Etude de l expression de gènes impliqués dans les voies de défense et les mécanismes épigénétiques

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1 Résumé En Français

2 Résumé de la thèse de Monsieur Jam Nazeer AHMAD Titre Etude de l expression de gènes impliqués dans les voies de défense et les mécanismes épigénétiques chez la tomate infectée par le phytoplasme du stolbur Introduction Les phytoplasmes sont des bactéries phytopathogènes sans parois cellulaires appartenant à la classe des Mollicutes. Ils sont responsables de nombreuses maladies de plantes d'espèces diverses dans le monde entier. Ils ont une petite taille de génome et ne peuvent pas être cultivés in vitro. Dans la plante hôte, les phytoplasmes sont limités au tissu du phloème dans lequel ils se multiplient et où ils se déplacent pour envahir toute la plante. Ils sont naturellement transmis de plante à plante par des insectes piqueurs-suceurs appartenant aux familles des Cicadellidae (leafhoppers) et des Fulgoridae (planthoppers) dans lesquels les phytoplasmes se multiplient. Les phytoplasmes du groupe du stolbur sont transmis par une cicadelle polyphage (Hyalesthes obsoletus) qui peut s alimenter sur de nombreuse espèces de plantes comme les labiaceae (lavande ), les convolvulaceae (liseron ), la vigne et les solanaceae (tomate, pomme de terre, poivron ). Ils induisent des symptômes sévères aboutissant à la perte de récolte en raison de la croissance limitée, du déclin et de la mort des plantes, mais aussi à cause d anomalies florales ou d avortement des fleurs et des fruits. L infection par le phytoplasme du stolbur est en effet connue pour affecter fortement la morphologie des fleurs. Chez la tomate, deux isolats du phytoplasme du stolbur, nommés C et PO, induisent des symptômes différents. Les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur PO montrent un développement anormal des fleurs comme des sépales hypertrophiés, voire des symptômes de big-bud, ainsi que des étamines et des pétales avortés. Les feuilles infectées sont de taille normale, mais chlorotiques et recourbées en forme de crochet. Les symptômes sont différents chez les tomates infectées par le

3 phytoplasme du stolbur C. En effet, les feuilles sont petites et découpées, alors que les fleurs sont presque normales et produisent des fruits. Il a été montré que les anomalies des fleurs de tomate induites par l'infection par le phytoplasme du stolbur PO sont associées aux changements d'expression de certains gènes du développement floral (Pracros et al., 2006). Par exemple, nous avons montré que le gène SlDEFICIENS (SlDEF), impliqué dans la formation des pétales des fleurs, est réprimé, alors que son facteur de transcription, le gène FALSIFLORA (FA), a une expression inchangée ou légèrement activée. La répression de l expression du gène SlDEF ne peut donc pas être due à l action de son facteur de transcription FA. La méthylation de l ADN est un mécanisme connu pour inhiber l'expression des gènes (Chan et al., 2005). Ainsi, chez les plantes et les animaux, la méthylation de la cytosine est un processus qui régule l expression des gènes de façon épigénétique. Les gènes peuvent être réprimés lorsque le nombre de cytosines méthylées est plus grand comparé au statut normal de méthylation (Jacobsen et al., 2000). Ce phénomène est appelé "hyperméthylation". Les méthylases et les déméthylases sont les enzymes qui déterminent le schéma de méthylation de l'adn génomique. Elles pourraient être impliquées dans la répression des gènes du développement floral chez les tomates infectées par l isolat PO du phytoplasme du stolbur. Il a d ailleurs été suggéré chez Arabidopsis, que la répression de l expression du gène APETALA3 (orthologue du gène SlDEF de tomate) peut résulter de son hyperméthylation (Finnegan et al., 1996). Peu de choses sont connues quand aux mécanismes moléculaires intervenant dans l apparition des symptômes observés chez les plantes infectées par des phytoplasmes. Pour comprendre les processus moléculaires associés aux anomalies florales et l'implication de la méthylation dans la dérégulation des gènes du développement floral, nous avons étudié l'expression de certains de ces gènes ainsi que des gènes impliqués dans les processus de méthylation (méthylases) et déméthylation (déméthylases). Nous avons également déterminé le statut de méthylation du gène SlDEF chez les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur. Ceci est l objet du premier chapitre de la thèse.

