La Biologie moléculaire

Transcription

1 La Biologie moléculaire Introduction La biologie moléculaire correspond à l étude de la vie à l échelle moléculaire. On s intéresse essentiellement aux acides nucléiques que sont les ADN et ARN, commandant la vie cellulaire, même si d autres molécules commandent la synthèse des protéines. Quelque soit la cellule de l organisme, elle ne peut vivre sans son microenvironnement. Ces cellules vont produire des molécules signal ayant systématiquement une répercussion sur l ADN : Ø Si une cellule peut se diviser, c est avant tout parce que l ADN est capable de se répliquer. Ø Une cellule peut survivre dans son environnement grâce à la synthèse de protéines, protéines codées par des gènes (Traduction). Ø A leur naissance, les cellules ne sont pas spécialisées c est lors de leur différenciation que les cellules s octroient des fonctions spécialisées, dépendantes de la composition en protéines. Ø Enfin, les gènes permettent de définir le temps de vie d une cellule aboutissant à la mort cellulaire programmée, l apoptose. L ADN est la molécule universelle de toutes les cellules du vivant. Cet ADN est responsable de la transmission des caractères génétiques. Chez certains virus, les rétrovirus, l équipement génétique n est pas de l ADN mais de l ARN. Les gamètes sont haploïdes, et c est lors de la fécondation que la cellule-œuf retrouve sa diploïdie : L ADN, et donc le patrimoine génétique, est ainsi transmis. Par analogie, toute anomalie de l ADN chez un gamète sera transmise, et toutes les pathologies qu elle invoque. v Flux de l information génétique Le flux de l information génétique dans une cellule va toujours des gènes vers les protéines. Ces protéines seront les effecteurs biologiques, ils naitront d une succession d étapes : Ø Transcription : Les langages «gène» et «ARN» sont identiques (Séquence nucléotidique). Ø Traduction : Conduit à la synthèse des protéines. Le langage nucléotidique va être traduit en AA. Certaines protéines ont une action essentielle dans la régulation de l expression des gènes. Ces protéines sont des facteurs de transcription. L altération d une cellule somatique ne sera pas transmise héréditairement mais va conduire une situation pathologique.

2 Découverte de l ADN v Les grandes découvertes de la biologie moléculaire 1865 : Travaux de Mendel sur les ptipoa. Il démontre qu une particule véhicule les informations donnant ses caractéristiques aux pois : Travaux de Morgan sur la drosophile. L idée de transmission génétique via les chromosomes n est pas accepté par les soviétiques qui considèrent que l acquis est bien plus important que l inné. Les années 1950 : L hérédité chromosomique est liée à une hérédité moléculaire, l acide désoxyribonucléique ADN, support physique et chimique des gènes (Avery, Hershey et Chase) : C est la naissance de la Biologie moléculaire : Watson et Crick découvrent la structure en double hélice de l ADN : La structure du gène est intimement liée à la structure d une protéine. Les années 1960 : Concept de l ARNm et du code génétique. La révolution génomique : Manipulation de l ADN Depuis 1970, on parle de révolution génomique, les découvertes s accélérant et des outils de manipulations apparaissant : Les enzymes de restriction, clivant l ADN, et la transcriptase inverse, permettant de synthétiser un fragment d ADN à partir d un ARNm (Présente chez les rétrovirus, composés uniquement d un brin d ARN). Ces avancées aboutissent à plusieurs applications : Ø Depuis 2006, tout le génome a été séquencé, sur plus de paires de bases. Ø Grâce au clonage moléculaire, on peut cloner à foison des gènes, ainsi que petits organismes. Ø La transgénèse correspond à la manipulation in vivo d un gène. Elle permet par exemple d obtenir des souris Knock-Out ou KO, c est l invalidation d un gène et l observation des conséquences ; la transgénèse végétale correspond aux OGM. Ø Il est possible d obtenir à partir d une cellule une véritable usine à protéine. On parle de protéines recombinantes. Ø L ADN peut être altéré, il est maintenant possible de diagnostiquer un gène afin de détecter les mutations. Possibilité de Thérapie génique, assez inefficace. Ø Thérapie cellulaire : Thérapie de reconstruction d un tissu, c'est-à-dire l administration de cellules souches afin de régénérer les tissus. Ø Des petits ARN, les ARN interférents, sont capables de réguler l expression des gènes. Ø Et bien d autres

