Rapport Scientifique Seine-Aval 3

Rapport Scientifique Seine-Aval 3 Séminaire Seine-Aval 2008 Fiches de synthèse des propositions SA4 THEME 1 : MORPHO-DYNAMIQUE, CYCLES DES VASES ET CONTAMINANTS ASSOCIES ANALYSE DU RISQUE MICROBIOLOGIQUE EN ESTUAIRE DE SEINE - 2006 - C. DégremR. HOcdéont R. Hocdé Berthe T., Pawlak B., Petit F., Cariou N., Ratajczak M., Touron A., Lotodé J., Laroche E. GIP Seine-Aval 12 Avenue Aristide Briand 76000 Rouen tel : 02 35 08 37 64 fax : 02 35 98 03 93 http://www.seine-aval.fr

Sommaire RESUME DU RAPPORT D ACTIVITE 2005... 4 I. INTERVENANTS... 6 II. OBJECTIFS SCIENTIFIQUES POUR L ANNEE... 6 III. STRATEGIE DES CAMPAGNES :... 7 IV. RESULTATS... 8 1 ERE PARTIE: RESISTANCE D'E. coli AUX ANTIBIOTIQUES ET AUX METAUX LOURDS EN ESTUAIRE DE SEINE...8 1-Résistances aux antibiotiques et aux métaux lourds de souches d' E.coli isolées de moules... 8 2- Résistance aux antibiotiques de souches d' E.coli isolées de Seine et de 2 sources majeures de contamination.8 3- Multirésistance aux antibiotiques et au mercure des souches d' E.coli isolées de l'estuaire de Seine 13 4- Analyse génétique de souches d' E.coli résistantes aux antibiotiques et au mercure...16 5-conclusion-discussion..16 2 EME PARTIE : RELATION ENTRE L ABONDANCE DES FLORES INDICATRICES DE CONTAMINATION FECALE ET LA PRESENCE DE SALMONELLE... 18 1- Relation entre l'abondance des flores indicatrices et Salmonella dans les eaux de Seine.. 18 2-Relation entre l'abondance des flores indicatrices et Salmonella dans les affluents...28 3-Qualité microbiologique des moules et coques de baie de seine. 30 4- Conclusion-discussion 32 V. BIBLIOGRAPHIE DU GROUPE DE RECHERCHE... 32 Annexe méthodologique.....34 2

Fiche synthètique Bilan d activités du LMDF UPRES 2123/ Groupe Biodiversité et environnement Synthèse des données de bactériologie (présence de Salmonella) dans les eaux de Seine acquises dans le cadre du programme Seine- aval et de la SNS (voire d autres données disponibles). Relation abondance des flores indicatrices et présence de Salmonella y compris sous forme non cultivable dans les moules, eaux de l estuaire, affluents (influence des évènements pluvieux). Relation abondance des flores indicatrices et présence de kystes de Giardia duodenalis et Cryptosporidium parvum dans les moules, eaux de l estuaire, affluents (influence des évènements pluvieux). Impact des évènements pluvieux sur la contamination microbiologique de la Risle, le Robec et le Cailly. Couplage des premiers résultats obtenus sur Salmonella avec le modèle sur la dynamique des coliformes thermotolérants Recherche de souches E. coli O157 :H7dans les populations d E. coli isolées le long de l estuaire (campagne SNS). Etude de souches résistantes aux métaux lourds (mer, czc, cada) et aux antibiotiques isolées de l estuaire (identification des sources) et des supports génétiques. Action proposée en 2004 et effectuée en 2005 Antibiorésistance de souches d E.coli isolées de moules Fait Fait pour les eaux et affluents de l estuaire Analyses microbiologiques effectuées pour les moules mais la synthèse sera effectuée pour les parasites dans le rapport de synthèse Nombre de campagnes insuffisantes à poursuivre en 2006 Un effort spécifique sera fait sur la Risle en collaboration avec A.Durand. Un retard a été pris en 2005 pour un problème d équipement sur site. Sera fait en collaboration avec Pierre Servais à l occasion de la rédaction du rapport de synthèse Colonies suspectes en cours d analyse Fait Fait et présenté dans ce rapport Action proposée 2005 : Analyse du risque virologique en estuaire de Seine Collecte des échantillons, filtration et envois des filtres à P. Payment (INRS, Québec) Fait mais la convention n a toujours pas été signée 3

Analyse du risque microbiologique en estuaire de Seine Résumé du rapport d activité 2005 LMDF UPRES 2123 Groupe Biodiversité et environnement Université de Rouen, 76821 Mont Saint Aignan cedex Ce résumé concerne les études ci-dessous proposées par notre groupe de recherche pour l année 2005 : - résistance bactérienne aux métaux lourds et aux antibiotiques en milieu estuarien (Action - 2004-10) - relation abondance des flores indicatrices avec Salmonella et les parasites (Giardia duodenalis et Cryptosporidium parvum) dans les eaux, les affluents (action I-2004-12). Une analyse collective des résultats obtenus sur les moules prélevées en baie de Seine est en cours avec l équipe de parasitologie (CHU, Rouen) et sera présentée dans le document de synthèse. Le couplage des résultats présentés dans notre étude avec le modèle sur la dynamique des coliformes thermotolérants sera fait avec Pierre Servais pour le rapport de synthèse 2005. 2004-10) Résistance bactérienne aux métaux lourds et aux antibiotiques en milieu estuarien (Action - Ce travail a permis de montrer dans l estuaire de Seine, environnement contaminé en métaux traces, la présence de nombreuses souches d E. coli multirésistantes au mercure et aux antibiotiques. Ces souches sont isolées dans les eaux de l estuaire mais sont aussi présentes dans les rejets de la STEP de l agglomération rouennaise et dans les eaux du Robec. La comparaison des profils de résistances aux antibiotiques suggère une variation saisonnière du niveau de résistance des souches d E. coli isolées dans les eaux de l estuaire (seize antibiotiques testés), qui peut s expliquer par l origine des réservoirs, l influence des évènements pluvieux sur le ruissellement, ou le débits. Des souches résistantes à l acide nalidixique et à la ciprofloxacine sont présentes dans les eaux, mais absentes dans les rejets de STEP et les eaux de Robec, ce qui suggère que la contamination en E. coli résistantes n est pas uniquement imputable à ces rejets, mais que les ruissellements des sols sont probablement à prendre en compte. La hiérarchisation des sites de l estuaire (méthode de Ward, distance Euclidienne) en fonction des profils de résistance des souches d E. coli montre un cluster où se regroupent les souches isolées des effluents traités de la STEP avec 4

celles isolées dans la zone de l embouchure suggèrant l existence de rejet de bactéries fécales de même origine (STEP?) dans cette zone. Des souches d E. coli présentant des résistances associées à au moins un antibiotique et au mercure (mera) sont présente dans les eaux de l estuaire, dans les effluents traités de la STEP et des eaux du Robec, où elles représentent jusque 30% de la population d E.coli. La résistance au mercure peut être associée à 7 résistances différentes aux antibiotiques. L analyse génétique initiée lors de ce travail a permis de montrer que 6 souches d E. coli (mera) possédaient des intégrons de classe I qui jouent un rôle important dans la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques. L analyse du contenu plasmidique des souches a montré que le gène mera était probablement chromosomique. Ces travaux se poursuivent aujourd hui dans le cadre de la thèse d Emilie Laroche co-financée par le programme Seine-aval. Présence de Salmonella et abondance des flores indicatrices d une contamination bactérienne d origine fécale dans les eaux et affluents de l estuaire de Seine L exploitation des analyses microbiologiques acquises par le SNS entre 1997 et 2004 et dans le cadre du programme seine aval (données SA 2000-2004) a permis de caractériser des zones de l estuaire en fonction d un danger microbiologique potentiel sur la base de l abondance des flores indicatrices de contamination fécales et de la fréquence de contamination par Salmonella: 2 zones présentent un «danger microbiologique» plus élevé, la zone de l agglomération Rouennaise et la zone amont sur le site de Poses. Dans la zone urbanisée de la région rouennaise la qualité microbiologique des eaux est fortement influencée par le rejet des STEP, et le rejet du Robec et du Cailly. Dans cette zone, les eaux sont contaminées de façon permanente par les Salmonella. Pour autant il n a pas été possible d établir une corrélation entre l abondance d une ou des flores indicatrices et la présence de cette bactérie pathogène. Le site de Poses qui correspond aux apports amont de l estuaire, est une zone de «danger microbiologique» en période de haut débit, la fréquence d échantillons contaminés par les Salmonella est 10 fois plus élevée, et il existe une corrélation positive entre l abondance de toutes les flores bactériennes indicatrices et la présence de Salmonella. A l embouchure, la fréquence de contamination des eaux par les Salmonella est plus faible, et il existe une corrélation entre la présence de ce pathogène et l abondance des entérocoques intestinaux (dénombrés par la norme ISO 7899-2) qui reste toutefois à confirmer avec la méthode miniaturisée de dénombrement sur plaque. Sur les autres sites de l estuaire il n a pas été possible d établir une relation positive entre l abondance des flores indicatrices et la présence de Salmonella ce qui suggère l existence d une relation complexe, et nécessite de tester l influence d autres paramètres tels que l influence des évènements pluvieux (évènements rares mais déterminants), le débit, la dynamiques des MES, la survie des différentes flores en fonction de la salinité. 5

