cellules: ATCC complete growth medium: Minimum Essential Medium (Eagle) with 2 mm L-glutamine and Earle's BSS adjusted to contain 1.5 g/l sodium bicarbonate, 0.1 mm non-essential amino acids and 1.0 mm sodium pyruvate, 90%; heat-inactivated horse serum, 10% Temperature: 37.0 C Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5% Growth Conditions: The cell line does not adhere to the substrate when left at room temperature for any length of time, therefore, live cultures may be received with the cells detached. The cells will re-attach to the flask over a period of several days in culture at 37C. Conservation des cellules: Freeze medium: Complete growth medium supplemented with 5% (v/v) DMSO Storage temperature: liquid nitrogen vapor phase