UE2 TD Cytosquelette (cours E. Cornillot) Protéines d adhérence / Jonctions intercellulaires (T. Maudelonde) N. Boulle Année 2014-2015
La plupart des illustrations du TD proviennent de Molecular Biology of the Cell Alberts, Johnson, Lewis et al. (5ème édition)
Définition: Le cytosquelette Globulaire Fibreux 25 µm Microfilaments d actine MF 7 nm Microtubules MT 25 nm Filaments intermédiaires FI 10 nm
Caractéristiques générales du cytosquelette Cytosquelette dynamique: renouvellement ++ Permet le changement de forme de la cellule, son mouvement, le déplacement d organites, de molécules, l endocytose, l exocytose, la formation du fuseau mitotique Cytosquelette stable: Impliqué dans certaines structures cellulaires: microvillosités, sarcomère, cils, flagelles
Caractéristiques générales du cytosquelette MF, MT: Toutes les cellules eucaryotes Pas de liaison covalente entre les monomères FI : Apparus plus tardivement au cours de l évolution Pas de liaison covalente entre les monomères Renouvellement aux extrémités: polymérisation / dépolymérisation aux extrémités Renouvellement sur toute la longueur du filament (y compris aux extrémités) Polymères orientés: + / - Moteurs Liaison ATP/GTP ADP/GDP Pas d orientation + / - Pas de moteurs Pas de liaison NTP/NDP Type de FI spécifique de tissu +++
Polymérisation des sous unités globulaires (MF, MT) Croissance in vitro: Equilibre sous unités globulaires (G) / polymères (F) Notion de concentration à l équilibre! Idem tubuline Sous-unités globulaires off A l extrémité, constantes: kon (polymérisation) koff (dépolymérisation) Filament (polymère) on La vitesse de polymérisation (= Le nombre de sous unités globulaires qui s ajoute à l extrémité par seconde) dépend de la concentration en sous unités globulaires [G]: V pol = kon x [G]
Polymérisation des sous-unités globulaires (MF, MT) Polymères (F) ou Viscosité = Nombre et longueur des polymères [G] diminue Équilibre Concentration à l équilibre : [G]eq Temps A l équilibre, à l extrémité, [G]eq où :V Polymérisation = V Dépolymérisation kon x [G]eq = koff [G]eq = koff / kon Polymérisation vs dépolymérisation? - [Sous unités globulaires] > concentration à l équilibre ([G]eq ) polymérisation. Formation et allongement des polymères - [Sous unités globulaires] < concentration à l équilibre ([G]eq ) Pas de polymères
Polymérisation des sous-unités globulaires (MF, MT) In vivo, équilibre modulé par: - La modification des sous unités globulaires (G) une fois polymérisées (ATP ADP / GTP GDP): Fragilise le polymère Les constantes cinétiques (kon et koff) ne sont pas les mêmes aux 2 extrémités (+ et -) des MF et des MT Polymérisation extrémité + et dépolymérisation extrémité [G] eq différentes aux 2 extrémités - La présence de protéines de liaison, stabilisation, nucléation, coiffe
Taux d élongation + Polymérisation Dépolymérisation 0 [G]eq - [G] Zone de tapis roulant et d instabilité dynamique
Actine et microfilaments 7 nm Rq: dans les cellules eucaryotes: [Actine G] soluble = 1000 fois [Actine G] eq? Cellules non musculaires: 50 % actine pas polymérisée
Exercice 1
QCM 1 6 (c) Intensité de la fluorescence 5 4 3 2 Croissance Equilibre (b) Concentration de sous-unités d actine en solution: a<b<c 1 Latence (a) 0 0 30 60 90 Temps (secondes) [Actine]eq = koff / kon Dépend des constantes cinétiques aux extrémités du filament
QCM 1-2 Protéines liant l actine (AAP) Séquestre (- polymérisation) Echange ADP / ATP (+ polymérisation) Rq: Liaison non covalente entre monomères!