4 Par ailleurs, il est connu que de nombreux organismes pathogènes et parasites, virus, bactéries, champignons, nématodes et herbivores, attaquent les plantes. Pour se défendre face à ces attaquants potentiels, les plantes emploient des stratégies différentes. Elles synthétisent notamment différentes phytohormones qui sont essentielles pour leur croissance, leur développement, et leur reproduction, mais qui sont également utilisées comme des molécules signal dans les réponses de défense. L acide salicylique (SA), l acide Jasmonique (JA) et l'éthylène (ET) sont les signaux principaux des voies de défense des plantes contre les pathogènes et les insectes herbivores. L'induction de protéines de pathogénie (les PR protéines) est l un des principaux évènements associés aux voies de défense. Chaque voie de défense possède ses propres marqueurs moléculaires qui permettent de les étudier. Les phytoplasmes pourraient altérer le niveau de diverses phytohormones. En effet, les changements saisissants dans la morphologie et le développement des plantes (feuilles plus petites, ou courbées, hypertrophie des sépales ) causés par les phytoplasmes suggèrent que ces pathogènes changent l'équilibre des signaux régulateurs dans les plantes infectées. A l heure actuelle, peu de choses sont connues sur les mécanismes de défense des plantes face à l infection par des phytoplasmes. Récemment, il a été montré que les phytoplasmes possédaient un système de translocation Sec-dépendant fonctionnel, permettant à ces pathogènes de sécréter des protéines, tels que des effecteurs comme SAP11 et TENGU du phytoplasme de l Aster Yellows ou de l Onion Yellows respectivement, qui sont retrouvées dans les cellules hôtes des plantes et des insectes (Hogenhout et al., 2010; Bai et al., 2009). Il a été montré notamment que chez des lignées d Arabidopsis transgéniques exprimant la protéine SAP11, une protéine effectrice sécrétée par le phytoplasme de l Aster Yellows, l'expression du gène Lox2 et l'accumulation de JA sont réduites (Sugio et al., 2010). La voie de signalisation dépendante de JA semble donc impliquée dans la réponse de défense des plantes au phytoplasme de l Aster Yellows AY-WB, la protéine SAP11 interférant avec la synthèse de JA. Ainsi il a été montré que SAP11 intervient dans la régulation des voies de défense des plantes et module la production de phytohormones comme le JA. Jusqu à présent, dans les quelques séquences connues du génome du phytoplasme du stolbur, aucun effecteur n'a été identifié. Nous ne savons pas si ce phytoplasme réprime les voies de défense afin de stimuler la colonisation des tissus infectés. C est dans ce but que nous avons étudié l'expression de 21

