Durée : 2 heures Coefficient : 2 REMARQUES IMPORTANTES

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1 CONCOURS EXTERNES IT 2015 EPREUVE TECHNIQUE D ADMISSION Durée : 2 heures Coefficient : 2 CONCOURS N 134 Corps : Assistant ingénieur BAP : A Sciences du Vivant Emploi-type : Assistant en techniques biologiques Délégation organisatrice : Ile de France Ouest et Nord, Meudon REMARQUES IMPORTANTES Donnez vos réponses directement sur le sujet dans l espace réservé après chaque question. Aucun document n est autorisé. L utilisation des téléphones portables est interdite. Seul l usage d une calculatrice non programmable est autorisé. Les parties et les questions au sein de chaque partie sont indépendantes. L épreuve est notée sur 70 points et comprend : Partie 1 : Questions à choix multiples (notée sur 8 points) Partie 2 : Exercices et Questions (notés sur 62 points) A. Exercice de Biologie Moléculaire (noté sur 18 points) B. Exercice de Génétique (noté sur 12 points) C. Exercice d analyse de protocole et de compréhension (noté sur 10 points) D. Questions spécifiques (notées sur 12 points) E. Questions générales (notées sur 10 points) Page introductive à lire attentivement par le candidat

2 PARTIE 1 : QCM (Noté sur 8 points) Entourez les bonnes réponses. Plusieurs réponses peuvent être possibles pour certaines questions à choix multiples. Vous devez donner toutes les réponses exactes pour une même question pour en obtenir les points. En revanche, tout oubli ou réponse fausse est pénalisant. 1. La molécule d ADN est composée de : A. de bases azotées, de lipides et de groupements phosphates B. de lipides, de groupements phosphates et de sucres C. de bases azotées, de sucres et de groupements phosphates D. de bases azotées, de lipides et de sucres 2. Une enzyme de restriction est : A. une exonucléase B. une phosphatase C. une ribonucléase D. une endonucléase 3. Pour réaliser une expérience d amplification de gène par PCR, il faut : A. une matrice d ARN, des amorces spécifiques, des ions Ca 2+, des dntps, une ARN polymérase ARN dépendante B. une matrice d ADN, des amorces spécifiques, des ions Mg 2+, des dntps, une ADN polymérase ADN dépendante C. une matrice d ADN, des amorces spécifiques, des ions Ca 2+, des dntps, une ADN polymérase ADN dépendante D. une matrice d ADN, des amorces spécifiques, des ions Mg 2+, des NTPs, une ADN polymérase ADN dépendante 4. Pour évaluer la pureté d un échantillon d ADN par rapport aux protéines, vous mesurez par spectrométrie : A. la densité optique à 260nm B. le rapport de densité optique à 260nm et 280nm C. la densité optique à 280nm 5. Quelle(s) molécule(s) permet(tent) de visualiser des fragments d ADN séparés par électrophorèse? A. le bromure d éthidium B. le bromure de potassium C. l actinomycine D D. la green fluorescent protein (GFP) 6. Quelle(s) méthode(s) utilise(nt)-on pour évaluer le niveau de pureté d une protéine en cours de purification? A. une mesure de diffusion de la lumière B. un dosage de Bradford C. une électrophorèse SDS-PAGE D. un spectre RMN 2

3 CONCOURS EXTERNES IT 2015 EPREUVE TECHNIQUE D ADMISSION Durée : 2 heures Coefficient : 2 CONCOURS N 134 Corps : Assistant ingénieur BAP : A Sciences du Vivant Emploi-type : Assistant en techniques biologiques Délégation organisatrice : Ile de France Ouest et Nord, Meudon REMARQUES IMPORTANTES Donnez vos réponses directement sur le sujet dans l espace réservé après chaque question. Aucun document n est autorisé. L utilisation des téléphones portables est interdite. Seul l usage d une calculatrice non programmable est autorisé. Les parties et les questions au sein de chaque partie sont indépendantes. L épreuve est notée sur 70 points et comprend : Partie 1 : Questions à choix multiples (notée sur 8 points) Partie 2 : Exercices et Questions (notés sur 62 points) A. Exercice de Biologie Moléculaire (noté sur 18 points) B. Exercice de Génétique (noté sur 12 points) C. Exercice d analyse de protocole et de compréhension (noté sur 10 points) D. Questions spécifiques (notées sur 12 points) E. Questions générales (notées sur 10 points) Page introductive à lire attentivement par le candidat