QCM 2 A connaître! Protéines liant l actine (AAP) Nucléation (ext (ext +) +) Nucléation (ext -) Séquestre (- polymérisation) Echange ADP / ATP (+ polymérisation) Protéines d ancrage Dégradation (lie actine ADP) Protéines à domaine FERM Spectrine Dystrophine Fragmentent Gel Solution (Ca++) Stabilisent Cap Z Stabilisent
QCM 2 A connaître! Protéines liant l actine (AAP) Nucléation (ext (ext +) +) Nucléation (ext -) Séquestre (- polymérisation) Echange ADP / ATP (+ polymérisation) Protéines d ancrage Dégradation (lie actine ADP) Protéines à domaine FERM Spectrine Dystrophine Fragmentent Gel Solution (Ca++) Stabilisent Cap Z Stabilisent
QCM 2 Protéines liant l actine (AAP) Protéines associées à l actine: Les protéines d'assemblage MF + α-actinine MF + fimbrine Dimère de filamine Faisceau contractile Disposition lâche permet d intercaler la myosine II Faisceau parallèle Disposition serrée ne permet pas d intercaler la myosine II Réseau type gel Réseau tridimensionnel mécaniquement résistant D après cours de S. Delbecq (2012-2013)
QCM 2 Protéines liant l actine (AAP) Contacts Focaux (intégrines) Fimbrine, villine α-actinine et Formine (ext +) Faisceau contractile antiparallèle Fibres de stress (Fibres de tension) Réseau, struct. type gel Faisceau serré parallèle filamine
QCM 2 Actine et microfilaments Lamellipode lamellipode Arp2/3 à la périphérie Réseau de type gel: filamine
QCM 2 Actine et microfilaments Protéines d ancrage: Les protéines à domaine FERM 2.2. Protéines associées et leurs fonctions + Protéines d ancrage. Ancrage à la membrane plasmique ex: Ezrine Recrutement à la membrane plasmique CD44 Phosphorylation extrémité C-terminale P Recrutement de MF d actine Forme globulaire P Forme allongée Signal cellulaire
QCM 2 Endocytose ARP2/3 Remarque: Endocytose: Figure Cours de Biologie Cellulaire, Edition 4, P Cau & R Seite, Ed. ellipses Polymérisation d actine (Arp 2/3): propulsion sans moteur («queue» d actine) Idem virus de la vaccine Arp2/3 Listeria Vésicule endocytose
QCM 3 Exocytose Figure Cours de Biologie Cellulaire, Edition 4, P Cau & R Seite, Ed. ellipses!! L effet de la gelsoline dépend de [actine G libre] [actine G libre] faible: dépolymérisation (exocytose) [actine G libre] élevée: polymérisation réorganisation du cytosquelette; (cf plaquettes activées)
QCM 3 Actine et microfilaments Dans les cellules non musculaires Assemblages permanents Ceinture d adhérence (cellules épithéliales) Filament bipolaire de Myosine II MF Cadhérine Cadhérines Actine Alpha-actinine Jonction d adhérence Ceinture d adhérence Jonction d adhérence Zone d adhérence
QCM 3 Actine et microfilaments Dans les cellules non musculaires Assemblages permanents Microvillosités: MF stables! Myosine I
QCM 3 Déplacement de la cellule 1 Cortex cellulaire Réseau MF Sens du déplacement Support Contact focal : MF + intégrines 2 Zone d endocytose Dépolymérisation MF Lamellipode Réseau MF Zone de tension au sein du cortex Nouveau MF Nouveau contact Flux de monomères d actine G et de vésicules d endocytose Rôle de MT Fibre de tension Contact focal Intégrines + MF actine 3 Zone d endocytose Dépolymérisation MF Zone d exocytose et de polymérisation des MF Détachement 4 Sens du déplacement Rétraction 1
QCM 4 Actine et microfilaments Sarcomère = unité contractile Disque Z Cap Z titine Ligne M Myosine (filament épais) Disque Z Extrémité + Extrémité - Actine (filament fin) Contraction musculaire: - Déclenché par le Ca ++ Filaments fins Filament épais - Déplacement des filaments fins d actine sur les filaments épais de myosine
QCM 5 Domaine moteur (ATPase) Protéines motrices: myosines /kinésines Kinésines (microtubules) Domaine moteur (ATPase) Myosines (microfilaments d actine) Activation par phosphorylation - Hydrolyse de l ATP changement conformationnel mouvement NB: Dynéine: famille différente
25 nm Microtubules
QCM 6 Tubuline et Microtubules 13 protofilaments 13 protofilaments α GT P β GT P α GT P Dimère de tubuline! Pas de liaisons covalentes Lumière Protofilament Tubuline β Extrémité + β:activité GTPase GTPase activée dans le microtubule Microtubule Extrémité -
QCM 6 Centrosome: COMT = Centre Organisateur des Microtubules Centrosome = principal COMT des cellules animales Les microtubules croissent à partir des sites de nucléation (anneaux de tubuline γ) (pas des centrioles!)
