Rapport Scientifique Seine-Aval 3

Rapport Scientifique Seine-Aval 3 Séminaire Seine-Aval 2008 Fiches de synthèse des propositions SA4 THEME 1 : MORPHO-DYNAMIQUE, CYCLES DES VASES ET CONTAMINANTS ASSOCIES ANALYSE DU RISQUE MICROBIOLOGIQUE EN ESTUAIRE DE SEINE - 2006 - C. DégremR. HOcdéont R. Hocdé Berthe T., Pawlak B., Petit F., Cariou N., Ratajczak M., Touron A., Lotodé J., Laroche E. GIP Seine-Aval 12 Avenue Aristide Briand 76000 Rouen tel : 02 35 08 37 64 fax : 02 35 98 03 93 http://www.seine-aval.fr

Sommaire RESUME DU RAPPORT D ACTIVITE 2005... 4 I. INTERVENANTS... 6 II. OBJECTIFS SCIENTIFIQUES POUR L ANNEE... 6 III. STRATEGIE DES CAMPAGNES :... 7 IV. RESULTATS... 8 1 ERE PARTIE: RESISTANCE D'E. coli AUX ANTIBIOTIQUES ET AUX METAUX LOURDS EN ESTUAIRE DE SEINE...8 1-Résistances aux antibiotiques et aux métaux lourds de souches d' E.coli isolées de moules... 8 2- Résistance aux antibiotiques de souches d' E.coli isolées de Seine et de 2 sources majeures de contamination.8 3- Multirésistance aux antibiotiques et au mercure des souches d' E.coli isolées de l'estuaire de Seine 13 4- Analyse génétique de souches d' E.coli résistantes aux antibiotiques et au mercure...16 5-conclusion-discussion..16 2 EME PARTIE : RELATION ENTRE L ABONDANCE DES FLORES INDICATRICES DE CONTAMINATION FECALE ET LA PRESENCE DE SALMONELLE... 18 1- Relation entre l'abondance des flores indicatrices et Salmonella dans les eaux de Seine.. 18 2-Relation entre l'abondance des flores indicatrices et Salmonella dans les affluents...28 3-Qualité microbiologique des moules et coques de baie de seine. 30 4- Conclusion-discussion 32 V. BIBLIOGRAPHIE DU GROUPE DE RECHERCHE... 32 Annexe méthodologique.....34 2

Fiche synthètique Bilan d activités du LMDF UPRES 2123/ Groupe Biodiversité et environnement Synthèse des données de bactériologie (présence de Salmonella) dans les eaux de Seine acquises dans le cadre du programme Seine- aval et de la SNS (voire d autres données disponibles). Relation abondance des flores indicatrices et présence de Salmonella y compris sous forme non cultivable dans les moules, eaux de l estuaire, affluents (influence des évènements pluvieux). Relation abondance des flores indicatrices et présence de kystes de Giardia duodenalis et Cryptosporidium parvum dans les moules, eaux de l estuaire, affluents (influence des évènements pluvieux). Impact des évènements pluvieux sur la contamination microbiologique de la Risle, le Robec et le Cailly. Couplage des premiers résultats obtenus sur Salmonella avec le modèle sur la dynamique des coliformes thermotolérants Recherche de souches E. coli O157 :H7dans les populations d E. coli isolées le long de l estuaire (campagne SNS). Etude de souches résistantes aux métaux lourds (mer, czc, cada) et aux antibiotiques isolées de l estuaire (identification des sources) et des supports génétiques. Action proposée en 2004 et effectuée en 2005 Antibiorésistance de souches d E.coli isolées de moules Fait Fait pour les eaux et affluents de l estuaire Analyses microbiologiques effectuées pour les moules mais la synthèse sera effectuée pour les parasites dans le rapport de synthèse Nombre de campagnes insuffisantes à poursuivre en 2006 Un effort spécifique sera fait sur la Risle en collaboration avec A.Durand. Un retard a été pris en 2005 pour un problème d équipement sur site. Sera fait en collaboration avec Pierre Servais à l occasion de la rédaction du rapport de synthèse Colonies suspectes en cours d analyse Fait Fait et présenté dans ce rapport Action proposée 2005 : Analyse du risque virologique en estuaire de Seine Collecte des échantillons, filtration et envois des filtres à P. Payment (INRS, Québec) Fait mais la convention n a toujours pas été signée 3

Analyse du risque microbiologique en estuaire de Seine Résumé du rapport d activité 2005 LMDF UPRES 2123 Groupe Biodiversité et environnement Université de Rouen, 76821 Mont Saint Aignan cedex Ce résumé concerne les études ci-dessous proposées par notre groupe de recherche pour l année 2005 : - résistance bactérienne aux métaux lourds et aux antibiotiques en milieu estuarien (Action - 2004-10) - relation abondance des flores indicatrices avec Salmonella et les parasites (Giardia duodenalis et Cryptosporidium parvum) dans les eaux, les affluents (action I-2004-12). Une analyse collective des résultats obtenus sur les moules prélevées en baie de Seine est en cours avec l équipe de parasitologie (CHU, Rouen) et sera présentée dans le document de synthèse. Le couplage des résultats présentés dans notre étude avec le modèle sur la dynamique des coliformes thermotolérants sera fait avec Pierre Servais pour le rapport de synthèse 2005. 2004-10) Résistance bactérienne aux métaux lourds et aux antibiotiques en milieu estuarien (Action - Ce travail a permis de montrer dans l estuaire de Seine, environnement contaminé en métaux traces, la présence de nombreuses souches d E. coli multirésistantes au mercure et aux antibiotiques. Ces souches sont isolées dans les eaux de l estuaire mais sont aussi présentes dans les rejets de la STEP de l agglomération rouennaise et dans les eaux du Robec. La comparaison des profils de résistances aux antibiotiques suggère une variation saisonnière du niveau de résistance des souches d E. coli isolées dans les eaux de l estuaire (seize antibiotiques testés), qui peut s expliquer par l origine des réservoirs, l influence des évènements pluvieux sur le ruissellement, ou le débits. Des souches résistantes à l acide nalidixique et à la ciprofloxacine sont présentes dans les eaux, mais absentes dans les rejets de STEP et les eaux de Robec, ce qui suggère que la contamination en E. coli résistantes n est pas uniquement imputable à ces rejets, mais que les ruissellements des sols sont probablement à prendre en compte. La hiérarchisation des sites de l estuaire (méthode de Ward, distance Euclidienne) en fonction des profils de résistance des souches d E. coli montre un cluster où se regroupent les souches isolées des effluents traités de la STEP avec 4