4 7. Dans un gel SDS dénaturant, la séparation des protéines se fait en fonction de : A. leur charge B. leur poids moléculaire C. leur point isoélectrique D. leur teneur en acides aminés aromatiques 8. Quel(s) est (sont) la(les) molécule(s) utilisée(s) habituellement pour faire polymériser un gel de polyacrylamide : A. le TEMED B. le persulfate d ammonium C. le bis-acrylamide D. la glycine 9. La révélation des protéines séparées sur un gel de polyacrylamide peut se faire par : A. coloration au réactif de Bradford B. coloration au bleu de Coomassie C. coloration au bleu de xylène cyanol D. coloration au nitrate d argent 10. Quel(s) support(s) de chromatographie permet(tent) de purifier des protéines recombinantes? A. une résine d affinité B. une résine échangeuse d ion C. une résine d exclusion D. une résine hydrophobe 11. Quel est le nom de la méthode utilisée pour transférer une protéine sur membrane? A. Southern blot B. western blot C. northern blot D. eastern blot 12. Une protéine est : A. la plus soluble quand le ph de la solution est égale à son pi B. la moins soluble quand le ph de la solution est égale à son pi C. la plus soluble quand le ph de la solution est différent de son pi 13. En utilisant le code génétique standard, quel(s) couple(s) de codons, au niveau de l ARNm, délimite(nt) une phase ouverte de lecture? A. ATG et TAA B. AUG et UAA C. AUG et UGG D. AUG et UAG 3

5 14. L épigénétique correspond à : A. L étude des changements d activité des gènes héritables mais indépendant de la séquence d ADN B. Un phénomène pouvant impliquer certaines modifications réversibles de l ADN C. Un phénomène impliquant des modifications de la séquence de l ADN 15. La méthylation de l ADN : A. a lieu au niveau de séquences CpG chez les mammifères B. a lieu au niveau de séquences CpG chez la bactérie Escherichia coli C. a lieu au niveau de séquences GATC chez la bactérie Escherichia coli D. n a pas lieu chez les bactéries 16. Le niveau d expression d un gène normalement traduit peut être déterminé par : A. Southern blot B. western blot C. qpcr D. RT-qPCR (reverse transcriptase qpcr) 17. L ARNm eucaryotique d un gène typique humain est : A. modifié à ses 2 extrémités B. uniquement polyadénylé C. épissé pour éliminer les exons D. épissé pour éliminer les introns 18. Les gènes humains codant les protéines sont transcrits par : A. l ARN polymérase I B. l ARN polymérase II C. l ARN polymérase III D. les ARN polymérases I et II 19. Une cellule haploïde A. peux contenir deux allèles d un même gène B. peut subir la meïose C. peut entrer en mitose D. contient une seule copie d un gène donné 20. Une souris adulte A. est diploïde B. est haploïde C. peut être homozygote pour une mutation D. peut être hétérozygote pour une mutation 4

6 PARTIE 2 : EXERCICES ET QUESTIONS (Notée sur 62 points) A. EXERCICE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE (Noté sur 18 points) Figure 1 : Séquence d ADN codant pour la protéine Artemin humaine 1 ATGGAACTTGGAGGCCTCTCCACGCTGTCCCACTGCCCCTGGCCTAGGCA GCAGGATCCACTTGGTCTCTCCGCGCAGCCTGCCCTGTGGCCCACCCTGG CCGCTCTGGCTCTGCTGAGCAGCGTCGCAGAGGCCTCCCTGGGCTCCGCG CCCCGCAGCCCTGCCCCCCGCGAAGGCCCCCCGCCTGTCCTGGCGTCCCC CGCCGGCCACCTGCCGGGGGGACGCACGGCCCGCTGGTGCAGTGGAAGAG CCCGGCGGCCGCCGCCGCAGCCTTCTCGGCCCGCGCCCCCGCCGCCTGCA CCCCCATCTGCTCTTCCCCGCGGGGGCCGCGCGGCGCGGGCTGGGGGCCC GGGCAGCCGCGCTCGGGCAGCGTGA 375 Figure 2 : Carte du plasmide pgex-6p3 3C protease recognition site Ptac ori 5