QCM 6 Tubuline et Microtubules Centriole: appartient au centrosome Centriole ~ Corpuscule basal (cils, flagelles) - 9 triplets de microtubules (A, B, C) - Seul A est complet - Ponts de nexine entre les triplets - Structure protéique en «rayons de roue» reliant les microtubules A Nexine! Triplets A B C Complexe de liaison
QCM 6 Structure des cils / Flagelles Structures stables (froid, agents chimiques) - Corpuscule basal (~ centriole) 9 triplets de microtubules qui se prolongent dans l axonème - Axonème = 9 paires de microtubules entourés de membrane plasmique ± 2 microtubules centraux (9+0; 9+2) + nexine, dynéine... + + +! paires Paire centrale de MT Doublet de MT périphériques Axonème = MT périphérique + Paire centrale MT rayon Gaine interne Microtubule central (simple) Bras de dynéine externe Nexine nexine Corpuscule basal Membrane plasmique Bras de dynéine interne Racine ciliaire Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Paire de microtubule périphérique
QCM 6 Cils et flagelles Nexine Dynéine ATP ADP Hydrolyse de l ATP (dynéine) = mouvement vers -
Exercice 2
QCM 7 a Kinésine-5 + + Même vitesse - Fixateur - Lame de verre microtubule Lukas et al (2005) Nature 435, 114-118 Axonème
Microtubule + + Axonème
Orientation antiparallèle microtubule / axonème Déplacement de la kinésine-5 Microtubule + + Axonème Microtubule + + Axonème Microtubule + + Axonème Unité de mouvement observée Glissement du microtubule par rapport au support «axonème»
Fuseau mitotique
Fuseau mitotique = Kinésines 5 = Kinésines 5 cf cours Mr S. Carillo
Actine / Myosine: même type de mouvements + Protéines moteur Les Myosines + MI + MI MF Vésicule + Déplacement de la myosine + MII Unité de mouvement observée MI +
Filaments intermédiaires 10 nm ~ corde
Filaments intermédiaires Renouvellement des sous-unités: - latéral - homogène le long du filament
QCM 8 Filaments intermédiaires Monomère Région en hélice alpha Aa Hydrophobes Dimère Même orientation Tetramère Décalage Dimères en orientation opposée Orientation inverse Protofilament (protofibre): Plusieurs tétramères bout à bout Un filament intermédiaire = 8 protofilaments
QCM 9 Filaments intermédiaires 4.2. Différents types de filaments intermédiaires + Classement - env. 50 protéines différentes - 6 groupes ou types de sous-unités Type I II III IV V VI Protéine Cytokératines acides Cytokératines neutres ou basiques Vimentine Desmine Protéines fibrillaires acides gliales (GFAP) Protéines de neurofilaments Lamines nucléaires Nestine Localisation / type cellulaire Cellules épithéliales Cellules épithéliales Fibroblastes, Cellules endothéliales, Muscle lisse Cellules musculaires Cellules gliales (astrocytes, ) Axones et dendrites des neurones Noyau Cellules souches neuronales et neurones immatures! Utilisé en anatomopathologie pour identifier l origine d une tumeur
QCM 9 Filaments intermédiaires Les lamines + Les lamines (Type V) - Dans les cellules animales - Localisation : le noyau Réseau sous-mb Nucléoplasme - Lamines A, B, C LMNA -> Lamines A et C LMNB1 et LMNB2 (même gène) -> Lamines B - CDK, caspases (cf S. Carillo & P. Pujol) Figure Cours de Biologie Cellulaire, Edition 4, P Cau & R Seite, Ed. ellipses Enveloppe nucléaire Réticulum endoplasmique rugueux Chromatine Nucléole
Concours PACES 2013-2014 Cyosquelette
Concours PACES 2013-2014 Q10 Marquage du cytosquelette d actine par la phalloïdine-af680 (gris) Phalloïdine: Stabilisatrice Idem Jasplakinolide Cytochalasine B (ext +) Latrunculine Bruno SAUBAMEA EA3621 Service de Biologie Cellulaire Service Commun d Imagerie Cellulaire et Moléculaire Université Paris Descartes http://www.etsl.fr/doc_pdf/imagerie_confocale_09.pdf
Concours PACES 2013-2014 Q10 (QCM 2) Protéines liant l actine (AAP) Contacts Focaux (intégrines) Fimbrine, villine α-actinine et Formine (ext +) Faisceau contractile antiparallèle Réseau, struct. type gel Faisceau serré parallèle Fibres de stress (Fibres de tension) filamine