5 gènes faisant partie des voies de défenses dépendantes de SA, JA ou ET chez des tomates infectées par le phytoplasme du stolbur isolats C et PO. Nous avons également étudié l'effet de la pré activation des voies de défenses dépendantes de SA et JA sur le développement des symptômes de la maladie. Ceci fait l objet du deuxième et du troisième chapitre de la thèse. Chapitre I L'expression transcriptionnelle des gènes du développement floral a été étudiée chez les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur par RT-PCR semi-quantitative. Il a été trouvé que l expression du facteur de transcription du gène SlDEF, c'est-à-dire le gène FA (orthologue de LEAFY chez Arabidopsis) était inchangée ou légèrement activée chez les tomates infectées par l isolat PO du phytoplasme du stolbur, tandis que, en accord avec le fait que les fleurs des plantes infectées n ont pas de pétales, l expression du gène SlDEF, orthologue d'apetala3 et impliqué dans la formation des pétales, était réprimée. La répression du gène SlDEF ne pouvant pas être associée à l action de son facteur de transcription FA, nous avons fait l hypothèse qu elle pouvait être due à sa méthylation. Ceci a été conforté par les résultats obtenus lors d expériences utilisant la 5-azacytidine. Cette molécule est connue pour diminuer le niveau de méthylation global des plantes. Les plants de tomates ont donc été traités avec la 5-aza-C puis infectés par le phytoplasme du stolbur. Le développement des symptômes a été noté et l'expression du gène SlDEF a été déterminée par RT-PCR. Les tomates traitées avec la 5-aza-C et infectées par le phytoplasme du stolbur isolat PO ont montré un développement normal des fleurs dans 2% des cas ainsi qu une 'expression rétablie de SlDEF. La méthylation est effectué par des enzymes nommées ADN méthylases, et se fait généralement chez les plantes dans des contextes CG, CNG ou CNN. La déméthylation est effectuée par des ADN déméthylases. Nous avons étudié l expression transcriptionnelle de gènes de méthytransferases et de déméthylases chez des tomates infectées par les phytoplasmes du stolbur isolats C et PO, par RT-PCR semi-quantitative. Les résultats ont montré que l'expression des gènes de classe II (Chromomethylases) qui sont spécifiques des plantes, est réprimée chez les tomates infectées par l isolat PO du phytoplasme du stolbur. Le niveau de transcriptions des gènes des ADN déméthylases a été aussi étudié par RT-PCR semi-quantitative et en temps réel. Les résultats ont indiqué que

6 l expression des gènes des ADN déméthylases est réprimée chez les tomates infectées par l isolat PO du phytoplasme du stolbur, mais activée par l isolat C du phytoplasme du stolbur. Le statut de méthylation du gène SlDEF a été déterminé par MSRE-PCR (Methylation Sensitive Restriction Enzyme Polymerase Chain Reaction). En utilisant deux enzymes de restriction, MboI et Sau3AI, de sensibilité différente à la méthylation, il a été trouvé qu un site CGATC situé dans la séquence du gène SlDEF était légèrement plus méthylé chez les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur isolat PO en comparaison aux tomates saines. Ce résultat semble être en faveur d une méthylation plus importante du gène SlDEF chez les tomates infectées par l isolat PO et supporte l hypothèse que la répression du gène SlDEF pourrait être due à la méthylation. L état de méthylation de la région promotrice du gène SlDEF a été déterminé par séquençage au bisufite. Le traitement au bisulfite convertit les cytosines non méthylées en thymine (T) ou uracyl (U) tandis que les cytosines méthylées (C) restent inchangées. Après analyse, il a été noté que l état de méthylation était fluctuant au long de la séquence étudiée du gène SlDEF, avec des positions plus méthylées que d'autres, mais aucune différence significative n a pas été observée entre les plantes saines et les plantes infectées. Conclusion du chapitre I Bien qu'une répression de l'expression de gènes impliqués dans la méthylation et la déméthylation ait été observée chez les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur isolat PO, ce qui semblait indiquer une absence de déméthylation, ceci n a pas été confirmé par l étude de l état de méthylation de l ADN, notamment du gène SlDEF. La répression du gène SlDEF ne peut donc pas être reliée fermement avec la méthylation de son promoteur. Chapitre II L'expression de 21 gènes impliqués dans les voies de défense des plantes a été étudiée chez les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur isolats C et PO par RT-PCR semi-quantitative et en temps réel. Ces gènes impliqués dans les voies de défenses dépendantes de SA, ET ou JA, incluent aussi quelques facteurs de transcription ainsi que des gènes intervenant dans la biosynthèse de ces phytohormones. Les résultats ont montré clairement que des voies de défense différentes ont été

