Méthodes d analyse structurale I Spectroscopie de Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) des biomolécules Stéphane Grimaldi BIP - Bioénergétique et Ingénierie des Protéines UPR 9036 CNRS et Aix-Marseille Université Plateforme de spectrométrie RPE 31 chemin Joseph Aiguier 13009 Marseille grimaldi@ifr88.cnrs-mrs.fr
RPE = Résonance Paramagnétique Electronique en anglais: EPR pour Electron Paramagnetic Resonance ESR pour Electron Spin Resonance EMR pour Electron Magnetic Resonance Découverte par Zavoïsky (Kazan, URSS) en 1945 Standard (bande X): 10 GHz, 3 cm
Que peut-on étudier par RPE? La RPE permet la détection d entités paramagnétiques possédant des électrons non appariés (spin électronique S 0) En chimie bioinorganique, biologie et médecine: 1. La plupart des métaux de transition: Fe III, Ni I,III, Cu II, Mo V, W V, Mn II/III/IV, Co II, V IV, Cr 2. Radicaux de chaines latérales d acides aminés (Tyr, Trp, Gly, Cys ) 3. Etats radicalaires de cofacteurs (flavines, semiquinones, ) 4. Radicaux inorganiques (NO, O 2, O 2 -, HO, ) 5. Espèces transitoires dans les processus photoinduits but also Piégeurs de spin («spin traps») utilisés pour piéger des radicaux de faible durée de vie Marqueurs de spin («spin labels») attachés aux protéines, acides nucléiques, lipides, pour étudier leur structure et leur dynamique. Note: Dans certains cas, on peut détecter indirectement des substances non paramagnétiques à proximité de centres paramagnétiques via le couplage magnétique électron/noyau (couplage hyperfin)
La spectroscopie RPE permet d obtenir des informations dynamiques, structurales et fonctionnelles sur les biomolécules Identification d espèces paramagnétiques, par exemple d intermédiaire réactionnels Mesure de potentiel d oxydoréduction, information sur la géométrie et la structure électronique des espèces paramagnétiques Dosages/stoechiométrie des métaux/radicaux Dynamique locale ou globale des protéines (changements conformationnels) Structure des sites hébergeant des espèces paramagnétiques Mesure de distances intercentres Fixation et activation de substrats Images in vivo Les outils: Spectroscopie RPE multifréquence (de 3 à 300 GHz) Spectroscopie de double résonance électron/noyaux Spectroscopie RPE impulsionelle Potentiométrie rédox Modélisation théorique et simulation spectrale Techniques de congélation rapide ( 1 ms) ou hyperquenching (<< 1 ms) Photochimie Dynamique moléculaire Calculs de type DFT (chimie quantique)
Fonctions biologiques des métaux visibles par RPE Métal Fonction Etat d oxydation paramagnétique détectable Fer (Fe) Oxydase, transport et stockage de l oxygène, transfert électronique, fixation d azote Fe(II) Fe(III) Cuivre (Cu) Oxydase, transport de l oxygène, transfert électronique Cu(II) Manganèse (Mn) Photosynthèse, oxydase, structure Mn(II) Mn(III) Mn(IV) Nickel (Ni) Hydrogénase, hydrolase Ni (I) Ni (II) Ni (III) Molybdène (Mo) Fixation d azote, oxydase, transfert d oxygène Mo(V) Cobalt (Co) Oxydase, transfert de groupements alkyle Co(II) Tungstène (W) Déshydrogénase W(V) Vanadium (V) Chrome (Cr) Fixation d azote, oxydase Inconnue, tolérance au glucose? V(III) Cr(III) Hydrolase: R-R +H 2 O R-OH+R H Groupement alkyle: C n H 2n+1