Concours PACES 2013-2014 Q11 + + - - - - + +
Concours PACES 2013-2014 Q11 Tubuline et Microtubules Moteurs moléculaires des microtubules vésicule Exocytose, Membrane plasmique Microtubule KINESINES (~ myosines) Endocytose, Mouvements des cils, flagelles DYNEINES - membrane, lysosomes vers le Golgi - RE vers le Golgi vésicule - Flux vectoriel permanent - Flux rétrograde : Golgi vers le RE
Taux d élongation + Concours PACES 2013-2014 Q12 Polymérisation [G]eq - Tapis roulant: 0 Dépolymérisation [G] Zone de tapis roulant et d instabilité dynamique - + Concentration en sous-unités globulaires telle que: Vitesse de croissance (ext +) = Vitesse de dépolymérisation (ext -) Polymère de longueur apparente constante = Tapis roulant («treadmilling» )
Protéines d adhérence Jonctions Cours T. Maudelonde
QCM 2 / QCM 10 Actine et microfilaments Interactions Cellule / Matrice extracellaire Contacts Focaux (Intégrines) Fibres de stress = Fibres de tension
QCM 10 Jonctions cellulaires Actine / Filaments intermédiaires Epithelium Pôle apical Cadhérines Actine (jonctions adhérentes) Filaments intermédiaires (desmosomes) Contacts focaux Intégrines Pôle basal
Protéines d adhérence
QCM 10 Molécules d adhérence - les Intégrines: Dimère α/β Toujours hétérophilique Interactions : - Cellule / Matrice extracellulaire +++ - Cellule / Cellule - 18 chaine α - 8 chaines β
QCM 10 Les Intégrines: Dimère α/β Activation «pince»
QCM 10 Les Intégrines: Interactions Cellule / Matrice extracellulaire Actine Contacts focaux Extracellulaire fibronectine Fibronectine Appartient à la matrice extracellulaire Séquence RGD Actine Signaux cellulaire Intracellulaire
QCM 10 Les Intégrines: Cellule épithéliale Interactions Cellule / Matrice extracellulaire Filaments intermédiaires Hémidesmosomes Intracellulaire Cytokératine (FI) Hemidesmosome Lame basale Cytokératine (FI) Protéines d Ancrage Intégrines Extracellulaire
QCM 10 Les Intégrines: Interactions Cellule / Cellule hétérophiliques Leucocyte CAM Intégrine (Immunoglobuline) Cellule endothéliale (vaisseaux)
QCM 11-12 Les protéines d adhérence: 1- Famille des Immunoglobulines Ex: N-CAM 2- Famille des Sélectines Ex: L - E - P- Sélectines 3- Famille des Cadhérines Ex: E-Cadhérine, Desmoglein 4- Famille des Integrines Ex: α5β1
QCM 11 1- Les Immunoglobulines
QCM 11 1- Les Immunoglobulines hétérophiliques homophiliques Dans les jonctions Leucocyte CAM Intégrine (Immunoglobuline) Cellule endothéliale (vaisseaux)
QCM 11 2- Les Sélectines: Glycoprotéines membranaires - Toujours hétérophilique Se lient aux sucres (via domaine lectine) Cellules spécialisées: E- endothéliales P- Plaquettes L- Leucocytes
Rôle des sélectines et des Ig CAM dans les Mouvements du leucocyte leucocyte sucres E-Selectine Cellule endothéliale Leucocyte Cellule endothéliale 1- Sucres 2- E-Sélectine Liaisons faibles - roulement 3- Intégrine activée 4- Ig-CAM Liaisons fortes - ouverture jonctions/passage
QCM 11 Jonctions cellulaires Actine / Filaments intermédiaires Cadhérines Actine (jonctions adhérentes) Filaments intermédiaires (desmosomes) Contacts focaux Intégrines
QCM 11 3- Les cadhérines Distribution des domaines dans différentes cadhérines Cadhérine T Glycosylphosphatidylinositol d ancrage (GPI) RET Tyrosine kinase Desmocolline-1a Desmogléine-1 ICS ICS Interaction avec les filaments intermédiaires Cadhérine E ICS Fixation de la caténine Domaine CAD
QCM 14 3- Les Cadhérines Interactions cellule / cellule Interactions homophiliques
QCM 11 3- Cadhérines et jonction adhérente (Actine) (Ceinture d adhérence / zonula adherens) α- catenine Actine Filament bipolaire de Myosine II MF Cadhérine Alpha-actinine Signalisation cellulaire Jonction d adhérence Ceinture d adhérence Jonction d adhérence Zone d adhérence