celles isolées dans la zone de l embouchure suggèrant l existence de rejet de bactéries fécales de même origine (STEP?) dans cette zone. Des souches d E. coli présentant des résistances associées à au moins un antibiotique et au mercure (mera) sont présente dans les eaux de l estuaire, dans les effluents traités de la STEP et des eaux du Robec, où elles représentent jusque 30% de la population d E.coli. La résistance au mercure peut être associée à 7 résistances différentes aux antibiotiques. L analyse génétique initiée lors de ce travail a permis de montrer que 6 souches d E. coli (mera) possédaient des intégrons de classe I qui jouent un rôle important dans la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques. L analyse du contenu plasmidique des souches a montré que le gène mera était probablement chromosomique. Ces travaux se poursuivent aujourd hui dans le cadre de la thèse d Emilie Laroche co-financée par le programme Seine-aval. Présence de Salmonella et abondance des flores indicatrices d une contamination bactérienne d origine fécale dans les eaux et affluents de l estuaire de Seine L exploitation des analyses microbiologiques acquises par le SNS entre 1997 et 2004 et dans le cadre du programme seine aval (données SA 2000-2004) a permis de caractériser des zones de l estuaire en fonction d un danger microbiologique potentiel sur la base de l abondance des flores indicatrices de contamination fécales et de la fréquence de contamination par Salmonella: 2 zones présentent un «danger microbiologique» plus élevé, la zone de l agglomération Rouennaise et la zone amont sur le site de Poses. Dans la zone urbanisée de la région rouennaise la qualité microbiologique des eaux est fortement influencée par le rejet des STEP, et le rejet du Robec et du Cailly. Dans cette zone, les eaux sont contaminées de façon permanente par les Salmonella. Pour autant il n a pas été possible d établir une corrélation entre l abondance d une ou des flores indicatrices et la présence de cette bactérie pathogène. Le site de Poses qui correspond aux apports amont de l estuaire, est une zone de «danger microbiologique» en période de haut débit, la fréquence d échantillons contaminés par les Salmonella est 10 fois plus élevée, et il existe une corrélation positive entre l abondance de toutes les flores bactériennes indicatrices et la présence de Salmonella. A l embouchure, la fréquence de contamination des eaux par les Salmonella est plus faible, et il existe une corrélation entre la présence de ce pathogène et l abondance des entérocoques intestinaux (dénombrés par la norme ISO 7899-2) qui reste toutefois à confirmer avec la méthode miniaturisée de dénombrement sur plaque. Sur les autres sites de l estuaire il n a pas été possible d établir une relation positive entre l abondance des flores indicatrices et la présence de Salmonella ce qui suggère l existence d une relation complexe, et nécessite de tester l influence d autres paramètres tels que l influence des évènements pluvieux (évènements rares mais déterminants), le débit, la dynamiques des MES, la survie des différentes flores en fonction de la salinité. 5

I. Intervenants I.1 - Enseignants-chercheurs permanents : Thierry Berthe (MC, 50%), Barbara Pawlak (MC, 20%), Fabienne Petit (Pr, 40%). I.2 - Techniciens Nicole Cariou (10%), Mehdy Ratajczack (40%) I.3 - Stagiaires étudiants Aurélie Touron (ATER, 50%), Stagiaire de master 1 Julien Lotodé (6 mois), Emilie Laroche, DEA/master2. II. Objectifs scientifiques pour l année Résistance bactérienne aux métaux lourds et aux antibiotiques en milieu estuarien (Action I- 2004-10) : La résistance bactérienne aux antibiotiques correspond à un phénomène d écologie globale, où sont observés des flux de gènes de résistance bactériens, parallèlement à la circulation des microorganismes entre les quatre écosystèmes majeurs (homme, animal, sol et eaux). Au sein de cet écosystème aquatique de nombreuses espèces bactériennes d origine fécale et environnementale sont résistantes aux antibiotiques. Les bactéries d origine fécale, majoritairement sélectionnées chez les hommes et les animaux, contaminent l environnement aquatique par l intermédiaire des rejets de station d épuration et le ruissellement des sols agricoles et pâturés. Les gènes de résistances aux antibiotiques souvent présents sur des transposons ou des intégrons peuvent être associés à d autres gènes de résistances, notamment aux contaminants chimiques. Ainsi dans des environnements naturels, la pression de sélection exercée par ces contaminants chimiques peut être favorable au maintien et/ou au transfert de ces gènes au sein de la communauté microbienne. Au cours des exercices précédents du programme Seine aval, l équipe Biodiversité et environnement du LMDF a montré, que la communauté microbienne présente dans les sédiments des vasières était enrichie en bactérie portant des gènes de résistance au cadmium (cada) et au mercure (mera). Une étude comparative montre une très faible abondance de ces communautés bactériennes résistantes aux métaux traces dans les sédiments des vasière de l Authie (site témoin non anthropisé, programme PNETOX). En 2005, nous avons recherché si des souches bactériennes susceptibles d être hébergées dans l organisme humain, présentaient une résistance multiple métaux lourds et antibiotiques. Cette étude s est effectuée sur des souches d E.coli isolées des eaux de l estuaire et de 2 sources de contamination en bactéries fécales : le rejet de STEP et le Robec. 6