7 activées chez les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur C et chez celles infectées par le phytoplasme du stolbur PO. Chez les tomates infectées par le phytoplasme du stolbur C, le gène de la phenylalanine ammonia lyase (PAL) qui agit en amont de la biosynthèse de SA et qui est impliqué dans les voies de défense, a été activé. Par contre, la transcription des gènes d enzymes de la biosynthèse de SA, l isochorismate synthase (ICS) et la chalcone synthase 2 (CHS2), n a pas été activée. Les gènes de certaines protéines PR de la voie de SA, PR1a, PR1b, PR2a, PR5, PR7 (69B) et PR10, ont été activés, suggérant que la voie de défense dépendante de SA est présente et active chez les tomates infectées par l isolat C du phytoplasme du stolbur. Les gènes de la voie de défense dépendante de l'éthylène (ET) ainsi que des gènes de facteurs de transcription, TSR et Pti4, des gènes marqueurs de la voie de l ET, PR1b, PR4, et PR7 (69B) ont été activés. Le gène de la lipoxygenase D (LoxD) qui est impliqué dans la biosynthèse de JA, ainsi que des gènes marqueurs de la voie dépendante de JA tel que l inhibiteur de protéase 2 (PIN2) et des gènes de protéines PR2 (PR2 basique, BGL2 et GluB) ont été activés, suggérant que la voie de défense dépendante de JA est aussi présente et active chez les tomates infectées par l isolat C du phytoplasme du stolbur. Chez les tomates infectées par l isolat PO du phytoplasme du stolbur, l'expression du gène PAL a été réprimée tandis que celle des gènes ICS et CHS2 a été activée, en parallèle avec l'activation de gènes de PR protéines de la voie dépendante de SA tels que PR1a, PR1b, PR2a, PR5, PR7 (69B) et PR10. Ceci suggère que la voie de défense dépendante de SA a été activée chez les tomates infectées par l isolat PO du phytoplasme du stolbur. De la même façon, l expression des gènes de la voie de défense dépendante de ET a aussi été activé parce que les gènes des facteurs de transcription TSR et Pti4, ainsi que les gènes des PR protéines PR1b, PR4, et PR7 (69B) ont été activés chez les tomates infectées par l isolat PO du phytoplasme du stolbur. Cependant, à la différence des tomates infectées par l isolat C, les gènes de la voie de défense dépendante de JA n'ont pas été activés. En effet, le gène de l'enzyme de biosynthèse de JA, LoxD, ainsi que des gènes marqueurs de la voie dépendante de JA comme PIN2 et PR2 basique (PR2 basique, BGL2 et GluB) était sévèrement réprimés.

8 Conclusion du chapitre II -La transcription des gènes impliqués dans les voies de défense dépendantes de SA, de ET et de JA a été activée chez les tomates infectées par l isolat C du phytoplasme du stolbur. Il est donc possible qu une interaction synergique existe entre ces différentes voies de défense chez les tomates infectées par l isolat C du phytoplasme du stolbur -La transcription des gènes impliqués dans les voies de défense dépendantes de SA et de ET a été activée chez les tomates infectées par l isolat PO du phytoplasme du stolbur. Par contre, une répression a été observée pour les gènes de la voie dépendante de JA. Le niveau d'expression des gènes ICS et CHS2 a été supérieur, contrairement au gène PAL qui était réprimé. Ainsi, une interaction synergique pourrait exister entre les voies de défense dépendantes de SA et ET, mais antagoniste avec la voie de défense dépendante de JA. -L'expression de tous les gènes mentionnés ci-dessus a été étudiée après l'infection des tomates par deux isolats différents du phytoplasme du stolbur. Les résultats de l'expression des gènes dans les feuilles et dans les boutons floraux ont suggéré le même schéma d'expression dans les deux organes. Chapitre III Il a été montré que la pré activation des voies de défense dépendantes de SA et de JA pouvait être efficace pour lutter contre différentes bactéries phytopathogènes. Peu de choses sont connues concernant l importance des voies de défense dépendantes de SA et JA dans la relation tomatephytoplasme du stolbur. Il n est pas encore clair si les voies de transduction de signal et les stratégies de défense déclenchées par l infection par l isolat PO du phytoplasme du stolbur sont les mêmes que celles observés lors de la résistance contre d'autres pathogènes foliaires ou contre des insectes piqueurs-suceurs. Nous avons donc déterminé si la pré activation et/ou la stimulation des voies de défense dépendantes de SA ou celle dépendante de JA pouvaient avoir un rôle dans l établissement de la maladie. Pour ceci, des traitements ont été effectués avec l'analogue de SA, le benzo (1, 2, 3) thiadiazole-7-carbothioic