3 I- Structure des acides nucléiques Il existe Deux types d acides nucléiques, découverts dans le noyau : Ø L acide désoxyribonucléique ADN. Ø L acide ribonucléique ARN. Ces structures se retrouvent majoritairement dans le noyau des cellules eucaryotes, mais aussi dans les mitochondries des cellules animales et dans les chloroplastes des cellules végétales. A l état de nucléotide seul, ces acides nucléiques sont appelés des polymères de nucléotide. A. Structure de base On y retrouve une base azotée et un sucre, obligatoirement un pentose (Ribose ou désoxyribose), formant le Nucléoside. L ajout d un acide phosphorique PO 3 sur le sucre en 5 forme le Nucléotide. 1. Les bases de la formation d un nucléotide v La Purine Elle comprend deux hétérocycles azotés formant 9 sommets. C est sur le N en position 9 qui va se fixer le pentose : Liaison N-osidique. Ses dérivés sont des bases puriques : Ø L Adénine : Elle présente une fonction amine sur le C 6. Ø La Guanine : Le C 2 présente une fonction amine et le C 6, une fonction oxydée. Les bases puriques : Adénine Guanine v La Pyrimidine Un hétérocycle à 6 sommets. C est le N en position 1 que se fixe au pentose. Elle dérive en bases pyrimidiques : Ø La Thymine : Une fonction méthyle sur C 5, et deux fonctions oxydes sur C 2 et C 4, elle est exclusivement constituante de l ADN. Ø La Cytosine : Fonction amide sur le C 4 et une fonction oxyde sur le C 2. Ø L Uracile : Deux fonctions oxydes sur C 2 et C 4, l uracile, exclusivement présent dans l ARN.

4 Les bases pyrimidiques : Thymine Uracile Cytosine 2. Formation de nucléosides Soit par le N 9 ou le N 1, il y a formation d une liaison β,n-glycosidique avec un pentose. Ses carbones sont numérotés de 1 à 5. La seule différence entre le ribose et le désoxyribose est que le ribose présente un OH en 2 alors que le désoxyribose ne présente qu un H : ADN ARN v L ADN On retrouve ainsi quatre types de nucléotides dans l ADN, via l ajout d un désoxyribose à la base : Ø Pour l Adénine, le nucléoside sera le Désoxy-adénilate. Ø Pour la Guanine : Désoxy-guanilate. Ø Pour la Thymine : Désoxy-thyminilate. Ø Pour la Cytosine : Désoxy-cytidilate. v L ARN Sur l ARN, le pentose est le ribose, les nomenclatures sont quelque peu modifiées : Ø Adénine : Adénylate. Ø Guanine : Guanylate. Ø Uracile : Uradylate. Ø Cytosine : Cytidilate. 3. Formation de nucléotides Le C 5 est estérifié par un groupement phosphate dans les nucléosides afin de donner les nucléotides, les appellations sont alors le désoxyadénosine 5 monophosphate damp, et par analogie, dgmp, dtmp et dcmp. Pour l ARN, c est la même chose, avec obtention après ajout du PO 3 en 5 : AMP, GMP, UMP et CMP.

5 v Cas particuliers de l AMPc et du GMPc (Cycliques) Ils possèdent une activité biologique propre, en dehors de toute intervention avec l ADN. Ce sont des messagers secondaires lors de transduction de signaux (Notamment d hormones). Le sucre présente une liaison ester-phosphorique en 5, mais également en 3. B. Polymérisation de plusieurs nucléotides 1. Formation de la liaison La polymérisation des nucléotides est naturelle, elle s effectue par des liaisons phospho-diester fait apparaitre une liaison covalente, assez difficile à casser. C est une liaison 3 OH 5 Phosphate qui va induire la condensation de Deux nucléotides et l élimination d une molécule de H 2 O. Cette réaction ne s effectue pas automatiquement et nécessite absolument l action d enzymes : L ADN polymérase et l ARN polymérase. 2. Sens de lecture et de polymérisation L ADN va alors correspondre à une chaine de nucléotide lié par des liaisons phospho-diester. La réaction de polymérisation s effectue toujours dans le sens 3 OH à 5 Phosphate : Ainsi, le premier nucléotide possède un 5 phosphate libre, et le dernier nucléotide, un 3 OH libre, et les enzymes travaillent donc dans le sens 5 phosphate libre, vers le 3 OH libre. L ARN va se différencier de l ADN par les bases nucléotidiques, c'est-à-dire la présence d Uracile à la place de le Thymine dans l ARN. Un oligonucléotide comporte moins de 100 nucléotides. Un polynucléotide en comporte plus de 100. C. Structure tridimensionnelle de l ADN L ADN possède une particularité : il est constituée de deux polymères de nucléotides, liées de manière antiparallèle. Les bases puriques sont toujours associées à une base pyrimidique, A avec T et C avec G. cet appareillement n est possible que par l apparition de liaisons hydrogène, donnant sa stabilité au polymère : Le couple G-C (3 liaisons H) est beaucoup plus stable que le couple A-T (2 liaisons H). Il suffit de chauffer l ADN afin de séparer les deux brins, on parle de dénaturation. Le pas de l hélice fait 10 paires de bases, la distance entre deux bases est d environ 34 Angström. La double hélice possède un diamètre d environ 2 nm. L alternance de l hélice permet de définir un petit sillon et un grand sillon. Ces zones sont le siège d interaction avec des protéines, très souvent des facteurs de transcription.