Les métaux de transition présents dans les biomolécules ne sont paramagnétiques (donc visibles par RPE) que dans certains états d oxydoréduction Exemple: le cas du Fer (Z=26) Spins entiers difficiles à observer par RPE S = 2 S = 5/2 Nécessité éventuelle de réduire ou d oxyder le métal/les échantillons pour l observer
Un exemple de spectre RPE de biomolécule: l ubiquinol oxidase de type bo 3 chez E. coli Spectre RPE (protéine purifiée et réduite à l ascorbate de sodium), mesure à 20 K Structure cristallographique 6000 hème o 3 (S = 5/2) ubisemiquinone Intensité RPE (unité arbitraire) 4000 2000 0-2000 -4000 hème b (S=1/2) 0 100 200 300 400 500 600 Champ magnétique (mt) Possible ubiquinone binding site Abramson et al., Nature Structural Biology (2000) - l état de spin de l ion Fe 3+ dépend de la coordination de celui-ci
De nombreux centres polynucléaires sont trouvés dans les biomolécules Exemple: les centres FeS
La RPE, un outil central d investigation du fonctionnement des chaînes bioénergétiques Exemple: Appareil photosynthétique des plantes
La chaîne respiratoire mitochondriale FeS-c entres N2 FMN FMNH 2 + NADH + H Complex I. - QH 2 /Q + NAD NADH:ubiquinone oxidoreductase QH 2 Q Complex II Q/QH2 Pool Q FeS QH 2 b FAD succinate fumarate Succinate:ubiquinone oxidoreductase Complex III 2QH 2 2Q FeS Q QH 2 b L b H c 1 Cyt. c Ubiquinol:cytochrome oxidoreductase c a Complex IV Mn ½O 2 Cu A Cu B a 3 Y 2 8 0 H O 2 Cytochrome c oxidase Structures 3D connues, mais Composition en cofacteurs variée (métaux, molécules organiques) Couplage transfert d électrons/translocation de protons permet le maintien d un gradient électrochimique de protons pour ATPase
Chaînes respiratoires bactériennes Similarité avec chaînes respiratoires des eucaryotes Facilités d étude Différences entre Procaryotes (pas de complexe III chez E. coli) Grande variété Modularité Adaptabilité Déshydrogénases Oxydoréductases terminales Anaérobies
Un centre paramagnétique qui porte un électron célibataire est assimilable à un dipôle magnétique Champ magnétique Paramagnétisme: Ensemble de dipôles magnétiques dans l échantillon paramagnétique En l absence d un champ magnétique En présence d un champ magnétique, il existe une aimantation dirigée dans le sens du champ Rappel: un électron possède un spin électronique ½ (donc un moment magnétique ) qui peut exister dans deux états mesurables: up et down (quantification) Moment magnétique électronique dû au spin: r r µ e = geβs g e = facteur g électronique 2.0023 β = magnéton de Bohr électronique 9.274x10-24 Am 2 µ r e Note: il existe aussi une contribution orbitalaire au moment magnétique
Moment magnétique électronique dans un champ magnétique - RPE Interaction avec un champ magnétique externe B : E = -µ e B Z B H = -µ e B = g β e S B On choisit Z // B H = g β B S Z µ e Pietr Zeeman Prix nobel 1902 Energies : E = g β B M S = ± ½ g β B (pour S = ½) X Y E M S = +1/2 Z B M S = + 1/2 S = 1/2 hν E = g β B S M S = -1/2 0 B Écart proportionnel au champ B hν = g β e B 0 M S = - 1/2 ν = fréquence (Hz, s-1) B = champ magnétique pour la résonance (T) h = constante de Planck (= 6.62607 x 10-34 J s ) g résultat de la mesure, porte l information (sans dimension)
