Chapitre 10 L isolement et la manipulation de gènes. Injection d ADN étranger dans une cellule animale

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1 Chapitre 10 L isolement et la manipulation de gènes Injection d ADN étranger dans une cellule animale

2 Comment amplifier un gène d intérêt?

3 Amplification in vivo à l aide du clonage d ADN L ensemble formé par un vecteur et un ou des fragments insérés est appelé ADN recombinant. Le mélange d ADN recombinant est ensuite utilisé pour transformer des cellules bactériennes. En général, il pénètre une seule molécule de vecteur recombinant par cellule bactérienne. Ces cellules sont étalées et se multiplient en formant des colonies. Par conséquent, une colonie contient une population très importante d inserts identiques d ADN, et on appelle cette population un clone d ADN.

4 La construction de l ADN recombinant 1- Les types d ADN donneur: a) ADN génomique b) ADN complémentaire (ADNc) c) ADN obtenu par synthèse chimique 2- Couper l ADN donneur et le vecteur à l aide d enzymes de restrictions 3- Relier les molécules d ADN (ADN donneur-vecteur) 4- Amplifier chaque ADN recombinant à l aide de la machinerie bactérienne C est la découverte et la caractérisation des enzymes de restriction qui a permis le développement de la technologie de l ADN recombinant. Les enzymes de restriction sont produites par des bactéries et agissent comme des ciseaux en coupant l ADN au niveau de séquences cibles spécifiques. Exemple de coupure à l aide d EcoRI:

5 Les enzymes de restriction Enzymes qui clivent l ADN Reconnaissent des séquences nucléotidiques spécifiques 1 ère enzyme découverte chez Haemophilus influenzae en 1970 Différentes enzymes sont disponibles commercialement Nomenclature: BamHI B première lettre du genre bactérien (Bacillus) am lettres de l espèce bactérienne (amyloliquefaciens) H représente la souche bactérienne (H) I première enzyme découverte chez cette bactérie

6 Fabrication d un plasmide d ADN chimérique Afin que des extrémités collantes s associent pour former une population de molécules chimériques, les squelettes sucre-phosphate doivent être soudés ensemble par l utilisation de l ADN ligase qui crée des liaisons phosphodiesters.

7 Amplifier l ADN recombinant L ADN recombinant ligaturé pénètre dans une cellule bactérienne par transformation. Après son entrée dans la cellule hôte, le vecteur plasmidique est capable de se répliquer car les plasmides possèdent habituellement une origine de réplication. La colonie résultante de bactéries contiendra des milliards de copies de l insert d ADN donneur de départ. Cet ensemble de copies amplifiées du fragment unique d ADN donneur constitue un clone d ADN.

8 Choisir un vecteur de clonage 1- Les plasmides: Petites molécules circulaires d ADN capables de répliquer leur ADN indépendamment du chromosome bactérien. Servent à cloner des fragments d au plus 30 kb. 2- Les vecteurs viraux: Offrent de nombreux avantages pour le clonage et les applications des gènes clonés qui en découlent. Comme l efficacité d infection des virus est élevé, le gène cloné peut être introduit dans une cellule à une fréquence élevée. Servent à cloner des fragments de tailles définies. 3- Les cosmides: Vecteurs hybrides de phages lambda et de plasmides. Leur ADN peut se répliquer dans la cellule comme celui d un plasmide et être empaqueté comme celui d un phage. Servent à cloner des fragments d au plus 45 kb. 4- Les vecteurs à large capacité: Permettent le clonage de larges fragments (maximum de 300 kb pour les BAC et de 400 kb pour les YAC). BAC: «Bacterial artificial chromosome» ; et YAC: «Yeast artificial chromosome». 5- Les vecteurs d expression: Permettent le clonage mais aussi l expression.

