Colorations. simple : bleu de methylene forme des bacteries, organisation diagnostique infection a gonocoques

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1 Colorations simple : bleu de methylene forme des bacteries, organisation diagnostique infection a gonocoques Gram : morpho et tinctorialité Les etapes: 1. Violet de gentiane 1-2 min 2. Lugol 1-2 min 3. Alcool acetone- 30 sec 4. Safranine (fucsine) 1-2 min Entre toutes les etapes on fait le lavage avec l eau de robinet Gram + : ( violet) Cocques: staphylocoques (amas) streptocoques (chaines de+ de 10 coques, avec hemolyse complete) pneumocoques (capsule rouge /jaune) Bacilles: Bacillus anthracis ( capsule noire) Corynebacterium diphteriae, Clostridium tetani, Clostridium botulinum Gram - : (rose) Coques: gonocoque, meningocoque Bacilles: Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella, Pseudomonas Cocobacilles : Haemophilus influenzae, Bordetella pertusis, brucella sans paroi : protoplaste (lysosyme bacterie gram + qui perd la paroi), spheroplaste (lysosyme et EDTA sur paroi bacterie gram, qlq restes de parois) formes «L» obtenue en psce d'un inducteur ( penicilline) mycoplasmes ( naturellement sans paroi) Ziehl-Neelsen : pour identification des mycobacteries ( BAAR ) 1er temps : coloration par la fuchsine à chaud On recouvre le frottis d'un papier filtre imprégné de fuchsine de Ziehl. Chauffage à émission de vapeur pendant dix minutes au moins, en veillant à ne pas laisser sécher le papier. Rinçage à l'eau distillée stérile. 2e temps : décoloration Trempage de la lame deux minutes dans une solution d'acide, suivi d'un rinçage. Trempage la lame cinq minutes dans l'alcool à 90, suivi d'un rinçage. 3e temps : recoloration On recouvre la lame pendant deux minutes d'une solution de bleu de méthylène, puis on rince. Observation MO immersion : mycobacteries rouges sur fond bleu

2 Coloration Fontana-tribondeau : identification des spirochetes 1. solution Rügge-3 fois, 30 secondes 2. alcool 96 % - 3 min. 3. acide tanic 5 % - 30 sec. ( chauffage mais sans vapeurs)-lavage avec l eau distillée 4. azotate d argent ammoniacal-1 minute, chauffage mais sans vapeur, lavage avec l eau distillée. Séchage MO immersion : marron,spiralé, sur fond jaune ex : treponema pallidum Coloration de Burri : coloration a l'encre de chine, identification de la capsule capsule blanche sur fond noir Coloration de Burri modifiée capsule blanche, bacille rouge (fuschine) Möller : (Ziehl-Neelsen modifiée) coloration des spores spore petit ovalaire centrale ne modifie pas forme bact. =BACILLUS spore grand, mofie forme bact. = Clostridium tetani ( spore terminale «allumette») clostridium botulinum (spore sous terminale «raquette») clostridium sporogenes ( spore centrale»barquette»)

3 clostridium botulinum clostridium difficile vert de malaschite saphranine spores (vert), formes vegetatives (rouge) Leiffson : impregnation argentique apresle zettnov flagelles, cils bacteriens et corps noirs La coloration Neisser( Neisser( pour le corpuscules de Babes-Ernst Corynebacterium diphteriae) corpuscules bruns / corps bacterien jaune. -on utilise des préparations fixées à la flamme Les étapes 1. cristal violet et bleu de méthylène(2/1)-5 min.(lavage avec l eau distillée) 2.Lugol-1 min. ( lavage avec l eau distillée) 3.crysoidine-30 sec. (éloigner, séchage sur papier filtre) corpuscules de Babes-Ernst bleu violet, cellule bactérienne jaune-marron.

4 Auramine-rodamine : colore BAAR pour les spirochetes Burri spirochete blancsur fond noir Fontana-Tribondeau spirochete brun/noir sur fond jaune Levaditi-Manuelian spirochete (sur section d'organe) noir brune sur tissus jaunes Giemsa treponemes rouges/violatre leptospires violet/rougeatre coloration des Rickettsia Gimenez (fuschine etvert de malachite) bacteries rouges etincellantes sur fond bleu Giemsa--> Rickettsia= cocobacilles (pourpres) Machiavello (semblable a Ziehl neelsen) Rickettsia rouge sur fond bleu Coloration Mycoplasmes ( pas de paroi bacterienne, polymorphisme dans colorations:) giemsa arcidine orange gram Coloration Chlamydia inclusion trachome (giemsa, machiavello et IF)