I. Intervenants I.1 - Enseignants-chercheurs permanents : Thierry Berthe (MC, 50%), Barbara Pawlak (MC, 20%), Fabienne Petit (Pr, 40%). I.2 - Techniciens Nicole Cariou (10%), Mehdy Ratajczack (40%) I.3 - Stagiaires étudiants Aurélie Touron (ATER, 50%), Stagiaire de master 1 Julien Lotodé (6 mois), Emilie Laroche, DEA/master2. II. Objectifs scientifiques pour l année Résistance bactérienne aux métaux lourds et aux antibiotiques en milieu estuarien (Action I- 2004-10) : La résistance bactérienne aux antibiotiques correspond à un phénomène d écologie globale, où sont observés des flux de gènes de résistance bactériens, parallèlement à la circulation des microorganismes entre les quatre écosystèmes majeurs (homme, animal, sol et eaux). Au sein de cet écosystème aquatique de nombreuses espèces bactériennes d origine fécale et environnementale sont résistantes aux antibiotiques. Les bactéries d origine fécale, majoritairement sélectionnées chez les hommes et les animaux, contaminent l environnement aquatique par l intermédiaire des rejets de station d épuration et le ruissellement des sols agricoles et pâturés. Les gènes de résistances aux antibiotiques souvent présents sur des transposons ou des intégrons peuvent être associés à d autres gènes de résistances, notamment aux contaminants chimiques. Ainsi dans des environnements naturels, la pression de sélection exercée par ces contaminants chimiques peut être favorable au maintien et/ou au transfert de ces gènes au sein de la communauté microbienne. Au cours des exercices précédents du programme Seine aval, l équipe Biodiversité et environnement du LMDF a montré, que la communauté microbienne présente dans les sédiments des vasières était enrichie en bactérie portant des gènes de résistance au cadmium (cada) et au mercure (mera). Une étude comparative montre une très faible abondance de ces communautés bactériennes résistantes aux métaux traces dans les sédiments des vasière de l Authie (site témoin non anthropisé, programme PNETOX). En 2005, nous avons recherché si des souches bactériennes susceptibles d être hébergées dans l organisme humain, présentaient une résistance multiple métaux lourds et antibiotiques. Cette étude s est effectuée sur des souches d E.coli isolées des eaux de l estuaire et de 2 sources de contamination en bactéries fécales : le rejet de STEP et le Robec. 6

III.Stratégie des campagnes : Le groupe de recherche (T.Berthe) a coordonné les campagnes de l ensemble des équipes impliquées dans la thèmatique «analyse du risque microbiologique en estuaire de Seine». Depuis Juillet 2005, nous collectons et filtrons les échantillons que nous envoyons à P.Payment (INRS, Institut A.Frappier, Québec, Canada) pour le dénombrement des virus. Campagne SNS Affluents/STEP Moules Tableau 1 : campagnes communes effectuées en 2005 Février 05 Avril 05 Juillet 05 Septembre 05 Novembre 05 Mars 05 3 affluents + STEP (après période de pluie) Juillet 05 2 affluents Juillet 05 7 affluents + STEP Février 05 St Jouin, Octeville Mai 05 St Jouin, sainte adresse Juillet 05 St Jouin, sainte adresse Microbiologie Rouen T.Berthe/F.Petit Parasitologie L.Favennec G.Gargala Virologie P.Payment ESA Bruxelle P.Servais Intercalibration Méthodes cultivables, moléculaires FISH Intercalibration Méthodes cultivables, moléculaires FISH Coques Septembre 05 St Jouin, sainte adresse Février 05 Penne de pie Septembre 05 Penne de pie 7

L analyse microbiologique a été effectuée sur l ensemble des échantillons : dénombrements des coliformes totaux, fécaux/thermotolérants, entérocoques, spores de Clostridium perfringens. Les Salmonella, Listeria monocytogenes ont été recherchées par la méthode de mise en culture et par biologie moléculaire (PCR). L étude de l antibiorésistance bactérienne et la résistance associée au mercure ont été effectuées sur les campagnes SNS de février et mars et sur les souches isolées de moules. E. coli O157 H7 a été recherchée lors de la campagne affluents de Juillet 2005 et SNS (juillet 05, septembre et novembre 05) IV.Résultats 1ère partie : Résistance bactérienne aux antibiotiques et aux métaux lourds en estuaire de Seine 1 Résistance aux antibiotiques des souches d E.coli isolées de Mytilus edulis Cette action correspond à une proposition de 2004, mais les souches isolées se sont avérées difficilement revivifiables pour permettre une étude des propriétés d antibiorésistance. Cette opération a donc été reportée et réalisée en 2005 et se poursuit en 2006 au vue du faible de souchesd E.coli isolées dans les moules de baie de Seine. Pénicillines Céfalosporines Aminosides Quinolone antibiotiques Vattetot N=43 Mai 2004 Villerville N=10 Ste Adresse N=4 Yport N=4 Amoxicilline 22 0 0 0 0 Amoxicilline+ac.clavulanique 20 0 0 0 0 Ticarcilline 8 0 0 0 0 Ticarcilline+ac.clavulanique 2 0 0 0 0 Imipénème 2 0 0 0 0 Céfalotine 26 0 0 0 0 Ceftazidine 2 0 0 0 0 Cefotaxine 0 0 0 0 0 Gentamycine 0 0 0 0 0 Amikacine 2 0 0 0 0 Acide nalidixique 4 0 0 0 0 Ciprofloxacine 0 0 0 0 0 Avril 2005 St Jouin Bruneval N=8 Tableau 2 : Antibiorésistance de souches d E.coli isolées de moules de l embouchure de Seine En 2004, nous avions observée une faible contamination des moules en flores indicatrices de contamination fécale y compris en entérocoques fécaux, qui peut s expliquer par la faible survie de cette souche bactérienne en milieu marin (stress osmotique). A l exception des moules prélevées sur le site de Vattetot, les souches isolées des moules sont sensibles à tous les antibiotiques testés. Ces résultats suggèrent que les souches d E.coli isolées sur les moules de ce site ont pour origine une sources de contamination en bactéries fécales différente de celles des autres sites. 2 Résistance aux antibiotiques des souches d E.coli isolees des eaux de Seine et de 2 sources majeures de contamination fécales intra- estuariene (STEP émeraude et Robec) 8

Afin de relativiser les résultats obtenus sur l étude de l antibiorésistance des souches d E.coli une étude préalable sur la représentativité de cette population bactérienne au sein des coliformes présent dans la colonne d eau, a été effectuée. 2-1 Proportion de souches d E.coli au sein des coliformes fécaux/thermotolérants A 1,E+04 1,E+03 ufc.100ml -1 1,E+02 1,E+01 1,E+00 Honfleur Tancarville Caudebec La bouille Rouen Pose n/n 0/27 2/51 28/72 45/100 24/65 26/50 % Escherichia coli 0 3,92 38,89 45 36,92 52 B 1,E+05 1,E+04 ufc.100ml -1 1,E+03 1,E+02 1,E+01 1,E+00 Robec STEP pk : 356 pk : 356 n/n 48/50 26/50 % Escherichia coli 96 52 Figure 1. Abondance des coliformes fécaux/thermotolérants et pourcentage d Escherichia coli dans les eaux de l estuaire de Seine et de 2 sources de contamination fécale intra-estuariennes (A) Eaux de l estuaire de Seine : ( ) Campagne de Février 2005 (débit : 354 m 3.s -1 ) ; ( ) Campagne d Avril 2005 (débit : 475 m 3.s -1 ). (B) Rejet de la STEP de l agglomération rouennaise (550 000 eq.habitants) et du Robec (Octobre 2004). Norme européenne pour la qualité des eaux de baignades (76/160/EC) pour les coliformes fecaux/thermotolérants, nombre guide : 10 2.100mL -1 et nombre impératif : 2x10 3.100mL -1. Le pourcentage d E. coli est évalué après repiquage de N souches de bactéries appartenant au groupe des coliformes thermotolérants sur un milieu Rapid E coli. 9

Le pourcentage d E. coli a été déterminé au sein des coliformes fécaux/thermotolérants isolés sur 6 sites de l estuaire (campagnes SNS février et avril 05 ; Figure 1). Dans les eaux de Seine, l abondance des coliformes fécaux thermotolérants est plus élevée en février 05 qu en Avril 05 les valeurs de débits sont voisines mais la campagne de février a été réalisée au flot alors que la campagne d avril a été échantillonnée au jusant. En avril 05, l abondance des coliformes fécaux thermotolérants est constante (1.10 2 UFC.100mL -1 ) sauf sur le site de La Bouille où on observe une augmentation d un facteur dix. La figure 1A montre que l abondance des coliformes fécaux thermotolérants n est pas toujours corrélée à la présence d E. coli. Le pourcentage d E. coli au niveau du bouchon vaseux atteint jusqu à 3,92% à Tancarville et même 0% à Honfleur, probablement dû à l effet de la salinité et à la présence de coliformes thermotolérants ubiquistes mieux adaptés à l environnement. Au niveau des deux sources principales de contamination en bactéries fécales intraestuariennes (STEP émeraude et Robec), on observe à nouveau que l abondance des coliformes fécaux/thermotolérants est aussi importante dans le Robec que dans les rejets d effluents traités de la STEP. Ces résultats confirment ceux déjà obtenus au laboratoire qui montraient que dans l estuaire les eaux du Robec sont une source de contamination en bactéries fécales aussi importantes que les rejets de la STEP Emeraude. De plus le pourcentage d E. coli parmi les coliformes fécaux/thermotolérants est plus élevé dans les eaux du Robec (96%) que dans les effluents traités de la STEP (52%), suggérant une contamination fécale récente de ces eaux. 10