Principe de l enregistrement d un spectre RPE: Irradiation continue de l échantillon à fréquence ν constante (continuous wave / cw EPR) hν Balayage du champ magnétique B pour trouver la condition de résonance En abcisse = valeur du champ magnétique (typiquement de 0.1 à 0.5 T) souvent en Gauss: 1 G = 10-4 T, 1T = 10.000 G En ordonnée = absorption nette de l échantillon (en unités arbitraires) Absorption (A) B (champ magnétique) Expérimentalement, on mesure la dérivée de l absorption (dispositif de modulation du champ magnétique et détection synchrone du signal d absorption) da/db B (champ magnétique)
Quels échantillons pour la RPE des biomolécules? En solution aqueuse «An optimal protein sample for EPR has a volume of circa 250 µl and a protein concentration of the order 1-100 mg/ml (as high as possible compliant with the protein s solubility and availability)» [spins] ~ 1 µm à 10 mm ( [protéine]) pas trop petite et pas trop grande degré de pureté état d oxydation viscosité non-dénaturé anaérobie vs aérobie Volume d échantillon: ~ 150 µl dans tube de diamètre externe 4 mm (solution gelée) ~ 30 µl dans tube capillaire de diamètre interne ~ 1 mm (solution à température ambiante) ~ monocristal de quelques centaines de µm de côté Note: la RPE des biomolécules à basse température n est pas destructive
Expérience de titrage d oxydoréduction suivie par RPE pour contrôler/mesurer le potentiel d oxydoréduction Centre 1 Centre 2 Normalized EPR signal amplitude (arb. units) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 état réduit Fe 2+ état «as prep» état oxydé Fe 3+ L amplitude du signal RPE mesuré pour chaque centre est proportionelle à la quantité de centres paramagnétiques dans l échantillon -200-100 0 100 200 300 Redox potential (mv) Titrage en réduction par addition «pas à pas» d un réducteur Ajustement d une «courbe de Nernst» pour déterminer le potentiel associé à une transition rédox Détermination du potentiel optimal pour générer un maximum de centres sous forme paramagnétique
Le spectromètre RPE Bruker Elexsys E500, mode continu Bruker Elexsys E580, mode impulsionnel Plateforme pluridisciplinaire de spectrométrie RPE d Aix-Marseille
hν = g eff β e B 0 Moment magnétique total où g eff = g e + g g caractéristique de la molécule Moment magnétique de spin Moment magnétique orbitalaire
La matrice g L écart entre les niveaux E c.a.d. la position de la raie RPE dépend de l orientation de la molécule par rapport au champ magnétique. C est l anisotropie de l effet Zeeman. Dans le cas le plus général, un centre paramagnétique est donc caractérisé par 3 valeur de g qui correspondent aux valeurs de g mesurées dans 3 directions perpendiculaires de l espace (directions propres x, y et z). On les note g x, g y et g z. Ce sont les valeurs propres de la matrice g. La matrice g est contrôlée par les propriétés électroniques du centre, sa symétrie locale = «empreinte digitale du centre»