5 Milieux de culture milieu usuel complexe ( bacteries intestinales) Gelose MacConkey cristal violet, sels biliaires, lactose separe lactose + jaune lactose - violet ( couleur non modifiée ) Milieu Levine ( EMB ) lactose, eosine, bleu methylene inhibe bacteries gram + differencie bacteries lactose +/E. Coli colonie S, lactose + anneaux verts lactose rouge (couleur du milieu)

6 Gelose mueller-hilton glucose, peptone de caséine, cœur de bœuf,agar-agar utilisé pour antibiogramme Milieu Drigalski non selectif (lactose,bromo-cresol pourpre) isole bactéries gram distingue lactose + (colonies jaune) lactose - ( colonies bleues) Milieu aux proteines natives(bacteries exigeantes) Gelose au sang frais activité hemolytique hemolyse complete streptocoque β-hemolytique (gram +) hemolyse faible (autour colonies) staphylocoque doré hemolyse complete bacille pyocyanique(=pseudomonas aeruginosa) ( gram, colonies S)

7 Gelose au sang cuit(70-80 C) Gelose simple colonies S (jamais rugueuses) pigment doré staphylocoque doré translucide enterobacterie transparent streptocoque β-hemolytique Milieux selectifs ( ajout d'antibiotiques, antiseptiques ou colorants rendent le milieu selectif) Chapman : milieu solide hypersalé, mannitol, rouge phenol staphylocoques mannitol + jaune autres bacteries mannitol - rouge ( couleur normale)

8 Milieu Hektoen salmonelle lactose - vert E.coli lactose + jaune orangé Leifson (desoxycolate de Na, rouge neutre, lactose thiosulfate, citrate fer ammoniacal) pour enterobacteries, milieu liquide germe inerte vert germe oxydatif jaune dans partie sup germe fermentatif tout jaune (enterobact. ) Istrati-Meitert( tres selectif, bile totale de boeub et BBT) seulement en roumanie bucarest enterobacteries et Pseudomonas aeruginosa Gelose mueller-hilton antibiotiques et sang isolement gonocoques et meningocoques Thayer et martin : gelose au sang cuit et antibiotiques isolation gonocoques ( flore vaginale complexe)

9 Milieu B.S.A. (agar et sels biliaires) ph 8,4 isolement vibrio cholerae Milieu Tinsdale (Tellurite de K) Cornybacterium diphteriae Milieu solide lowenstein-jensen (sels, asparagine,glycerine neutre, amidon patate, œufs,vert malachite) mycobacteries ( nottament mycobacterium tuberculosis) Gelose sabouraud (glucose, agar, peptone, antibiotiques) isolement champignons Milieux bile-esculine, gelloses bile-esculine-azide isolement enterocoques noirs ( hydrolyse esculine)

10 Gelose cetrimide pyocianine bleue ( produit par pseudomonas) gelose TSI enterobacteries fermentation glucose, lactose, saccharose production H2S (disulfure d'hydrogene) Milieux d'enrichissements (milieux liquides, multiplication de bacteries presentent en petite quantitée dans les prelevements biologiques, avant isolation et identification) eau peptonée alcaline ph=8 vibrio cholerae Chapman liquide hypersalé(15%) staphylocoques milieu avec selenite acide de Na Salmonella milieu O.C.S.T. (œuf serum, cysteine, tellurite de K)-> corynebacterium diphteriae milieu kauffman-müller Salmonella Milieux Anaerobies Veillon semi-solide (agar + glucose ) tubes longs et etroits bact. Anaerobies encensement profond Tarozzi (blanc œuf dur/viande bovin/ viscere animal foie rein cœur)

11 Antibiogramme methode diffusimetrique sechage 5 min puisdepose disques antibiotique avec pince espace de 2 cm min entre les disques maintient a 37 C pendant 18 / 24 h lecture : zone d'inhibition mesure du diametre ( du centre du disque Antibio jusqu'à la limite du cercle) resultat en millimétre comparé aux valeurs standard (tableaux) bacterie resistante/intermediaire/sensible a l'antibiotique analyse de l'action addictive / inactive de deux antibiotiques en fonction de l'angle ou se recoupent les cercles d'inhibition antibiogramme par dilution dans milieux liquides determination de la concentration minimale inhibitrice dilution decroissante d'antibiotique + méme quantité de bacteries incubation puis lecture : milieu limpide inhibition croissance bacteriennne milieu trouble developpement bacterien le dernier tube limpide concentration minimale inhibitrice E-test concentration minimale inhibitrice bandelette graduée (logarythmique) de concentrations zone d'inhibition ovalaire point intersection bandelette et de la zone d'inhibition C minimale inhibitrice