QCM 14 3- Cadhérines et desmosomes (filaments intermédiaires) «boutons» Protéines d ancrage Filaments intermédiaires (ex: cytokératine des cellules épithéliales)
Jonctions intercellulaires
Jonctions intercellulaires Importance des interactions: Cellule / cellule Cellule / matrice extracellulaire Jonctions cellulaires signaux intracellulaires: survie cellulaire, division, migration La cellule cancéreuse «s affranchit» de ses jonctions perturbations +++ des molécules d adhérence Exemple: perte de E-cadhérine
Les jonctions dans la cellule épithéliale Complexe de jonction: cellule épithéliale polarisée Jonction étanches (occludines / claudines) Jonction adhérente Desmosome (en «bouton») Jonction communicante (connexons) Contacts focaux Hemi-desmosome actine Filament intermédiaire
Les jonctions dans la cellule épithéliale Jonction Étanche (serrée) Jonction adhérente Desmosome
QCM 12 Les jonctions communicantes Protéines «spécifiques»: connexines Communication entre deux cellules électro-chimique / métabolique Jusqu à 1 kd! Ions, sucres, acides aminés, nucléotides, vitamines, AMPc, inositol triphosphate Mais pas protéines, acides nucléiques, polysaccharides Dans muscle cardiaque, cellules musculaires lisses, foie, ovaire
QCM 12 Les jonctions communicantes Protéines «spécifiques»: connexines (différentes connexines connues) Communication entre deux cellules électro-chimique / métabolique Membranes plasmiques des 2 cellules Canal Membranes cellules adjacentes Membranes plasmique Protéines de connexine Fermé 2 Connexons formant 1 canal aqueux entre les 2 cellules Connexon composé de 6 connexines Ouvert Espace inter-cellulaire Ouverture jonctions communicantes régulée: Ca ++, H +, DDP Mort cellulaire Entrée de Ca ++ Fermeture des jonctions communicantes
Concours PACES 2013-2014 Jonctions
Concours PACES 2013-2014 Q17 Les jonctions dans la cellule épithéliale Complexe de jonction: cellule épithéliale polarisée Jonction étanches (occludines / claudines) Jonction adhérente Desmosome (en «bouton») Jonction communicante (connexons) Contacts focaux Hemi-desmosome actine Filament intermédiaire
Concours PACES 2013-2014 Q17 Espace étroit: Les jonctions étanches Définit la polarité cellulaire Protéines «spécifiques»: occludines / claudines tout autour de la cellule Jonctions étanches (serrées)
Concours PACES 2013-2014 Q17 Espace étroit: Les jonctions étanches Définit la polarité cellulaire Protéines «spécifiques»: occludines / claudines
Ex Les molécules d adhérence Dépendance Ca++ Interactions Homophiliques ou hétérophilique Adhésion cellule / cellule Cytosquelette Jonctions cellulaires Cadhérines «classiques» E-Cadhérine Oui Homophiliques Filaments d actine via les catenines (α et β) Jonction adhérente Cadhérines des desmosomes Desmoglein, desmocollin Oui Homophiliques Filaments intermédiaires (cytokératine...) Desmosomes Immunoglobulines N-CAM Non Les 2 Sélectines Cellules spécialisées: L-E- et P-sélectines Oui Hétérophiliques Filaments d actine Adhésion cellule / matrice Intégrines α5β1 Oui Hétérophiliques Intégrines Filaments d actine via talin, vinculin, α- actinin Oui Hétérophiliques Filaments intermédiaires Jonctions serrées, Desmosomes Contacts focaux Hemi-desmosomes
Les Jonctions Jonctions cellulaires Jonction adhérente Molécules d adhérence Adhésion cellule / cellule Cadhérines «classiques» Cytosquelette Filaments d actine via les caténines (α et β) Desmosomes Jonctions étanches Cadhérines des desmosomes (desmoglein, desmocollines ) Occludines, Claudines, Filaments intermédiaires (cytokératine...) Filaments d actine Jonctions communicantes Autres Connexines Selectine / CAM Ig / Integrine Leucocyte / endothélium (des vaisseaux) ; immunité Points d adhésion focaux Hemi-desmosomes Adhésion cellule / matrice Intégrines α5β1 Intégrines Filaments d actine via talin, vinculin, α- actinin Filaments intermédiaires