9 Choisir un vecteur de clonage -suite Un clonage dans le phage lambda Différents scénarios pour l entrée des molécules recombinantes dans la cellule bactérienne

10 Fabrication d une banque d ADN Une banque d ADN constitue l ensemble des clones obtenu à partir d un seul échantillon d ADN. Il existe trois types de banques d ADN: 1- Banque génomique: Banque couvrant l ensemble du génome. 2- Banque d ADN complémentaire ou ADNc: Banque constituée d ADNc, qui ne représentent pas nécessairement la totalité des ARNm. Il s agit plutôt d une banque fabriquée à partir uniquement des régions transcrites du génome. 3- Banque d expression: Banque dans laquelle le vecteur porte des signaux transcriptionnels permettant à n importe quel insert cloné de produire un ARNm et en dernier lieu, une protéine.

11 Trouver des clones spécifiques à l aide de sondes Le criblage d une banque d ADN est réalisé en utilisant une sonde spécifique qui trouvera et signalera le clone que l on cherche à identifier. On peut soit utiliser une sonde d ADN ou une sonde qui reconnaît les protéines si un vecteur d expression est utilisé et si le produit spécifique d un gène (protéine) a au préalable été isolé sous forme pure, permettant le développement d anticorps. Criblage d une banque d ADN phagique

12 Le criblage destiné à identifier des acides nucléiques spécifiques Les techniques de transferts de Southern et Northern peuvent également être utilisée pour déterminer si 1) un individu est porteur du gène ou plus précisément de l allèle qui aura au préalable été cloné ou 2) déterminer si le gène en question est exprimé sous certaines conditions à l étude.

13 La complémentation fonctionnelle On peut détecter des clones spécifiques dans une banque bactérienne (plasmidique) ou phagique grâce à leur capacité à restaurer la fonction éliminée par la mutation récessive dans un organisme. Cette procédure s appelle la complémentation fonctionnelle ou le sauvetage de mutants. Construire une banque bactérienne ou phagique contenant des inserts d ADN donneur recombinant de type sauvage a + Transformer les cellules d une lignée cellulaire mutante a - en utilisant l ADN de clones individuels de la banque Identifier les clones de la banque qui produisent des cellules transformées avec le phénotype dominant a + Récupérer le gène a + à partir du clone phagique ou bactérien positif

14 Amplification in vitro à l aide de la réaction de polymérase en chaîne Si on connaît la séquence de certaines parties du gène ou d un fragment intéressant, on peut l amplifier en conditions in vitro dans un tube, tout cela sans clonage. Cette procédure s appelle la réaction de polymérase en chaîne (PCR ou polymerase chain reaction en anglais). Étapes de la réaction: 1) Dénaturation (95 C) étape qui dénature les deux fragments d ADN 2) Hybridation (température variable) étape où les amorces s hybrident à leurs séquences complémentaires 3) Élongation (72 C) Extension des amorces par l ADN polymérase

15 Applications de la technologie de l ADN recombinant Le fait de disposer d un gène isolé sous la forme d un clone (ou obtenu par PCR) ouvre diverses perspectives expérimentales: 1- On peut déterminer la séquence d ADN de ce gène en utilisant la technique de séquençage. 2- On peut muter le gène cloné et le réintroduire dans son hôte d origine afin d étudier les propriétés fonctionnelles de ce gène. 3- On peut l utiliser comme sonde pour la cartographie ou le diagnostic génétique. 4- On peut introduire le gène cloné dans un nouvel hôte afin de créer un organisme transgénique (ou génétiquement modifié) que l on n aurait pas pu obtenir facilement à la suite de procédures standards de croisement.

16 Déterminer une séquence d ADN La séquence nucléotidique d un gène représente l aboutissement de la caractérisation de sa structure génétique. Pour séquencer un ADN, il faut pouvoir en obtenir des fragments définis. Il y a donc une forte interdépendance entre la technologie du clonage et celle du séquençage.

17 Le principe du séquençage La technique de séquençage la plus utilisée actuellement a été développée par Fred Sanger. Elle est basée sur une synthèse d ADN en présence de didésoxynucléotides, qui à l inverse de désoxynucléotides normaux, sont dépourvus de groupement hydroxyle en 3.