2-2 Résistance aux antibiotiques d E.coli isolées des eaux de Seine et des principales sources de contamination en bactéries fécales intraestuariennes Antibiotiques % de souches d' E.coli résistantes campagne longitudinale rejets intra-estuariens FEV 05 (N=43) AV 05 (N=76) STEP (N=26) Robec (N=48) Pénicillines Amoxicilline 20,93% 6,58% 38,46% 45,83% Amoxicilline + Ac. Clavulanique 18,60% 7,89% 0,00% 6,25% Ticarcilline 39,53% 13,16% 34,62% 83,33% Ticarcilline+ Ac Clavulanique 9,30% 0,00% 0,00% 6,25% Imipénème 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% Céfalosporines Céfalotine 11,63% 5,26% 7,69% 22,92% Ceftazidine 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% Céfotaxine 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% Aminosides Gentamicine 2,33% 0,00% 7,69% 2,08% Amikacine 2,33% 0,00% 0,00% 2,08% Kanamycine 11,63% 1,32% 19,23% 56,25% Phénicolés Chloramphénicol 9,30% 6,58% 15,38% 14,58% Cyclines Tétracycline 30,23% 14,47% 34,62% 35,42% Sulfamides Triméthoprime-sulfamides 13,95% 2,63% 26,92% 79,17% Quinolones Acide Nalidixique 13,95% 5,26% 0,00% 2,08% Ciprofloxacine 6,98% 3,95% 0,00% 0,00% Tableau 3. Pourcentage de souches d Escherichia coli résistantes aux antibiotiques testés, isolées de l estuaire de Seine et de sources de contamination intra-estuariennes a. N, nombre de souches isolées et testées pour chaque antibiotique selon la méthode de diffusion sur gélose Différentes populations d E. coli, prélevées dans les eaux de l estuaire en février (N=43) et avril 2005 (N=76), ainsi que dans les rejets de la STEP (N=26) et du Robec (N=48) en octobre 2004, ont été comparées sur la base de leur profil de résistance aux antibiotiques (Tableau 3). Dans les eaux de Seine, les pourcentages de souches résistantes sont plus élevés en février, qu en avril. Lors de ces deux campagnes, les pourcentages de souches résistantes les plus élevés sont observés pour la ticarcilline (39,53% et 13,16%) et la tétracycline (30,23% et 14,47%). La présence de souches résistantes à la ticarcilline/acide clavulanique (9,30%), à la gentamicine (2,33%) et à l amikacine (2,33%) n est observée qu en février. Ceci montre un effet saisonnier sur le profil de résistance des souches d E. coli isolées des eaux de Seine probablement dû aux réservoirs d origine sous influence du débit et de la pluviométrie qui modifient les transferts de ces bactéries dans l environnement aquatique. Dans les effluents traités de la STEP Emeraude et les eaux du Robec, on observe des pourcentages de souches résistantes plus élevés à l ensemble des antibiotiques par rapport à ceux des souches d E. coli isolées des eaux de l estuaire, à l exception des deux antibiotiques, l acide nalidixique et la ciprofloxacine. Il est aussi à noter l absence de souche résistante à l amoxicilline-acide clavulanique 11

dans les effluents traités de STEP. Ce qui suggère que les bactéries résistantes présentes dans les eaux de l estuaire ont également des origines différentes de celles isolées des rejets de STEP et du Robec. Lors de nos campagnes, aucune souche d E. coli ne présentait de résistance pour la ceftazidine, la céfotaxine et l imipénème. 2-3 Hiérarchisation des différentes populations d.e coli isolées de l estuaire de Seine en fonction de leurs profils de résistance aux antibiotiques (6 campagnes 2001-2005) Rouen 8-0.65 1.6 0 La Bouille Pose Croisset Caudebec STEP Emeraude Embouchure Figure 2. Hiérarchisation des différentes populations d Escherichia coli isolées de l estuaire de Seine en fonction de leurs profils de résistance aux antibiotiques. Dendrogramme obtenu à partir des pourcentages de résistance à 12 antibiotiques (AMX, AMC, TIC, TIM, IPM, CF, CAZ, CTX, GM, AN, NA, CIP) des souches d Escherichia coli isolées de l environnement estuarien lors de ces travaux et incrémentés par les données acquises précédemment au laboratoire (Méthode de Ward, distance Euclidienne) Sur la base des profils de résistance à douze antibiotiques (AMX-AMC-TIC-TIM-IPM-CF- CAZ-CTX-GM-AN-NA-CIP) des souches d E. coli isolées de l estuaire, une matrice de données a été réalisée. Elle rassemble les données obtenues lors de ces travaux (octobre 2004, février et avril 2005) et celles obtenues précédemment par le laboratoire, correspondant à 4 campagnes (2001 et 2002). Cette matrice a permis d effectuer une hiérarchisation par la méthode de Ward (distance Euclidienne), afin de mettre en évidence une variabilité spatiale des différentes populations d E. coli en fonction de leur profil de résistance aux antibiotiques. La figure 2 montre qu il se distingue deux clusters principaux : d une part, les populations isolées des rejets de la STEP Emeraude de l agglomération rouennaise et celles isolées de l embouchure (site de Honfleur et Tancarville) et d autre part, les populations isolées sur les autres sites de l estuaire (Poses pk 202, Rouen pk 243, Le Croisset pk 246,6, La Bouille pk 260 et Caudebec pk 310). Le regroupement de l embouchure et de la STEP dans un même cluster suggère la présence dans les eaux de l embouchure de souches d E. coli ayant des profils de résistance proches de ceux observés chez les souches isolées des effluents traités de la STEP 12

de l agglomération rouennaise, alors qu elles sont rarement isolées sur ce site. Ces résultats laissent supposer que des rejets de même nature que la STEP Emeraude contaminent l embouchure. Ceci pourrait s expliquer par l impact de l affluent La Risle où se rejettent les effluents traités d une STEP. L analyse du deuxième cluster est quant à elle plus délicate à interpréter car de nombreux paramètres interviennent dans cette zone de l estuaire comme le débit, la pluviométrie, ou des rejets ponctuels. 3- Multirésistance aux antibiotiques et au mercure des souches d Escherichia coli isolées de l environnement estuarien Dans le cadre de cette étude, nous avons recherché si la résistance aux antibiotiques pouvait être associée à la résistance au mercure au sein des populations d E. coli isolées de l environnement estuarien (octobre 04, février et avril 05). 3-1 Isolement des souches d Escherichia coli résistantes au mercure (mera) Les souches d E. coli isolées ont été testées pour leur résistance au mercure. Les souches résistantes au mercure ont été identifiées après croissance sur un milieu LB supplémenté en HgNa 2 (20 µg.ml -1 ). La mise en évidence du gène mera a été effectuée par hybridation sur colonie avec la sonde spécifique du gène mera. Puis une détection moléculaire du gène mera a été réalisée pour chaque souche et a permis d amplifier une séquence spécifique de ce gène de 1238 pb. Au total 193 souches d E. coli isolées de différents sites lors de différentes campagnes ont été testées (Tableau 4) : 50 se cultivent sur LB en présence de la pression de sélection au mercure, 47 ont hybridé avec la sonde mera et 47 ont permis de détecter par amplification moléculaire le gène mera. Toutes les souches qui présentaient le phénotype résistant possédaient dans leur génome le gène mera, à l exception de trois souches où le gène n a pas pu être mis en évidence. En conclusion, sur 193 souches d E coli isolées de Seine 47, sont capables de se multiplier en présence de mercure et possèdent le gène mera. Sites Croissance sur milieu supplémenté en Hg (20 µg.ml -1 ) 13 Hybridation sur colonie mera Détection du gène mera par PCR profil longitudinal Honfleur pk 356 (N=0) 0 0 0 Tancarville pk 337 (N=2) 0 0 0 Caudebec pk 310 (N=27) 6 5 5 La Bouille pk 260 (N=45) 8 7 7 Rouen pk 243 (N=21) 9 8 8 Poses pk 202 (N=24) 4 4 4 rejets intra-estuariens STEP pk 247 (N=26) 9 9 9 Robec pk 242 (N=48) 14 14 14 Total (N=193) 50 47 47 Tableau 4. Résultats de croissance, d hybridation et de PCR pour l identification des souches d Escherichia coli, isolées de l environnement estuarien, résistantes au mercure (mera)