9 l'ester de S-méthyle acide (BTH) ainsi qu avec l Acide Méthyle Jasmonique (MeJA) pour activer les voies de défense respectives. L expression du gène PR1 acide a été utilisée comme marqueur de la voie dépendante de SA, et le gène PIN2 comme marqueur de la voie dépendante de JA. Comme attendu, chez les tomates traitées avec le BTH, nous avons observé une activation de la transcription du gène marqueur PR1 acide en parallèle avec une répression du gène PIN2. L opposé a été observé chez les tomates traitées par le MeJA. Les résultats ont montré que la pré activation de la voie de défense dépendante de SA par l'application de BTH modifiait peu l'évolution des symptômes de la maladie chez les tomates infectées par l isolat PO du phytoplasme du stolbur. Même si après 2 semaines de transmission du phytoplasme du stolbur isolat PO, seulement 30 % des tomates traitées par le BTH ont montré des symptômes, en comparaison avec les tomates non traitées, après 3 à 4 semaines, toutes les tomates étaient symptomatiques. Tous les échantillons prélevés sur les tomates infectées, traitées ou non au BTH, ont été trouvés positifs pour la présence de phytoplasmes. Le traitement au BTH semble cependant avoir un effet sur la multiplication des phytoplasmes du stolbur PO puisque une plus faible amplification était observée chez les tomates traitées au BTH en comparaison des non traitées. Le traitement au MeJA active la voie de défense dépendante de JA et réprime la voie de défense dépendante de SA. En effet, le gène marqueur de la voie dépendante de JA, PIN2, a été activé tandis que le gène de marqueur de la voie dépendante de SA, PR1, a été réprimé. Les observations ont montré que la pré activation de la voie de défense dépendante de JA n'a pas contribué à la modification de l'évolution de la maladie et n a eu aucun effet sur la multiplication de l isolat PO du phytoplasme du stolbur chez les tomates traitées. L étude de l expression d autres gènes marqueurs des voies de défense chez les tomates traitées par le BTH ou le MeJA a permis de montrer que ces deux composés activaient bien les voies correspondantes chez les tomates traitées par aspersion, et ceci dès 2 jours après application. Conclusion du chapitre III

10 -Chez les tomates, le traitement au BTH active la voie de défense dépendante de SA et active l'expression transcriptionnelle de gènes marqueurs comme PR1 acide, et réprime la voie dépendante de JA et réprime entre autre le gène marqueur PIN2. -Chez les tomates, la pré activation de la voie de défense dépendante de SA par l'application de BTH modifie peu l'évolution des symptômes de la maladie causée par l isolat PO du phytoplasme du stolbur. Ainsi, même si seulement 30 % des tomates traitées au BTH montrent des symptômes après deux semaines d infection alors que 100% des non traitées sont symptomatiques, toutes les tomates infectées sont symptomatiques après 3 semaines. -Le traitement au BTH semble avoir un effet sur la multiplication de l isolat PO du phytoplasme du stolbur. Les signaux d'adn amplifiés pour la détection sont en effet plus faibles chez les tomates traitées au BTH. -le traitement au MeJA active la voie de défense dépendante de JA et réprime la voie de défense dépendante de SA. En effet, le gène marqueur de la voie dépendante de JA, PIN2, a été activé, alors que le gène de marqueur de la voie dépendante de SA, PR1, a été réprimé. -Le traitement au MeJA a peu d influence sur l évolution de la maladie ainsi que sur la multiplication de l isolat PO du phytoplasme du stolbur chez les tomates. -Comme attendu, le niveau d'expression des gènes de la voie dépendante de SA a été augmenté après traitement au BTH, et le niveau d'expression des gènes de la voie dépendante de JA a été augmenté après traitement au MeJA. -La pré activation des voies de défense dépendantes de SA et/ou JA n intervient pas, ou très peu, dans le déroulement de la maladie.