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8 Clonage moléculaire (8 points) A.1) Vous allez réaliser le sous-clonage de l intégralité de la séquence d ADN codant pour la protéine Artemin en amplifiant par PCR cette séquence que vous insérerez dans le plasmide pgex-6p3 linéarisé par les endonucléases de restriction BamHI et XhoI. A.1.1) Que signifie le terme PCR? En décrire succinctement les étapes. (1 point) A.1.2) Quelle(s) particularité(s) possède(nt) généralement l ADN polymérase utilisée couramment pour la PCR? (1 point) A.2) Vous avez à votre disposition les enzymes de restriction suivantes pour réaliser le sous-clonage de la séquence d ADN : Acc65I : NlaIV : BamHI : SalI : BglII : XhoI : ClaI : Les séquences de ces sites de restriction, présents dans la séquence d ADN, sont soulignées sur la figure 1. 7

9 A.2.1) Donnez le(s) couple(s) de sites de restriction à ajouter de part et d autre de la séquence d ADN en vue de son sous-clonage dans le vecteur pgex-6p3 précédemment linéarisé? Commentez votre choix. (2 points) A.2.2) Citez une technologie de clonage permettant de s affranchir de l utilisation d enzyme(s) de restriction pour un clonage. En décrire brièvement le principe. (2 points) 8

10 A.2.3) Dessinez, en les orientant de 5 à 3, le couple d amorces (20 nucléotides chacune) nécessaires pour amplifier la séquence d ADN permettant de réaliser votre sous-clonage en utilisant les sites de restrictions que vous aurez précédemment choisis. (1,5 point) A.2.4) Vous disposez de vos amorces en solution stock à 0,1mM. Vous réalisez une dilution intermédiaire de 20x. Quel volume de la dilution intermédiaire allez-vous prélever sachant qu il faut 10pmoles de chaque amorce dans la réaction de PCR? (0,5 point) Expression de protéine (10 points) A.3) Le sous-clonage de l ADN codant pour la protéine Artemin dans le plasmide pgex-6p3 est maintenant réalisé et vous décidez d exprimer cette protéine humaine. A.3.1) Quel système d expression allez-vous utiliser? Expliquez. (1 point) A.3.2) Citez un autre système d expression pour les protéines recombinantes. Indiquez un de ses avantages. (1 point) 9

11 A.3.3) Quel type de chromatographie allez-vous utiliser préférentiellement pour purifier la protéine recombinante produite dans la phase soluble de votre extrait cellulaire? Expliquez. (1,5 points) A.3.4) Indiquez le nombre d acides aminés du polypeptide généré contenant la protéine Artemin après clivage par la protéase. Donnez en un poids moléculaire approximatif. (1 point) A.3.5) Vos analysez vos échantillons en cours de purification sur SDS-PAGE. Le tampon de charge contient du SDS et du β-mercaptoéthanol. Précisez le rôle de ces deux produits. Quelles précautions devez-vous prendre pour préparer ces solutions? (1,5 points) A.4) Soit la table du code génétique standard : 10

12 A.4.1) Donnez la séquence en acides-aminés de la séquence d ADN surlignée en gris dans la figure 1 en débutant dans la première phase de lecture. (1 point) A.4.2) Un codon est indiqué en gras dans la séquence. Pour quel acide-aminé code t il? Vous décidez de muter ce codon pour qu il code pour une lysine. Quel(s) changement(s) de nucléotide(s) allez-vous faire? (0,5 point) A.5) Vous décidez de réaliser cette mutation en utilisant la technique de «rolling-circle» qui consiste à amplifier le plasmide en une seule PCR avec un couple d amorce approprié apportant la mutation à fixer. Vous transformez la bactérie Escherichia coli dam + avec une fraction aliquote de cette réaction de PCR. Après étalement et croissance sur gélose, vous obtenez un grand nombre de colonies. Après analyse, il s avère que la majorité des colonies contiennent le plasmide parental. A.5.1) Comment réalisez-vous cette analyse pour différencier le plasmide parental du plasmide ayant intégré la mutation? (1,5 points) A.5.2) Quelle expérience simple menée au laboratoire proposez-vous pour augmenter l efficacité expérimentale? Commentez. (1 point) 11