3-2 Occurrence de souches d Escherichia coli multirésistantes aux antibiotiques et au mercure dans les eaux de l estuaire et de la STEP emeraude et du Robec A Caudebec pk 310 (N=27) La Bouille pk 260 (N=45) Nb de souches 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de souches 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de résistance aux antibiotiques Nb de résistance aux antibiotiques Rouen pk 243 (N=21) Poses pk 202 (N=24) Nb de souches 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de souches 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de résistance aux antibiotiques Nb de résistance aux antibiotiques B STEP pk 247 (N=26) Robec pk 242 (N=48) Nb de souches 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de souches 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de résistance aux antibiotiques Nb de résistance aux antibiotiques Figure 3. Multirésistance au mercure et aux antibiotiques des souches d Escherichia coli isolées de l environnement estuarien. ( ) Nombre de souches multirésistantes au mercure et aux antibiotiques, ( ) nombre de souches résistantes aux antibiotiques. (A) Profils de multirésistance sur les sites d étude de l analyse des eaux estuarienne (Février et Avril 2005). (B) Profils de multirésistance des rejets de la STEP de Rouen et d un affluent, le Robec (Octobre 2004). 14

Parmi les 47 souches d E. coli (mera), 30 présentent au moins une résistance aux antibiotiques. La figure 3 présente pour chaque site échantillonné, le nombre de bactéries où la résistance au mercure est associée à une ou plusieurs résistances aux antibiotiques (jusqu à 9 antibiotiques différents). Les sites de Honfleur et de Tancarville ont été exclus de l analyse, le nombre de souches d E. coli étant insuffisant. La multirésistance antibiotiques/mercure est retrouvée aussi bien dans les eaux de l estuaire que dans les rejets de la STEP et du Robec. Dans les eaux de l estuaire (Figure 3A), la résistance au mercure est associée à un nombre variable de résistance aux antibiotiques chez les souches isolées des sites de Caudebec (pk 310), La Bouille (pk 260) et de Rouen (pk 243), avec un maximum de 7 résistances aux antibiotiques chez une souche d E. coli isolée à Caudebec. A Poses (pk 202), il a été isolé uniquement des souches d E. coli où la résistance au mercure est associée à une seule résistance aux antibiotiques sur les 16 testés dans notre étude. Les souches d E. coli mera isolées des effluents traités de la STEP rouennaise (pk 247) et des eaux du Robec (pk 242) ont une association à un plus grand nombre de résistances aux antibiotiques (Figure 3B). On constate que les eaux du Robec contiennent uniquement des souches d E. coli possédant de 3 à 6 résistances aux antibiotiques. Ces résultats montrent le rôle aussi important de cet affluent dans l apport de bactéries fécales multirésistantes dans les eaux de l estuaire, équivalent aux rejets de la STEP. Sur l ensemble des bactéries analysées, 30% des souches d E.coli résistante à au moins 1 antibiotique sont aussi résistante au mercure(mera). Tableau 5. Profil de résistance aux antibiotiques des 30 souches d Escherichia coli isolées de l environnement estuarien, identifiées résitantes au mercure (mera) Profil de résistance aux antibiotiques Caudebec La Bouille Rouen Poses STEP Robec TOTAL AMX-TIC-SXT 1 1 AMX-TIC-K-SXT 1 1 AMX-TIC-K-TE 5 5 AMX-TIC-C-SXT 1 1 AMX-TIC-CF-TE-SXT 1 1 2 AMX-TIC-CF-K-TE-SXT 1 1 AMX-TIC-K-C-TE-SXT 1 2 3 AMX-TIC-C-TE-SXT-NA 1 1 AMX-TIC-GM-K-C-TE-SXT 2 2 AMX-AMC-SXT 1 1 AMX-AMC-TIC-NA 1 1 AMX-AMC-TIC-TIM-CF-C-TE 1 1 AMC 1 1 TIC 1 1 2 TIC-TE 1 1 TIC-TE-SXT 1 1 CF 1 1 C 1 1 TE 1 1 NA 1 1 NA-CIP 1 1 15

Le tableau 5 présente les profils de résistance aux antibiotiques des 30 souches multirésistantes isolées lors de ces travaux. On observe des associations de résistance très variées, chez les souches d E. coli isolées des eaux estuariennes, des effluents traités de la STEP et des eaux du Robec. Il n est pas possible d identifier une association spécifique de gènes, liée à la présence de la résistance au mercure. Cependant dans les eaux du Robec, cinq souches présentent le profil suivant : amoxicilline ticarcilline kanamycine - tétracycline qui est retrouvé chez deux autres souches du Robec et chez une souche de STEP où sont aussi associés deux autres résistances (chloramphénicol et aux sulfamides). Ceci suggère que des réarrangements de gènes sont peut être à l origine de ces différentes souches. 4 Analyse génétique de souches d Escherichia coli multirésistantes au mercure (mera) et aux antibiotiques isolées de l environnement estuarien Parmi les 30 souches d E. coli (mera) présentant au moins une résistance aux antibiotiques, 6 ont été sélectionnées afin d étudier la base génétique de leur résistance (tableau 6). Tableau 6. Caractéristiques des souches d Escherichia coli mera isolées de l environnement estuarien analysées au niveau génétique Souches Site Profil de résistance aux antibiotiques testés 16 Présence du gène teta Présence de l intégron de classe I inti1 SA 119 STEP AMX-TIC-CF-TE-SXT + + A120 STEP AMX-TIC-CF-K-TE-SXT - + SA125 Robec AMX-TIC-C-TE-SXT-NA + + SA126 Robec AMX-TIC-K-C-TE-SXT - + SA130 Robec AMX-TIC-K-C-TE-SXT - + SA170 Caudebec AMX-AMC-TIC-TIM-CF-C-TE - + L étude a porté sur 6 souches d E. coli (mera) choisies pour leur multirésistances à au moins 5 antibiotiques. Chez toutes les souches, il a été possible d amplifier une séquence spécifique du gène de l intégrase inti1des intégrons de classe I. Les souches SA119 (STEP) et SA125 (Robec), possèdent la séquence spécifique gène teta qui code une pompe à efflux responsable de la résistance aux tétracyclines. Les souches SA119 et SA170 présentent un plasmide de taille respectivement de 9,5kb et de 5kb. Une analyse par Southern blot avec la sonde mera suggère que la résistance au mercure est probablement portée par le chromosome bactérien. Cette étude se poursuit au laboratoire dans le cadre de la thèse de doctorat d Emilie Laroche. 5 Conclusion Discussion Le rôle de l environnement aquatique naturel dans l émergence et la dissémination des gènes et des bactéries résistantes aux antibiotiques n est pas encore clairement établit. Dans cette étude, des méthodes de microbiologie conventionnelle et de biologie moléculaire ont été mis à profit afin d isoler

des souches d E. coli résistantes aux antibiotiques et au mercure dans un environnement aquatique contaminé en métaux traces, l estuaire de Seine. Deux sources majeures de contamination en bactéries d origine fécale de l estuaire ont été également analysées pour tenter de comprendre l origine des bactéries résistantes dans cet environnement. Afin d étudier la possibilité de co-transfert de gène de résistance aux antibiotiques et au mercure, l analyse génétique de souches d E. coli (mera) résistantes aux antibiotiques a été initiée. Dans cette étude, la comparaison des profils de résistances aux antibiotiques des souches d E. coli isolées des eaux de l estuaire montre une variation saisonnière du niveau de résistance des souches d E. coli (% de souches résistantes aux seize antibiotiques testés). Ces résultats peuvent s expliquer par l origine des réservoirs qui est directement liée aux conditions de prélèvement, à la prédominance ou non des eaux de ruissellement en période de pluie, ou des débits. En estuaire de Seine, les souches d E. coli sont le plus souvent résistantes aux pénicillines et à la tétracycline, des résultats analogues ont été décrits dans la littérature avec une prédominance de souches d E. coli résistantes à ces antibiotiques dans les milieux aquatiques naturels. Des souches résistantes à l acide nalidixique et à la ciprofloxacine ont été isolées dans les eaux, au contraire des rejets de STEP et des eaux de Robec, suggérant que la contamination en E. coli résistantes des eaux de l estuaire n est pas uniquement imputable à ces rejets, mais que les ruissellements des sols sont probablement à prendre en compte. La hiérarchisation des sites de l estuaire (méthode de Ward, distance Euclidienne) en fonction des profils de résistance des souches d E. coli montre un cluster où se regroupent les souches isolées des effluents traités de la STEP avec celles isolées dans la zone de l embouchure. Ces résultats suggèrent l existence de rejet de bactéries fécales de même origine dans cette zone. Dans les eaux de l estuaire des souches d E. coli présentant des résistances associées à au moins un antibiotique et au mercure (mera) ont été isolées. Ces souches sont rejetées en Seine via les effluents traités de la STEP et des eaux du Robec, où prés de 30% de souches d E.coli résistantes au mercure et à au moins 1 antibiotique. La résistance au mercure peut être associée à 7 résistances différentes aux antibiotiques. Les profils de résistance aux antibiotiques des souches d E. coli (mera) sont très variés et ne permettent pas d identifier une association spécifique de gènes. L analyse génétique initiée lors de ce travail a permis de montrer que 6 souches d E. coli (mera) possédaient des intégrons de classe I qui jouent un rôle important dans la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques. L analyse du contenu plasmidique des souches a montré que le gène mera était probablement chromosomique. Ce travail a permis de montrer dans l estuaire de Seine, environnement contaminé en métaux traces, la présence de nombreuses souches d E. coli multirésistantes au mercure et aux antibiotiques. Ces souches sont isolées dans les eaux de l estuaire mais sont aussi présentes dans les rejets de la STEP de l agglomération rouennaise et dans les eaux du Robec. Ces travaux se poursuivent aujourd hui dans le cadre de la thèse d Emilie Laroche co-financée par le programme Seine-aval. 17