III.Stratégie des campagnes : Le groupe de recherche (T.Berthe) a coordonné les campagnes de l ensemble des équipes impliquées dans la thèmatique «analyse du risque microbiologique en estuaire de Seine». Depuis Juillet 2005, nous collectons et filtrons les échantillons que nous envoyons à P.Payment (INRS, Institut A.Frappier, Québec, Canada) pour le dénombrement des virus. Campagne SNS Affluents/STEP Moules Tableau 1 : campagnes communes effectuées en 2005 Février 05 Avril 05 Juillet 05 Septembre 05 Novembre 05 Mars 05 3 affluents + STEP (après période de pluie) Juillet 05 2 affluents Juillet 05 7 affluents + STEP Février 05 St Jouin, Octeville Mai 05 St Jouin, sainte adresse Juillet 05 St Jouin, sainte adresse Microbiologie Rouen T.Berthe/F.Petit Parasitologie L.Favennec G.Gargala Virologie P.Payment ESA Bruxelle P.Servais Intercalibration Méthodes cultivables, moléculaires FISH Intercalibration Méthodes cultivables, moléculaires FISH Coques Septembre 05 St Jouin, sainte adresse Février 05 Penne de pie Septembre 05 Penne de pie 7

L analyse microbiologique a été effectuée sur l ensemble des échantillons : dénombrements des coliformes totaux, fécaux/thermotolérants, entérocoques, spores de Clostridium perfringens. Les Salmonella, Listeria monocytogenes ont été recherchées par la méthode de mise en culture et par biologie moléculaire (PCR). L étude de l antibiorésistance bactérienne et la résistance associée au mercure ont été effectuées sur les campagnes SNS de février et mars et sur les souches isolées de moules. E. coli O157 H7 a été recherchée lors de la campagne affluents de Juillet 2005 et SNS (juillet 05, septembre et novembre 05) IV.Résultats 1ère partie : Résistance bactérienne aux antibiotiques et aux métaux lourds en estuaire de Seine 1 Résistance aux antibiotiques des souches d E.coli isolées de Mytilus edulis Cette action correspond à une proposition de 2004, mais les souches isolées se sont avérées difficilement revivifiables pour permettre une étude des propriétés d antibiorésistance. Cette opération a donc été reportée et réalisée en 2005 et se poursuit en 2006 au vue du faible de souchesd E.coli isolées dans les moules de baie de Seine. Pénicillines Céfalosporines Aminosides Quinolone antibiotiques Vattetot N=43 Mai 2004 Villerville N=10 Ste Adresse N=4 Yport N=4 Amoxicilline 22 0 0 0 0 Amoxicilline+ac.clavulanique 20 0 0 0 0 Ticarcilline 8 0 0 0 0 Ticarcilline+ac.clavulanique 2 0 0 0 0 Imipénème 2 0 0 0 0 Céfalotine 26 0 0 0 0 Ceftazidine 2 0 0 0 0 Cefotaxine 0 0 0 0 0 Gentamycine 0 0 0 0 0 Amikacine 2 0 0 0 0 Acide nalidixique 4 0 0 0 0 Ciprofloxacine 0 0 0 0 0 Avril 2005 St Jouin Bruneval N=8 Tableau 2 : Antibiorésistance de souches d E.coli isolées de moules de l embouchure de Seine En 2004, nous avions observée une faible contamination des moules en flores indicatrices de contamination fécale y compris en entérocoques fécaux, qui peut s expliquer par la faible survie de cette souche bactérienne en milieu marin (stress osmotique). A l exception des moules prélevées sur le site de Vattetot, les souches isolées des moules sont sensibles à tous les antibiotiques testés. Ces résultats suggèrent que les souches d E.coli isolées sur les moules de ce site ont pour origine une sources de contamination en bactéries fécales différente de celles des autres sites. 2 Résistance aux antibiotiques des souches d E.coli isolees des eaux de Seine et de 2 sources majeures de contamination fécales intra- estuariene (STEP émeraude et Robec) 8