18 Séquenceurs automatisés Ces appareils ont permis d intensifier les séquençages d ADN et même d obtenir la séquence de génomes complets en employant à grande échelle des protocoles de séquençages robustes à haut débit. Ajout des 4 ddntp marqués par un fluorophore différent Électrophorégramme obtenu suite au séquençage automatisé

19 Exprimer des gènes eucaryotes dans des bactéries Les bactéries transgéniques, contenant un transgène, peuvent être utilisées comme «usine» de synthèse de protéines eucaryotes utiles, qui autrement seraient difficiles à obtenir. Il existe plusieurs systèmes de ce type pour produire en masse des protéines étrangères. L un de ces systèmes utilise l ARN polymérase du phage T7 dont l action s exerce sur un promoteur de T7. Vers la fin de l infection, le phage T7 synthétise de grandes quantités de produits de gène à partir de plusieurs sites appelés promoteurs tardifs. Les gènes des chromosomes de l hôte n étant pas synthétisés à ce moment-là, ces produits sont les seules protéines synthétisées. Pour tirer profit de ce système, le gène de l ARN polymérase de T7 est manipulé de façon à être transcrit sous le contrôle d un promoteur lac, à partir duquel la transcription est normalement inhibée par le répresseur lac, une protéine exerçant une régulation négative. Toutefois, si on ajoute de l IPTG, un analogue du lactose, le répresseur est inactivé et de grandes quantités de l ARN polymérase de T7 sont synthétisées. Dans le second composant du système, le gène choisi est inséré à côté du promoteur tardif de T7. L ARN polymérase de T7 transcrit alors ce gène en quantité élevée.

20 La technologie de l ADN recombinant chez les eucaryotes Les techniques de manipulation, clonage et expression des gènes ont d abord été développées chez les bactéries, mais elles sont désormais utilisées en routine chez de nombreux modèles eucaryotes. Le baculovirus des insectes est un vecteur largement employé pour les protéines eucaryotes. Des gènes sont insérés dans celui-ci et exprimés à des fréquences élevés dans des cellules d insectes en culture.

21 Suivre l introduction d un gène Lorsque de l ADN étranger (provenant de la même espèce ou non) est introduit dans une cellule eucaryote, il peut soit remplacer un gène résidant, soit subir une insertion ectopique. Une fois introduit, il peut être difficile de détecter l activité d un gène donné. Ce problème peut être résolu en mettant sous le contrôle d un même promoteur le gène en question et un autre gène, un gène rapporteur, dont le produit est facilement décelable. Le gène rapporteur signalera les endroits et les moments auxquels le gène étudié est actif.

22 Le génie génétique chez les végétaux Le plasmide Ti: Les principaux vecteurs utilisés de façon routinière pour produire des plantes transgéniques sont dérivés de la bactérie du sol Agrobacterium tumefaciens. Cette bactérie provoque une maladie appelée galle du collet au cours de laquelle la plante infectée produit des excroissances incontrôlées, généralement à la base du collet de la plante. Le responsable de la formation de tumeurs est un grand ADN plasmidique circulaire de 200 kb, le plasmide Ti inducteur de tumeurs.

23 Le génie génétique chez les végétaux

24 Le génie génétique chez les animaux On peut maintenant cloner et manipuler des gènes de champignons, végétaux et animaux dans des bactéries, puis les réintroduire dans la cellule eucaryote, où ils s intègrent généralement dans l ADN chromosomique. Ces recherches ont ouverts la voie à la thérapie génique, soit une approche où un gène fonctionnel est introduit pour remplacer ce même gène mais qui est déficient chez un receveur. On en distingue deux types, soient la thérapie génique germinale et la thérapie génique somatique.

25 Utilisation de la génétique moléculaire pour détecter directement les allèles responsables des maladies Lorsque l on peut attribuer une maladie génétique au changement d un nucléotide spécifique, des sondes oligonucléotidiques synthétiques permettent d identifier ces changement. Une sonde, qui contient la séquence de type sauvage, peut être utilisée lors d une analyse par transfert de Southern, pour déterminer si l ADN contient la séquence de type sauvage ou mutante. La PCR constitue également un autre outil qui permet de mener à bien ce diagnostic grâce à l utilisation d amorces spécifiques qui encadrent le site, puis isolation de cet ADN amplifié et séquençage.

26 Quelques maladies génétiques courantes