2 ème partie : Relation entre l abondance des flores bactériennes indicatrices de contamination fécale et la présence de Salmonella 1 Relation entre l abondance des flores indicatrices de contamination fécale et Salmonella dans les eaux de l estuaire de Seine : 1-1 Analyse des données du SNS (1997-2004) et des données Seine Aval (2000-2005) Données SNS : Le suivi de la qualité microbiologique de l estuaire est assuré par le SNS (coliformes totaux, fécaux/thermotolérants, entérocoques) tous les 2 mois sur 22 sites le long de l estuaire depuis une 30 aine d années. Les Salmonella ont été recherchées et sérotypées sur 11 sites entre 1995 et 2002. Plusieurs dates ont été prises en compte lors de l utilisation de cette banque de données : (i) 1997, mise en place de la station émeraude qui a contribué à une amélioration de la qualité microbiologique des eaux et l entrée en vigueur de la nouvelle norme ISO-6340 pour la détection des Salmonella et qui explique une plus grande fréquence d échantillons contaminés cette bactérie, (ii) 2000, détection des entérocoques et de E.coli par la technique des microplaques. Les données 2005 ne sont pas intégrées car les campagnes ne sont pas faites dans les mêmes conditions de marées. Données Seine- aval (SA) : Dans le cadre du programme Seine aval 3 des analyses spécifiques ont été effectuées à partir d eaux prélevées lors des campagnes du SNS. Les échantillons d eaux ont été analysés simultanément par les équipes de bactériologie (coliformes totaux, fécaux/thermotolérants, entérocoques, spores de Clostridium perfringens, E.coli, Salmonella [y compris sous sa forme non cultivable], E.coli O157 :H7 ), par l équipe de parasitologie (Giarda duodenalis et Cryptosporidium parvum,) et depuis juillet 2005 par une équipe de virologie (adénovirus). Dans le cadre de cette étude, nous avons échantillonné 4 zones de l estuaire (Tableau7): la zone amont (site de Poses, pk 202) ; la zone urbanisée intra estuarienne (pk :243-pk :260) où se localise la confluence avec le Robec et le rejet de la principale STEP estuarienne (Emeraude, 550 000 eq hab) ; Caudebec (pk :310,5 ; limite de l intrusion des eaux salines) ; zone de l embouchure (pk : 338 - pk : 355,8) 1-2 Distribution de la contamination des bactériologique d origine fécale dans les eaux de l estuaire de Seine (données SNS 2000-2004, données Seine aval 2000-2005) Les résultats des campagnes SNS et SA sont présentés tableau 8. A l amont de l estuaire (Poses, pk :202) les abondances en coliformes thermotolérants et entérocoques sont supérieures aux valeurs impératives de la norme pour 40,5% et 53,7% des échantillons respectivement. Nous avons 18

montré en 2004, qu en conditions de haut débit les apports amont étaient la source principale de contamination en coliformes fécaux/thermotolérants de l estuaire (Garcia-Armisen et al., 05). Les abondances les plus élevées en flore bactériennes indicatrices de contamination fécale sont observées dans la zone urbaine de l agglomération rouennaise. Dans cette zone, les abondances en coliformes thermotolérants (58,5% à 87,2% des échantillons selon le site) et en entérocoques (76% à 94,6% des échantillons selon le site) dépassent les valeurs impératives de la norme européenne des eaux de baignades (voir tableau 9). Il est remarquable d observer que dans cette zone l abondance en E.coli peut atteindre 10 fois la norme impérative pour les coliformes fécaux/thermotolérants (tableau 8). La qualité de cette zone est aussi fortement influencée par le niveau de contamination fécale des eaux du Robec (pk : 242), du Cailly (pk : 246) et du rejet des eaux usées de la STEP émeraude (pk : 247) (voir partie II). Dans l embouchure de l estuaire (pk : 337- pk :356) les abondances en flores bactériennes indicatrices de contamination fécale sont plus rarement supérieures aux valeur impératives de la norme que dans la zone urbaine (tableau 9) : 17,8% à 39,5% des échantillons dépassent les valeurs impératives de la norme pour les coliformes fécaux/thermotolérants et 37,2% à 64,3% pour les entérocoques. Le site de Honfleur se distingue des 2 autres sites avec des valeurs plus élevées en abondance des flores indicatrices, notamment les entérocoques où les valeurs sont plus souvent supérieures aux normes impératives. Les spores de Clostridium perfringens dénombrées dans le cadre des campagnes SA atteignent des valeurs maximales à l embouchure de L estuaire. Cette zone est probablement favorable à une accumulation des spores dans la colonne d eau, leur dynamique doit être similaire à celle des MES. Les spores, formes de résistance bactérienne peuvent se maintenir longtemps dans un environnement qui leur est hostile. Par ailleurs, il a été montré lors de l exercice 2004 du programme seine-aval, que les sédiments des vasières étaient le siège d une contamination fécale et que les spores de Clostridium perfringens étaient détectées sur les 30 premiers cm. Les spores de C. perfringens peuvent donc être remises en suspension dans la colonne d eau lors des cycles de dépôt-resuspension des sédiments. 19

Tableau 7 : Caractéristiques des sites échantillonnés le long de l estuaire de Seine (1997-2005) Sites pk (km) Nombre d échantillons Salinité (g.l -1 ) MES (mg.l -1 ) SNS* SA** min - Max min max *** Apport amont Poses 202 40 13 0 3.5 86.1 Rouen 243 40 8 0 3.7 67.2 Zone urbaine Le Croisset 247 40 10 0 5.4 112.9 Bassin des Docks 251 40 2 0 4.9 87.2 La Bouille 260 40 11 0 9.7 405.0 Limite de la salinité Embouchure de l estuaire Caudebec 310.5 40 5 0 7.8 769.4 Tancarville 338 40 17 0.5-25 39.7 3419.2 Berville 346 na 8 0.5-25 28.0 3293.5 Honfleur 355.8 40 14 0.5-25 101.1 3419.2 na: non analysé. *: de 1997 à 2004, coliformes totaux, coliformes fécaux / thermotolérants, E. coli (à partir de 2000), Enterocoques and Salmonella. **: de 2001 à 2005, coliformes totaux, coliformesfécaux /thermotolérants, Enterocoques, Salmonella, Giardia duodenalis et Cryptosporidium sp, de 2001 à 2004 spores de C. perfringens (enterovirus depuis juillet 2005). ***: les données 2005 ne sont pas intégrées 20

Tableau 8. Abondance des indicateurs de contamination fécale en estuaire de Seine (données SNS et SA). Sites pk (km) Coliformes totaux Coliformes thermotolérants Enterococci b Escherichia coli c Spores de Clostridium perfringens d min Max a Moy. Geom min Max a Moy. Geom min Max a Moy. Geom min Max a Moy. Geom min Max a Moy. Geom Apports amont Poses 202 215 93 000 3 410 90 93 000 1 034 < 10 23 000 217 34-54130 835 300 1 450 727 Rouen 243 307 93 000 7 005 130 43 000 2 204 36 9 300 570 292-23690 2 194 700 1 500 981 Zone urbaine Limite de l intrusion des eaux salines Embouchure de l estuaire Le Croisset 246.6 430 430 000 10 791 92 250 000 4 159 57 23 000 635 350-26700 2 247 290 5 500 1 133 Bassin des Docks 251.3 430 93 000 7 566 150 43 000 2 569 36 9 300 522 160-16620 2 183 na na La Bouille 259.7 207 93 000 5 498 230 43 000 1 974 15 4 300 266 293-6520 1 195 450 5 000 1 194 Caudebec 310.5 33 9 300 897 27 9 300 339 < 10 2 300 111 38-1126 181 na na Tancarville 337 150 34 500 1 736 < 10 25 000 609 10 2 300 110 36-2472 154 810 4 500 1 836 Berville 346 450 12 000 2 980 < 10 8 000 463 23-600 86 na na 1 000 20 000 4 308 Honfleur 355.8 230 27 500 2 236 < 10 25 425 868 < 10 11 454 171 36-4300 338 620 10 000 2 138 moy.geom.: moyenne géométrique a Abondances exprimées en ufc.100 ml -1 ou en spores.100 ml -1. b Résultats pour les Enterococci prennent en compte les 2 méthodes (classique et microplaque). c E. coli: résultats collectés de 2000 à 2004 ( données SNS). d C. perfringens: spores dénombrées de 2001 à 2004 ( données SA). na: non analysé. 21

Tableau 9 : Pourcentage d échantillons où l abondance des flores indicatrices est supérieure aux valeurs impératives préconisées par la norme des eaux de baignades (76/160/EC) 1997 à 2005 (données SNS et SA ). Coliformes Thermotolérants Enterocoques E. coli* Sites n/n % n/n % n/n % Zone amont Poses 17/42 40,5% 22/42 53,7% 12/33 36,4% Zone Urbaine Embouchure Rouen 22/35 62,9% 32/35 91,4% 12/23 52,2% Le Croisset 34/39 87,2% 35/37 94,6% 14/27 51,9% Bassin Docks 18/32 56,3% 28/32 87,5% 4/22 18,2% La Bouille 24/41 58,5% 31/41 75,6% 8/28 28,6% Caudebec 7/34 20,6% 16/34 47,1% 0/22 0,0% Tancarville 8/45 17,8% 16/43 37,2% 1/33 3,0% Berville 1/5 20,0% 2/5 40,0% na na Honfleur 17/43 39,5% 27/42 64,3% 3/32 9,4% n: nombre d échantillons où l abondance des flores indicatrices est supérieure à la norme impérative * la norme impérative de référence est la valeur de la norme pour les coliformes fécaux/thermotolérants N : nombre total d échantillons analyses Na: non analysés 22