Afin de relativiser les résultats obtenus sur l étude de l antibiorésistance des souches d E.coli une étude préalable sur la représentativité de cette population bactérienne au sein des coliformes présent dans la colonne d eau, a été effectuée. 2-1 Proportion de souches d E.coli au sein des coliformes fécaux/thermotolérants A 1,E+04 1,E+03 ufc.100ml -1 1,E+02 1,E+01 1,E+00 Honfleur Tancarville Caudebec La bouille Rouen Pose n/n 0/27 2/51 28/72 45/100 24/65 26/50 % Escherichia coli 0 3,92 38,89 45 36,92 52 B 1,E+05 1,E+04 ufc.100ml -1 1,E+03 1,E+02 1,E+01 1,E+00 Robec STEP pk : 356 pk : 356 n/n 48/50 26/50 % Escherichia coli 96 52 Figure 1. Abondance des coliformes fécaux/thermotolérants et pourcentage d Escherichia coli dans les eaux de l estuaire de Seine et de 2 sources de contamination fécale intra-estuariennes (A) Eaux de l estuaire de Seine : ( ) Campagne de Février 2005 (débit : 354 m 3.s -1 ) ; ( ) Campagne d Avril 2005 (débit : 475 m 3.s -1 ). (B) Rejet de la STEP de l agglomération rouennaise (550 000 eq.habitants) et du Robec (Octobre 2004). Norme européenne pour la qualité des eaux de baignades (76/160/EC) pour les coliformes fecaux/thermotolérants, nombre guide : 10 2.100mL -1 et nombre impératif : 2x10 3.100mL -1. Le pourcentage d E. coli est évalué après repiquage de N souches de bactéries appartenant au groupe des coliformes thermotolérants sur un milieu Rapid E coli. 9

Le pourcentage d E. coli a été déterminé au sein des coliformes fécaux/thermotolérants isolés sur 6 sites de l estuaire (campagnes SNS février et avril 05 ; Figure 1). Dans les eaux de Seine, l abondance des coliformes fécaux thermotolérants est plus élevée en février 05 qu en Avril 05 les valeurs de débits sont voisines mais la campagne de février a été réalisée au flot alors que la campagne d avril a été échantillonnée au jusant. En avril 05, l abondance des coliformes fécaux thermotolérants est constante (1.10 2 UFC.100mL -1 ) sauf sur le site de La Bouille où on observe une augmentation d un facteur dix. La figure 1A montre que l abondance des coliformes fécaux thermotolérants n est pas toujours corrélée à la présence d E. coli. Le pourcentage d E. coli au niveau du bouchon vaseux atteint jusqu à 3,92% à Tancarville et même 0% à Honfleur, probablement dû à l effet de la salinité et à la présence de coliformes thermotolérants ubiquistes mieux adaptés à l environnement. Au niveau des deux sources principales de contamination en bactéries fécales intraestuariennes (STEP émeraude et Robec), on observe à nouveau que l abondance des coliformes fécaux/thermotolérants est aussi importante dans le Robec que dans les rejets d effluents traités de la STEP. Ces résultats confirment ceux déjà obtenus au laboratoire qui montraient que dans l estuaire les eaux du Robec sont une source de contamination en bactéries fécales aussi importantes que les rejets de la STEP Emeraude. De plus le pourcentage d E. coli parmi les coliformes fécaux/thermotolérants est plus élevé dans les eaux du Robec (96%) que dans les effluents traités de la STEP (52%), suggérant une contamination fécale récente de ces eaux. 10

2-2 Résistance aux antibiotiques d E.coli isolées des eaux de Seine et des principales sources de contamination en bactéries fécales intraestuariennes Antibiotiques % de souches d' E.coli résistantes campagne longitudinale rejets intra-estuariens FEV 05 (N=43) AV 05 (N=76) STEP (N=26) Robec (N=48) Pénicillines Amoxicilline 20,93% 6,58% 38,46% 45,83% Amoxicilline + Ac. Clavulanique 18,60% 7,89% 0,00% 6,25% Ticarcilline 39,53% 13,16% 34,62% 83,33% Ticarcilline+ Ac Clavulanique 9,30% 0,00% 0,00% 6,25% Imipénème 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% Céfalosporines Céfalotine 11,63% 5,26% 7,69% 22,92% Ceftazidine 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% Céfotaxine 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% Aminosides Gentamicine 2,33% 0,00% 7,69% 2,08% Amikacine 2,33% 0,00% 0,00% 2,08% Kanamycine 11,63% 1,32% 19,23% 56,25% Phénicolés Chloramphénicol 9,30% 6,58% 15,38% 14,58% Cyclines Tétracycline 30,23% 14,47% 34,62% 35,42% Sulfamides Triméthoprime-sulfamides 13,95% 2,63% 26,92% 79,17% Quinolones Acide Nalidixique 13,95% 5,26% 0,00% 2,08% Ciprofloxacine 6,98% 3,95% 0,00% 0,00% Tableau 3. Pourcentage de souches d Escherichia coli résistantes aux antibiotiques testés, isolées de l estuaire de Seine et de sources de contamination intra-estuariennes a. N, nombre de souches isolées et testées pour chaque antibiotique selon la méthode de diffusion sur gélose Différentes populations d E. coli, prélevées dans les eaux de l estuaire en février (N=43) et avril 2005 (N=76), ainsi que dans les rejets de la STEP (N=26) et du Robec (N=48) en octobre 2004, ont été comparées sur la base de leur profil de résistance aux antibiotiques (Tableau 3). Dans les eaux de Seine, les pourcentages de souches résistantes sont plus élevés en février, qu en avril. Lors de ces deux campagnes, les pourcentages de souches résistantes les plus élevés sont observés pour la ticarcilline (39,53% et 13,16%) et la tétracycline (30,23% et 14,47%). La présence de souches résistantes à la ticarcilline/acide clavulanique (9,30%), à la gentamicine (2,33%) et à l amikacine (2,33%) n est observée qu en février. Ceci montre un effet saisonnier sur le profil de résistance des souches d E. coli isolées des eaux de Seine probablement dû aux réservoirs d origine sous influence du débit et de la pluviométrie qui modifient les transferts de ces bactéries dans l environnement aquatique. Dans les effluents traités de la STEP Emeraude et les eaux du Robec, on observe des pourcentages de souches résistantes plus élevés à l ensemble des antibiotiques par rapport à ceux des souches d E. coli isolées des eaux de l estuaire, à l exception des deux antibiotiques, l acide nalidixique et la ciprofloxacine. Il est aussi à noter l absence de souche résistante à l amoxicilline-acide clavulanique 11