Spectres RPE caractéristiques d espèces radicalaires Microwave absorption (first derivative a.u.) -. Q A /PSII -. Q i /bc 1 -. A 1 /PSI -. Q H /Q.O. Chl a +. /PSII Plastoquinone Q A PS2 Ubiquinone Q i /bc 1 ou Q H /QO Phylloquinone A 1 PS1 0,332 0,334 0,336 0,338 Magnetic Field [Tesla] Signaux radicalaires (isotropes) Chlorophylle (Chl)
Tyrosyl Tryptophanyl Glycyl Thiyl
RCHO + H 2 O + O 2 RCOOH + H 2 O 2
Interactions hyperfines Le moment magnétique électronique d un centre paramagnétique est susceptible d interagir avec les moments magnétiques nucléaires environnants. C est le «couplage hyperfin» (couplage magnétique électron/noyau(x)), dont l intensité est décrite par la constante hyperfine A. Une interaction hyperfine avec un noyau de spin nucléaire I se manifeste par un éclatement des raies RPE («hyperfine splitting») en 2I+1 raies Cet éclatement est visible sur le spectre (ou «résolu») s il est «suffisamment» important (A >> largeur de la raie spectrale)
Exemple: Interaction S = ½, I = ½
L interactions hyperfine est une source majeure d information en RPE. Structure électronique du centre paramagnétique Distance et orientation relative des moments magnétiques électroniques et nucléaires Certaines techniques sont spécialisées dans la détection des interactions hyperfines non-résolues sur le spectre RPE (ENDOR, ESEEM, )
Exemple de spectres RPE d enzymes à Cuivre Plastocyanine Stellacyanine En général, l interaction hyperfine est anisotrope (matrice hyperfine caractérisée par A x, A y, A z )
Système formate déshydrogénase - nitrate réductase chez Escherichia coli -420 mv CO HCOO - 2 + H + Mo-bisMGD FeS FdnGHI 4x FeS 2 H + périplasme cytoplasme b P b D MQ 2 H + MQH 2 b -80 mv L NarI e - b H NarGHI 4x FeS FeS NarH Mo-bisMGD NO - 2 + H 2 O NO - 3 + 2 H + +420 mv NarG
Le complexe respiratoire nitrate réductase r (NarGHI( NarGHI) ) chez E. coli Opéron nar narg narh narj nari 2H + Q NarI (22 kda) b D QH 2 b P NarH (60 kda) NarG (140 kda) Moco FS4 FS3 FS1 FS0 FS2 2e - NO 3 - + 2H + NO 2 - + H 2 0
Détection des centres rédox de NarGHI par spectroscopie RPE 12.5K 20mW b D g ~3.76 Hèmes b P 3.36 [3Fe-4S] g ~ 2.02 1.98 12.5K 100mW 12.5K 100mW 160 180 200 220 240 260 Magnetic Field (mt) [4Fe-4S] g ~ 2.05 1.95 1.87 280 300 320 340 360 380 400 Magnetic Field (mt) Mo V ph 8.3 g ~ 1.986 1.98 1.96 50K 4mW ph 5.85 280 300 320 340 360 380 400 Magnetic Field (mt) 3300 3400 3500 Magnetic Field (G)
Discrimination des différents centres métalliques Potentiométrie rédox Propriétés de relaxation 12.5K 100mW 12.5K 1mW [3Fe-4S] +210 mv +210 mv 50K 4mW Mo V +210 mv 320 340 360 Magnetic Field (mt)
Quantification de spin
Selective View of Metal Centers in NarGHI by EPR b D g ~3.76 b P 3.36 12.5 K 20 mw b D 160 180 200 220 240 260 Champ magnétique (mt) 12.5 K 100 mw b P FS4 FS3 FS2 FS1 FS0 Moco 1.98 1.96 50K 4mW
Importance des phénomènes de relaxation en spectroscopie RPE - Température fixe, en variant la puissance micro-onde Amplitude signal RPE 1 Relaxation rapide - T 1 court 2 Relaxation lente T 1 long P 1 2 1 2 Séparation des espèces par différence spectrale - Augmentation de Température : suppression d un signal par élargissement 1 2 Un centre paramagnétique peut ne pas être observable du fait de ses propriétés de relaxation. Nécessité d optimiser les conditions d enregistrement...