1-3 Evaluation des zones de «danger microbiologique» en estuaire de Seine Une analyse de hiérachisation ascendante par la méthode de Ward a permis de regrouper les sites sur la base de la valeur des flux en coliformes fécaux/thermotolérants et ce en fonction des conditions de débits (figure 2). La distribution de ces clusters a été confirmée par le test de Kramer- Turkey. A bas débit on distingue 2 clusters : le premier regroupant les sites de Rouen, Le Croisset et les Docks qui présentent un «danger microbiologique» potentiel élevé alors que le second regroupe les sites présentant un «danger microbiologique» moins élevé. En condition de haut débit, un dendogramme similaire est obtenu mais le site de Poses est regroupé avec les sites présentant un «risque microbiologique potentiel» plus élevé. Ces résultats confirment le rôle important des apports amont dans la contamination fécale des eaux de l estuaire à haut débit. A B Poses Tancarville Caudebec La Bouille Honfleur Rouen Le Croisset Docks 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 Average Distance Between Clusters Poses Le Croisset Rouen Docks La Bouille Honfleur Tancarville Caudebec 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 Average Distance Between Clusters Figure 2. Hiérachisation des différents sites de l estuaire en fonction du flux de coliformes thermotolérants. (a) en condition de bas débit (inférieur à 300 m 3.s -1 ) (6 campagnes); (b) conditions de haut débit (supérieur à 500 m 3.s -1 ) (10 campagnes). 23

1-4 Occurrence des Salmonella dans les eaux de l estuaire de Seine Les eaux de Seine sont fréquemment contaminées par des Salmonella avec plus de 50 sérovars différents qui correspondent aux sérovars les plus fréquemment isolés en épidémiologie humaine et animale (Touron et al., 04). La contamination en Salmonella des 8 sites échantillonnés est statistiquement différente (test de Pearson, p<0.05 ; tableau 10). Les eaux de la zone urbanisée de la région rouennaise sont plus fréquemment contaminées en Salmonella notamment pour les sites localisés à proximité de la confluence du Robec et de la STEP. Les résultats de détection moléculaire de cette bactérie menée pendant les campagnes SA confirme une contamination quasi permanente des eaux de cette zone par Salmonella. Sur le site de Poses la fréquence d échantillons contaminés par Salmonella est dix fois plus importante à haut débit qu en période de bas débit. (tableau 11). Tableau 10 : Occurrence de Salmonella en estuaire de Seine Salmonella (n/n*) Sites pk (km) SNS SA Culture (%) Culture nmpcr Apport amont Poses 202 20 / 39 (51.2) 5 / 13 7 / 13 Rouen 243 19 / 35 (54.2) 6 / 8 7 / 8 Zone urbaine Le Croisset 246.6 25 / 39 (64.1) 6 / 10 8 / 10 Bassin des docks 251.3 27 / 39 (69.2) 2 / 2 2 / 2 La Bouille 259.7 18 / 37 (48.6) 9 / 11 11 / 11 Limite de l intrusion des eaux salines Caudebec 310.5 17 / 37 (45.9) 4 / 5 5 / 5 Tancarville 337 15 / 35 (42.8) 7 / 17 8 / 17 Embouchure Berville 346 na 3 / 8 4 / 8 Honfleur 355.8 9 / 35 (25.7) 7 / 14 9 / 14 *n: nombre d échantillons positifs, N: nombre d échantillons analysés. 24

Tableau 11 : Occurrence de Salmonella en estuaire de Seine en fonction des conditions de débit Apport amont Poses (pk 202) Rouen (pk 243) Le Croisset (k pk 246.6) Zone urbaine Bassin des Docks (pk 251.3) La Bouille (pk 259.7) Limite de l intrusion des eaux salines Caudebec (pk 310.5) Tancarville (pk 337) Embouchure Honfleur (pk 355.8) Proportion d échantillons positifs à haut débit n/n (%) 16/18 (88.9 %) 10/15 (66.6 %) 12/19 (63.1 %) 15/19 (78.9 %) 11/17 (64.7 %) 13/18 (72.2 %) 8/16 (50 %) 6/15 (40 %) Proportion d échantillons positifs à bas débit n/n (%) 1/13 (7.69 %) 4/11 (36.3 %) 8/11 (72.7 %) 8/11 (72.7 %) 4/11 (36.3 %) 3/13 (23 %) 5/13 (38.4 %) 1/10 (10 %) n: nombre d isolats. N: nombre total d échantillons Une étude de la relation entre l abondance des différentes flores bactériennes indicatrices de contamination fécale et la présence de Salmonella a été effectuée à partir des données SNS 2000-2004 (Tableau 12). Une relation positive (p< 0,05) entre la présence de Salmonella cultivables et l abondance des flores indicatrices n existe que dans la zone urbanisée de l estuaire, Honfleur et Poses. A Poses, il existe une relation significative entre l abondance des coliformes fécaux/thermotolérants (p<0,05), les entérocoques (p<0,05 ou p<0,01 selon la méthode utilisée) et E.coli (p<0,01). Sur le site de Rouen l occurrence des Salmonella n est corrélée qu avec l abondance des coliformes fécaux/thermotolérants (p<0,05). A l embouchure de l estuaire, l occurrence des Salmonella est corrélée avec l abondance des entérocoques (p<0,05; méthode cultivable) ce qui suggère que les entérocoques pourraient être de meilleurs indicateurs de la contamination fécale dans la zone saline (toutefois, cette relation n est plus mise en évidence avec les entérocoques dénombrés par la méthode miniaturisée). Aucune relation positive n a pu être observée entre l abondance des flores indicatrices et l occurrence des Salmonella sur les 5 sites compris entre le Croisset et Caudebec. Ces résultats montrent que dans l estuaire il n existe pas de relation simple entre l abondance des flores indicatrices de contamination fécale et la présence de Salmonella, même si dans les zones ou l abondance des coliformes fécaux est importante (zone urbaine, Poses à haut débit), les eaux sont plus fréquemment contaminées par Salmonella. Différents facteurs peuvent expliquer l existence d une relation complexe notamment l impact localisé d événements pluvieux l influence de la dynamique des MES. 25

Tableau 12 : Relation entre l abondance des flores bactériennes indicatrice de contamination fécale et la présence de Salmonella dans les eaux de l estuaire de Seine (données SNS 1997-2004) Salmonella (-) Salmonella (+) Stations kp Indicator Geom. mean min Max Geom. mean min - Max Poses 202 Total coliform 3727 430-93000 9404 930 93000 Thermotolerant coliform 1122 230-93000 4777* 92 93000 Enterococci (1) 98 30 4300 598* 36 23000 Enterococci (2) 62 19 1662 921** 117 7250 E. coli 262 38 1666 1803** 34 16810 Rouen 243 Total coliform 3334 430 9300 12126* 4300 93000 Thermotolerant coliform 1793 230 9300 2587 150 43000 Enterococci (1) 414 92 4300 1151 36 4300 Enterococci (2) 439 78 6217 723 117 3553 E. coli 2392 292 23690 2325 599 17520 Le Croisset 246.6 Total coliform 7002 2300 43000 10656 2300 230000 Thermotolerant coliform 3330 930 15000 4517 930 93000 Enterococci (1) 402 230 930 1035 92 9300 Enterococci (2) 504 78 1990 611 19 6350 E. coli 2272 350 15830 2685 584 26700 Bassin des Docks 251.3 Total coliform 8658 430 93000 4966 430 43000 Thermotolerant coliform 2755 230 43000 1807 230 15000 Enterococci (1) 615 36 4300 383 36 4300 Enterococci (2) 439 38 4300 544 163 1297 E. coli 2468 160 12280 2005 599 16620 La Bouille 259.7 Total coliform 3260 430 23000 4130 930 23000 Thermotolerant coliform 1355 230 93000 1234 230 4300 Enterococci (1) 268 36 4300 296 36 4300 Enterococci (2) 219 38 1200 290 38 2068 E. coli 1145 293 5700 1382 403 6520 Caudebec (310.5) 310.5 Total coliform 902 230 4300 1643 430-9300 Thermotolerant coliform 448 36 2300 577 74 9300 Enterococci (1) 85 30 2100 156 30 2100 Enterococci (2) 76 38 556 172 38 584 E. coli 135 38 1126 258 38 60 Tancarville 337 Total coliform 1371 150 23000 2294 150 21000 Honfleur 355.8 Thermotolerant coliform 584 36 4300 868 92 9300 Enterococci (1) 125 30 11454 371* 36 9300 Enterococci (2) 127 38 2940 139 38 1759 E. coli 272 36-4300 184 38-2472 Analyses statistiques effectuées avec le test de Wilcoxon geom mean : moyenne géométrique * p< 0,05/**p<0,01 différence statistiquement significative avec les échantillons négatifs en Salmonella (1) dénombrement des entérocoques selon la normes ISO 7899-2 / (2) dénombrement des entérocoques par la méthode miniaturisée 26