dans les effluents traités de STEP. Ce qui suggère que les bactéries résistantes présentes dans les eaux de l estuaire ont également des origines différentes de celles isolées des rejets de STEP et du Robec. Lors de nos campagnes, aucune souche d E. coli ne présentait de résistance pour la ceftazidine, la céfotaxine et l imipénème. 2-3 Hiérarchisation des différentes populations d.e coli isolées de l estuaire de Seine en fonction de leurs profils de résistance aux antibiotiques (6 campagnes 2001-2005) Rouen 8-0.65 1.6 0 La Bouille Pose Croisset Caudebec STEP Emeraude Embouchure Figure 2. Hiérarchisation des différentes populations d Escherichia coli isolées de l estuaire de Seine en fonction de leurs profils de résistance aux antibiotiques. Dendrogramme obtenu à partir des pourcentages de résistance à 12 antibiotiques (AMX, AMC, TIC, TIM, IPM, CF, CAZ, CTX, GM, AN, NA, CIP) des souches d Escherichia coli isolées de l environnement estuarien lors de ces travaux et incrémentés par les données acquises précédemment au laboratoire (Méthode de Ward, distance Euclidienne) Sur la base des profils de résistance à douze antibiotiques (AMX-AMC-TIC-TIM-IPM-CF- CAZ-CTX-GM-AN-NA-CIP) des souches d E. coli isolées de l estuaire, une matrice de données a été réalisée. Elle rassemble les données obtenues lors de ces travaux (octobre 2004, février et avril 2005) et celles obtenues précédemment par le laboratoire, correspondant à 4 campagnes (2001 et 2002). Cette matrice a permis d effectuer une hiérarchisation par la méthode de Ward (distance Euclidienne), afin de mettre en évidence une variabilité spatiale des différentes populations d E. coli en fonction de leur profil de résistance aux antibiotiques. La figure 2 montre qu il se distingue deux clusters principaux : d une part, les populations isolées des rejets de la STEP Emeraude de l agglomération rouennaise et celles isolées de l embouchure (site de Honfleur et Tancarville) et d autre part, les populations isolées sur les autres sites de l estuaire (Poses pk 202, Rouen pk 243, Le Croisset pk 246,6, La Bouille pk 260 et Caudebec pk 310). Le regroupement de l embouchure et de la STEP dans un même cluster suggère la présence dans les eaux de l embouchure de souches d E. coli ayant des profils de résistance proches de ceux observés chez les souches isolées des effluents traités de la STEP 12

de l agglomération rouennaise, alors qu elles sont rarement isolées sur ce site. Ces résultats laissent supposer que des rejets de même nature que la STEP Emeraude contaminent l embouchure. Ceci pourrait s expliquer par l impact de l affluent La Risle où se rejettent les effluents traités d une STEP. L analyse du deuxième cluster est quant à elle plus délicate à interpréter car de nombreux paramètres interviennent dans cette zone de l estuaire comme le débit, la pluviométrie, ou des rejets ponctuels. 3- Multirésistance aux antibiotiques et au mercure des souches d Escherichia coli isolées de l environnement estuarien Dans le cadre de cette étude, nous avons recherché si la résistance aux antibiotiques pouvait être associée à la résistance au mercure au sein des populations d E. coli isolées de l environnement estuarien (octobre 04, février et avril 05). 3-1 Isolement des souches d Escherichia coli résistantes au mercure (mera) Les souches d E. coli isolées ont été testées pour leur résistance au mercure. Les souches résistantes au mercure ont été identifiées après croissance sur un milieu LB supplémenté en HgNa 2 (20 µg.ml -1 ). La mise en évidence du gène mera a été effectuée par hybridation sur colonie avec la sonde spécifique du gène mera. Puis une détection moléculaire du gène mera a été réalisée pour chaque souche et a permis d amplifier une séquence spécifique de ce gène de 1238 pb. Au total 193 souches d E. coli isolées de différents sites lors de différentes campagnes ont été testées (Tableau 4) : 50 se cultivent sur LB en présence de la pression de sélection au mercure, 47 ont hybridé avec la sonde mera et 47 ont permis de détecter par amplification moléculaire le gène mera. Toutes les souches qui présentaient le phénotype résistant possédaient dans leur génome le gène mera, à l exception de trois souches où le gène n a pas pu être mis en évidence. En conclusion, sur 193 souches d E coli isolées de Seine 47, sont capables de se multiplier en présence de mercure et possèdent le gène mera. Sites Croissance sur milieu supplémenté en Hg (20 µg.ml -1 ) 13 Hybridation sur colonie mera Détection du gène mera par PCR profil longitudinal Honfleur pk 356 (N=0) 0 0 0 Tancarville pk 337 (N=2) 0 0 0 Caudebec pk 310 (N=27) 6 5 5 La Bouille pk 260 (N=45) 8 7 7 Rouen pk 243 (N=21) 9 8 8 Poses pk 202 (N=24) 4 4 4 rejets intra-estuariens STEP pk 247 (N=26) 9 9 9 Robec pk 242 (N=48) 14 14 14 Total (N=193) 50 47 47 Tableau 4. Résultats de croissance, d hybridation et de PCR pour l identification des souches d Escherichia coli, isolées de l environnement estuarien, résistantes au mercure (mera)