13 B. EXERCICE GÉNÉTIQUE (Noté sur 12 points) On a généré chez la souris une mutation par intégration homologue sur un des allèles du génome d une cellule souche d un fragment d ADN contenant un gène de sélection de façon à éliminer l exon 2 d un gène d intérêt en suivant le schéma ci-dessous. Les cellules ainsi générées sont hétérozygotes pour la mutation. Elles ont ensuite servi à reconstituer une lignée de souris transmettant le gène muté dans sa lignée germinale. Techniquement, la détection des allèles sauvage et mutant peut se faire grâce aux réactions de PCR indiquées sur le schéma. Le fragment généré sur l allèle sauvage par la réaction PCR1 a une taille de 250 paires de bases. Celui généré pour l allèle mutant par la réaction de PCR2 a une taille de 400 paires de bases. (Voir schéma.) B.1) Expliquez «recombinaison homologue». (3 lignes maximum 2 points) B.2) A quoi sert le gène NeoR dans cette expérience. (3 lignes maximum 1 point) 12

14 B.3) D après vous, que sera la conséquence de la mutation sur l expression du gène ciblé? Pourquoi? (5 lignes maximum 4 points) B.4) La souris hétérozygote portant un allèle muté dans sa lignée germinale a été croisée avec une souris sauvage. Pour chacun des 5 souriceaux résultant de ce croisement, de l ADN génomique a été isolé et les réactions de PCR1 et 2 ont été effectuées. Les produits de la réaction de PCR ont été fractionnés sur un gel d agarose, et photographiés après une coloration appropriée. Les résultats sont présentés dans le schéma suivant. Donnez le génotype de chacun des souriceaux. (1 point) 13

15 B.5) L assistant-ingénieur qui suit cette lignée a effectué plusieurs croisements entre souris mâles et femelles tous hétérozygotes pour la mutation. Il a caractérisé le génotype de tous les souriceaux obtenus par la stratégie décrite ci-dessus et rassemblé les données : - Nombre de souris sauvages : 52 - Nombre de souris hétérozygotes : 98 Un autre génotype était-il attendu? Que concluez-vous de cette expérience? (On considérera que toute différence d un nombre supérieur à 10 souris par rapport au nombre théorique attendu est significative, et que toute différence inférieure résulte des aléas de l expérimentation.) (5 lignes maximum 4 points) C. ANALYSE DE PROTOCOLE / COMPRÉHENSION (Noté sur 10 points) C.1) ANALYSE DE PROTOCOLE (Noté sur 8 points) Soit un extrait de la partie «Experimental Procedures» de l article de Trispsianes K. et coll. publié en 2014 dans la revue The Journal of Biological Chemistry 289 : [..] [..] 14

16 C.1.1) Traduire les phrases encadrées en noir. (1,5 points) C.1.2) Quelle technique est utilisée pour rompre les parois bactériennes afin de libérer les protéines? Quel(s) est(sont) le(s) inconvénient(s) de cette technique? Citez une autre technique de lyse cellulaire. (1,75 points) 15

17 C.1.3) Comment se déroule l élimination de l étiquette GST? (1,5 points) C.1.4) Vous disposez des produits et solutions suivants : - Tris-HCl ph 7,5 1M - NaCl 5M - Imidazole (PM = 68,8 g.mol -1 ) - DTT 2,5M - NaN 3 (PM = 65,01 g.mol -1 ) Quelle volume de solutions et quelle quantité de poudre allez-vous prendre pour préparer le volume de tampon de lyse nécessaire à la première étape du protocole présenté dans la publication ci-dessus? Les constituants autres de ceux mentionnés cidessus ne seront pas pris en compte pour votre calcul. (1,25 points) 16