2 Abondance des flores bactériennes indicatrices de contamination fécales et occurrence de Salmonella dans les eaux des affluents (campagnes SA 2000-2005) Dans le cadre du programme seine-aval 3, 7 affluents de Seine ont été échantillonnés (tableau 13). Le cumul des analyses microbiologiques effectuées sur les affluents confirme les résultats obtenus les années précédentes. Parmi les 7 affluents échantillonnés, le Robec et la Risle d une part et l Andelle et l Eure sont les sources de contamination de l estuaire les plus importantes en coliformes fécaux/thermotolérants, en entérocoques et en Salmonella (tableaux 14 et 15). Le niveau de contamination important de la Risle doit très probablement influencer la qualité des eaux sur le site de Honfleur. Il est notable d observer une fréquence aussi importante (voire supérieure) d échantillons contaminés par des Salmonella dans les eaux du Robec et les effluents traités de la STEP émeraude. La forte contamination des eaux du Robec ne trouve pas d explication dans l analyse de l usage de son bassin versant et est très probablement lié a un ou des rejets locaux probablement d origine hospitalière comme le suggère les propriétés d antibiorésistance des souches d E.coli isolées dans ces eaux. Tableau 13 : Caractéristiques des affluents échantillonnés dans le cadre du programme Seine-Aval (2000-2005) Affluents pk (km) Nombre de campagnes surface du bassin versant (km 2 ) débits a (m 3.s -1 ) Andelle 204 4 757 6.4 10.3 Eure 218 4 6 032 19.8-36 Robec 242 7 152 0.21 0.41 Cailly 246 7 246 2.5 4.3 Austreberthe 278 5 214 1.7 2.5 Commerce 335 5 176 0.62 1.2 Risle 344 6 2 315 10.2 17.5 a flux donnés par la DIREN correspondant aux valeurs du jour de prélèvement (données 2005 non incluses, collecte en cours ). 27

Tableaux 14 : Flux de flores bactériennes indicatrices de contamination fécale rejetés par les affluents en Seine (2000-2004) Coliformes totaux Coliformes thermotolerant Enterocoques b Spores de Clostridium perfringens Affluents pk(km) min max a Geom. mean min max a Geom. mean min max a Geom. mean min max a Geom. mean Andelle 204 1.89.10 8 2.24.10 8 2.05.10 8 7.15.10 7 2.05.10 8 1.08.10 8 1.12.10 7 2.05.10 7 1.42.10 7 6.60.10 6 9.75.10 6 8.43.10 6 Eure 218 2.38.10 9 6.13.10 9 3.74.10 9 3.60.10 6 5.81.10 9 2.32.10 8 3.10.10 6 3.19.10 7 8.50.10 6 1.44.10 8 2.31.10 8 1.93.10 8 Robec 242 4.83.10 9 2.87.10 10 1.04.10 10 8.64.10 8 1.21.10 10 2.04.10 9 2.75.10 6 3.17.10 7 1.06.10 7 4.10.10 5 2.24.10 7 7.16.10 6 Cailly 246 4.80.10 7 9.89.10 8 3.39.10 8 8.36.10 6 2.66.10 8 4.22.10 7 1.25.10 7 1.18.10 9 4.14.10 7 3.00.10 6 1.67.10 7 5.31.10 6 Austreberthe 278 5.10.10 7 3.55.10 8 1.24.10 8 3.63.10 7 2.91.10 8 7.25.10 7 2.75.10 6 3.17.10 7 1.06.10 7 1.90.10 6 6.80.10 6 2.97.10 6 Commerce 335 8.06.10 7 2.15.10 9 2.62.10 8 2.16.10 7 8.97.10 7 3.71.10 7 3.10.10 6 3.19.10 7 8.5.10 6 2.61.10 6 2.61.10 7 6.15.10 6 Risle 344 9.29.10 8 5.78.10 10 5.83.10 9 2.72.10 8 6.83.10 9 1.39.10 9 1.75.10 6 1.23.10 8 1.92.10 7 1.07.10 7 4.89.10 7 2.82.10 7 WWTP 247 1.27.10 9 8.34.10 9 3.39.10 9 2.66.10 8 2.32.10 9 5.30.10 8 3.15.10 7 2.04.10 8 9.66.10 7 2.80.10 7 2.32.10 8 6.72.10 7 Geom. moy.: moyenne géométrique a flux exprimées en ufc.100 ml -1 ou en spores.100 ml -1. d C. perfringens: spores dénombrées de 2001 à 2004 ( données SA). 28

Tableau 15: Occurrence de Salmonella dans les affluents de Seine Salmonella (n/n*) Affluents pk (km) SA Cultivable nmpcr Andelle 204 2 / 4 2 / 4 Eure 218 2 / 4 3 / 4 Robec 242 6 / 7 7 / 7 Cailly 246 3 / 7 4 / 7 Austreberthe 278 1 / 5 1 / 5 Commerce 335 1 / 5 3 / 5 Risle 344 4 / 6 4 / 6 WWTP 247 3 / 4 4 / 4 * n: nombre d échantillons positifs, N: nombre total d échantillons. 3 Analyse microbiologique des moules (Mytilus edulis) et coques de baie de Seine L analyse microbiologique des moules effectuées en 2005 montre une faible contamination de ces bivalves en flores bactériennes indicatrices de contamination fécale pour autant des Salmonella ont pu être isolées lors de 3 campagnes (une confirmation par PCR est en cours). Les résultats obtenus depuis 2 ans doivent donner lieu à une synthèse avec l équipe de parasitologie qui sera présentée dans le document de synthèse 2005. 29

St Jouin de Bruneval St Adresse Octeville sur mer Tableau 16 : Qualité microbiologique des moules de baie de Seine A B Coliformes Totaux (UFC/g) Coliformes fécaux (UFC/g) Février 2005 Mai 2005 Juillet 2005 Septembre 2005 Entérocoques fécaux (UFC/5g) Spores de Clostridium perfringens (spores/ 100g) Coliformes Totaux (UFC/g) Coliformes fécaux (UFC/g) Entérocoques fécaux (UFC/5g) Spores de Clostridium perfringens (spores/100g) Coliformes Totaux (UFC/g) Coliformes fécaux (UFC/g) Entérocoques fécaux (UFC/5g) Clostridium perfringens (spores/g) Coliformes Totaux (UFC/ml) Coliformes fécaux (UFC/g) Entérocoques fécaux (UFC/5g) <10 <10 <10 50 <10 <10 <10 150 <10 <10 <10 <1 <10 <10 <10 <1 <10 <10 <10 400 19 <10 <10 <1 <10 <10 <10 <10 <10 <10 50 <1 Spores de Clostridium perfringens (spores/ 100g) St Jouin de Bruneval St Adresse Octeville sur mer Tableau 17 : Qualité microbiologique des coques de baie de Seine A Salmonella Février 2005 Mai 2005 Juillet 2005 Septembre 2005 Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus (UFC/0,1g) Salmonella Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus (UFC/0,1g) Salmonella Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus (UFC/0,1g) Salmonella Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus (UFC/25g) + + <10 - - <10 - - <10 - na 1583 + + <10 + - <10 - - <10 - na 1750 Penne de Pie Penne de Pie Coliformes Totaux (UFC/g) Salmonella Coliformes fécaux (UFC/g) Février 2005 Septembre 2005 Février 2005 Septembre 2005 Listeria monocytogenes Entérocoques fécaux (UFC/5g) Spores de Clostridium perfringens (spores/100g) Staphylococcus aureus (UFC/25g) Salmonella Coliformes Totaux (UFC/g) Coliformes fécaux (UFC/g) Listeria monocytogenes Entérocoques fécaux (UFC/5g) Staphylococcus aureus (UFC/0,1g) + na 2417 + - <10 Spores de Clostridium perfringens (spores/g) <10 <10 <10 200 18 <10 <10 <1 B 30

4 Conclusion - discussion: L exploitation des analyses microbiologiques acquises par le SNS entre 1997 et 2004 et dans le cadre du programme Seine Aval (données SA 2000-2005) a permis de caractériser des zones de l estuaire en fonction d un «danger microbiologique» sur la base de l abondance des flores indicatrices de contamination fécale et de la présence de Salmonella. Deux zones présentent un danger microbiologique plus élevé : la zone de l agglomération Rouennaise et la zone amont sur le site de Poses à haut débit. Dans la zone urbanisée de la région rouennaise la qualité microbiologique (abondance des flores indicatrices et présence de Salmonella) des eaux est fortement influencée par le rejet des STEP, le rejet du Robec et du Cailly. Alors que dans cette zone les eaux sont contaminées de façon permanente par les Salmonella, il n a pas été possible d établir une corrélation entre l abondance d une ou des flores indicatrices et la présence de cette bactérie pathogène. Le site de Poses qui correspond aux apports amont de l estuaire, est une zone de danger microbiologique potentiel en période de haut débit : la fréquence d échantillons contaminés par les Salmonella est 10 fois plus élevée, et il existe une corrélation positive entre l abondance de toutes les flores bactériennes indicatrices et la présence de Salmonella. A l embouchure, la fréquence de contamination des eaux par les Salmonella est plus faible, et il existe une corrélation entre la présence de ce pathogène et l abondance des entérocoques (dénombrées par la norme ISO 7899-2) qui reste toutefois à confirmer avec la nouvelle méthode de dénombrement sur plaque. Sur les autres sites de l estuaire, il n a pas été possible d établir une relation positive entre l abondance des flores indicatrices et la présence de Salmonella. Ces résultats suggèrent l existence d une relation complexe, et nécessite de tester l influence d autres paramètres tels que l influence des évènements pluvieux (évènements rares mais déterminants), le débit, la dynamiques des MES, la survie des différentes flores en fonction de la salinité. Les affluents constituent des sources de contamination en flores bactériennes indicatrices de contamination fécale et Salmonella. Une analyse plus fine intégrant l occupation des sols du bassin versant est en cours. L ensemble de ces données va donner lieu à un travail en commun avec l équipe de P.Servais, pour un couplage avec la modélisation de la dynamique des colifomes fécaux/thermotolérants et qui sera présenté dans le document de synthèse 2005. 31

