UMR CNRS : 7213 Laboratoire de biophotonique et pharmacologie Equipe de signalisation cellulaire : Signalisation intracellulaire et protéines transmembranaires Les voies de signalisation intracellulaire : la protéine Rab5 NCBI : Protéine Rab5a Tuteur : M. ---------- UE Pharmacologie Spécialisée M1S2 2009 Mathieu SCHMITT
Présentation de l équipe et thèmes de recherche UMR 7213 Mécanismes antihypertenseurs Neuropeptide Y (NPY) + NA Hypertension artérielle NPY Recherche : Antagoniste du récepteur Y Expérience : FRET Transfection de Y(GFP) dans cellules HEK293 NPY (BODIPY)! 37 C Diminution fluorescence (ph endosome acide) INTERNALISATION DU RECEPTEUR Y Disparition du récepteur de la membrane : désensibilisation et recyclage
NPY 5 récepteurs Y1 Internalise QUE en présence de NPY C-terminal : Expérience : Délétions Troncation Δ32 INTERNALISATION CONSTITUTIVE Troncation Δ42 : pas d internalisation Séquence consensus : Yxxφ Internalisation? Récepteur Y1 Récepteur Y1 Δ32
Protéines Rab5 NCBI : Protéine Rab5a 3 isoformes : Rab5a Rab5b Rab5c Buts Internalisation? Valider un modèle de trafic cellulaire Rab5a associée la 1 ère étape d internalisation? Expériences Blocage expression des Rab5a Internalisation? I) Dominant négatif : S34N (mutant pour la Rab5a) Diminution internalisation II) sirna : abolition expression??? faible HEK293 transfectées avec Y1Δ32 Rab5a-siRNA Augmentation de synthèse des Rab5b et c Pas de diminution de l internalisation (même si répression Rab5a) Objectif : Transfection des 3 sirna des isoformes réprime leur expression?
Etude par FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) de l internalisation après transfection des sirna Rab5a, b et c GFP couplé au domaine N-terminal du récepteur Y1Δ32 : baisse de la fluorescence dans les endosomes (ph acide) à cause de la déstabilisation de la GFP 1.20 4 C 37 C Normalized fluorescence 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0 10 20 30 40 50 60 Pas de différence d internalisation entre les cellules traitées (+sirna) ou non traitées (-sirna) time (min) NPY Y 1 32 + sirna Rab5a,b and c (10 nm) (2) NPY Y 1 32 - sirna (2) Hypothèse : la transfection des Rab5-siRNA n est pas efficace Nouvelle étude Vérifier par Western blot la répression de l expression des isoformes de la protéine Rab5
Western blot 10nM de chaque sirna SDS-PAGE molecular weight standards board 161-0372 Rab5a 97% d expression 25Kd Rab5b - sirna + sirna Rab5c 25Kd 25Kd - sirna + sirna - sirna + sirna 29% d expression Pas d expression
Discussion et perspectives Répression de l expression de la protéine Rab5 Ancienne étude avec Rab5a-siRNA : répression de 85 à 90 % de l expression Plus de répression de Rab5a dans notre cas! Différences par rapport à l ancienne étude mélange de sirna des différentes isoformes Hypothèses : Interaction entre les vecteurs de transfection? Compensation de Rab5b et c par l augmentation de l expression de Rab5a? Semble être la plus probable Perspective Vérifier l expression de la Rab5a en transfection de la Rab5b-c-siRNA
Inconvénient des sirna Silencing Incomplet Taux faible de protéine Rab5 10 à 15% expression Hypothèse : La répression ne sera jamais suffisante pour voir un blocage de l internalisation Perspective Mutant de toutes les isoformes de Rab5 Néanmoins, une interprétation possible Rab5b et c Pas nécessaire à l internalisation Hypothèse : Une isoforme peut avoir la même fonction dans le processus d internalisation Conclusion Le Western Blot est un contrôle : Il permet de mettre en évidence un problème de répression de l expression dû à une mauvaise transfection des sirna La transfection de Rab5a-siRNA n est pas efficace Perspective Augmenter les concentrations de Rab5a-siRNA
La Rab5 serait plus ou moins impliquée dans l internalisation récepteur β2-adrénergique récepteur dopaminergique D2 récepteur chémokine CXC 2 Mutant Rab5 de l internalisation Seachrist et al., 2000; Iwata et al., 1999; Fan et al., 2003 récepteur AT1AR Zhang et al. 1996 Mutant Rab5 Modification du trafic et de la fusion endosomale Aucune influence sur l internalisation Hypothèse : mécanisme similaire pour le récepteur Y1 Récepteur Y1 et domaine C-terminal tronqué (Y1Δ32) récepteur AT1AR Perspective Seachrist et al. 2002 Interaction de Rab5 avec le domaine C-terminal Procéder à la même étude avec le récepteur Y1 natif Conclusion La répression de Rab5 n aura peut être jamais d effet sur l internalisation du récepteur Y1Δ32
Mutation de C-terminal Substitutions de nucléotides : Y1Δ32-A : 3D (acide aspartique) 3 A (alanine) en position 39 à 41 de la partie C-terminale Présence forte membranaire Présence faible périnucléaire Y1 Δ32 : Contrôle Y1 Δ32-AF : 3D 3A Y(tyrosine) F (phénylalanine) en position 38 de la partie C-terminale Présence exclusivement membranaire Pas de présence périnucléaire Périnucléaire
Discussion et perspectives Rôle des séquences d acides aminés dans l internalisation Internalisation du récepteur > > Y1 Δ32 Y1Δ32-A : Y1 Δ32-AF : Internalisation constitutive Acide aspartique (a.a electrovalent) Alanine (a.a neutre) Tyrosine: site de phosphorylation - structure tertiaire - liaison de ligand Conséquences: Blocage du trafic endosomal? Bloque l internalisation du récepteur? Blocage de la phosphorylation par la GRK (G-protein-coupled receptor kinase)
GRK et internalisation des récepteurs Blocage de la phosphorylation par la GRK Blocage du complexe β-arrestine- AP2- clathrine Blocage de l endocytose Perspective Mesure de l internalisation par FACS Conclusion L internalisation est impliquée dans de nombreux mécanismes de modulation des réponses de la cellule Conséquences physiopathologiques Exemples : Dépendance et tolérance aux opioïdes Internalisation excessive de récepteurs β2-adrénergique au niveau des cellules musculaires lisses chez les patients souffrant d asthme bronchique
Vésicule à clathrine Lignée corticotrope hypophysaire murine AtT20 transfectée avec le récepteur humain hypophysaire de la vasopressine, hv3, EGFP en C-terminale Institut Cochin http://www.nanobio.frontier.kyoto-u.ac.jp/lab/slides/4/e.html Puits à clathrine