18 C.1.5) Question en anglais à répondre en anglais : C.1.5.1) Why using imidazole for eluting proteins bound to Ni-NTA resin? (1 point) C.1.5.2) Which is the role of the size exclusion chromatography step? (1 point) C.2) COMPRÉHENSION (2 points) Soit le schéma en désordre de la procédure de construction d une banque d ADN pour un séquençage haut débit. A. B. C. D. E. F. 17

19 G. Soit la description des différentes étapes : 1. Denature, anneal 1 st and 2 nd primers 2. Size select DNA on gel 3. PCR product after 1 st cycle 4. End repair of DNA fragments 5. Denature, anneal 1 st primer 6. PCR product after 18 cycles 7. Add A overhang and ligate adapters Associez chaque étape du schéma avec sa description et proposez la suite logique de la procédure de construction d une banque d ADN pour un séquençage haut débit. Indiquez une lettre et un chiffre par case D. QUESTIONS SPÉCIFIQUES (Noté sur 12 points) D.1) QUESTION 1 (4 points) Plusieurs catégories d ARN coexistent dans une cellule eucaryote dont les ARN messagers (mrna), les «mirna» et les longs ARN non-codants. Quelles sont les caractéristiques de ces différentes classes d ARN? Comment sont-ils synthétisés (présence de précurseurs, étapes de maturation)? Quelles sont les fonctions des ARN matures? (15 lignes maximum) 18

20 D.2) QUESTION 2 (2 points) La littérature décrit abondamment l usage d une méthodologie qui a recours à l interférence à ARN dite «RNAi». Quel est le mécanisme général de l interférence avec les ARN messagers cibles et la conséquence sur ceux-ci? (5 lignes) D.3) QUESTION 3 (3 points) Pour l espèce de Drosophile «Drosophila melanogaster» des collections de milliers de mutants sont accessibles depuis plusieurs banques publiques. Ces mutants sont majoritairement obtenus par une technique génétique de modification du génome. La transposase qui reconnait des motifs dit «P elements» est l enzyme clé pour l obtention de ces collections. Pouvez-vous décrire succinctement le mécanisme mettant en jeu la transposase, les éléments P et le génome de la drosophile pour l obtention de ces banques? (10 lignes maximum) 19

21 D.4) QUESTION 4 (3 points) Comment la présence de groupe méthyl sur l ADN modifie l expression des gènes chez les plantes et les insectes? (5 lignes maximum) 20

22 E. QUESTIONS GÉNÉRALES (Noté sur 10 points) E.1) EXERCICE 1 (1,5 points) On veut faire 250 ml d'une solution aqueuse d'acide trichloracétique à 80% (poids/volume). Ce produit se présente sous forme d'une poudre. On dispose d'une balance, d un bécher, d'une éprouvette de 0,5 l graduée. Décrire précisément comment procéder. (3 lignes maximum). E.2) EXERCICE 2 : Questions sur le ph (3,5 points) E.2.1) Définition (2 lignes maximum 1 point) E.2.2) Comment le mesure-t-on? (3 lignes maximum 1 point) E.2.3) Comment préparer 200 ml d'un tampon Tris de molarité 1 M, ajusté à ph 7.2 par l'acide chlorhydrique? On présentera la méthode la plus simple. Le Tris est fourni en poudre, l'acide chlorhydrique sous forme d'une solution concentrée. On dispose de tout l'équipement classique d'un laboratoire de biochimie. À titre d'indication, on donne: le poids moléculaire du Tris = g.mol -1, son pka = 8,1 et la normalité de la solution d'acide chlorhydrique fournie : 10 N. NB : ces renseignements ne sont pas tous indispensables pour répondre à la question, aucun calcul compliqué n'est nécessaire. (5 lignes maximum 1,5 points) 21

23 E.3) EXERCICE 3 : Hygiène et sécurité (5 points) E.3.1) Indiquez une signification simple aux pictogrammes ci-dessous : (1,5 points) E.3.2) Définir le terme OGM et donner un exemple d OGM. Les OGMs ont été répartis en plusieurs classes. Expliquez pourquoi et quelles en sont les conséquences pour leur manipulation au laboratoire. (10 lignes maximum 3,5 points). 22