3-2 Occurrence de souches d Escherichia coli multirésistantes aux antibiotiques et au mercure dans les eaux de l estuaire et de la STEP emeraude et du Robec A Caudebec pk 310 (N=27) La Bouille pk 260 (N=45) Nb de souches 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de souches 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de résistance aux antibiotiques Nb de résistance aux antibiotiques Rouen pk 243 (N=21) Poses pk 202 (N=24) Nb de souches 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de souches 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de résistance aux antibiotiques Nb de résistance aux antibiotiques B STEP pk 247 (N=26) Robec pk 242 (N=48) Nb de souches 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de souches 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Nb de résistance aux antibiotiques Nb de résistance aux antibiotiques Figure 3. Multirésistance au mercure et aux antibiotiques des souches d Escherichia coli isolées de l environnement estuarien. ( ) Nombre de souches multirésistantes au mercure et aux antibiotiques, ( ) nombre de souches résistantes aux antibiotiques. (A) Profils de multirésistance sur les sites d étude de l analyse des eaux estuarienne (Février et Avril 2005). (B) Profils de multirésistance des rejets de la STEP de Rouen et d un affluent, le Robec (Octobre 2004). 14

Parmi les 47 souches d E. coli (mera), 30 présentent au moins une résistance aux antibiotiques. La figure 3 présente pour chaque site échantillonné, le nombre de bactéries où la résistance au mercure est associée à une ou plusieurs résistances aux antibiotiques (jusqu à 9 antibiotiques différents). Les sites de Honfleur et de Tancarville ont été exclus de l analyse, le nombre de souches d E. coli étant insuffisant. La multirésistance antibiotiques/mercure est retrouvée aussi bien dans les eaux de l estuaire que dans les rejets de la STEP et du Robec. Dans les eaux de l estuaire (Figure 3A), la résistance au mercure est associée à un nombre variable de résistance aux antibiotiques chez les souches isolées des sites de Caudebec (pk 310), La Bouille (pk 260) et de Rouen (pk 243), avec un maximum de 7 résistances aux antibiotiques chez une souche d E. coli isolée à Caudebec. A Poses (pk 202), il a été isolé uniquement des souches d E. coli où la résistance au mercure est associée à une seule résistance aux antibiotiques sur les 16 testés dans notre étude. Les souches d E. coli mera isolées des effluents traités de la STEP rouennaise (pk 247) et des eaux du Robec (pk 242) ont une association à un plus grand nombre de résistances aux antibiotiques (Figure 3B). On constate que les eaux du Robec contiennent uniquement des souches d E. coli possédant de 3 à 6 résistances aux antibiotiques. Ces résultats montrent le rôle aussi important de cet affluent dans l apport de bactéries fécales multirésistantes dans les eaux de l estuaire, équivalent aux rejets de la STEP. Sur l ensemble des bactéries analysées, 30% des souches d E.coli résistante à au moins 1 antibiotique sont aussi résistante au mercure(mera). Tableau 5. Profil de résistance aux antibiotiques des 30 souches d Escherichia coli isolées de l environnement estuarien, identifiées résitantes au mercure (mera) Profil de résistance aux antibiotiques Caudebec La Bouille Rouen Poses STEP Robec TOTAL AMX-TIC-SXT 1 1 AMX-TIC-K-SXT 1 1 AMX-TIC-K-TE 5 5 AMX-TIC-C-SXT 1 1 AMX-TIC-CF-TE-SXT 1 1 2 AMX-TIC-CF-K-TE-SXT 1 1 AMX-TIC-K-C-TE-SXT 1 2 3 AMX-TIC-C-TE-SXT-NA 1 1 AMX-TIC-GM-K-C-TE-SXT 2 2 AMX-AMC-SXT 1 1 AMX-AMC-TIC-NA 1 1 AMX-AMC-TIC-TIM-CF-C-TE 1 1 AMC 1 1 TIC 1 1 2 TIC-TE 1 1 TIC-TE-SXT 1 1 CF 1 1 C 1 1 TE 1 1 NA 1 1 NA-CIP 1 1 15

Le tableau 5 présente les profils de résistance aux antibiotiques des 30 souches multirésistantes isolées lors de ces travaux. On observe des associations de résistance très variées, chez les souches d E. coli isolées des eaux estuariennes, des effluents traités de la STEP et des eaux du Robec. Il n est pas possible d identifier une association spécifique de gènes, liée à la présence de la résistance au mercure. Cependant dans les eaux du Robec, cinq souches présentent le profil suivant : amoxicilline ticarcilline kanamycine - tétracycline qui est retrouvé chez deux autres souches du Robec et chez une souche de STEP où sont aussi associés deux autres résistances (chloramphénicol et aux sulfamides). Ceci suggère que des réarrangements de gènes sont peut être à l origine de ces différentes souches. 4 Analyse génétique de souches d Escherichia coli multirésistantes au mercure (mera) et aux antibiotiques isolées de l environnement estuarien Parmi les 30 souches d E. coli (mera) présentant au moins une résistance aux antibiotiques, 6 ont été sélectionnées afin d étudier la base génétique de leur résistance (tableau 6). Tableau 6. Caractéristiques des souches d Escherichia coli mera isolées de l environnement estuarien analysées au niveau génétique Souches Site Profil de résistance aux antibiotiques testés 16 Présence du gène teta Présence de l intégron de classe I inti1 SA 119 STEP AMX-TIC-CF-TE-SXT + + A120 STEP AMX-TIC-CF-K-TE-SXT - + SA125 Robec AMX-TIC-C-TE-SXT-NA + + SA126 Robec AMX-TIC-K-C-TE-SXT - + SA130 Robec AMX-TIC-K-C-TE-SXT - + SA170 Caudebec AMX-AMC-TIC-TIM-CF-C-TE - + L étude a porté sur 6 souches d E. coli (mera) choisies pour leur multirésistances à au moins 5 antibiotiques. Chez toutes les souches, il a été possible d amplifier une séquence spécifique du gène de l intégrase inti1des intégrons de classe I. Les souches SA119 (STEP) et SA125 (Robec), possèdent la séquence spécifique gène teta qui code une pompe à efflux responsable de la résistance aux tétracyclines. Les souches SA119 et SA170 présentent un plasmide de taille respectivement de 9,5kb et de 5kb. Une analyse par Southern blot avec la sonde mera suggère que la résistance au mercure est probablement portée par le chromosome bactérien. Cette étude se poursuit au laboratoire dans le cadre de la thèse de doctorat d Emilie Laroche. 5 Conclusion Discussion Le rôle de l environnement aquatique naturel dans l émergence et la dissémination des gènes et des bactéries résistantes aux antibiotiques n est pas encore clairement établit. Dans cette étude, des méthodes de microbiologie conventionnelle et de biologie moléculaire ont été mis à profit afin d isoler