Spectroscopie RPE -Etude directe sur membranes -Spécifique du centre et de son état rédox Propriétés de relaxation (Saturation, T) -Discrimination par les propriétés de relaxation électronique Intensité du signal RPE (normalisée) Titrage Potentiométrique suivi par RPE 12.5K 100mW 12.5K 1mW 50K 4mW [3Fe-4S] Mo V Potentiel redox (mv) 320 340 360 Magnetic Field (mt)
Transfert d électrons transmembranaire et centres FeS Combinaison RPE / mutagenèse dirigée : - suppression - transformation Attribution des potentiels rédox à chaque centre Variation non régulière du potentiel dans la chaîne et Importance dans le fonctionnement Potentiel mv e- [4Fe-4S] Cys Fe [3Fe-4S] Ala CYS ALA -400 mv +100 mv
Etude des quinones dans le complexe membranaire nitrate réductase M e O O CH 3 M e O O CH 3 e - e - M e O O H CH 3 M e O O quinone Oxydée R1 M e O O R1 semi-quinone S = ½ RPE g moy = 2.0045 2H + M e O O H R1 quinol Réduit B /mt 335 mt Localisation des semiquinones au sein du complexe membranaire
Caractérisation d une espèce de type ménasemiquinone on E. coli inner membrane vesicles E m, 7.5 (MQ/MQH 2 ) ~ -95 mv E 2, 7.5 (MSQ/MQH 2 ) ~ -150 mv E 1, 7.5 (MQ/MSQ) ~ -40 mv EPR signal amplitude -95 mv 60 K 332 334 336 338 340 Magnetic field (mt) WT NarGHI WT NarGHI+NQNO (inhibiteur) SQ in NarGHI Q H in Quinol oxidase (bo3) Ks 70 4-9 Grimaldi et al., 2005 Sato-Watanabe et al., 1995 SQ in Fumarate reductase E29L 1.2 x 10-2 Hagerhall et al., 1999 Free SQ ~ 10-10 Mitchell, 1976 ph 7.5, ~ 298 K K S = SQ QH 2 2 Q = exp [(E 1 o - E 2 o )F/RT]
MSQ est stabilisée à proximité de l hème distal Lanciano et al., Biochemistry 2007 H187 H56 b D H66 b P PCP Normalized semiquinone EPR signal Intensity 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 - - - NarGHI NarGHI H66Y NarGHI H187Y NarGHI H56Y NarGHI K86A b D b P -400-200 0 200 Redox potential (mv) K86 NarGHI H56Y b P MSQ MSQ is remote from b P NarGHI H66Y, NarGHI H66Y b D MSQ MSQ is strongly associated with heme b D NarGHI K86A K86 is required for the stabilization of MSQ
Un modèle de fixation de la ménasemiquinone dans NarGHI d après les données de spectroscopie RPE Séquence d impulsions micro-ondes Fréquence (MHz) Combinaison avec marquage isotopique sélectif Grimaldi et al. JBC 20110
Structure du complexe I entier de Thermus Thermophilus à 4.5 Ǻ (pdb: 3M9S) Sazanov et al., Science (2006) Efremov et al., Nature (2010) 523 kda Modèle de translocation de protons Le mécanisme de couplage entre transfert d électron et translocation de protons reste inconnu Position de la (des?) quinone(s)? Le centre N2 interagit avec une espèce semiquinone. L analyse des spectres RPE suggère une distance centre à centre de 12 Ǻ (Yano et al. 2005, Biochemistry)
Biogenèse des Molybdoenzymes: la Nitrate Réductase A Site actif de la NRA FS0 Nterm 1 Mo Mo[bis-MGD] 1. Transport du molybdène 2. Biosynthèse du Moco 3. Assemblage et maturation 4. Ancrage à la membrane 3 2 GG J I HH I 4 5 Vergnes A et al. J. Biol. Chem. (2006) - NarJ est une protéine spécifique impliquée dans la maturation de NarA. - NarJ est indispensable à l insertion du Moco. Protéine chaperon
Caractérisation de la NR exprimée en absence de NarJ G H J I wt J G H MogA MoeA MobA?. FSO 9K WT narj- Mo V 50K g ~ 1.986 1.98 100 110 120 130 140 150 Magnetic Field (mt) 1.96 WT G H I narj- 320 330 340 350 360 Magnetic Field (mt) Perte du Moco narj- MogA MoeA MobA J? G H Perte du FS0
Caractérisation de la NR exprimée en absence de cofacteur à molybdène FS0 Moco Perturbation structurale G H J MogA MoeA MobA?.. Mo V 50K mob- FS0 9K wt 320 330 340 350 360 Magnetic Field (mt) 100 110 120 130 140 150 Magnetic Field (mt) En absence de Moco le FS0 est présent
Caractérisation de la NR exprimée ayant perdu le FS0 (H50S) FS0 9K C93 C54 C58 H50S?. Mo V 50K H50S wt 100 110 120 130 140 150 Magnetic Field (mt) 320 330 340 350 360 Magnetic Field (mt) La perte du FS0 (H50S) entraîne la perte du Moco
Conclusions 1. L absence de NarJ entraîne la perte du Moco et du FS0 2. En absence de Moco le FS0 est présent 3. La perte du FS0 (H50S) entraîne la perte du Moco Moco FS0 L insertion du FS0 semble être une condition pré-requise pour l insertion du Moco. La protéine NarJ pourrait donc être impliquée directement ou indirectement dans l insertion du FS0. Maîtrise de la Biologie Moléculaire et de la Biochimie du système indispensable!