V.Bibliographie du groupe de recherche En relation avec l étude effectuées dans le cadre du programme Seine- Aval : Distribution and diversity of a cadmium resistance determinant (cada) and occurrence of IS257 insertion sequences in staphylococcal bacteria isolated from a contaminated estuary (Seine, France). C. Oger,J. Mahillon and F. Petit. FEMS Microbiol. Ecol. (2003) 43:173-183. Detection of Salmonella in environmental water and sediments, by a nested multiplex polymerase chain reaction (nmpcr) assay. A. Touron, T. Berthe, B.Pawlak and F. Petit. Res. Microbiol (2004) 156:541-553. Sources of microbiological contamination in the Seine estuary (France) T.Garcia-Armisen, A.Touron, F.Petit, P. Servais. Estuaries (2005) : 28 : 627-633. Faecal contamination of sediments from estuarine mudflats (Seine, France). A. Touron, Thierry berthe, J. Leloup, J. Deloffre and F. Petit ( Hydrobiologia).sous presse Assessment of fecal pollution in an estuarine environment (Sein, France) and the relationship between pathogens and fecal indicators. A. Touron, T. Berthe, G. Gargala, K. Leuvraud, P. Servais, F.Petit Mar. Pollut. Bull. (soumis) Colloques congrés : Abondance des flores indicatrices de contamination fécale et présence de pathogènes (Cryptosporidium parvum, Giardia duodenalis, Salmonella) en estuaire de Seine. A. Touron, T. Berthe, K. Leuvraud, L. Favennec, R. Lafite, P. Servais et F. Petit 2 ème colloque d écologie microbienne, Obernai, France Mémoires de Thèse et de Master 2005 «Contribution à l analyse du risque microbiologique en estuaire de Seine : présence et de venir de Salmonella et relation aux flores indicatrices» Aurélie touron. Thèse de doctorat, Université de Rouen 2005 «Antibiorésistance des souches d E.coli isolées de moules et des eaux de l estuaire de Seine» Julien Lotodé. Master I Biologie des populations et des écosystèmes. Université de Rouen.( 30pp) 2005 : «Résistance aux antibiotiques et au mercure (mera) de souches d E.coli isolées de l estuaire de Seine.» Emilie Laroche. Master 2 recherche d écologie microbienne. Université Lyon I (18pp) : L étude effectuée sur l antibiorésistance des souches d E.coli isolées de l estuaire de Seine a été effectuées dans le cadre du stage de Master 2 d Emile Laroche. Le mémoire de stage et le mémoire bibliographique ont servi de document pour le CES eaux de l AFSSA et de l AFSSE dans le cadre de la saisine 2003-SA-0311 32

ANNEXE METHODOLOGIQUE Prélèvements et conditions de stockage Les échantillons d'eau ont été prélevés dans les affluents, dans la mesure du possible, au niveau de la confluence avec la Seine. La localisation de ces points de prélèvement sont pour la Risle: prélèvement au niveau d'un pont sur la N178 (proximité du lieu-dit "La Chevalerie"), l'austreberthe: prélèvement au niveau de la commune de Duclair (ponton en bois au niveau du jardin public), le Cailly: prélèvement au niveau de la commune de Deville Les Rouen, à proximité du Bassin St Gervais (derrière le M.I.N.) le Robec: prélèvement effectué sur les quais à proximité de la voie ferrée, l'eure, prélèvement au niveau de la D77e (pont), l'andelle: prélèvements effectué dans la commune de Romilly sur Andelle. Les prélèvements d eaux de Seine ont été réalisés dans le cadre des campagnes de la SNS. Les prélèvements de carottes de sédiments de vasières ont été prélevés dans les conditions définis dans le cadre du projet DYVA. Les échantillons d eau sont analysés moins de 4 heures après leurs prélèvements. Pour les études de biologie moléculaire, 500 ml sont filtrés et 500 ml d eau sont supplémentés avec 1mM de Na 2 EDTA 1mM et 0,1% de SDS (p/v). Les filtres et les échantillons d eau sont stabilisés à -20 C. Les carottes de 30 cm de profondeur, sont découpées tous les 2 cm et des aliquots de 1g sont prélevés. L analyse microbiologique est effectuée dans un délai de moins de 4 heures. Pour les analyses de biologie moléculaire les échantillons sont stockés à 20 C. Extraction des acides nucléiques Les échantillons d eau (500mL) ont été filtrés ( filtre 0,45µm HV, durapore). Puis les acides nucléiques sont extraits après une lyse directe avec le kit d extraction «FastDNA SPIN kit for soil» (BIO 101), des cellules présentes sur les filtres (analyse d échantillons d eaux), ou de celles présentes dans les sédiments (0,5 g masse humide) pour les analyses d échantillons de vasières. Les extraits d acides nucléiques bruts sont nettoyés sur colonne Elutip D afin d éliminer les inhibiteurs d amplification génique notamment les contaminants chimiques et organiques. Extraction plasmidique L ADN plasmidique a été extrait selon la méthode de Kado et Liu modifiée (Laroche, 06). Amplification génique (PCR) La détection moléculaire des bactéries appartenant au genre Salmonella (gène flic) est effectuée par une multiplex nested PCR selon le protocole décrit par Touron et al (04). La détection de Listeria monocytogenes, est effectuée à partir d amorces spécifiques du gène hly selon le protocole décrit par Rossen et al. (1991). L optimisation des conditions d amplifications géniques à partir d ADN extrait d eaux et de sédiments d eau de Seine ont été validées au laboratoire (thèse aurélietouron 2005). 33

La séquence spécifique du gène mera ont été amplifiées selon le protocole decrit par La réaction de polymérisation en chaîne décrite par Liebert et al, 97. Le choix des amorces spécifiques des gènes de résistance à la tétracycline teta et du gène inti1 codant l intégrase des intégons de classe 1 a fait l objet d une recherche bibliographique (Laroche, 06). Analyse bactériologique : Les flores bactériennes indicatrices de la qualité sanitaire des eaux et des sédiments sont dénombrées d après les protocoles préconisés par les normes ISO-AFNOR en vigueur. Coliformes totaux et thermotolérants (fécaux) normes ISO 9308-1, spores de Clostridium perfringens (Norme NFT 90-415), entérocoques Normes ISO 7899-2. Les espèces E. coli sont isolées après repiquage sur milieu spécifique RAPID E.COLI (Biorad) validé par les normes ISO-AFNOR. La recherche de bactérie pathogène a été effectuée à partir de 100 ml d eau filtrée sur membrane 0,45µm HA47 (millipore) ou de 25g de chair et liquide intervalvaire de moules en triplicat : Salmonella est isolée selon la norme ISO 6340, la confirmation est effectuée par analyse PCR des souches suspectes sur milieu ASAP ; L.monocytogenes est isolée conformément à la norme ISO 1190 avec confirmation par analyse PCR des colonies suspectes sur milieu ALOA (AES laboratoire). Staphylococcus aureus est isolée des moules selon la norme NFV08-014, la confirmation de l espèce est effectuée sur milieu Baird Parker-rpf (AES, France). Les bactéries résistantes au mercure ont été sélectionnées après croissance sur gélose LB supplémenté en HgCl 2 (20 µg.ml -1 ) (37 C, 24h). Validation des résultats : Le dénombrement des colonies n est pris en compte que si le nombre de colonies cultivées est compris entre 5 et 50 sur un filtre de 47mm de diamètre, entre 15 et 150 sur une gélose de 9 cm de diamètre, entre 5 et 10 dans les tubes de milieu TSN ( dénombrement des spores de Clostridium perfringens). Résistance aux antibiotiques : La résistance aux antibiotiques est déterminée par la méthode de diffusion et l interprétation des résultats est effectuée selon les recommandations du comité de l antibiogramme de la SFM Analyse statistique La matrice des pourcentages de résistance pour chaque antibiotique sur chacun des sites a été convertie en une matrice de distance (distance Euclidienne) afin de réaliser une classification ascendante hiérarchique selon la méthode de Ward. Le logiciel ADE-4 http://univ-lyon1.fr/ade- 4.html a été utilisé pour cette analyse statistique. 34

Crédits photos : C. Dégremont, R. Hocdé, C. Lévêque, S. Moussard Pour tout renseignement, veuillez contacter la coordination scientifique : cdegremont@seine-aval.fr Le GIP Seine-Aval ne saurait être tenu responsable d'évènements pouvant résulter de l'utilisation et de l'interprétation des informations mises à disposition. Travaux co-financés par :