des souches d E. coli résistantes aux antibiotiques et au mercure dans un environnement aquatique contaminé en métaux traces, l estuaire de Seine. Deux sources majeures de contamination en bactéries d origine fécale de l estuaire ont été également analysées pour tenter de comprendre l origine des bactéries résistantes dans cet environnement. Afin d étudier la possibilité de co-transfert de gène de résistance aux antibiotiques et au mercure, l analyse génétique de souches d E. coli (mera) résistantes aux antibiotiques a été initiée. Dans cette étude, la comparaison des profils de résistances aux antibiotiques des souches d E. coli isolées des eaux de l estuaire montre une variation saisonnière du niveau de résistance des souches d E. coli (% de souches résistantes aux seize antibiotiques testés). Ces résultats peuvent s expliquer par l origine des réservoirs qui est directement liée aux conditions de prélèvement, à la prédominance ou non des eaux de ruissellement en période de pluie, ou des débits. En estuaire de Seine, les souches d E. coli sont le plus souvent résistantes aux pénicillines et à la tétracycline, des résultats analogues ont été décrits dans la littérature avec une prédominance de souches d E. coli résistantes à ces antibiotiques dans les milieux aquatiques naturels. Des souches résistantes à l acide nalidixique et à la ciprofloxacine ont été isolées dans les eaux, au contraire des rejets de STEP et des eaux de Robec, suggérant que la contamination en E. coli résistantes des eaux de l estuaire n est pas uniquement imputable à ces rejets, mais que les ruissellements des sols sont probablement à prendre en compte. La hiérarchisation des sites de l estuaire (méthode de Ward, distance Euclidienne) en fonction des profils de résistance des souches d E. coli montre un cluster où se regroupent les souches isolées des effluents traités de la STEP avec celles isolées dans la zone de l embouchure. Ces résultats suggèrent l existence de rejet de bactéries fécales de même origine dans cette zone. Dans les eaux de l estuaire des souches d E. coli présentant des résistances associées à au moins un antibiotique et au mercure (mera) ont été isolées. Ces souches sont rejetées en Seine via les effluents traités de la STEP et des eaux du Robec, où prés de 30% de souches d E.coli résistantes au mercure et à au moins 1 antibiotique. La résistance au mercure peut être associée à 7 résistances différentes aux antibiotiques. Les profils de résistance aux antibiotiques des souches d E. coli (mera) sont très variés et ne permettent pas d identifier une association spécifique de gènes. L analyse génétique initiée lors de ce travail a permis de montrer que 6 souches d E. coli (mera) possédaient des intégrons de classe I qui jouent un rôle important dans la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques. L analyse du contenu plasmidique des souches a montré que le gène mera était probablement chromosomique. Ce travail a permis de montrer dans l estuaire de Seine, environnement contaminé en métaux traces, la présence de nombreuses souches d E. coli multirésistantes au mercure et aux antibiotiques. Ces souches sont isolées dans les eaux de l estuaire mais sont aussi présentes dans les rejets de la STEP de l agglomération rouennaise et dans les eaux du Robec. Ces travaux se poursuivent aujourd hui dans le cadre de la thèse d Emilie Laroche co-financée par le programme Seine-aval. 17