Etude par RPE de la biogenèse du complexe nitrate réductase r : une symphonie bien orchestrée 3,31 3,29 2,92 3,76 3,31 180 200 220 180 200 220 180 200 220 P Q pool C NarI [Fe-S] [Fe-S] Moco NO 2- + H 2 O NO 3 - + 2H + NarJ [Fe-S] [Fe-S] NarJ [Fe-S] [Fe-S] Moco [Fe-S] [Fe-S] Moco holonargh NarJ aponargh NarJ aponargh NarJ Moco Moco Moco FeS FeS FeS Magalon, A. et al. 2002 J. Biol. Chem. Vergnes, A. et al. 2006 J. Biol. Chem. Vergnes, A. et al. 2004 J. Biol. Chem. Lanciano, P. et al. 2007 J. Biol. Chem.
Etude des biomolécules par marquage de spin et spectroscopie RPE Site-directed spin labeling (SDSL)
Extrinsic Paramagnetic Probes : Spin Labeling SDSL : Site-Directed Spin Labeling = grafting of a stable nitroxide radical on a Cys residue MTSL E S= ½ I = 1 Ms=+1/2 E=gβB Ms=-1/2 B=0 B 0 A M I =+1 M I =0 M I =-1 M I =-1 M I =0 M I =+1 Hyperfine coupling with 14 N (I=1) M I = +1 M I = 0 M I = -1 A B B (mt) 347 348 349 350 351 352 353 354 355 B (m T)
Introduction à la technique du marquage de spin Greffer un radical nitroxide en une position choisie d une protéine O Méthanethiosulfonate (MTSL) N O. S S CH 3 O Réagit spécifiquement avec les cystéines Relativement faible encombrement Haute sensibilité du spectre à un changement structural Mutagenèse dirigée SH Marquage N O. Contrôle de l activité de la protéine marquée S S Analyse par RPE
Influence de la mobilité du radical rapide intermédiaire ps ns µs Comment diminuer la mobilité? -Diminuer la température -Augmenter la viscosité -Greffage sur une protéine lent ms SDSL Site-directed spin labeling 342 344 346 348 350 352 B (mt) τ c Spectres reflètent la mobilité du radical témoin de l environnement local
Article fondateur But : Relation entre la mobilité du marqueur et la structure de la protéine 30 mutants cystéines positionnés en différents sites hélice-α sans interaction tertiaire boucles sites enfouis
Site I : en surface des hélices-α (sans interaction 3 aire ) Régime de mobilité intermédiaire Différences entre les spectres pas d influence des résidus voisins structure/dynamique de la chaine protéique
Site II : sur les boucles boucle = site connectant des éléments de structures secondaires Régime de mobilité rapide Flexibilité de la chaine protéique
Site III : sites enfouis Sites enfouis = sites situés au cœur de la protéine Régime de mobilité lent
Bilan et conclusion H 0 «averaging» de l anisotropie de la matrice g <H 2 > «averaging» de l anisotropie de la matrice A dû au mouvement du nitroxyde Haute mobilité Mobilité intermédiaire Faible mobilité Spectres RPE = reflet de la structure de la protéine Technique adaptée à l étude des changements conformationnels induits par interaction protéine/protéine interaction protéine/ligand un évènement physique (illumination)
Ouvrages Sortie le 18 novembre 2010