6 II- Propriétés biologiques des acides nucléiques A. Les travaux d Avery Pour ce faire, plusieurs expériences phares ont eu lieu, notamment des travaux sur les pneumocoques, dont il existe deux souches : Ø Une forme virulente S, liée à l existence d une capsule poly-osidique donnant un aspect lisse à la bactérie. Ø Une forme non virulente R, dépourvue de capsule et beaucoup moins virulente. Plusieurs combinaisons sont alors possibles, que l on peut injecter à une pauvre souris : Ø La forme S tue la souris, d une infection pulmonaire, la pneumonie. La pauvre souris. Ø La forme R n a aucun effet sur la petite souris. Ø La forme S dénaturée par la chaleur n a aucun effet. Ø Enfin, un mélange entre la forme R et la forme S dénaturée entraine la mort de la souris. è Il existe un principe capable de transformer la forme R en forme S. Une deuxième expérience permet de montrer l origine de ce principe : Ø La forme R annexées à des protéines est non virulente. Ø La forme R, en présence d ADN est létale pour cette souris trop torturée. è Le principe est l ADN, il permet la transformation de R en S. L expérience n est pas approuvée et il faut attendre une deuxième expérience qui va confirmer les travaux. B. Les travaux de Hershey et Chase, expérience du pneumocoque Les bactériophages sont des virus composés d un unique chromosome contaminant uniquement les bactéries. Ils possèdent une capside protéique les protégeant. On cherche à savoir si le principe infectieux est l ADN ou les protéines. Il marque alors le 32 P de l ADN et le 35 S des protéines, selon le marquage de la bactérie, on conclue que la virulence est liée à l ADN. De plus, les descendances des bactéries présentaient également du 32 P marqué radioactivement. à On prouve catégoriquement que l ADN est transmis au fil des générations.

7 III- Les acides ribonucléiques ARN A. Structure Etant une chaine monocaténaire linéaire, l ARN ne présente pas d appariement. Il est également beaucoup plus court que l ADN, n étant qu une simple copie d un fragment d ADN. Des appariements peuvent néanmoins exister en formant des petites boucles, on les retrouve notamment dans les ARNm et les ARN de transfert. B. Les principaux types d ARN (3) 1. L ARN ribosomial ARNr Il est présent sur les ribosomes, acteur de la synthèse protéique. 80% des ARN sont des ARN ribosomiaux. Un ribosome est composé majoritairement d ARN. L association de deux sous-unités d ARN forme un sillon permettant d un site de fixation pour un ARNm. Les eucaryotes présentent des sous-unités 80S tandis que les procaryotes ne présentent que des 70S. 2. L ARN messager ARNm Synthétisé au cours de la transcription, c est l exacte copie d un fragment des deux brins d ADN. à Un brin d ADN est dit codant ou directeur, l autre est non-codant ou matrice. A partir de ces ARNm seront synthétisés des protéines, via la traduction par les ARNr, cela n étant possible que par l existence des ARN de transferts : 3. L ARN de transfert ARNt Ils possèdent une fonction particulière : Ils sont capables de se fixer au niveau du ribosome à l ARNm, grâce à un anticodon. Dans l espace, l ARN a une forme de trèfle, due aux appariements, et faisant apparaitre à certains endroits des structures particulières en double brin : Notons tout d abord que les ARN de transfert sont toujours terminés dans leur partie 3 par une séquence CCA. L adénylate terminal permettra la fixation d un AA, sujet du transfert. Ø A l opposé de cette séquence CCA, on retrouve une boucle de Trois nucléotides, le bras Anticodon, pouvant s associer avec un codon de l ARNm. La séquence de l anticodon est spécifique de l AA transféré. Ø Une autre structure spéciale comporte la Dihydro-uridine, c est le bras DHU. Ø Le bras TΨC est riche en Thymine et en Cytosine, et comporte une pseudo-uridine.

8 IV- Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques A. Absorbance dans l UV Les ADN simple et double brin absorbent tous les deux à 260 nm, mais le simple brin absorbe plus intensément, c est la densité optique qui varie selon le nombre de brin. à On parle d effet hyperchrome. Ce qui veut dire également que lorsque l on dénature un ADN, on observe une augmentation de l absorbance à 260 nm. B. Dénaturation thermique Si on suit l absorbance à 260 nm en fonction de la température, on constate que pour une température entre 80 et 100 C, la densité optique augmente considérable, c est dans cette tranche que la dénaturation va être totale. à On définit le point de fusion comme la température pour laquelle la destruction de l hélice est de 50%. Ce point de fusion va dépendre : Ø De la taille de l ADN, plus il va être grand, plus le point de fusion va être élevée. Ø Du nombre de paires de bases GC, couple très stable (3 liaisons H). Plus il y aura ce type de liaisons, plus il faudra apporter d énergie afin de dénaturer l ADN. C. Renaturation de l ADN Il est également essentiel de savoir reformer un fragment d ADN à double brin par simple refroidissement. Lors de l hybridation moléculaire, cela permet par exemple de savoir après refroidissement avec quel brin d ADN un autre brin aura le plus d affinité, c est une méthode d identification de gène.