2 ème partie : Relation entre l abondance des flores bactériennes indicatrices de contamination fécale et la présence de Salmonella 1 Relation entre l abondance des flores indicatrices de contamination fécale et Salmonella dans les eaux de l estuaire de Seine : 1-1 Analyse des données du SNS (1997-2004) et des données Seine Aval (2000-2005) Données SNS : Le suivi de la qualité microbiologique de l estuaire est assuré par le SNS (coliformes totaux, fécaux/thermotolérants, entérocoques) tous les 2 mois sur 22 sites le long de l estuaire depuis une 30 aine d années. Les Salmonella ont été recherchées et sérotypées sur 11 sites entre 1995 et 2002. Plusieurs dates ont été prises en compte lors de l utilisation de cette banque de données : (i) 1997, mise en place de la station émeraude qui a contribué à une amélioration de la qualité microbiologique des eaux et l entrée en vigueur de la nouvelle norme ISO-6340 pour la détection des Salmonella et qui explique une plus grande fréquence d échantillons contaminés cette bactérie, (ii) 2000, détection des entérocoques et de E.coli par la technique des microplaques. Les données 2005 ne sont pas intégrées car les campagnes ne sont pas faites dans les mêmes conditions de marées. Données Seine- aval (SA) : Dans le cadre du programme Seine aval 3 des analyses spécifiques ont été effectuées à partir d eaux prélevées lors des campagnes du SNS. Les échantillons d eaux ont été analysés simultanément par les équipes de bactériologie (coliformes totaux, fécaux/thermotolérants, entérocoques, spores de Clostridium perfringens, E.coli, Salmonella [y compris sous sa forme non cultivable], E.coli O157 :H7 ), par l équipe de parasitologie (Giarda duodenalis et Cryptosporidium parvum,) et depuis juillet 2005 par une équipe de virologie (adénovirus). Dans le cadre de cette étude, nous avons échantillonné 4 zones de l estuaire (Tableau7): la zone amont (site de Poses, pk 202) ; la zone urbanisée intra estuarienne (pk :243-pk :260) où se localise la confluence avec le Robec et le rejet de la principale STEP estuarienne (Emeraude, 550 000 eq hab) ; Caudebec (pk :310,5 ; limite de l intrusion des eaux salines) ; zone de l embouchure (pk : 338 - pk : 355,8) 1-2 Distribution de la contamination des bactériologique d origine fécale dans les eaux de l estuaire de Seine (données SNS 2000-2004, données Seine aval 2000-2005) Les résultats des campagnes SNS et SA sont présentés tableau 8. A l amont de l estuaire (Poses, pk :202) les abondances en coliformes thermotolérants et entérocoques sont supérieures aux valeurs impératives de la norme pour 40,5% et 53,7% des échantillons respectivement. Nous avons 18

montré en 2004, qu en conditions de haut débit les apports amont étaient la source principale de contamination en coliformes fécaux/thermotolérants de l estuaire (Garcia-Armisen et al., 05). Les abondances les plus élevées en flore bactériennes indicatrices de contamination fécale sont observées dans la zone urbaine de l agglomération rouennaise. Dans cette zone, les abondances en coliformes thermotolérants (58,5% à 87,2% des échantillons selon le site) et en entérocoques (76% à 94,6% des échantillons selon le site) dépassent les valeurs impératives de la norme européenne des eaux de baignades (voir tableau 9). Il est remarquable d observer que dans cette zone l abondance en E.coli peut atteindre 10 fois la norme impérative pour les coliformes fécaux/thermotolérants (tableau 8). La qualité de cette zone est aussi fortement influencée par le niveau de contamination fécale des eaux du Robec (pk : 242), du Cailly (pk : 246) et du rejet des eaux usées de la STEP émeraude (pk : 247) (voir partie II). Dans l embouchure de l estuaire (pk : 337- pk :356) les abondances en flores bactériennes indicatrices de contamination fécale sont plus rarement supérieures aux valeur impératives de la norme que dans la zone urbaine (tableau 9) : 17,8% à 39,5% des échantillons dépassent les valeurs impératives de la norme pour les coliformes fécaux/thermotolérants et 37,2% à 64,3% pour les entérocoques. Le site de Honfleur se distingue des 2 autres sites avec des valeurs plus élevées en abondance des flores indicatrices, notamment les entérocoques où les valeurs sont plus souvent supérieures aux normes impératives. Les spores de Clostridium perfringens dénombrées dans le cadre des campagnes SA atteignent des valeurs maximales à l embouchure de L estuaire. Cette zone est probablement favorable à une accumulation des spores dans la colonne d eau, leur dynamique doit être similaire à celle des MES. Les spores, formes de résistance bactérienne peuvent se maintenir longtemps dans un environnement qui leur est hostile. Par ailleurs, il a été montré lors de l exercice 2004 du programme seine-aval, que les sédiments des vasières étaient le siège d une contamination fécale et que les spores de Clostridium perfringens étaient détectées sur les 30 premiers cm. Les spores de C. perfringens peuvent donc être remises en suspension dans la colonne d eau lors des cycles de dépôt-resuspension des sédiments. 19

Tableau 7 : Caractéristiques des sites échantillonnés le long de l estuaire de Seine (1997-2005) Sites pk (km) Nombre d échantillons Salinité (g.l -1 ) MES (mg.l -1 ) SNS* SA** min - Max min max *** Apport amont Poses 202 40 13 0 3.5 86.1 Rouen 243 40 8 0 3.7 67.2 Zone urbaine Le Croisset 247 40 10 0 5.4 112.9 Bassin des Docks 251 40 2 0 4.9 87.2 La Bouille 260 40 11 0 9.7 405.0 Limite de la salinité Embouchure de l estuaire Caudebec 310.5 40 5 0 7.8 769.4 Tancarville 338 40 17 0.5-25 39.7 3419.2 Berville 346 na 8 0.5-25 28.0 3293.5 Honfleur 355.8 40 14 0.5-25 101.1 3419.2 na: non analysé. *: de 1997 à 2004, coliformes totaux, coliformes fécaux / thermotolérants, E. coli (à partir de 2000), Enterocoques and Salmonella. **: de 2001 à 2005, coliformes totaux, coliformesfécaux /thermotolérants, Enterocoques, Salmonella, Giardia duodenalis et Cryptosporidium sp, de 2001 à 2004 spores de C. perfringens (enterovirus depuis juillet 2005). ***: les données 2005 ne sont pas intégrées 20